CN1109507A - 高效抗肿瘤γ型干扰素突变体的制法和用途 - Google Patents

Abstract

采用基因工程技术构建一类新型、高效的抗肿 瘤、抗病毒药物。它是由C端缺失11个氨基酸的人 γ型干扰素通过中间连接肽与痘苗病毒生长因子第 三环进行连接的融合蛋白(HuIFN-γ-VVGFC)。 它兼有人γ型干扰素的抗病毒活性、与EGF受体结 合活性、增强的抗肿瘤细胞增殖活性。同法构建的 MuIFN-γ-EGFC对小鼠黑色素瘤有更强的抑瘤作 用。

Description

本发明涉及一类人工设计构建的新型、高效的抗肿瘤药物--人γ型干扰素-表皮生长因子受体结合域融合蛋白的制作技术及其用途。这类突变体与母体分子比较，具有活性高、特异性强的优点。

干扰素是一类重要的细胞素，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学活性。经10多年临床应用研究表明，它是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。迄今所知，人、小鼠、牛、马等哺乳动物的干扰素均有α、β、γ等三个型别。其中γ型干扰素具有较强的免疫调节活性，所以又称免疫干扰素。但是，临床治疗肿瘤的疗效却不如α型干扰素明显。

成熟的人γ型干扰素由143个氨基酸组成;含有较丰富的碱性氨基酸残基，其C末端有一多价阳离子区RKRKRS，C末端易受蛋白酶的降解而使C端不均一。人γ型干扰素的C端可缺失11个氨基酸，而其抗病毒活性不受影响。γ干扰素的活性型为二聚体。

许多肿瘤细胞表面富有表皮生长因子受体（EGFR），它的配体除表皮生长因子（EGF）外，还包括α转化生长因子（TGF-α），痘苗病毒生长因子（VGF），Shope纤维瘤病毒生长因子（SVGF），粘液瘤病毒生长因子（MVGF）。属于EGF超家族的成员还有：肝素结合生长因子（HB-EGF），基膜素（Laminin），双性调节素（Amphiregulin），低密度脂蛋白（LDL）的结构域同源区，神经分化因子（NDF）凝血丝氨酸前体蛋白C（蛋白C）等。上述多肽具有相类似的结构：与EGF受体有高度亲和性，在EGF敏感细胞中引起丝裂效应。在其一级结构中有高度保守的6个Cys，第36和39位的Gly也是高度保守的。分子内部形成3个二硫键环。实验证明，TGF-α的第三环能与EGF竞争受体，并且阻断EGF对细胞增生的诱导，说明TGF-α的第三环具有与受体结合的功能，但无有丝分裂原活性（Nestor et al 1985 Biochem，Biophys. Res. Commun. 129：226）;同样，采用痘苗病毒19KD蛋白中与EGF C环的一段同源序列，也获得同样结果。Eppstein等（Nature 318：663，1985）也合成了TGF-α和痘苗病毒VVGF的C环，发现它们有与EGF结合的功能;Purchio等（Gene 60：175，1987）将TGF-α的C环置换为VVGF的C环，结果TGF-α的活性不变;Heath等（PNAS  83：6367，1986）的部分实验也支持Nestor的结论，即EGF的C环具有与EGFR结合功能，但无有丝分裂原效应。但也有部分实验认为EGF的B环才是与EGFR结合的主要区段，C环只起辅助作用。（Komoriyaet等PNAS  81：1351，1984）。

本发明是在人γ型干扰素的C末端去除对其活性发挥非必需的11个氨基酸，与证明无致癌作用的痘苗病毒生长因子（HindⅢ C片段19KD蛋白）第三环的15个氨基酸连接，连接肽为Pro Gly Ile三肽。这一融合蛋白已证明具有较强的抗肿瘤细胞分裂活性。

采用类似的方法构建成小鼠γ型干扰素-小鼠EGF  C环融合蛋白，在细胞水平和小鼠机体水平验证了这一抗肿瘤多肽的可靠性。

C 端缺失11个氨基酸的人γ干扰素（IFN-γPGIL）突变体

IFN-γPGIL突变体的构建：

pγ为带有全长人γ型干扰素cDNA的表达质粒，载体为带有PRPL启动子和λcIts857基因的pBV220。以EcoRI消化pBV220/IFN-γ，获得全长IFN-γcDNA，再以BglI和HinfI消化，获得0.43kb片段，后者含有HuIFN-γ cDNA N′端132个氨基酸，再与编码Pro Gly Ile Leu的寡核苷酸序列连接，接TAG翻译终止密码子，后者含多酶切点。

人γ型干扰素母体cDNA的3′端序列及部分氨基酸序列：

397nt

AGT  CAG  ATG  CTG  TTT  CGA  GGT  CGA  AGA  GCA  TCC  CAG  TAA

132aa

Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln ＊

人γ型干扰素-PGIL（HuIFN-γ  PGIL）突变体的部分核苷酸和氨基酸序列：

397nt

AGT CCG GGG ATS（CTC TAG

132aa

Ser Pro Gly Ile Leu ＊

以上序列由酶切分析和DNA测序所证明。

HuIFN-γPGIL突变体的生物学活性

HuIFN-γPGIL突变体基因及其母体基因分别插入pBV220表达载体的EcoRI-Pst位点，获得高效表达。在SDS-PAGE上分别显示出17.5kD和16.5kD的条带。其表达量分别占菌体蛋白的24%和43%。

采用WISH细胞-VSV系统测定突变体的抗病毒活性，结果表明，突变体的平均滴度为4500MU/升菌液;而人γ干扰素母体分子则平均为270MU/升液（P＜0.01），即突变体的抗病毒活性比母体提高了10倍以上。

采用3H同位素掺入法，在EGF受体丰富的CNEⅡ细胞（来源于鼻咽癌）上，在2ng/ml EGF存在的条件下，测定其抗肿瘤细胞生长活性。结果表明，干扰素浓度分别为10，100，1000单位时，突变体的抗肿瘤细胞分裂活性分别为：16.6±7.4，30.9±12.9，62.2±6.7;而γ干扰素母体则为：9.7±4.0，26.8±4.1，62.8±6.8;说明当干扰素浓度在100U/ml以下时，突变体的抗肿瘤细胞分裂活性有明显提高（P＜0.05）。

人γ型干扰素-痘苗病毒生长因子（VVGF）EGFR结合域融合蛋白（HuIFN-γ-VVGF C）

HuIFN-γ-VVGF C融合蛋白的构建：

痘苗病毒HindⅢ C 片段中编码-19kD蛋白，为痘苗病毒生长因子（VVGF），考虑到痘苗病毒无致癌的危险性，其可能的抗原决定蔟与人EGF类似，所以采用VVGF的受体结合域，即VVGF的第三环，共16个氨基酸：

CGC TGC TCC CAT GGC TAC ACT CGT ATT CGT TGC CAA GCA

Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln Ala

GTA GTT CTC TAG

Val Val Leu *

其中第13位氨基酸原为His，对其功能的发挥为非必需的，它位于后一Cys旁，而前一Cys旁的Arg也带阳电荷，不利于二硫键的形成，所以改为Ala。

为此，人工合成了编码上述氨基酸序列的核苷酸序列，5′端带BamHI位点，3′端带XbaI位点。上述HuIFN-γ-PGIL突变体基因的3′端也有BamHI位点，用人工合成的BamHI-XbaI片段与HuIFN-γ-PGIL的EcoRI-BamHI连接，组建成HuIFN-γ-PGI-VVGF C融合蛋白。

上述结构经酶切分析和DNA测序所证实。

将带有HuIFN-γ-PGI-VVGF C基因全序列的EcoRI-XbaI片段插入表达载体pBV220的EcoRI位点，升温表达后在SDS-PAGE上，表达量占菌体蛋白的36%。

由于PRPL强启动子的作用，发生了通读TAG的现象，为去除此通读现象，采用定位突变技术，在融合蛋白基因的3′端将TAG改为TAATAA。

融合蛋白基因的3′端的序列如下：

397nt

AGT CCG GGG ATC CGC TGC TCC CAT GGC TAC ACT GGT ATT

132aa

Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile

CGT TGC CAA GCA GTA GTT CTC TAA TAA

Arg Cys Gln Ala Val Val Leu * *

HuIFN-γ-PGI-VVGF C突变体基因全序列

HuIFN-γ-PGI-VVGF C突变体的生物学活性

HuIFN-γ-PGI-EGF C突变体与母体IFN-γ经纯化后在SDS-PAGE上显示均一条带，其分子量分别为18.7kD和17.5kD，纯度可达90%，比活性为8MU/mg。ELISA检测证实融合蛋白及其母体均可与人γ干扰素单克隆抗体产生显色反应。

采用WISH细胞-VSV系统测定其抗病毒活性的结果表明，融合蛋白平均滴度为530MU/升菌液，而γ干扰素母体则为270MU/升菌液。说明融合蛋白的抗病毒活性并未降低。

采用3H同位素掺入法，在EGF受体丰富的CNEⅡ细胞（来源于鼻咽癌）上，在2ng/mlEGF存在的条件下，测定其抗肿瘤细胞生长活性。

%细胞增殖抑制率＝（1- (实验组cpm)/(对照组cpm) ）×100

结果表明，干扰素浓度分别为10，100，1000单位时，突变体的抗肿瘤细胞分裂活性分别为：24.1±9.0，46.1±2.4，70.7±5.8;而γ干扰素母体则为：9.7±4.0，26.8±4.1，62.8±6.8;说明当干扰素浓度在100U/ml以下时，突变体的抗肿瘤细胞分裂活性有明显提高（P＜0.01）。

采用MTT法，在EGF受体丰富的A431细胞上，测定其抗肿瘤细胞增殖活性。

%细胞增殖抑制率＝（1- (实验组OD)/(对照组OD) ）×100

结果表明，干扰素浓度分别为16，32，62.5，125，250，500，1000单位时，突变体的抗肿瘤细胞增殖活性分别为：24.3±1.7，39.4±3.6，50.7±6.4;58.3±5.7，57.7±4.1，61.6±1.9，69.6±1.9;而干扰素母体则为：1.2±1.6，11.3±0.8，22.4±2.3，41.7±5.6，44.3±4.4，52.9±2.9，59.2±4.0;说明突变体的抗肿瘤细胞分裂活性比其母体分子有明显提高（P＜0.01）;特别在低浓度时更为明显。

融合蛋白及其母体干扰素对A431细胞表面EGFR竞争抑制作用：

3种浓度干扰素（62.5，250，1000IU/ml）处理A431细胞，每1样品2个复孔，37℃20小时后加125I-EGF（136uCi/ug）6ng，室温放置2.5小时后，Hank′s液洗，NaOH裂解，用Beckman γ5000计数仪测定cpm值。

125IEGF结合率按下式计算：

%结合率＝ (实验组cpm-非特异结合cpm)/(最大结合cpm-非特异结合cpm) ×100

结果表明，融和蛋白处理细胞后，125IEGF的结合率各为：38.9±3.5，29.7±4.1，13.4±10.6;而γ干扰素母体则各为：79.2±9.2，40.0±2.6，18.6±1.5。干扰素浓度在62.5IU/ml时，融合蛋白与其母体的结合率的差异十分显著（P＜0.01）;250IU/ml时，差异也显著（P＜0.05）;但当干扰素浓度达1000IU/ml时，差异不显著（P＞0.05）。

小鼠γ干扰素-上皮生长因子受体结合域融合蛋白

（MuIFN-γ-EGF C融合蛋白）

mEGF由53个氨基酸组成，与人EGF和VVGF有类似的结构，分子内有6个Cys，形成三个二硫键。EGFR为1186个氨基酸残基的多肽，分子量为170kD。分子由3部分构成：胞外配体结合域，跨膜区以及具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。

成熟的MuIFN-γ由133个氨基酸组成，其C端也有KRKRS样结构。其他特性与人IFN-γ相似。

MuIFN-γ-EGF C融合蛋白的组建

始原MuIFN-γ cDNA的改造：

pmγ携带有MuIFN-γcDNA全序列。为便于在大肠杆菌中表达，组建融合蛋白，首先人工合成两条核苷酸引物：

A：5′CCGAATTCTTATGCACGGCACAGTCATTGAAAG  3′

b：5′AAGGATCCTTACCCGGGGCGACTCCTTTTCCGCTTCC  3′

以MuIFN-γcDNA序列为模板，上述A，B为引物进行PCR，获得约0.4kb条带，DNA测序结果如下：

上述MuIFN-γcDNA的特点是：

1.去除了信号肽，5′端加EcoRI酶切位点;2.在第一个氨基酸His前加一Met;3.保原MuIFN-γcDNA5′132个核苷酸，加上CCCGGGTAAGGATCCTT编码Pro Gly作为随后组建融合蛋白的连接肽，3′有BamHI酶切位点。

小鼠EGF受体结合域序列的人工合成

根据mEGF第三环（C环）序列，人工合成编码第33位至第47位氨基酸的核苷酸序列，两端配置酶切位点。序列如下：

EcoRI  SmaI  33  34  35  36  37  38  39  40

5'  AAGAATTCCATGCCCGGG GGT TGC GTT ATC GGT TAC TCT GGT GAT

Gly Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp

41  42  43  44  45  46  47

CGA TGT CAA ACT CGA GAT CTT TAA GGATCCAT

Arg Cys Gln Thr Arg Asp Leu * BamHI

上述序列经DNA测序所证实。

融合蛋白组建：

将用PCR改造的MuIFN-γcDNA用EcoRI和SmaI切开，与经SmaI切开的mEGF C环序列相连，获得MuIFN-γ-EGF C融合基因，并经DNA测序所证实。

融合基因连接区的序列如下：

MuIFN-γ  130  131  132  连接肽  mEGF  33  34  35...

N  ...Arg Ser Arg  Pro Gly Gly  Cys Val Ile...  C

5'  ...AGG AGT CGC  CCC GGG GGT  TGC GTT ATC...  3'

融合基因全序列如下：共472个核苷酸，151个氨基酸。

MuIFN-γ-EGF C融合蛋白的生物学活性

突变体在大肠杆菌中的高效表达

将上述MuIFN-γ-EGF C融合蛋白基因用EcoRI和BamHI切开，插入表达载体pBV220的EcoRI-BamHI位点处。用同法也将改变的MuIFN-γcDNA插入pBV220表达载体。经升温诱导表达后，SDS-PAGE上的表达量均为30%左右。分子量各为16.7kD和14.9kD。

融合蛋白的抗病毒活性

在小鼠L细胞-VSV系统上，融合蛋白与其母体的抗病毒滴度均为100MU/升菌液。说明，融合蛋白保留了原有的抗病毒活性。

融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖活性

采用Jyg-MC（A）乳腺癌细胞进行的抗细胞增殖活性试验表明，用1000单位融合干扰素处理细胞时，第1，3，5，7天的细胞数分别为：230K，200K，150K，50K;而用母体干扰素处理细胞时，则分为：230K，210K，180K，100K;对照则为：230K，220K，200K，150K。说明融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖活性有明显提高。

融合蛋白的mEGF受体结合竞争试验

采用A431细胞进行EGFR结合竞争试验，该细胞表面的EGFR数可达100万/细胞。先用不同浓度干扰素样品（10，9，8，7，6.^-logM）处理细胞，25℃，30分钟后，加约20000cpm的125IEGF，在25℃继续放置30分钟。然后用RPMI 1640+0.1%BSA洗4次，再用裂解液（0.5M NaOH+0.1%SDS）裂解细胞，37℃，1小时后，用Beckman GAMMA 5500测定γ射线。

结果表明，融合蛋白处理细胞后125IEGF的结合率分别为：97，74，48，38，17;而干扰素母体分子处理细胞后125IEGF的结合率分别为：99，91，86，66，58。说明有明显差异;融合蛋白中mEGF  C环序列仍保留有与EGFR结合的功能。

融合蛋白在小鼠的抗肿瘤试验

按Carpenter，G（J Biol. Chem 254：4884，1979）方法进行。从北京大学动物中心购得7-8周龄，体重18-20克，雌性纯种C57品系小鼠50只，分5组，每组10只，从传代第13天的小鼠体内取出B16黑色素瘤，每克瘤加3ml无菌生理盐水，研磨成均浆，按200ul/只接种在小鼠右腋部皮下。第二天开始，腹腔注射给药，第1-4组，分别给以大肠杆菌蛋白裂解液、环磷酰胺（60mg/kg）、50万单位γ干扰素融合蛋白和50万单位γ干扰素母体。第3，4天停药，第5天起继续给药至第12天;第5组为生理盐水对照组。停药后1天处死小鼠取瘤，称重。结果表明，大肠杆菌蛋白对照组的平菌瘤体重为3.6±0.6克;环磷酰胺组的平均瘤体重为1.04±0.4克;抑瘤率为72%（P＜0.01）;融合蛋白组的平菌瘤体重为1.6±0.7克;抑瘤率为55%（P＜0.01）;γ干扰素母体组的平菌瘤体重为2.6±0.8克;抑瘤率为27%（P＜0.01）。融合蛋白组与其γ干扰素母体组的抑瘤率有明显差异（P＜0.05）。

上述结果说明，融合蛋白在小鼠体内的抗黑色素瘤能力比其母体分子有明显提高，从而证明了融合蛋白既保留了γ干扰素的功能，又保留了EGF  C结构域的功能;在细胞水平和机体水平均证明融合蛋白的抗肿瘤活性高于其母体γ干扰素。

Claims (4)

1、采用DNA重组技术人工构建C端缺失11个以下氨基酸的人γ型干扰素基因及用人工生物体系(大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等)制备该干扰素突变体用于治疗肿瘤和/或病毒性疾病。这一突变体的生物学活性高于其母体分子。

2、采用DNA重组技术，人工构建人γ型干扰素-EGF  C  环融合蛋白。人γ干扰素的C端可以缺失几个至11个;连接肽以Gly为核心;EGF包括其他EGF超家族成员的分子第三环，第三环序列的非必需氨基酸可以替代。采用人工生物体系（大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等）制备该融合蛋白用于治疗肿瘤和/或病毒性疾病。

3、采用DNA重组技术，人工构建小鼠γ型干扰素-mEGF  C  环融合蛋白。小鼠γ干扰素的C端可以缺失KRKRS下游几个氨基酸;连接肽以Gly为核心;EGF分子第三环序列的非必需氨基酸可以替代。采用人工生物体系（大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等）制备该融合蛋白用于实验肿瘤学的研究。

4、其他与γ干扰素有类似功能的细胞素通过以Gly为核心的连接肽与EGF  C  环连接构建融合蛋白用于肿瘤/病毒病治疗。