CN1220701C

CN1220701C - 重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN1220701C
Application number: CN 02141557
Authority: CN
Inventors: 尹长城; 黄华樑; 刘明学; 林晴; 春雷
Original assignee: Beijing ABT Genetic Engineering Technology Co Ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Hongye Innovative Antibody Technologies Co ltd
Priority date: 2002-09-02
Filing date: 2002-09-02
Publication date: 2005-09-28
Anticipated expiration: 2022-09-02
Also published as: CN1480465A

Abstract

本发明涉及一种新的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子，表达该重组细胞因子的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体，以及含有该载体的宿主细胞，和该重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的生产方法及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途和含有它的药物组合物。

Description

重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子及其制备方法和用途

发明领域

本发明涉及一种基因工程领域，具体地，涉及一种新的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子，表达该重组细胞因子的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体，以及含有该载体的宿主细胞，和该重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的生产方法及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途和含有它的药物组合物。

发明背景

趋化因子是一类在结构和功能上相互关联的细胞因子，通过蓖麻毒素敏感的G蛋白受体发生作用。它可以选择性地富集某些白细胞的亚类，从而在感染和免疫反应过程中发挥重要作用，还有一些趋化因子还具有指导淋巴细胞的迁移和归巢，刺激或抑制血管生成等作用。趋化因子及其受体在淋巴细胞迁移过程的作用主要体现在两个环节中，一是由血液进入淋巴结、Peyer’s集结和炎症组织的过程中，一是在指导淋巴细胞在淋巴组织、器官中定向的过程中。根据趋化因子N端两个保守Cys的结构状况可以将其分为四类，外周淋巴组织趋化性细胞因子SLC(secondary lymphoid-tissue Chemokine)属CC类趋化因子，其两个半胱氨酸之间无其它氨基酸间隔，是CC类趋化因子受体CCR 7(CCchemokine receptor)的一个配体，其基因定位于人染色体9 p13。CC类趋化因子主要作用于单核细胞、淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)、NK细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞。SLC可以和ELC(Epstein-Barr virus-induced molecule-1 ligand chemokine)共同指导T细胞和树突细胞进入淋巴组织T细胞区。SLC和ELC在脾脏的T细胞区、淋巴结和Peyer’s集结处组成型表达。其中SLC在淋巴结高度内化的小静脉(high endothelial venules，HEVs)和Peyer’s集结处高度表达。对SLC趋化T细胞的作用，已经有确定的实验证据支持。在SLC基因缺陷的plt鼠(paucity of lymph node T cell，plt)的HEV中不能大量表达SLC蛋白，也就不能引发T细胞的粘附作用，虽然SLC及CCR7的另一个配体MIP-3β都是通过CCR7发生作用，但在T细胞的快速粘附过程中，可能只有SLC才有能力被提呈，CCR7与SLC之间的互作对于完成T细胞进入淋巴器官的过程是不可或缺的。结果它可以在体外引发大多数依赖整联蛋白(integrin)的外周血淋巴细胞发生粘附作用。将SLC注入肿瘤组织后可以吸引淋巴细胞和树突状细胞到达肿瘤组织发挥作用。树突状细胞应用于肿瘤治疗的研究报道渐多，SLC及其他趋化因子则可以改善免疫治疗的效果。已有研究表明在通常情况下，虽然肿瘤细胞表面可以表达异常蛋白，但其逃避免疫监视的机制使得免疫系统不能有效地发挥作用，SLC则可使肿瘤组织中免疫增强蛋白显著增加，有助于激活免疫系统的识别和杀伤功能。此外，SLC还能抑制肿瘤组织的血管生成，阻断其养分供应途径，限制实体瘤的生长。已有实验表明将重组的杆状病毒表达系统制备的SLC蛋白用于实验动物的肺癌治疗时，可使40％个体的肿瘤消退，其余个体肿瘤细胞的生长也明显受到抑制，而对照组肿瘤细胞则无限增生。目前正在开展的SLC在免疫应答过程中的作用机制的研究结果表明SLC是一个很有希望的肿瘤免疫治疗候选分子(主要参考文献：1.Cyster，在次要的淋巴样的组织中趋化因子和细胞迁移(Chemokines and cell migration in secondary lymphoidorgans).科学(Science).1999，286：2098-2102.2.Federica，趋化因子受体在初次，效应，和记忆免疫反应中的作用(The role ofchemokine receptors in primary，effector，and memory immuneresponses).免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)2000，18：503-602.3.Campobell，在组织-特异性和微环境-特异性的淋巴细胞寻靶中的趋化因子(Chemokines in tissue-specific and microenvironment-specificlymphocyte homing).当代免疫学观点(Curr.Opin.In Immu.)2000，12：336-341.4.Nagira，作为淋巴细胞的有效的化学引诱剂的新的人趋化因子次要的淋巴样的组织中趋化因子的分子克隆和对染色体9p13的定位(Molecular cloning of a novel human chemokine secondarylymphoid-tissue chemokine that is a potent chemoattractant forlymphocytes and mapped to chromsome 9p13).JBC.1997，272：19518-19524.5.Sharma，次要的淋巴样的组织中趋化因子介导体内的T细胞依赖性的抗肿瘤反应(Secondary lymphoid tissue chemokinemediates T cell-dependent antitumor response in vivo.)免疫学杂志(J.Immunology).2000，164(9)：4558-4563.)。

我们采用人工合成的方法获得了此基因的序列，并以大肠杆菌为宿主表达目的蛋白可以以较低的成本生产出完全人源的SLC，避免治疗过程中免疫原性的干扰。

发明内容

本发明的一方面是提供一种广谱、高效、易于生产的肿瘤免疫治疗制剂-重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子。

本发明的另一方面是提供一种适合在大肠杆菌中表达的编码所述的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的核苷酸序列。

本发明的另一方面是提供两种可用于表达所述的趋化性细胞因子的大肠杆菌质粒。

本发明的另一方面是提供一种用本发明的表达载体转化的宿主细胞。

本发明的另一方面是提供一种利用大肠杆菌生产广谱、高效的肿瘤免疫治疗制剂-重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的生产方法和纯化方法。

本发明的另一方面是上述的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

本发明的另一方面是提供一种药物组合物，其含有上述的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和具有创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

附图简要说明

图1.重叠PCR方法拼接扩增带有大肠杆菌肠毒素信号肽的SLC的10个核苷酸序列及设计的中间引物。

图2.重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子(SLC)的核苷酸及氨基酸序列(分别以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2表示)。

图3.表达质粒载体pTMF-SLC的物理图谱及其多克隆位点序列。

图4.表达质粒载体pALM-SLC的物理图谱及其多克隆位点序列。

图5.pTMF-SLC表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：其中泳道1、2为pTMF-SLC未诱导的沉淀和上清，泳道3、4、5、6分别为pTMF-SLC上清、沉淀、沉淀、上清，泳道7为Marker，泳道8为pTMF-SLC沉淀，泳道9、10为pTMF-SLC上清和沉淀，泳道11、12为空载体对照的上清和沉淀。

图6 pALM-SLC表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：其中泳道1，2：分别为空载体的超声上清和沉淀；泳道3，4：分别为pALM-SLC-slc超声上清和沉淀；泳道5：分子量标记。

图7.重组人SLC的包含体经柱上复性后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，其中泳道1：用6M盐酸胍裂解后的离心沉淀用6M盐酸胍裂解，泳道2：用8M尿素裂解后的沉淀再用6M盐酸胍裂解，泳道3：分子量Marker，泳道4：复性结果。

图8.pALM-SLC表达可溶形式的重组SLC经亲和层析纯化后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果：其中泳道1、2：分别为结合缓冲液的洗脱液和上样峰；泳道3：pTMF-SLC超声上清；泳道4：清洗缓冲液洗脱峰；泳道5：为洗脱缓冲液I洗脱峰；泳道6：洗脱缓冲液II洗脱峰；泳道7：分子量标记；泳道9：pTMF-SLC。

图9.Western Blot检测大肠杆菌表达重组人SLC的结果纯化SLC的Western blotting结果，其中泳道1：对照；2：分子量标记；3：SLC纯化产物。

图10.重组SLC与Jurkat细胞细胞膜制备物的ELISA结果。

图11.重组SLC对人外周淋巴细胞趋化性测定结果。

图12.重组人SLC趋化人外周血淋巴细胞的显微摄影照片A为重组SLC的趋化性结果，B和C分别为空白和无关蛋白对照：pALM-SLC-SLC上清纯化产物对外周血淋巴细胞的趋化作用A.0.04μg/ml的重组SLC；B.PBS对照；C.1mg/ml BSA对照

具体实施方式

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。

本发明提供了一种重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子，它保留了人外周淋巴组织趋化性细胞因子的成熟肽部分，由大肠杆菌偏爱的密码子编码，它能特异性地与表达其天然受体CCR7的成熟T细胞结合，并能特异性地对T细胞和树突状细胞产生趋化作用。编码序列中包括编码C-myc标签序列，其中C-myc标签可以用于表达产物的检测及纯化；在各个标签序列之间以及重组趋化性细胞因子之间存在酶切位点，便于在不同载体之间移植，或者与其他导向蛋白分子融合表达。

本发明提供了两种可用于表达重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子在大肠杆菌中表达的质粒。一种质粒以pTMF为基础构建，pTMF质粒由北京安波特基因工程技术有限公司以具有T7启动子的pET28a为背景质粒，通过设计和合成一个带有多种酶切位点的DNA片段置换pET28a的多克隆位点构建而成(图3)。该质粒除了具有高效表达的特点外，还具备如下特点：具有多种较稀少的酶切位点，便于插入各种外源基因使它们或共表达或成融合蛋白表达；在两组酶切位点之间有一凝血酶的酶切位点，可将表达的融合蛋白纯化后分开；在多克隆位点的3’端有(His)6密码子，便于表达产物作金属鳌合层析纯化。在重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子基因下游融合一段人原癌基因c-myc标签序列后进行双酶切，将此片段连接到pTMF多克隆位点，这种含有人外周淋巴组织趋化性细胞因子的质粒命名为pTMF-SLC。另一种质粒以pALM为基础构建，pALM质粒由北京安波特基因工程技术有限公司以具有pL启动子的pAL-781(购自Invitrogen公司)为背景质粒，通过设计和合成一个带有多种酶切位点的DNA片段置换pAL-781的多克隆位点构建而成(图4)，为便于检测与纯化，在重组人外周淋巴组织组织趋化性细胞因子和多组氨酸标签序列之后加入c-myc标签序列，这种含有重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的质粒命名为pALM-SLC。

本发明还提供了一种含有所述表达载体的宿主细胞，所述的宿主细胞最好为大肠杆菌。

本发明还涉及一种生产重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的方法，这一方法可以归结为如下步骤：

1.按照SLC的成熟肽序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，设计10个基因片段，经体外重叠PCR扩增出可以编码SLC的完整基因。

2.将得到的SLC基因和质粒表达载体经相应的酶切后，插入多克隆位点。构建成高效表达的载体，转化宿主细胞。

3.培养转化的宿主细胞，使其表达所述的趋化因子。

4.分离纯化表达的趋化因子。

本发明生产重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的方法最好包括以下步骤：

1.依据GenBank(ACCESSION No.AB002409)提供的SLC成熟肽的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，设计出适合在大肠杆菌中表达的SLC核苷酸序列，并在其5’端加入有利于可溶表达的大肠杆菌肠毒素信号肽。将此人工设计序列拆分为10个长度为50-60个核苷酸的片段，各片段间有15-20个碱基重叠以便复性后延伸，各片段的核苷酸序列见附图1。经重叠PCR的方法用高保真热稳定DNA聚合酶pfu(购自上海博亚生物技术公司)扩增最终产生长度为405bps的全长序列，为便于连接到不同载体中，分别在编码序列上游和下游设计了含有NcoI、EcoRI或XhoI、BamHI酶切位点的接头(adaptor)序列。上述片段与载体分别经NcoI、EcoRI或XhoI、BamHI双酶切后电泳回收(上述内切酶均购自TaKaRa公司，柱离心式DNA凝胶回收试剂盒为上海华舜公司生产)，回收产物经连接反应后，热激转化相应的宿主细胞BL21(购自Invirtrogen Inc，USA)和GI724(购自Invitrogen公司)，构建成表达载体pTMF-SLC和pALM-SLC。

2.诱导pALM-SLC和pTMF-SLC表达载体的表达，挑取经测序鉴定为阳性的克隆pTMF-SLC和pALM-SLC分别在含终浓度为50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨苄青霉素的LB和RM培养基中培养过夜(LB培养基：在800ml水中加入胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母抽提物5g，固体培养基加入1.5％琼脂粉，加水定容为1L；RM培养基：在800ml水中加入Na₂HPO₄·12H₂O 15.12g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，酪蛋白酶解物20g，MgCl₂·6H₂O 0.203g，50％甘油20ml，调pH为7.0，加水定容为1L)。按1∶100转接过夜培养物，快速振荡培养至OD₆₀₀≈0.6时在pTMF-SLC培养基中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导表达，在pALM-SLC培养基中按1∶100的比例加入终浓度为100微克/毫升的色氨酸诱导表达。快速振荡培养3-4小时后离心收集菌体，用PBS洗涤后超声碎菌，12000rpm离心10分钟，分别收集超声上清和沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，初步鉴定表达产物的分子量、表达量以及表达形式，然后用Western blot的方法进一步鉴定表达产物的分子量和特异性。用培养的表达SLC受体CCR7的Jurkat细胞和人新鲜外周血提取的淋巴细胞制备细胞膜制备物，具体方法为：2000rpm离心5min收集培养的细胞，用PBS洗涤两次后加入适量PBS，选择输出功率指数为3-4，占空比为40％的条件下超声60秒，破碎细胞。12000rpm离心15min，取上清待用，或-20℃保存。以ELISA的方法检测纯化的重组SLC与Jurkat细胞以及外周血T淋巴细胞细胞膜制备物结合的特异性。

3.pTMF-SLC和pALM-SLC表达载体经诱导表达时以包含体或可溶形式存在于产物中。经包含体柱上复性的和亲和层析纯化的SLC产物分别进行趋化性测定，检测重组SLC对T淋巴细胞的趋化作用。

实施例：

实施例1.重叠PCR扩增重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子基因和构建pTMF-SLC

及pALM-SLC的方法

依据GenBank中AB002409提供的SLC成熟肽氨基酸序列，用大肠杆菌偏爱的密码子对SLC基因序列进行了重新设计，为保证合成的真实性将整个序列拆分为10个长度小于60个核苷酸的片段(附图1)，其中SLCFR1-2为附加的大肠杆菌肠毒素信号肽序列，SLCFR3-10为SLC的成熟蛋白编码区序列，在SLCFR1、SLCFR4、SLCFR5、SLCFR8和SLCFR10的上游分别设计了用于扩增的PCR引物SLCPR1～5，用于提高两两复性片段的扩增效率。单重叠延伸PCR(Single OverlappingExtension-PCR，SOE-PCR)是一种有效的基因融合方法，在拼接过程中选择“逐步延伸法”来获得全长SLC编码序列。在拼接过程中，首先将上述10个片段分成5组，分别为SLCFR1～2、SLCFR3～4、SLCFR5～6、SLCFR7～8和SLCFR9～10，在20微升的反应体系中，分别加入浓度为5pmol/μl的片段各2μl，浓度为2mM的dNTP2μl，10×PCR反应缓冲液2μl，1U pfu DNA聚合酶(购自上海博亚生物公司)，加水至总体积为20μl，在T-GRADIENT扩增仪(BIOMETRA，Germany)上按下述程序扩增，94℃变性30秒，50℃复性40秒，72℃延伸40秒，扩增20个循环。扩增结束后经2％琼脂糖凝较电泳，用柱离心DNA胶回收试剂盒(上海华舜公司)依程序回收大小为80～100bps的条带，5组回收产物分别命名为SLC-A、SLC-B、SLC-C、SLC-D和SLC-E。然后按如下体系进行下一轮扩增：

体系F：体系G：

回收的SLC-A 2μl 回收的SLC-D 2μl

回收的SLC-B 2μl 回收的SLC-E 2μl

10×PCR缓冲液 2μl 10×PCR缓冲液 2μl

dNTP 2μl dNTP 2μl

SLC-PR1 2μl SLC-PR3 2μl

SLC-PR2 2μl SLC-PR4 2μl

Pfu DNA polymerase 1U Pfu DNA polymerase 1U

H₂O 8μl H₂O 8μl

扩增体系F和体系G时首先94℃变性30秒，50℃复性40秒，72℃延伸40秒，扩增20个循环。分别电泳回收扩增产物，方法同上。回收产物命名为E和F，然后依上述方法以片段F和片段G为模板，SLC-PR1和SLC-PR4为引物扩增得到片段H，扩增程序同体系F和体系G的方法。以回收的片段H和片段E为模板，SLC-PR1和SLC-PR5为引物扩增全长SLC基因。引入适当的酶切位点，扩增产物回收后分别经双酶切(NcoI、EcoRI或者XhoI和BamHI，上述内切酶均购自TaKaRa生物(大连)公司)，体系如下：

回收的SLC基因 10μl

NcoI、EcoRI(或XhoI、BamHI)各 1μl

10×内切酶缓冲液 3μl

H₂O 16μl37℃酶切2小时，电泳回收。在10μl的连接体系中加入4μl外源片段，4μl线性化载体，1μ10×T₄DNA连接酶缓冲液和1μlT₄DNA连接酶(购自TaKaRa生物(大连)公司)。在4℃连接过夜后用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞GI724()及BL21。转化克隆至已经过双酶切线性化的表达载体pTMF和pALM中，转化后测序获得阳性克隆，分别命名为pTMF-SLC(图3)和pALM-SLC(图4)。

实施例2.重组人SLC的诱导表达和纯化

用pTMF-SLC转化BL21(购自Invirtrogen Inc，USA)，挑取经测序鉴定的阳性克隆转接在2ml含卡那霉素(30μg/ml)的LB培养基中37℃振荡培养过夜，次日按1∶100(V/V)转接快速摇至OD₆₀₀＞1，再以1∶100转接，放大培养。在37℃摇至0.D.₆₀₀≈0.6时(约3小时)加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，诱导3小时后5000rpm离心5分钟收集菌体。离心收集的菌体重悬于200ml超声缓冲液中(20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L EDTA pH8.0，0.5％ Triton X-100，pH8.0)，每50ml冰浴超声2min(粗探头，Output Control 6～8，占空比30～40％)，反复3～4次，每次间隔1～2min，然后12000rpm离心30min，收集包含体沉淀，分别电泳检测超声上清和沉淀，结果见附图5。用包含体洗涤液(50mmol/LTris-Cl，5mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，pH8.0)洗涤包含体三次，最后将包含体沉淀于-20℃冻存。裂解时将包含体溶于3ml变性缓冲液(6mol/L Guanidine Hydrochloride，50mmol/LTris-Cl8.0，250mmol/L NaCl，20mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，pH8.0)中，4℃搅拌12h。柱上复性时，首先用平衡缓冲液(1mol/L Urea，50mmol/LTris-Cl，250mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，1.25mmol/L GSH，0.25mmol/LGSSG，pH8.0)对Superdex 75 Prep Grade凝胶过滤柱进行平衡，然后将包含体裂解液12000rpm离心30min，取上清过滤，用滤液上样。接着用洗脱缓冲液(同平衡缓冲液)以0.1ml/min的流速对样品进行柱上复性，收集不同的样品峰，电泳检测(附图7)。

用pALM-SLC转化大肠杆菌GI724(购自Invitrogen公司)，挑取经测序鉴定的阳性克隆转接到2ml RM培养基中(在800ml水中加入Na₂HPO₄·12H₂O 15.12g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，酪蛋白酶解物20g，MgCl₂₍·6H₂O 0.203g，50％甘油20ml，调pH为7.0，加水定容为1L)30℃过夜培养，次日以1∶50(V/V)的比例接种于50ml RM培养基中30℃放大培养，然后以1∶50(V/V)的比例转接于2L RM培养基中，于30℃生长至OD₆₀₀＝0.5～0.7，在以1∶100的比例加入Trp于37℃诱导表达4h后，离心收集菌体。重组SLC以可溶表达为主(附图6)。诱导表达的重组SLC经亲和层析进行了纯化，经亲和层析后的样品电泳结果见附图8，由图可见，亲和层析所得的样品纯度极高，超过95％。上述纯化产物因为带有其C端带有c-myc标签序列，因此可以用9E10为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western Blot检测，结果见附图9。

实施例3.重组人SLC与Jurkat细胞及人外周血淋巴细胞膜制备物的结合活性测定

制备T淋巴细胞的裂解物，未用NP40等去污剂处理以减少干扰，T淋巴细胞选择Jurkat细胞(ATCC TIB-152)，包被及其后的实验均按标准的ELISA过程操作。具体操作：取96孔细胞板，每个孔中加入用包被液稀释的Jurkat细胞细胞膜的粗制物100μl(＞20μg/孔)，4℃包被过夜，PBS(pH7.4)洗板后加入含4％脱脂奶粉或1％BSA的PBS封闭液，37℃封闭2hr，PBS洗板三次。按不同比例稀释表达的SLC超声上清，37℃孵育1-2hr；用含0.05％吐温20的PBS洗板三次，每次1min，下同；加入鼠抗人C-myc单克隆抗体(1∶1000)孵育1-2hr，洗板；加入HRP标记的羊抗鼠抗体(1∶2500)孵育1hr以上，洗板5次，每孔加入显色液(每10ml柠檬酸缓冲液中含4mg OPD，用前加入15μl 30％ H₂O₂)15μl，避光显色至出现差异，用2N H₂SO₄终止反应，在490nm读取吸光值以鼠抗C-myc抗体为二抗，HRP-羊抗鼠IgG为三抗。纯化的重组SLC与T淋巴细胞的制备物之间有较明显的特异性结合，并表现出一定的量效关系，当浓度为50μg/ml时表现出较高的活性(附图10)。

实施例4.重组人SLC对人外周血淋巴细胞的趋化性测定

趋化因子的重要生物学功能在于可以特异性地对特定的细胞亚群产生趋化作用。在测定趋化性时，首先进行聚碳酸酯膜的预处理：在聚碳酸酯膜面向趋化物质的一面覆盖上0.5％ IV型胶原蛋白，室温下两小时，然后在双蒸水中轻轻涮洗，晾干后备用。在趋化性测定板(Neuroprobe Inc，USA)底板每孔加入160μl不同浓度的待测液及空白(磷酸缓冲液，PBS)和无关蛋白(小牛血清白蛋白，BSA)对照(样品在加之前在37℃水浴20-30分钟)，使其形成外凸弯月面，以防气泡产生；将不含PVP的聚碳酸膜(Neuroprob Inc，USA)光面向下盖在底板之上，硅胶垫片按位置盖在滤膜之上，加上上层板后将各个位置的螺母均匀拧紧，防止孔间污染。上层板各孔加满细胞液(130μl)，避免气泡，每平方毫米上细胞数量为1000左右则细胞量为10⁵个；将加了细胞的趋化性板在37℃含5％CO₂，饱和水汽二氧化碳培养箱中孵育3小时，其间上孔中的细胞经由聚碳酸膜上面向下做趋化运动。孵育结束后用吸水纸吸去上孔的培养液，松开螺丝，将趋化板翻转，提起底板，勿动滤膜，此时滤膜粘附于硅胶垫上，有迁移细胞的一面向上。取下滤膜，在清水中漂洗无迁移细胞的一面，用橡皮刷刷去未迁移细胞，不要碰到膜另侧。将滤膜的光面向上置于载玻片上，70％甲醇固定10分钟，用Baso刘氏染料(Baso Inc，Taiwan)染色，晾干后在高倍镜下进行细胞记数。

计算趋化指数(chemotactic index，CI)

综合几次实验的结果得到了重组SLC浓度与对淋巴细胞趋化指数的关系，从附图11可知，SLC对外周血淋巴细胞的最大趋化活性在0.004μg/ml-0.006μg/ml之间，重组SLC在0.04μg/ml时对外周血淋巴细胞趋化性作用的镜检结果见附图12。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

北京安波特基因工程技术有限公司

<120>重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子及其制备方法和用途

<130>I020284

<160>17

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>405

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(405)

<223>

<400>1

atg aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt tct 48

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

att gct aca aac gcg tac gct agc gat ggc ggc gcg cag gat tgc tgc 96

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

ctg aaa tat agc cag cgt aaa att ccg gcg aaa gtt gtt cgc agc tac 144

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

cgt aaa cag gaa ccg agc ctg ggc tgc agc atc ccg gcg atc ctg ttt 192

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

ctg ccg cgt aaa cgt agc cag gcg gaa ctg tgc gcc gat ccg aaa gaa 240

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

ctg tgg gtg cag cag ctg atg cag cat ctg gat aaa acc ccg agc ccg 288

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

cag aaa ccg gcg cag ggc tgc cgt aaa gat cgt ggc gcg agc aaa acc 336

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

ggc aaa aaa ggc aaa ggc agc aaa ggc tgc aaa cgt acc gaa cgt agc 384

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

cag acc ccg aaa ggc ccg tag 405

Gln Thr Pro Lys Gly Pro *

130

<210>2

<211>134

<212>PRT

<213>Artificial

<400>2

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro *

130

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>Artificial

<400>3

aaaaagaata tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttc 44

<210>4

<211>57

<212>DNA

<213>Artificial

<400>4

gcatctatgt tcgttttttc tattgctaca aacgcgtacg ctagcgatgg cggcgcg 57

<210>5

<211>54

<212>DNA

<213>Artificial

<400>5

agcgatggcg gcgcgcagga ttgctgcctg aaatatagcc agcgtaaaat tccg 54

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<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

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caggctcggt tcctgtttac ggtagctgcg aacaactttc gccggaattt tacgctggct 60

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<400>7

aaacaggaac cgagcctggg ctgcagcatc ccggcgatcc tgtttctgcc gcgtaaacgt 60

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<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

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tgcacccaca gttctttcgg atcggcgcac agttccgcct ggctacgttt acgcggcaga 60

<210>9

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<212>DNA

<213>Artificial

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cgaaagaact gtgggtgcag cagctgatgc agcatctgga taaaaccccg agcccgcag 59

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<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

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ttttgctcgc gccacgatct ttacggcagc cctgcgccgg tttctgcggg ctcggggttt 60

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<212>DNA

<213>Artificial

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cgtggcgcga gcaaaaccgg caaaaaaggc aaaggcagca aaggctgcaa acgtaccg 58

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<212>DNA

<213>Artificial

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ctacgggcct ttcggggtct ggctacgttc ggtacgtttg cagcctt 47

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<212>DNA

<213>Artificial

<400>13

ggctcgagat ggcgcagtct ctggc 25

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<211>21

<212>DNA

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caggctcggt tcctgtttac g 21

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<212>DNA

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aaacaggaac cgagcctgg 19

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ttttgctcgc gccacg 16

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<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<400>17

ccgaattcct acgggccttt cgggg 25

Claims

1.一种重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子，其氨基酸序列为SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的核苷酸序列。

3.权利要求2的核苷酸序列，其为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求2或者3所述的核苷酸序列的表达载体。

5.按照权利要求4所述的载体，它是pTMF-SLC。

6.按照权利要求4所述的载体，它是pALM-SLC。

7.一种含有权利要求4-6中任何一项所述表达载体的宿主细胞。

8.按照权利要求7所述的宿主细胞，它是大肠杆菌。

9.一种生产权利要求1的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子的方法，包括：

a.按照大肠杆菌偏爱的密码子，设计适合在大肠杆菌中表达的人外周淋巴组织趋化性细胞因子，此序列中包含有大肠杆菌肠毒素信号肽序列，

b.用重叠PCR的方法将人工合成的带有大肠杆菌外毒素信号肽序列的人外周淋巴组织趋化性细胞因子序列片段体外拼接为完整分子，插入表达载体，诱导表达，

c.分离纯化表达产物，进行此重组趋化性细胞因子与其天然受体的结合活性测定和对人外周血淋巴细胞的趋化性测定。

10.权利要求1的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

11.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其含有权利要求1的重组人外周淋巴组织趋化性细胞因子作为活性成分，以及药用载体或者赋形剂。