CN108117595A - 一种犬α干扰素的制备及其应用 - Google Patents

一种犬α干扰素的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种犬α干扰素的制备及其应用。本发明保护一种蛋白质，是如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列4的氨基酸序列经过除第48位、第95位和第136位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。本发明的发明人对犬干扰素基因进行了随机突变，并进行高生物活性干扰素的筛选，最终成功筛选到一株生物活性较原始序列提高8倍以上的犬干扰素突变株，该突变株的应用将有效降低生产成本，使得犬基因工程干扰素制品更易规模化生产和应用。

Description

一种犬α干扰素的制备及其应用
技术领域
本发明涉及一种犬α干扰素的制备及其应用。
背景技术
干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应，而产生并分泌的一类天然生成的蛋白分子，分子量为15，000-21，000道尔顿。已经确定的干扰素有三大类：I型、II型和。I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ四个亚型，II型干扰素主要有IFN-γ。
犬干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ亚型均已有基因序列报道，并在原核或真核表达系统中实现重组表达，表达产物具有抗病毒活性。本发明的发明人通过对犬的其他亚型干扰素进行发掘，分别发现了犬IFN-ε、IFN-K和IFN-λ，对犬干扰素进行了全面系统的分析，进一步丰富了对犬干扰素家族的认识。
干扰素作为一种广谱抗病毒制剂，已被广泛用于乙肝、丙肝以及肿瘤的治疗，而我国目前还没有商品化的犬干扰素产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬α干扰素的制备及其应用。
本发明提供了一种蛋白质(蛋白质A)，是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列2的氨基酸序列经过除第10位、第57位和第98位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明还保护所述蛋白质A的编码基因(基因A)。
所述基因A为如下(c1)-(c3)中任一所述的DNA分子：
(c1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；
(c3)与(c1)或(c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质A的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本发明提供了一种蛋白质(蛋白质CaIFN-αmut)，是如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列4的氨基酸序列经过除第48位、第95位和第136位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
为了使(b1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述(b2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明还保护所述蛋白质B的编码基因(基因CaIFN-αmut)。
所述基因B为如下(d1)-(d3)中任一所述的DNA分子：
(d1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
(d2)在严格条件下与(d1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质CaIFN-αmut的DNA分子；
(d3)与(d1)或(d2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质B的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本发明还保护含有基因A的重组表达载体、表达盒或重组菌。
本发明还保护含有基因CaIFN-αmut的重组表达载体、表达盒或重组菌。
所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1所示的双链DNA分子替换载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。
所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列3所示的双链DNA分子替换载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。
本发明还保护蛋白A或蛋白质CaIFN-αmut在制备犬干扰素中的应用。
本发明还保护基因A或基因CaIFN-αmut在制备犬干扰素中的应用。
本发明还保护以上任一所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在制备犬干扰素中的应用。
本发明还保护蛋白A或蛋白质CaIFN-αmut在制备产品中的应用；所述产品的用途为抗犬病毒感染。
本发明还保护基因A或基因CaIFN-αmut在制备产品中的应用；所述产品的用途为抗犬病毒感染。
本发明还保护以上任一所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为抗犬病毒感染。
本发明还保护一种犬干扰素的制备方法，包括如下步骤：培养含有基因A的重组菌，得到所述干扰素。
本发明还保护一种犬干扰素的制备方法，包括如下步骤：培养含有基因CaIFN-amut的重组菌，得到所述干扰素。
所述基因A可通过含有基因A的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。
所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1所示的双链DNA分子替换载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。
所述基因CaIFN-amut可通过含有CaIFN-αmut的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。
所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列3所示的双链DNA分子替换载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。
以上任一所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌DH5α。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的犬干扰素。
本发明还保护一种抗犬病毒感染的药物，其活性成分为以上任一所述的犬干扰素。
本发明还保护一种抗犬病毒感染的药物，其活性成分为蛋白A或蛋白质CaIFN-αmut。
以上任一犬干扰素为犬α干扰素。
为推动犬干扰素产品产业化，本发明的发明人希望能够通过优化改造犬干扰素以提高其生物学活性。本发明的发明人对犬干扰素基因进行了随机突变，并进行高生物活性干扰素的筛选，最终成功筛选到一株生物活性较原始序列提高8倍以上的犬干扰素突变株，该突变株的应用将有效降低生产成本，使得犬基因工程干扰素制品更易规模化生产和应用。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测犬α干扰素突变体基因在大肠杆菌中的表达产物结果。
图2为经纯化的重组犬α干扰素突变体的SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
MDCK细胞：Number：CRL-2935TM。
水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)：Number：VR-1238AFTM。
实施例1、犬α干扰素突变体基因的筛选和获得
1、对现有的野生型犬α干扰素基因进行优化，替换稀有密码子，调节AT含量，并且采用错倾PCR技术引入随机突变，得到若干犬α干扰素突变基因。
野生型犬α干扰素基因如序列表的序列5所示，编码序列表的序列6所示的蛋白质。
2、将步骤1得到的若干犬α干扰素突变基因分别插入原核分泌表达载体pLLP-STII(Gene Power，California)的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到若干犬α干扰素突变基因表达载体。
3、将步骤2得到的若干犬α干扰素突变基因表达载体分别转化大肠杆菌TOP10F’，得到重组菌；培养重组菌，诱导表达得到若干犬α干扰素突变蛋白。
4、采用步骤3得到的若干犬α干扰素突变蛋白分别与MDCK细胞共培养，检测细胞培养液上清中的犬干扰素刺激基因Mx表达情况，以野生型犬α干扰素蛋白为对照，筛选使犬干扰素刺激基因Mx表达量明显提高的突变蛋白。经过多轮筛选，最终得到一个效果最优的突变蛋白，经过测序比对，与野生型犬α干扰素蛋白的氨基酸序列相比，突变蛋白的氨基酸序列存在三个点突变(R10-L，V57-L，V98-T)。
突变体蛋白的编码基因如序列表的序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质。为了提高蛋白表达量和蛋白复性效率，在突变体蛋白的编码基因5’端增加一段胸腺肽编码序列，得到最终的突变体编码基因，将其命名为CaIFN-amut，如序列表的序列3所示，编码序列表的序列4所示的蛋白质。
实施例2、犬α干扰素突变体蛋白的表达纯化
1、采用序列表的序列3所示的双链DNA分子(CaIFN-amut)替换载体pBV220(赢润生物技术有限公司，货号：VYG0264)的EcoRI和BamHI酶切位点之间的片段，得到重组表达载体CaIFN-αmut/pBV220(已经测序验证)。
2、将步骤1得到的重组表达载体CaIFN-αmut/pBV220转化大肠杆菌DH5α(宝生物工程(大连)有限公司，货号：D9052)，得到重组菌DH5α-CaIFN-αmut/pBV220。
3、采用LB液体培养基30℃、200转/分(旋转半径为13mm)振摇培养步骤2得到的重组菌DH5α-CaIFN-αmut/pBV220，至菌液OD600nm＝1，取出少量菌液离心收集菌体沉淀(诱导前菌体)，其余菌液42℃、200转/分(旋转半径为13mm)振摇诱导6小时。
4、完成步骤4后，将培养体系5000g离心10min收集菌体沉淀(诱导后菌体)。
分别将步骤3得到的诱导前菌体和步骤4得到的诱导后菌体进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示。图1中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为诱导前全菌，泳道2为诱导后全菌。结果表明，在23kD左右处出现一条蛋白条带，与犬α干扰素突变体蛋白大小相符。收集23kD左右处出现的蛋白条带，经过蛋白质N端测序显示N端10个氨基酸分别为SDAAVDTSSE，表明重组犬α干扰素突变体基因(CaIFN-αmut)在大肠杆菌中正确表达。将SDS-PAGE电泳图，采用Totallab软件进行扫描分析确定表达产物在全菌蛋白中所占比例大于60％。
5、将步骤4得到的菌体沉淀经PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，PH 8.0)洗涤后PBS缓冲液重悬，超声(Φ10探头，超声7秒间隔5秒)30分钟，使菌体破壁，10000g，4度，离心10分钟收集沉淀。
6、采用PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，PH 8.0)洗涤步骤5得到的沉淀(包涵体)，然后用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris·Cl，10mmol/L DTT，pH 8.5)溶解包涵体，10000g，4度，离心10分钟收集上清，即变性蛋白溶液，然后将变性蛋白溶液缓慢加入复性缓冲液(0.5mol/L L-Arg；2mmol/L EDTA，20％甘油；0.9mmol/L GSSG，0.1mol/L Tris.Cl，pH 8.0)中，4度静置48小时，10000g，4度，离心20分钟收集上清，即为含有重组犬干扰素α蛋白的溶液。
7、将步骤6得到的含有重组犬干扰素α蛋白的溶液用蒸馏水稀释5倍，过弱阴离子交换层析柱(HiTrapDEAE FF，Amersham Biosciences)，将样品以0.3ml/分钟的速度加入层析柱中，用pH 7.2PBS缓冲液和1M的NaCl以1ml/分钟的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm进行检测。收集目标洗脱峰，将收集的洗脱峰液再过Sephacryl分子筛层析柱(Amersham Biosciences)，用pH 7.2PBS缓冲液以0.4ml/分钟的速度分离目的蛋白，收集目标洗脱峰，用0.22um滤径的膜过滤除菌后纯化的重组干扰素溶液。纯化后的犬α干扰素突变体溶液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。结果显示纯化后得到单一的目的蛋白条带。泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为纯化后的犬α干扰素突变体。
检测纯化后蛋白的蛋白含量，目的蛋白的产量为750mg/L。
8、采用序列表的序列5所示的双链DNA分子(野生型犬α干扰素基因)替代序列表的序列3所示的双链DNA分子(CaIFN-αmut)，按照步骤1-7进行操作，检测纯化后蛋白的蛋白含量，目的蛋白的产量为23mg/L。
9、采用序列表的序列1所示的双链DNA分子(未添加胸腺肽编码序列的突变体蛋白的编码基因)替代序列表的序列3所示的双链DNA分子(CaIFN-αmut)，替代序列表的序列3所示的双链DNA分子(CaIFN-αmut)，按照步骤1-7进行操作，诱导后全菌进行SDS-PAGE电泳检测，看不到目的条带，能破碎离心后收到少量包涵体，目的蛋白的产量为5mg/L，表明未添加胸腺肽编码序列的突变体蛋白表达量低，胸腺肽编码序列可以显著提高突变体蛋白的表达量和活性。
实施例3、犬α干扰素突变体的生物学活性测定
生物学活性测定参照2005年《中华人民共和国药典》三部附录XC细胞活性抑制法，用MDCK细胞-水疱性口炎病毒系统，采用CPE(细胞致病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。
待测干扰素：首先测定实施例2制备的犬α干扰素突变体溶液、野生型犬α干扰素溶液和未添加胸腺肽编码序列的突变体蛋白溶液的蛋白浓度。然后，将待测干扰素4倍(40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、410、411)倍比稀释为不同浓度的待测干扰素稀释液。
病毒溶液：取水疱性口炎病毒(VSV)，采用无FBS的DMEM配置为100TCID50/ml的VSV病毒溶液。
1、将培养好的MDCK细胞用0.25％的胰酶正常消化下来后，用10％FBS的DMEM培养液重悬后铺至96孔板100μl/孔，密度调整为1×105个/mL，置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养，直至全部贴壁。
2、完成步骤1后，取所述96孔板，进行如下分组处理：
实验组：吸弃培养上清，各孔分别加入100μl不同浓度的待测干扰素稀释液，作用12h后弃掉孔内液体，用PBS洗一遍，各孔加入100μl的病毒稀释液，继续置于37℃，5％CO2培养箱培养。
阴性对照组：吸弃培养上清，各孔分别加入100μl10％FBS的DMEM培养液，作用12h后弃掉孔内液体，用PBS洗一遍，各孔加入100μl无FBS的DMEM培养液，继续置于37℃，5％CO2培养箱培养培养。
阳性对照组：吸弃培养上清，各孔分别加入100μl 10％FBS的DMEM培养液，作用12h后弃掉孔内液体，用PBS洗一遍，各孔加入100μl的病毒稀释液，继续置于37℃，5％CO2培养箱培养。
3、染色：在培养的24h～48h在倒置显微镜下观察阳性对照组的细胞90％以上产生病变时，弃掉细胞板中的液体，用PBS洗2-3遍后加入结晶紫染色液，100μL/孔，室温避光放置30min。
4、脱色：弃掉染料，用自来水冲洗未着色染料后加入脱色液100μL/孔，室温放置10min后在波长570nm处测定吸光度。
5、数据处理：以能抑制50％细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算干扰素效价，即能抑制50％细胞病变的稀释倍数。
结果表明得到的犬α干扰素突变体活性为8.9×107U/mg，而未改造的野生型犬α干扰素活性为1.2×106U/mg，未添加胸腺肽编码序列的突变体蛋白活性为9.6×107U/mg，表明突变体抗病毒活性明显高于野生型犬α干扰素，而且胸腺肽融合标签对于干扰素活性无明显影响。
实施例4、犬α干扰素突变体的安全性测定
实验动物：Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)30只，体重18-22g，雌雄各半。
1、将实验动物分为如下4组进行实验(表1)：
A组给药组(10只)：禁食禁水16h，采用腹腔注射200μl实施例2制备得到的犬α干扰素突变体溶液，5只按照5万U/只的剂量注射，5只按照50万U/只的剂量注射。
B组给药组(10只)：禁食禁水16h，采用肌肉注射200μl实施例2制备得到的犬α干扰素突变体溶液，5只按照5万U/只的剂量注射，5只按照50万U/只的剂量注射；
C组对照组(5只)：禁食禁水16h，采用腹腔注射200μl生理盐水；
D组对照组(5只)：禁食禁水16h，采用肌肉注射200μl生理盐水。
2、完成步骤1后，常规饲养，连续观察7天。检查是否死亡，观察各种毒性反应症状以及记录体重。对每只动物仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。从动物体重、体温、呼吸指征、运动指征、皮肤(毛色)、死亡时间、死亡症状等方面进行观察。
在整个试验过程中，小鼠无一例死亡。试验前后各组小鼠的行为特征无明显变化。毛色正常，无脱毛现象。小鼠爪、尾呈正常肉红色，无红肿糜烂，行为正常，触之反应灵敏。给药组的小鼠体温变化与对照组相似，即各组小鼠体温都在正常的36-38℃内波动，没有异常的体温偏高或偏低，属于正常的波动范围。试验结束后，对各组小鼠进行解剖，结果显示与对照组情况无明显差异。试验结束后，动物体重变化统计结果如表1所示。给药组小鼠体重和对照组小鼠体重较试验前体重均有增加，且试验组小鼠体重与对照组无显著差异。
表1小鼠急性毒性试验体重变化
注：与给药前相比，数值角标小写字母如相同，则表示差异不显著(p＞0.05)，如不同则表示差异显著(p＜0.05)。与对照相比，数值角标小写字母如相同，则表示差异不显著(p＞0.05)，如不同则表示差异显著(p＜0.05)。
上述结果表明，犬α干扰素突变体具有良好的安全性。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种犬α干扰素的制备及其应用
<160> 6
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tgccatctgc cggataccca tggtctgctc aattggcgtg ttctgacgct gctgggtcag 60
atgcgtcgtc tgtctgctgg ctcttgcgat cattatacca atgattttgc ttttccgaaa 120
gaactgtttg atggccagcg cctgcaggaa gcgcaggcgc tgtctgtgct tcatgtgatg 180
acccagaaag tttttcatct gttttgcccg gatacgagca gcgctccgtg gaacatgacc 240
ctgctggaag aactgtgctc gggtctgtct gaacagctgg atgatctgga aacgtgtccg 300
ctgcaggaag cgggtctggc cgaaaccccg ctgatgcatg aagattccac cctgcgtacc 360
tattttcagc gtatttccct gtatctgcag gatcgtaacc acagcccgtg tgcctgggaa 420
atggtgcgcg cagaaattgg tcgctccttc ttctcctcga ccattctgca ggaacgtatt 480
cgtcgtcgta aataa 495
<210> 2
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Leu Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Leu His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Thr Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys
<210> 3
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
agtgacgcgg ctgtggatac tagctctgag attaccacca aagatctgaa agagaaaaaa 60
gaagttgtcg aagaagctga aaacggcggg ggtggatctg gtggcggggg aagctgccat 120
ctgccggata cccatggtct gctcaattgg cgtgttctga cgctgctggg tcagatgcgt 180
cgtctgtctg ctggctcttg cgatcattat accaatgatt ttgcttttcc gaaagaactg 240
tttgatggcc agcgcctgca ggaagcgcag gcgctgtctg tgcttcatgt gatgacccag 300
aaagtttttc atctgttttg cccggatacg agcagcgctc cgtggaacat gaccctgctg 360
gaagaactgt gctcgggtct gtctgaacag ctggatgatc tggaaacgtg tccgctgcag 420
gaagcgggtc tggccgaaac cccgctgatg catgaagatt ccaccctgcg tacctatttt 480
cagcgtattt ccctgtatct gcaggatcgt aaccacagcc cgtgtgcctg ggaaatggtg 540
cgcgcagaaa ttggtcgctc cttcttctcc tcgaccattc tgcaggaacg tattcgtcgt 600
cgtaaataa 609
<210> 4
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Leu
35 40 45
Asn Trp Arg Val Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala
50 55 60
Gly Ser Cys Asp His Tyr Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu
65 70 75 80
Phe Asp Gly Gln Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Leu His
85 90 95
Val Met Thr Gln Lys Val Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser
100 105 110
Ala Pro Trp Asn Met Thr Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser
115 120 125
Glu Gln Leu Asp Asp Leu Glu Thr Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu
130 135 140
Ala Glu Thr Pro Leu Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe
145 150 155 160
Gln Arg Ile Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala
165 170 175
Trp Glu Met Val Arg Ala Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr
180 185 190
Ile Leu Gln Glu Arg Ile Arg Arg Arg Lys
195 200
<210> 5
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tgccacctgc ccgacaccca cggcctgcgc aactggaggg tcctgacgct cctgggacag 60
atgaggagac tctccgccgg ctcttgtgac cactacacca atgactttgc cttccccaag 120
gagctgtttg atggccagcg gctccaggag gcgcaggccc tctctgtggt ccacgtgatg 180
acccagaagg tcttccacct cttctgcccg gacacgtcct ctgctccttg gaacatgact 240
ctcctggagg aactgtgctc ggggctctct gagcagctgg atgacctgga ggcctgtccc 300
ctgcaggagg cggggctggc cgagaccccc ctcatgcatg aggactccac cctgaggacc 360
tacttccaaa ggatctccct ctacctgcaa gacaggaacc acagcccgtg tgcctgggag 420
atggtccgag cagaaatcgg gagatccttc ttctcctcga caatcttgca agaaagaatc 480
aggaggcgga aatga 495
<210> 6
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys

Claims (10)

1.蛋白质，是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列2的氨基酸序列经过除第10位、第57位和第98位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.蛋白质，是如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列4的氨基酸序列经过除第48位、第95位和第136位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
4.权利要求2所述蛋白质的编码基因。
5.含有权利要求2或4所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
6.权利要求1或3所述的蛋白质，或，权利要求2或4所述的基因，或，权利要求5所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在制备犬干扰素中的应用。
7.权利要求1或3所述的蛋白质，或，权利要求2或4所述的基因，或，权利要求5所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为抗犬病毒感染。
8.一种犬干扰素的制备方法，包括如下步骤：培养含有权利要求4所述编码基因的重组菌，得到所述干扰素。
9.权利要求8所述的方法制备得到的犬干扰素。
10.一种抗犬病毒感染的药物，其活性成分为权利要求9所述的犬干扰素或权利要求1或3所述的蛋白质。
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