PL189415B1

PL189415B1 - Polipeptyd fuzyjny,izolowany polinukleotyd, sposób przygotowania polipeptydu fuzyjnego, wektor zawierający DNA kodujący polipeptyd fuzyjny, zwierzę nie będące człowiekiem posiadające zrekombinowane komórki somatyczne lub zwierzę transgeniczne, preparat farmaceutyczny zawierający polipeptyd fuzyjny oraz zastosowanie polipeptydu fuzyjnego i izolowanego polinuklotydu

Info

Publication number: PL189415B1
Application number: PL97331356A
Authority: PL
Inventors: Mary Ellen Digan; Philip Lake; Hermann Gram
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1999-01-25
Publication date: 2005-08-31
Also published as: CO4650184A1; NO323611B1; IL128094A0; JP3681402B2; CN1146664C; EP0917581A1; ID19420A; ZA976666B; PL331356A1; IL128094A; JP2000516089A; RU2209211C2; NO990328L; EP0917581B1; AU4202597A; NO990328D0; BR9710605A; ES2300114T3; NZ333908A; TR199900155T2

Abstract

1 Polipeptyd fuzyjny zawierajacy co najmniej jedna domene wiazaca immunoglobuline E (IgE) polaczo- na z co najmniej jednym skladnikiem albuminy surowicy ludzkiej (HSA), w którym domene wiazaca immuno- globuline E stanowi IgER Iub pre-IgER (SEQ.ID.NO.I), a skladnik albuminy surowicy ludzkiej stanowi HSA-I Iub HSA-II (SEQ.ID.N0.2), Iub jego sól Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równowaznik, przy czym fizjolo- gicznie funkcjonalny równowaznik stanowi wieksza czasteczka zawierajaca polipeptyd fuzyjny. 2. Polipeptyd Iub jego sól wedlug zastrz 1, znamienne tym, ze zawieraja dwie domeny wiazace IgER wraz z jednym skladnikiem HSA-II umieszczonym pomiedzy nimi, wraz z jego sekwencja liderowa (SEQ ID.NO.3) albo w postaci dojrzalej (reszty Val2 6-Leu9 78 z SEQ ID.NO 3) 4. Sposób przygotowania polipeptydu okreslonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze transformuje sie komórke gospodarza wektorem zawierajacym DNA kodujacym polipeptyd okreslony w zastrz. 1 Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równowaznik; nastepnie dokonuje sie ekspresji polipeptydu Iub jego fizjologicz- nie funkcjonalnego równowaznika w tej komórce, po czym fizjologicznie funkcjonalny równowaznik polipep- tydu jest modyfikowany do uzyskania polipeptydu fuzyjnego okreslonego w zastrz. 1; a nastepnie odzyskuje sie powstaly polipeptyd z komórki gospodarza, korzystnie w postaci jego soli, przy czym komórka gospodarza jest wybrana z grupy obejmujacej komórki eukariotyczne i prokariotyczne, a fizjologicznie funkcjonalny równowaz- nik stanowi wieksza czasteczka zawierajaca polipeptyd fuzyjny 7. Preparat farmaceutyczny zawierajacy polipeptyd fuzyjny zawierajacy co najmniej jedna domene wiazaca immunoglobuline E (IgE) polaczona z co najmniej jednym skladnikiem albuminy surowicy ludzkiej (HSA), w którym domene wiazaca immunoglobuline E stanowi IgER Iub pre-IgER (SEQ.ID.NO.I), a skladnik albuminy surowicy ludzkiej stanowi HSA-I Iub HSA-II (SEQ ID NO.2), Iub jego sól Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równowaznik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równowaznik stanowi wieksza czasteczka zawierajaca polipeptyd fuzyjny, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik Iub rozcienczalnik, korzystnie sterylny, wolny od pirogenów, farmaceutycznie dopuszczalny plyn. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd fuzyjny zawierający co najmniej jedną domenę wiążącą immunoglobulinę E (IgE) połączoną z co najmniej jednym składnikiem albuminy surowiev ludzkiej (HSA), w którym domenę wiążącą immunoglobulinę E stanowi IgE^K Iub pre-IgE* (SEQ.ED.NO.I), a składnik albuminy surowicy ludzkiej stanowi HSA-I Iub HSA-II (SEQ.ID.N0.2), Iub jego sól Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny.

Korzystnie, polipeptyd Iub jego sól zawierają dwie domeny wiążące IgE wraz z jednym składnikiem HSA-II umieszczonym pomiędzy nimi, wraz z jego sekwencją liderową (SEQ.ID.N0.3) albo w postaci dojrzałej (reszty Val26-Leu97₈ z SEQ.ID.N0.3)

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd.

189 415

Istotą wynalazku jest to, że polinukleotyd jest związkiem pośrednim w przygotowaniu polipeptydu Iub jego soli określonych w zastrz. 1, i który zawiera reszty Val26-Leu978 z SEQ.ID.NO.3

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania polipeptydu według wynalazku.

Istotą wynalazku jest to, że transformuje się komórkę gospodarza wektorem zawierającym DNA kodującym polipeptyd według wynalazku lub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik; następnie dokonuje się. ekspresji polipeptydu Iub jego fizjologicznie funkcjonalnego równoważnika w tej komórce, po czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik polipeptydu jest modyfikowany do uzyskania polipeptydu fuzyjnego według wynalazku; a następnie odzyskuje się powstały polipeptyd z komórki gospodarza, korzystnie w postaci jego soli, przy czym komórka gospodarza jest wybrana z grupy obejmującej komórki eukariotyczne i prokariotyczne, a fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający DNA kodujący polipeptyd według wynalazku Iub kodujący jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik; Iub zwierzę nie będące człowiekiem posiadające zrekombinowane komórki somatyczne; Iub zwierzę transgeniczne.

Istotą wynalazku jest to, że wektor, zwierzę nie będące człowiekiem posiadające zrekombinowane komórki somatyczne; Iub zwierzę transgeniczne wyraża polipeptyd określony według wynalazku Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku Iub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli jako leku do leczenia Iub zapobiegania chorobom, w których pośredniczy IgE Iub receptor IgE, korzystnie alergii.

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest preparat farmaceutyczny zawierający polipeptyd fuzyjny zawierający co najmniej jedną domenę wiążącą immunoglobulinę E (IgE) połączoną z co najmniej jednym składnikiem albuminy surowicy ludzkiej (HSA), w którym domenę wiążącą immunoglobulinę E stanowi IgE^R Iub pre-IgE^R (SEQ.ID.NO.l), a składnik albuminy surowicy ludzkiej stanowi HSA-I Iub HSA-II (SEQ.ID.NO.2), Iub jego sól Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik Iub rozcieńczalnik, korzystnie sterylny, wolny od pirogenów, farmaceutycznie dopuszczalny płyn.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu Iub jego soli według wynalazku w immunologicznej próbie diagnostycznej in vitro do oznaczaniu poziomu IgE Iub auto-przeciwciał na FcsRI w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta - człowieka

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku zastosowanie izolowanego polinukleotydu, który jest związkiem pośrednim w przygotowaniu polipeptydu Iub jego soli według wynalazku i który zawiera reszty Vali6-Leu978 z SEQ.ID.nO.3 do wytwarzanie leku do przeprowadzania terapii genowej, przy czym terapia genowa obejmuje modyfikowanie komórek pacjenta poprzez wprowadzenie do nich polinukleotydu kodującego polipeptyd fuzyjny według wynalazku.

Określenie „w postaci fuzji” Iub „fuzja” tu dotyczy polipeptydów, w których:

(i) dana domena funkcjonalna (np. domena wiążąca IgE) jest związana na swoim C-końcu za pomocą wiązania kowalencyjnego (korzystnie peptydowe tzn. amidowe) do N-końca innej domeny funkcjonalnej (np. składnika HSA) Iub do peptydu linkerowego, który sam jest związany wiązaniem kowalencyjnym (korzystnie peptydowym) do N-końca drugiej domeny funkcjonalnej.

(ii) dana domena funkcjonalna (np. domena wiążąca IgE) jest związana na swoim N-końcu za pomocą wiązania kowalencyjnego (korzystnie peptydowe tzn. amidowe) do albo C-końca innej domeny funkcjonalnej (np. składnika HSA) Iub do peptydu linkerowego, który sam jest związany wiązaniem kowalencyjnym (korzystnie peptydowym) do C-końca drugiej domeny funkcjonalnej.

Podobnie „w postaci fuzji” stosowane w stosunku do polinukleotydowych związków pośrednich według wynalazku oznacza, że 3' (Iub 5') koniec sekwencji nukleotydowej kodują6

189 415 cej pierwszą domenę funkcjonalną jest powiązany z odpowiednim 5' (lub 3') końcem sekwencji nukleotydowej kodującej drugą domenę funkcjonalną, albo za pomocą wiązania kowalencyjnego, albo pośrednio poprzez linker nukleotydowy, który sam jest połączony kowalencyjnie korzystnie na swoich końcach z pierwszym polinukleotydem kodującym domenę i z drugim funkcjonalnym polinukleotydem kodującym domenę.

Polipeptydy fuzyjne według wynalazku mogą też zawierać dalsze funkcjonalne domeny w dodatku do domen wiążących IgE i składników HSA np. pełnej długości Iub skrócone (np. rozpuszczalne zewnątrzkomórkowe fragmenty) białek ludzkich, takich jak cytokiny Iub N-końcowy fragment urokinazy. Te dodatkowe domeny funkcjonalne mogą same służyć jako peptyd linkerowy, na przykład dla połączenia domeny wiążącej IgE do innej domeny wiążącej IgE Iub do składnika HSA, alternatywnie mogą być one zlokalizowane gdzie indziej na cząsteczce fuzyjnej, np. na jej N- Iub C-końcu.

Przykłady polipeptydów fuzyjnych mogą być przedstawiane przez następujące wzory:

I. R1-L-R2

II. R2 -L-R1

Π1. R1-L-R2 -L-R1

IV. R1-L-R1-L-R2

V. R2-L-R i-L-R 1, w którym

Ri jest sekwencją aminokwasów domeny wiążącej IgE

R2 a jest sekwencją aminokwasów składnika HSA, każdy L jest niezależnie wiązaniem kowalencyjnym (korzystnie peptydowym) lub jest peptydowym linkerem, który jest związany przez wiązanie kowalencyjne (korzystnie peptydowe) z końcem Ri i/iub R2, przez co powyższe fragmenty cząsteczek są czytane kierunkowo, tzn. z lewą stroną odpowiadającąN-końcowi a prawą stroną C-końcowi cząsteczki.

Stwierdzono, że wiązanie IgE jest na wysokim poziomie, gdy polipeptyd fuzyjny jest prowadzony przez domeną wiążącą IgE, to znaczy gdy domena wiążąca IgE stanowi N-końcową część dojrzałego białka fuzyjnego (tak jak w związkach z wzorów l, lll i IV powyżej). Szczególne korzystną postacią wynalazku jest dimer według wzoru lll powyżej tzn. gdy obszar białkowy, który prowadzi ekspresję jest obszarem wiążącym lgE, połączonym na C-końcu z N-końcem składnika HSA, który z kolei jest sam połączony na swym C-końcu z N-końcem/drugiej domeny wiążącej lgE. Gdy jest więcej niż jedna reszta R, lub więcej niż jedna reszta R2 lub więcej niż jedna reszta L, te reszty mog^ ale nie musza. być identyczne.

SEQ.ID.NO. 1. Sekwencja aminokwasów dominującej formy o pełnej długości natywnego ludzkiego FcsRla wraz z sekwencją sygnałową.

Określenie „pre-lgE^R” dotyczy reszt Meti-Leu204 SEQ.lD.NO.1. Określenie „lgE^R” dotyczy dojrzałej formy pre-lgER i stanowi reszty Val26-Leu204 SEQ.ID.NO.1 (tzn. zewnątrzkomórkową domeną FcsRla).

SEQ.ID.N0.2. Sekwencja aminokwasów dominującej formy natywnego prepro HSA (określanego tutaj jako „prepro HSA l”) zawierające reszty Meti-Leu609·

Dominująca forma dojrzałego natywnego białka (określana tu jako „HSA l”) jest reprezentowana przez reszty Asp26-Leu204 SEQ.1D.NO.2.

Określenie „prepro-HSA M” przedstawia skrócenie natywnej sekwencji o jeden aminokwas (Leu609) na C-końcu, i dotyczy więc reszt Meti-Gly608 SEQ.ID.N0.2.

Dojrzała forma prepro-HSA ll, określana tu jako „HSA ll” jest reprezentowana przez reszty Asp25-Gly608 SEQ.lD.N0.2.

SEQ.ID.NO.3. Sekwencja aminokwasów kodowana przez fragment EcoRl plazmidu R-H-R/SK #50 przygotowana w przykładzie 5, zawierająca: sekwencję „preIgE^R” w resztach 1-204; linker Ala-Ser(Gly)4Ser (określany dalej jako „Li”) w resztach 205-211; sekwencją HSA ll w resztach 2l2-795; linker (GlyESer (określany dalej jako „L2”) w resztach 796-799, i sekwencję „lgER” w resztach 800-978.

Dojrzały dimeryczny polipeptyd fuzyjny według wynalazku określany tu jako „lgE - Li- HSA ll - L2 - lgER” lub alternatywnie jako „Dimer -HSA ll - lgER”, wyrażany z komórek CHO w sposób opisany w przykładzie 7, ma sekwencją aminokwasów Val26-Leu978 SEQ.lD.NO.3.

189 415

SEQ.ID.NO.4. Sekwencja nukleotydów fragmentu EcoRI plazmidu R-H-R/SK#50 przykładu 5, zawierająca: sekwencję polinukleotydową kodującą „pre-IgE^R” w pozycjach 10-621; oligonukleotyd kodujący L, w pozycjach 622-642; Polinukleotyd kodujący HSA II w pozycjach 643-2394; oligonukleotyd kodujący L2 w pozycjach 2395-2406; i Polinukleotyd kodujący IgE^R w pozycjach 2944-2949.

Miejsca restrykcyjne na końcach fragmentów kodujących i w obszarach linkerów są w pozycjach 1-6; 622-627; 637-642; 2387-2393; 2401-2406; i 2950-2955. Sekwencja Kozak jest w pozycjach nukleotydów 7-9.

Mutacje punktowe różniące się od sekwencji nukleotydów HSA najwyższej zgodności są w pozycjach 804, 1239, 1290, 1446, 1815, 2064 i 2079. Ponieważ mutacje punktowe są w pozycjach tolerancji nie wpływają na sekwencje aminokwasów.

SEQ.ID.NO.5. Sekwencja nukleotydów dominującej formy natywnej prepro-HSA odpowiadająca fig. 12 i sekwencji aminokwasów SEQ.ID.NO.2.

SEQ.IiD.NO.6. Sekwencja nukleotydów dominującej formy o pełnej długości natywnego ludzkiego FceRIa zawierająca sekwencję sygnałową, odpowiadająca fig. 13 i sekwencji aminokwasów SEQ.ID.NO.1.

W następujących figurach wskazane cząsteczki są czytane kierunkowo, tzn. od lewej strony odpowiadającej N (lub 5') końcowi i prawej stronie odpowiadającej C- (lub 3') końcowi.

Figura 1 A-C. Okres połowiczny w surowicy myszy: Stężenie białka in vivo (w pikomolach białka na ml surowicy) w czasie (10-800 minut po wstrzyknięciu) (A) wolnego białka HSA I (b) Białka IgE^R (określanego jako „Wolny łańcuch alfa”) i dimerycznego polipeptydu fuzyjnego IgER - L1- HSA II - L2 - IgER (określany jako dimer „IgER - HSa - IgE'”) przygotowany z komórek CHO jak opisano w przykładzie 7.

(C) Okres połowiczny wolnego HSA I z (A) porównany z okresem połowicznym dimerycznego polipeptydu fuzyjnego („IgER - HSA - IgER”) z (B) przez normalizację odnośnie stężeń surowicy w 10 minut po wstrzyknięciu.

Figura 2. Wynaczynienie wynikające z pasywnej reakcji anafilaktycznej skóry u myszy, którym podano dożylnie seryjne rozcieńczenia (10 μg/ag, 50 μg/kg, 500 μg/ag) polipeptydu IgE^R - L1- HSA II - L2 - IgE^R (dimer IgER - HSA - IgEr) przygotowanego jak opisano w przykładzie 7 (grupa kontrolna otrzymywała 10 μg/kg); powierzchnia w mm²; w okresach co 5, 15 Iub 30 minut przed uczuleniem przed śródskórny zastrzyk mysiego monoklonalnego przeciwciała IgE anty-dinitrofenylowego (DNP) i następnie podanie roztworu DNP-bydlęcej albuminy surowiczej zawierającego 1% błękitu Evansa.

Figura 3. Schematyczne przedstawienie trzech polipeptydów fuzyjnych według wynalazku (dwa monomery i jeden dimer) z także pokazanymi linkerami polipeptydowymi:

I. Monomery (1) Monomer wiodący HSA zawierający HSA II (określany na fig. jako „HSA”) połączony przez L2 („GGGS) do IgER. Nukleotydy kodujące pozycje Leu607Gly608 z HSA Π zawierają unikalne miejsce Mstll jak wskazano, i nukleotydy kodujące GlySer L2 zawierają miejsce BamHI (kodowane aminokwasy podkreślono).

(2) Monomer domeny wiążącej IgE wiodący zawierający IgER połączony na swoim C-końcu poprzez L1, (tzn. „ASGGGgS) do HSA II (określanego na fig. jako „hSa”). Oligonukleotyd kodujący L1 zawiera odpowiednio miejsce Nhel i miejsce BamHI (kodowane aminokwasy AlaSer i GlySer L1 podkreślono).

II. Dimer

........ A£,A^ amr aounoraiaoA T<tTw

............ .............

C-końcu poprzez L1 do N-końca HSA II (określanego na fig. jako „HSA”), którego C-koniec jest połączony do drugiego IgE poprzez L2 z miejscami restrykcyjnymi w kodującym polinukleotydzie jak opisano powyżej dla monomeru.

Figura 4. Primery PGR do skracania ludzkiego cDNA FceRIa pełnej długości (określany jako „cDNA receptora IgE”) aby uzyskać DNA kodujący:

189 415 (i) igER (Miejsce BamHI dodane do 5' końca dla FceRIa za pomocą nukleotydu # 18; i kodon stop i miejsca EcoRI i Sali dodane do 3' końca nici niekodującej przez oligonukleotyd # 19);

(ii) pre-IgER (oligonukleotyd #20 dodaje miejsca Sstl, EcoRI i Kozak do 5' końca nici kodującej dla FcsRIa; oligonukleotyd #31 dodaje Notl i Nhel (i deletuje drugie miejsce Nhel) w niekodującej nici dla FcsRIa);

(iii) pre-IgE^R (oligonukleotydy#20 i #19 stosowane jak opisano powyżej):

(A) „HSA-wiodący”: subklonowanie (i) powyżej do wektora SK, co daje klon wektora TA pEKl stosowany w konstrukcji wiodącego monomeru HSA II;

(B) „IgER-wiodący”: subklonowanie (ii) do wektora SK, co daje konstrukt IgER/TA#1 stosowany w konstrukcji wiodącego monomeru IgE^K;

(C) „IgER-sam”: subklonowanie (iii) do wektora SK, co daje konstrukt IgER FL/TA#34 stosowany w ekspresji dojrzałego IgER do stosowania jako wzorzec.

Podwójne asteryski oznaczają dwa kodony stop.

Figura 5. Pary primerów do PCR stosowane do skrócenia pełnej długości ludzkiego cDNA prepro-HSA w celu uzyskania cDNA kodującego:

(i) prepro-HSA Π połączony na C-końcu z L?

(oligonukleotyd #24 dodaje Spel, EcoRI i sekwencję Kozak do 5' końca nici kodującej; oligonukleotyd #28 i #29 dodają linker kodujący miejsca Mstlł i Hindlll na 3' końcu HSA II);

(ii) L1 połączony z 5' końcem HSA II (oligonukleotyd #26 dodaje Notl, Nhel, linker i miejsce BamHI do nici kodującej; oligonukleotyd #27 zawiera miejsce Notl w nici niekodującej);

(iii) prepro-HSA I (oligonukleotyd #24 stosowany jak wyżej; i oligonukleotyd #25 dodaje stop i miejsca EcoRI i Hindlll do 3' końca nici niekodującej);

(A) „HSA-wiodący”: subklonowanie (i) do wektora SK, dające pEK7 stosowane do konstrukcji monomeru wiodącego HSA II;

(B) „IgER-wiodący”: subklonowanie (ii) do wektora SK, dające HSA/SK#5 stosowane do konstrukcji monomeru wiodącego IgER.

(C) „HSA-sam”: subklonowanie (iii) do wektora SK, dające HSA/SK#17 kodujący dojrzałe białko albuminy surowicy ludzkiej do stosowania jako standard.

Figura 6. Oligonukleotydy do sekwencjonowania albuminy surowicy ludzkiej (HSA) #1-10, 12, 16, 17, 22 i 30 stosowane do sekwencjonowania materiałów sklonowanych w TA i po połączeniu z fragmentami wiążącymi IgE.

Figura 7. Oligonukleotydy do sekwencjonowania receptora IgE #11, 13 i 23 stosowane do sekwencjonowania fragmentów sklonowanych w TA i po połączeniu ze składnikami HSA,

Figura 8.

(A) Mutagenne oligonukleotydy #14 i #15 do albuminy surowicy ludzkiej;

(B) Oligonukleotydy do PCR i linkerów #18-20, 24-29 i 31 do konstrukcji polipeptydów fuzyjnych.

Figura 9. Konstrukcja wektora HSA-IgER/SK#49 zawierającego polnukleotyd kodujący prepro-HSA II (określany na fig. jako „HSA”) połączony na 3' końcu poprzez oligonukleotyd kodujący linker L2 (reprezentowany na fig. 9 przez „GGG”) do 5' końca polinukleotydu kodującego IgER (określany w fig. 9 jako „IgER”) przez ligację fragmentu BamHI, Sali pEKl z pEK7 przeciętym BamHI-Sall.

Figura 10. Konstrukcja wektora IgER-HSA/SK#l zawierającego Polinukleotyd kodujący pre-IgE^R (określany na fig. jako „IgER”) połączony na 3' końcu poprzez oligonukleotyd dla linkera L1 (reprezentowany przez „GGG”) do 5' końca polinukleotydu kodującego HSA II („HSA”) przez ligację fragmentu Sstl, Nhel z IgER/TA#l do HSA/SK#5 przeciętym Sstl, Nhel.

Figura 11. Konstrukcja wektora HSA-IgER Pst Sal/SK#37 zawierającego Polinukleotyd kodujący HSA II (określany jako „HSA3”) połączony na 3' końcu poprzez oligonukleotyd dla L2 (nie pokazany) do 5' końca polinukleotydu kodującego IgER (określany jako „IgER”) przez ligację fragmentu Pstl, Sali HSA-IgER/SK#49 do wektora SK. Pokazana jest też konstrukcja

189 415 wektora R-H-R/SK#50 zawierającego polinukleotyd kodujący pre-IgE^R (określany jako „IgER”) połączony na swoim 3' końcu poprzez oligonukleotyd dla linkera Li (nie pokazany) do 5' końca polinukleotydu kodującego HSA II („HSA”), który z kolei jest połączony poprzez oligonukleotyd dla L2 (nie pokazany) do 5' polinukleotydu kodującego Igi. („IgER”). Wektor jest przygotowany przez ligację fragmentu Pstl, KpnI HSA-IgER Pst Sal/SK#37 do IgERHSA/SK#1 przeciętego Pstl, KpnI.

Figura 12. Sekwencja nukleotydową albuminy surowicy ludzkiej i sekwencja aminokwasów odpowiadająca SEQ. ID.NO. 2 i SEQ.ID.n0.5.

Figura 13. Sekwencja nukleotydową IgE^R i sekwencja aminokwasów odpowiadająca SEQ.ID.NO.1 i SEQ.ID.N0.6.

Figura 14. Sekwencja nukleotydową i aminokwasów fragmentu EcoRI R-H-R/SK#50 odpowiadająca SEQ.ID.NO.3 i SEQ.ID.NO.4 kodująca dimeryczne białka fuzyjne R1-HSA-R1. Sekwencja HSA jest oznaczona kursywą. Sekwencje linkera oznaczono małymi literami. Mutacje punktowe różniące się od sekwencji najwyższej zgodności pokazane są wytłuszczonymi małymi literami. Ponieważ mutacje punktowe są w pozycji tolerancji, nie wpływają na sekwencje, aminokwasów. Miejsca restrykcyjne na końcach fragmentów i obszaru linkera podkreślono.

Figura 15. Dojrzałe polipeptydy fuzyjne z przykładu 7 oczyszczone na SDS-PAGE:

Całkowite ilości nałożone na żel: 8 pg (ścieżka 1), 6 pg (ścieżka 2), 4 pg (ścieżka 3) i 2 pg (ścieżka 4); standardy masy cząsteczkowej 97400, 66200, 45000, 31000, 21500 i 14400 (ścieżka 5).

Określenie „domena wiążąca IgE” dotyczy sekwencji aminokwasów zdolnej do wiązania Iub w inny sposób łączenia się z IgE ssaka, np. człowieka, w sposób zapobiegający wiązaniu IgE z jego receptorem FcsRI.

cDNA i wydedukowaną sekwencja ludzkiego FcsRIa są znane (J. Kochan i wsp., Nucleic Acids Research 16 (1988) 3584 i Leder i wsp., USP 4'962'035). Ludzki FceRIa koduje N-końcowy peptyd sygnałowy (reszty aminokwasów (wraz z pierwszą Met) Motl-Ala25), dwie podobne do immunoglobuliny domeny zewnątrzkomórkowe (reszty Val26-Leu204) i hydrofobowy obszar transmembranowy (Gln205-Ile224) i hydrofilowy ogon cytoplazmatyczny (reszty Ser225-Asn257) (w odniesieniu do SEQ.ID.NO.1). Peptyd sygnałowy jest przecinany w czasie obróbki wewnątrzkomórkowej. Pełna sekwencja aminokwasów dominującej formy natywnego ludzkiego FcsRIa jest tu włączona jako SEQ.ID.NO.1.

„IgE^K” dotyczy tu sekwencji aminokwasów Val26-Leu2o4 SEQ.ID.NO.1 (kodująca domenę zewnątrzkomórkową) i określenie „pre-IgER” dotyczy reszt Meti-Leu204 SEQ.ID.NO.1 (kodujące sekwencje sygnałową powyżej domeny zewnątrzkomórkowej).

Domena wiążąca IgE to na przykład sekwencja aminokwasów mająca przynajmniej 80%, bardziej korzystnie przynajmniej 85%, bardziej korzystnie przynajmniej 95% Iub najbardziej korzystnie przynajmniej 99% homologii do IgER jak opisano powyżej (homologia jest liczona jako % identyczności między sekwencją natywną i sekwencją zmienioną jako funkcja całkowitej długości sekwencji natywnej cząsteczki, po uliniowaniu cząsteczek i wprowadzaniu przerw, jeżeli to jest konieczne, aby uzyskać maksymalny procent identyczności sekwencji).

W grupie polipeptydów fuzyjnych według wynalazku składnik wiążący domeną IgE jest (Xa) gdzie (Xa) oznacza:

(a) IgER; lub (b) naturalnie występujący allel IgE , Iub (c) formę (a) Iub (b) skróconą na C-końcu o 1-12 aminokwasów (np. 1-10, 1-7 Iub 1-4); Iub (d) wariant (a), (b) Iub (c).

189 415

Przez „wariant” rozumie się:

- sekwencję (a), (b) Iub (c) zmodyfikowaną przez jedną Iub więcej delecji (które są inne niż skrócenia na C-końcu) do 10 aminokwasów (np. 1-7 Iub 1-5);

- insercję łącznie do 10 aminokwasów (np. 1-5) wewnętrznie w obrębie sekwencji aminokwasów Iub łącznie do 100 aminokwasów na do wolnym końcu; Iub

- konserwatywne podstawienia łącznie do 15 (np. 1-5) aminokwasów.

Domeną wiążącą IgE jest bardziej korzystnie (Xb) gdzie (Xb) oznacza:

(a) IgER;

(b) IgE skróconą na C-końcu o 1-7 aminokwasów; Iub (c) wariant (a) Iub (b).

Domeną wiążącą IgE jest jeszcze bardziej korzystnie (Xc) gdzie (Xc) jest:

(a) IgER Iub (b) IgE skróconą na C-końcu o 1-7 aminokwasów (np, sekwencja Vali6-Alai97 w odniesieniu doSEQ.ID.NO. 1.

(c) wariant (a) Iub (b).

Domeną wiążącą IgE jest najbardziej korzystnie IgER.

Korzystnie dowolny homolog, skrócona wersja Iub wariant jest przygotowywany za pomocą rekombinacji jako „wydzielany” polipeptyd, to znaczy dojrzała sekwencja kodująca domenę wiążącą IgE może być wydzielana z komórki gospodarza, w której ona (Iub forma prekursora taka jak forma pre-) jest syntetyzowana z polinukleotydu.

Drugi główny składnik zrekombinowanych fuzji według wynalazku, albumina surowicy ludzkiej (HSA) stasiowi najbardziej liczne białka plazmy, stanowiąc 60% (wag) całkowitej zawartości białek osocza. Cząsteczka albuminy ludzkiej surowicy składa się z pojedynczego nieglikozylowanego łańcucha polipeptydowego złożonego z 585 aminokwasów o masie cząsteczkowej 66500. Cechą specyficzną dla albuminy jest jej wzór złożonych wiązań dwusiarczkowych (F.F. Clerc i wsp., J. Chromatogr. 662 (1994) 245-259). Albumina surowicy ludzkiej jest szeroko rozpowszechniona w ciele, w szczególności w przedziałach gdzie bierze udział, jako najczęstsze białko surowicy, w utrzymaniu osmolarności i objętości osocza. Co więcej, jest wolno usuwana przez wątrobę i wykazuje okres połowiczny około 14-20 dni u ludzi (T.A. Waldmann, Albumin Structure. Function and Uses. Pergamon Press (1977) 255-275). Albumina surowicy ludzkiej nie posiada funkcji enzymatycznej ani immunologicznej. Jest naturalnym nośnikiem biorącym udział w endogennym transporcie i dostarczaniu różnych naturalnych jak i terapeutycznych cząsteczek (H. Lu i wsp., FEBS Lett. 356 (1994) 56-59; WO 93/15199; EP 648499; P. Yeh i wsp., PNAS USA 89 (1992) 1904-1908; EP 413622). _ ,

Ludzkie komórki syntetyzują albuminę surowicy najpierw w postaci prepro polipeptydu. Sekwencja sygnałowa 18 aminokwasów (w tym pierwsza Met) jest usuwana, gdy białko przechodzi przez światło retikulum endoplazmatycznego, pozostawiając nadal 6 aminokwasów na N-końcu (w głównej postaci Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg), które są następnie usuwane proteolitycznie w czasie Iub tuż po transporcie przez aparat wydzielniczy.

Dobrze wiadomo, ze albumina surowicy ludzkiej jest polimorficzna (D.C. Carter i J.X. Ho, Adv. Prot. Chem. 45 (1994) 153-203). Na przykład albumina Naskapi ma Lys37i na miejsce Glu372 a proalbumina Christchurch ma zmienioną pro sekwencję tzn. GIun zamiast Argi4 (Lang i wsp. USP5'100784).

189 415

Całkowita sekwencja aminokwasów dominującej formy naturalnie występującego białka określana tu jako („prepro-HSA I”) jest znana (A. Dugaiczyk i wsp., PNAS USA 79 (1982) 71-75) (SEQ.ID.N0.2). Dominująca forma dojrzałego białka („HSA I”) jest reprezentowana przez Asp25-Leu609 SEQ.ID.N0.2.

Nośnik HSA polipeptydu fuzyjnego według wynalazku może być sekwencja aminokwasów mającą przynajmniej 80%, bardziej korzystnie przynajmniej 85%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 95%, i najbardziej korzystnie przynajmniej 99% homologii z resztami 25-609 SEQ.ID.N0.2 (tzn. HSA I) (homologia jest liczona jako % identyczności między natywną sekwencją i zmienioną sekwencją, jako funkcja całkowitej długości sekwencji cząsteczki natywnej, po uliniowaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli jest to konieczne, aby uzyskać maksymalny procent identyczności sekwencji).

W podgrupie polipeptydów fuzyjnych według wynalazku składnik HSA jest (Ya) gdzie (Ya) oznacza:

(a) HSA I: lub (b) naturalnie występujący allel (a); lub (c) skróconą wersją na C-końcu o 1-10 (np. 1-5 lub 1 lub 2) aminokwasów wersja (a) lub (b); lub (d) skróconą wersję (a) kończącą się na reszcie aminokwasowej n, gdzie n oznacza 369 do 419 i szczególnie gdy n oznacza 373, 387, 388, 389, 390 i 407 (jak opisano w USP 538(0712) lub (e) wariant (a), (b), (c) lub (d).

Przez „wariant” rozumie się:

- sekwencję (a), (b), (c) lub (d) zmodyfikowaną przez jedną lub więcej delecji (które są inne niż skrócenia na C-końcu) do 10 aminokwasów (np. 1-7 lub 1-5);

- insercję łącznie do 10 aminokwasów (np. 1-5) wewnętrznie w obrębie sekwencji aminokwasów lub łącznie do 100 aminokwasów na dowolnym końcu; lub

- konserwatywne podstawienia łącznie do 15 (np. 1-5) aminokwasów.

Składnik HSA I jest bardziej korzystnie (Yb) gdzie (Yb) oznacza:

(a) HSA I: lub (b) naturalnie występujący allel (a); lub (c) wersję skróconą na C-końcu o 1-10 (np. 1-5 lub 1 lub 2) aminokwasów wersją (a) lub (b); lub (d) wariant (a), (b), lub (c).

Składnik HSA I jest jeszcze bardziej korzystnie (Yc) gdzie (Yc) oznacza:

(a) HSA I: lub (b) naturalnie występujący allel (a); lub (c) skróconą na C-końcu o 1-10 (np. 1) aminokwasów wersję HSA I; (przykładem takiego skrócenia jest „HSA Π”, który jest sekwencją aminokwasów reprezentowaną przez Asp25-Gly608 SeQ.ID.N0.2.)

W jeszcze bardziej korzystnej podgrupie, składnik HSA jest HSA I lub HSA II, szczególnie HSA II.

189 415

Szczególnie korzystny jest polipeptyd fuzyjny z przykładu 7, szczególnie bez sekwencji liderowej, tzn. polipeptyd Val26-Leu97g SEq.ID.N0.3.

Korzystnie, dowolny homolog, skrócona wersja Iub wariant natywnego HSA, który jest stosowany do przygotowania białka fuzyjnego według wynalazku będzie pozbawiony funkcji enzymatycznej; i nie będzie zapobiegać Iub hamować wiązania domeny wiążącej IgE do surowicy IgE. Jest również korzystne, żeby taki dowolny homolog czy wariant miał okres połowiczny w surowicy przynajmniej 14 dni.

Odnośnie domeny wiążącej IgE albo składnika HSA określenie „konserwatywne podstawienia” dotyczy zastąpienia jednego Iub więcej aminokwasów przez inne mające podobne właściwości tak, że oczekuje się, że przynajmniej struktura drugorzędową i korzystnie trzeciorzędowa struktura polipeptydu pozostanie zasadniczo niezmieniona. Na przykład takie typowe podstawienia obejmują alaninę Iub walinę za glicyną, asparginę za glutaminę, serynę za treoninę i argininą za lizynę. Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny) są korzystnie naturalnie występującymi L-aminokwasami.

Korzystnie każda domena wiążąca IgE jest przynajmniej w 95% homologiczna do IgE^Ri każdy składnik HSA jest przynajmniej 95% homologiczny do HSA I. W innych korzystnych podgrupach:

- każda domena wiążąca IgE oznacza korzystnie (Xa) i każdy składnik HSA oznacza (Ya), Iub bardziej korzystnie (Yb) Iub jeszcze bardziej korzystnie (Yc) jak zdefiniowano powyżej;

- każda domena wiążąca IgE oznacza bardziej korzystnie (Xb) i każdy składnik HSA oznacza (Ya), Iub bardziej korzystnie (Yb) Iub jeszcze bardziej korzystnie (Yc) jak zdefiniowano powyżej;

- każda domena wiążąca IgE oznacza jeszcze bardziej korzystnie (Xc) i każdy składnik HSA oznacza (Ya), Iub bardziej korzystnie (Yb) Iub jeszcze bardziej korzystnie (Yc).

W dalszej korzystnej postaci domena wiążąca IgE jest IgER i każdy składnik HSA oznacza (Ya), Iub bardziej korzystnie (Yb) Iub jeszcze bardziej korzystnie (Yc) jak zdefiniowano powyżej, i jest najbardziej korzystnie HSA I Iub HSA II, szczególnie HSA II.

Preferencje wyrażone powyżej także stosują się w szczególności do polipeptydów każdego z wzorów I, II, III, IV i V tu podanych.

Korzystne polipeptydy według wynalazku to te zawierające pierwszą cząsteczkę IgER, która jest połączona przez swój C-koniec do N-końca cząsteczki HSA II, który to HSA II jest połączony na swoim C-końcu do N-końca drugiej cząsteczki IgER (IgER to reszty Val26-Leu204 SEQ.ID.NO.1; i HSA II to reszty Asp25-Gly608 SEQ.ID.N0.2).

Szczególnie korzystne polipeptydy według wynalazku zawierają dimery o wzorze III podanym wyżej gdzie każdy R1 jest IgER i R2 jest HSA II. Szczególnie korzystne są dimery według wzoru III gdzie każdy 1 to 1-25 aminokwasów.

Dowolny linker peptydowy (określany jako „L” w podanych tu wzorach I-V) korzystnie pozwala na niezależne zwijanie i aktywność domen wiążących IgE; jest wolny od skłonności do tworzenia ułożonej struktury drugorzędowej, która mogłaby interferować z domeną wiążącą IgE Iub powodować reakcje, immunologiczną u pacjenta i ma minimalne cechy hydrofobowości Iub ładunku, które mogłyby oddziaływać z domeną wiążącą IgE.

Linker peptydowy ma korzystnie 1-500 aminokwasów, bardziej korzystnie 1-250; i jeszcze bardziej korzystnie 1-100 (np. 1-25, 1-10, 1-7 Iub 1-4). Linker jest korzystnie liniowy tzn. nierozgałęziony. Na ogół oczekuje się, że linkery zawierające Gly, Ala i Ser spełnią wymagania w stosunku do linkera. Na przykład linkery według niniejszego wynalazku obejmują GlyGlyGlySer (tutaj „L1”) i AlaSerGlyGlyGlyGlySer (tutaj „L2”). Mogą też być stosowane linkery o różnych innych długościach i sekwencji.

Wynalazek także obejmuje oligonukleotydy kodujące peptydowe linkery według wynalazku. Takie oligonukleotydy powinny być połączone w fazie z polinukleotydami kodującymi domenę wiążącą IgE i składnikiem HSA i korzystnie zawierać miejsca restrykcyjne unikalne dla cząsteczki. Przez „połączone w fazie” rozumie się, że:

(1) Nie ma przesunięcia w ramce odczytu domeny wiążącej IgE Iub składnika HSA spowodowanej przez oligonukleotyd linkera; i

189 415 (2) nie ma i rransaacji pomiędzy ramkami odczytu domeny wiążącej IgE i składnika HSA.

Wynalazek dalej obejmuje fizjologicznie czynne ekwiwalenty nowych polipeptydów fuzyjnych, które są normalnie pośrednikami w syntezie nowych polipeptydów. Określenie „fizjologicznie funkcjonalnie ekwiwalentne” korzystnie dotyczy większej cząsteczki zawierającej polipeptyd fuzyjny według wynalazku, do którego dodano taką sekwencję aminokwasów jaka jest konieczna lub pożądana dla skutecznej ekspresji i wydzielania dojrzałego zrekombinowanego polipeptydu fuzyjnego według wynalazku z danej komórki gospodarza. Taka dodana sekwencja jest typowo na N-końcu dojrzałego polipeptydu i na ogół stanowi sekwencję lidera (tzn. sygnałową), która służy do kierowania ich do szlaku wydzielniczego, i jest normalnie odcinana w czasie lub przed wydzielaniem polipeptydu z komórki. Sekwencja sygnałowa może pochodzić z naturalnego obszaru N-końcowego odpowiedniego polipeptydu lub może być uzyskana z genów gospodarza kodujących wydzielane białka lub może pochodzić z dowolnej sekwencji, o której wiadomo, że zwiększa wydzielanie interesującego polipeptydu w tym sekwencji syntetycznych i wszystkich kombinacji między regionami „pre” i „pro”. Styk między sekwencja sygnałową i sekwencją kodującą dojrzałego peptydu powinien odpowiadać miejscu przecięcia u gospodarza.

W polipeptydach fuzyjnych, w których domena wiążąca lgE „rozpoczyna” ekspresję tzn. lezy powyżej innych sekwencji kodujących w cząsteczce fuzyjnej, jest wygodne stosowanie sekwencji liderowej naturalnego ludzkiego FcaRIa (tzn. Meti + Ala2-Ala25 SEQ.lD.NO.l) i było to skutecznie stosowane, aby uzyskać dojrzały polipeptyd z układów ekspresyjnych pochodzących od ssaków (np. CHO, COS) jak i z drożdży (Pichia pastoris).

Przykładem fizjologicznie czynnego ekwiwalentu dojrzałego dimerycznego polipeptydu fuzyjnego lgER- Li - HSA Π - L2 - lgER jest pre-lgER - Li - HSA ll - L2 - lgER. Jednak dodatkowa sekwencja liderowa niekoniecznie musi pochodzić z ludzkiego FcaRIa i może być uzyskana z dowolnego odpowiedniego źródła o ile jest ono odpowiednie aby uzyskać ekspresję/wydzielanie dojrzałego polipeptydu z komórki danego gospodarza. Na przykład preprosekwencja HSA powyżej może być użyta do przygotowania powyższych dimerycznych polipeptydów fuzyjnych, w szczególności dla ekspresji w drożdżach.

W polipeptydach fuzyjnych według wynalazku gdzie składnik HSA rozpoczyna ekspresję, odpowiednia sekwencja lidera może zawierać natywne sekwencje lidera. Na przykład natywny region prepro HSA może być stosowany aby uzyskać wydzielanie dojrzałego heterologicznego polipeptydu z komórek ssaków (np. CHO, COS) lub drożdży (Pienia pastoris).

Przykładem fizjologicznie funkcjonalnego ekwiwalentu dojrzałego polipeptydu fuzyjnego reprezentowanego przez HSA ll - L2 - lgE^R jest prepro HSA 13 - L2 - lgE . Jednak inne sekwencje liderowe, niekoniecznie z natywnego HSA lub z komórki gospodarza mogą dostarczyć skuteczną ekspresję dojrzałego białka fuzyjnego u niektórych gospodarzy (USP 5'100'784; USP 5'330'901).

Wynalazek obejmuje także polinukleotydy, które są pośrednikami w przygotowaniu zrekombinowanych polipeptydów fuzyjnych według wynalazku w tym polinukleotydów kodujących polipeptydy fuzyjne lub ich fizjologicznie funkcjonalnie ekwiwalenty i oligonukleotydy kodujące peptydy linkerowe, np. jak przedstawiono na fig. 8.

Jako dalszy aspekt dostarczony jest sposób przygotowania zrekombinowanego polipeptydu fuzyjnego jak określono powyżej lub jego soli, który obejmuje:

(a) transformację komórki gospodarza wektorem zawierającym DNA kodującym polipeptyd fuzyjny jak zdefiniowano powyżej lub jego fizjologicznie funkcjonalny ekwiwalent;

(b) ekspresję polipeptydu fuzyjnego lub jego fizjologicznie funkcjonalnego ekwiwalentu w tej komórce, przez co fizjologicznie funkcjonalny ekwiwalentny polipeptyd jest modyfikowany (np. przez rozcięcie sekwencji sygnałowej) aby uzyskać polipeptyd fuzyjny jak zdefiniowano powyżej; i (c) odzyskanie powstałego polipeptydu z komórki gospodarza, korzystnie jako wydzielany produkt, dowolnie w postaci jego soli.

Jeszcze następny aspekt mniejszego wynalazku dostarcza wektory, korzystnie plazmidy, do stosowania w ekspresji polipeptydów fuzyjnych. Te wektory zawierają DNA kodujący po14

189 415 linukleotydy zdefiniowane powyżej Iub ich fizjologicznie funkcjonalne ekwiwalenty. Na ogół, odpowiednie wektory, które mogą transformować mikroorganizmy zdolne do ekspresji polipeptydów fuzyjnych obejmują wektory ekspresyjne zawierające sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy fuzyjne, połączone z sekwencjami regulatorowymi transkrypcji i translacji, takimi jak promotory, które razem stanowią kasetę ekspresyjną. Promotory mogą pochodzić z genów danego stosowanego gospodarza, Iub takie obszary regulacyjne mogą być modyfikowane na przykład za pomocą ukierunkowanej mutagenezy in vitro, przez wprowadzenie dodatkowych elementów regulatorowych Iub sekwencji syntetycznych. Tak więc, kaseta ekspresyjna stosowana konkretnie w niniejszym wynalazku także zawiera region terminacji transkrypcji i translacji, który działa w przewidzianym gospodarzu i który jest umieszczony na 3' końcu sekwencji kodującej hybrydową makrocząsteczką. Oprócz kasety ekspresyjnej wektor będzie zawierał jeden Iub kilka markerów pozwalających na selekcję transformowanego gospodarza. Takie markery obejmują markery nadające oporność na antybiotyki takie jak G418. Te geny oporności będą umieszczone pod kontrolą odpowiednich sygnałów transkrypcji i translacji pozwalających na ekspresję w danym gospodarzu.

Bardziej szczegółowo, przygotowanie zrekombinowanych polipeptydów fuzyjnych według wynalazku może być przeprowadzone w sposób następujący:

A. Konstrukcja wektorów do ekspresji białek fuzyjnych

Pierwszym krokiem w konstrukcji zrekombinowanych polipeptydów fuzyjnych jest subklonowanie części polipeptydów fuzyjnych w wektorach do klonowania. W tym znaczeniu „wektor do klonowania” to cząsteczka DNA, taka jak plazmid, cosmid Iub bakteriofag, która jest zdolna do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza prokariotycznego. Wektory do klonowania typowo zawierają jedno Iub niewielką ilość miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne, w które obce sekwencje DNA mogą być wstawione w określony sposób bez utraty istotnych funkcji biologicznych wektora, jak i gen markera, który jest odpowiedni do stosowania w identyfikacji i selekcji komórek przetransformowanych wektorem do klonowania. Geny markerów typowo obejmują geny, które zapewniają oporność na tetracyklinę Iub oporność na ampicyliną. Odpowiednie wektory do klonowania są opisane w J. Sambrook i wsp. (red) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 wydanie (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) i mogą być uzyskane na przykład z różnych źródeł.

Klon cDNA FcsRla pGEM-3-110B-l jest opisany w A. Shimizu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 1907-1911 i może być uzyskany od American Type Tissue Collection (ATCC stock #67566). Jednoniciowy cDNA z wątroby ludzkiej może być otrzymany od Clontech (PCRready Quick Clone cDNA, Cat. D#7113-1). Sekwencja HSA jest dostępna od GenBank pod numerami dostępu: V0095, J00078, 1.00132, L00133. cDNA HSA może być uzyskany za pomocą amplifikacji stosując oligonukleotydy #24 i 25 jak opisano w przykładzie 2.

Polinukleotyd kodujący odpowiednią domenę wiążącą IgE Iub DNA składnika HSA może być przygotowany stosując reakcją łańcuchową polimerazy (PGR). PGR stosuje jednoniciową matrycą cDNA i mieszaninę primerów oligonukleotydowych. Procedura PCR jest wykonywana stosując dobrze znane metody (np. patrz C.R.M. Bangam: „The Polymerase Chain Reaction: Getting Started” w Protocols in Human Molecular Genetics. Human Press (1991) Rozdz. 1, str. 1-8). Zestawy PCR i materiał do stosowania w zestawach są dostępne handlowo z wielu źródeł. Zestawy i sposoby ich stosowania są dalej opisane w np. USP 5'487'993.)

Sekwencje DNA kodujące peptydy sygnałowe mogą być dodane za pomocą PCR Iub, jeśli jest to konieczne stosując syntetyczne oligonukleotydy, które kodują znane sekwencje

.........

oy^UcuAjyw . υνκwviivjv i/nn n.uuujc[vv πνινιviv^ivzaij ρνρι^νΛ oąouuAiu^- nowane w fazie z sekwencjami DNA kodującymi N-koniec polipeptydu fuzyjnego.

Fuzja polinukleotydów może być uzyskana przez subklonowanie w pośrednich wektorach. Alternatywnie jeden gen może być wklonowany bezpośrednio do wektora zawierającego drugi gen. Linkery i adaptory mogą być użyte do połączenia sekwencji DNA.

Subklonowanie przeprowadza się według konwencjonalnych technik takich jak stosowanie trawienia enzymami restrykcyjnymi aby dostarczyć odpowiednie końce, stosowanie traktowania alkaliczną fosfatazą aby zapobiec niepożądanemu łączeniu się cząsteczek DNA

189 415 i ligacja za pomocą odpowiednich ligaz. Techniki do manipulacji są opisane w literaturze i są znane w dziedzinie.

B. Klonowanie ekspressyne polipeptydów ifizvinych

Sklonowane białko fuzyjne następnie odcina się z wektora do klonowania i wstawia do wektora ekspresyjnego. Odpowiednie wektory ekspresyjne typowo zawierają (1) elementy proknriotycvnsgo DNA kodujące origin replikacji bakterii i marker oporności na antybiotyk, aby zapewnić wzrost i selekcję wektora ekspresyjnego w gospodarzu bakteryjnym;

(2) elementy eukariotycznego DNA, które kontrolują inicjację transkrypcji takie jak promotor; i (3) elementy DNA, które kontrolują obróbką iranskty-Otów takie jak sekwencje terminacji trayskrypcji/poliadsnylacji.

Tak więc, inny aspekt mniejszego wynalazku dotyczy wektorów, korzystnie wektorów plazmidowych, do stosowania w ekspresji polipeptcóów fuzyjnych według wynalazku, które zawierają opisane tu sekwencje poliyukleotydowe, które kodują polipeotydy fuzyjne według wynalazku. Odpowiednie wektory ekspresyjne, które mogą transformować komórki orokariotyczye Iub eukariotyczne obejmują wektory ekspresyjne zawierające sekwencje yukleotydowe kodujące cząsteczki fuzyjne połączone z sekwencjami regulującymi transkrypcją i translacją, które są wybrane w zależności do komórek gospodarza. Dla ekspresji w E. coli mogą być stosowane wektory takie jak opisali M.W. Robertson J. Biol. Chem. 268 (1993) 12736-12743. Oczekuje się, że produkt będzie miał wiązania dwusiaΓcvkows, ale nie będzie glikozylowany. Do ekspresji w drożdżach może być stosowany taki wektor ekspresyjny taki jak pHIL-D2 dostarczany z zestawem Iyvitrogsy (San Diego, CA., USA) do ekspresji w Pichia pastoris (katalog #K1710-01). Oczekuje się, że produkt białkowy będzie posiadał wiązania dwusiarczkowe i będzie glikovylowayy. Inne odpowiednie układy drozdżowe obejmują Saccharomyces hersvisiae i Klucyeromyhss lactis. Dla ekspresji w bahulowIrusαhh, pożyteczne do infekcji komórek owada są wektory takie jak pAC360, pVL1392 i pVL1393 (Imdtrogen, San Diego, USA) oczekuje się, że będzie wydzielany glikozylowany produkt z wiązaniami dwusiarczkowymi.

Poliepeptyó fuzyjny według wynalazku jest normalnie glikoproteiną, szczególnie gdy jest wyrażany w komórkach ssaków i wynalazek obejmuje polipeptydy fuzyjys w każdym stanie glikozylacji i mostków dwusiarczkowych. W szczególności analiza mutacyjna sugeruje, ze N-glikozylacja w pierwszej, drugiej i siódmej pozycji miejsc N-glikozylacji łańcucha a receptora IgE (A. Shimizu i wsp., PNAS USA 85 (1988) 1907-1911, fig. 2) (odpowiada to resztom aminokwasów 46, 67 i 191 SEQ.ID.NO.ł) sprzyja aktywności biologicznej cząsteczki IgER i monomerów i dimerów, które ją zawierają. Najbardziej korzystny układ ekspresji to taki, w którym dowolne dodane cukry będą najbardziej podobne do występujących w natywnej cząsteczce, z której pochodzi oolipsptyó. Wiadomo, że komórki drożdży i owadów modyfikują glikoorotsiyy inaczej niż komórki ssaków, podczas gdy E. coli nie dodaje reszt cukrów po wydzieleniu. Tak więc choć ekspresja z każdego z tych systemów może dać produkt, który jest uzyteczny do zastosowania diagnostycznego (np. wykrywania stanu alergicznego) najbardziej korzystna postać do wyrażania tego produktu do stosowania jako cząsteczki terapeutycznej to ekspresja w komórkach ssaków Iub być może ekspresja w mleku transgenicznych ssaków.

Do ekspresji w gospodarzu ssaku sekwencje regulacyjne translacji i transkrypcji stosowane w kasecie ekspresyjnej mogą pochodzić ze źródeł wirusowych, takich jak adenowirus, wirus brodawczak bydlęcy, Iub wirus małpi, w których sygnały regulatorowe są związane celzwengie ronnlofnrouzę όνΐτ ViłV|V 1 V*lUVVł. V T· · któm ma wysoki nozzmm elsenrocii łiłił r» j ρνί^ινιιι wxvu^xx k/łjj χ.

Odnrmneidmp yzwjzu tt xvvtinv genom T m ^νίΐνιιι.

’l_J i i « łiłlł TT J ρνί^ΐνΐΐΐ WXVk>^XX K/kJJ X . YZ V r» 1 VVłl il V »ł ViłVJV i transkrypcji i translacji mogą być otrzymane także z genów ssaków, takich jak aktyna, kolagen, miozyna i metalotioneina. Regulatorowe sekwencje transkrypcji obejmują region promotorowy wystarczający do sterowania inicjacją syntezy RNA w komórce ssaka. Przykładami typowych komórek ssaka są komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki nerki małpy transformowane SV40 (COS), HeLa, BHK, komórki zarodków mysich Swiss NIH, fibroblasty szczura, małpy, Iub ludzkie, Iub komórki wątrobiaka szczura.

Dla ekspresji w komórkach ssaka, preferowaną metodą jest wydzielanie z komórek CHO. Ani CHO ani komórki ludzkie nie dodają al,3-związanych reszt galaktozowych, które

189 415 są typowe dla ekspresji w komórkach myszy takich jak komórki C127 i SP2/0. Przeciwciała na to powiązanie z cukrem są obecne w surowicy ludzkiej (C.F. Goochee i wsp., Biotechnol. 9 (1991) 1347-1355) i mogą wpływać na okres półtrwania, dostępność i klirans zrekombinowanych produktów wyrażanych z komórek myszy. Komórki CHR, dhfr- są zmutowane dla reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) i w związku z tym nie są zdolne do syntezy puryn, tymidyny i glicyny de novo. Liczba kopii chromosomalnie zintegrowanych plazmidów niosących kopie typu dzikiego genu DHFR może być zwiększona Iub zamplifikowana przez ekspozycję komórek transformowanych tymi plazmidami na zwiększające się ilości metotreksatu, analogu folanu, który współzawodniczy z folanem o wiązanie do aktywnego miejsca enzymu. Odpowiednim wektorem do ekspresji w komórkach CHO dhfr- jest pMT2 (R.J. Kaufman i wsp.. EMBO J. 6 (1987) 187-193). Wektor pMT2 ma dziką kopię genu DHFR, który jest przepisywany na pojedynczy mRNA z obcym genem. Tak więc, po traktowaniu transformowanych komórek CHO, dhfr- zwiększającymi się stężeniami metotreksatu, zarówno obcy gen jak i gen DHFR są wspólnie amplifikowane. Oczekuje się, ze produkt wydzielany z tych komórek będzie miał mostki dwusiarczkowe i będzie glikozylowany w sposób charakterystyczny dla ssaków.

Wektor ekspresyjny może wprowadzony do komórek gospodarza przez zastosowanie różnych technik, w tym transfekcji z fosforanem wapnia, transfekcji z udziałem liposomów, elektroporacji, i tym podobnych. Korzystnie komórki transfekowane są selekcjonowane i namnażane tak, że wektor ekspresyjny jest stabilnie wintegrowany do genomu komórki gospodarza aby dać stabilną transformację. Komórki mogą być hodowane na przykład w pożywkach DMEM. Polipeptyd wydzielany do pożywki może być odzyskany za pomocą standardowych podejść biochemicznych po przejściowej ekspresji 24-72 godzin po transfekcji komórek Iub po ustaleniu stabilnych linii komórkowych po selekcji np. przez oporność na antybiotyk.

Konwencjonalne sposoby odzyskiwania eksprymowanego peptydu z hodowli obejmują frakcjonowanie części hodowli zawierającej polipeptyd stosując dobrze znane techniki biochemiczne. Na przykład metody sączenia na zelu, chromatografii na żelu, ultrasączenia, elektroforezy, wymiany jonowej Iub chromatografii powinowactwa takie jak są znane do frakcjonowania białek mogą być stosowane do izolacji eksprymowanych białek obecnych w hodowli. Dodatkowo można stosować konwencjonalne metody immunochemiczne takie jak immunopowinowactwo Iub immunoabsorpcja. Techniki transformacji, hodowli, amplifikacji, przeszukiwania i produkcji produktów są także dobrze znane (patrz np. J. Sambrook i wsp. (1989) powyżej, R.J. Kaufman, Genetic Engineering: Principies and Methods: Plenum Press tom 2 (1987) 156-198.

Polipeptydy fuzyjne według wynalazku są tez wskazane do terapeutycznego zastosowania do leczenia pacjentów-ssaków, a w szczególności ludzi, cierpiących na alergie. Domena wiążąca IgE polipeptydów fuzyjnych współzawodniczy z IgE i receptorem IgE naturalnie obecnymi na komórkach tucznych, bazofilach i komórkach Langerhansa, tak, że IgE jest związana z podanym białkiem i niezdolna do wiązania tych komórek efektorowych alergii aby pośredniczyć w odpowiedzi alergicznej. Domena wiążąca IgE także współzawodniczy z receptorem IgE FcsRI przez wiązanie autoprzeciwciał na FcsRI.

Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną do kompetytywnego wiązania IgE (i/lub autoprzeciwciał na FcsRI) i/lub hamujących produkcję IgE tak więc do supresji i zapobiegania zaburzeniom związanym z IgE i receptorem IgE, a bardziej specyficznie alergii i stanów związanych z alergią, takich jak atopowe zapalenie skóry, astma atopowa i przewlekła pokrzywka.

Przez „IgE- Iub zaburzenia związane z IgE” rozumie się zaburzenia związane z wiązaniem receptora IgE związanego z komórkami, FcsRI, z IgE Iub autoprzeciwciałami na FcsRI, tzn, typowe reakcje alergiczne („zespół hiper-IgE”) takie jak astma oskrzelowa, astma atopowa, katar sienny, alergia na pyłek, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóiy, egzema, anafilaksja, jak i przewlekła pokrzywka, i także niealergiczna choroba Kimury i inne choroby płucne, dermatologiczne Iub autoagresyjne.

W szczególności atopowe zapalenie skóry, jeden z najbardziej dramatycznych przejawów atopii, jest przewlekłą chorobą zapalną skóry związaną z wysokim poziomem IgE w surowicy i uczuleniem na różne antygeny środowiskowe (M-A. Morren i wsp., J. AM. Acad. Dermatol. 31 (1994) 467-473. Obecne leczenie skazy atopowej skupia się na stosowa189 415 niu kremów zawierających steroidy, i ciężkie przypadki atopowego zapalenia skóry leczono z powodzeniem za pomocą cyklosporyny A (H. Granlund i wsp. Br. J. Dermatol. 132 (1995) 106-112) ale efekty uboczne ograniczają tę terapię do mniejszości pacjentów. Czynnik, który hamuje działania IgE takie jak degranulację komórek tucznych i prezentację antygenu przez komórki B, w której pośredniczy IgE i inne komórki prezentujące antygen byłoby lepsze od dowolnej obecnie znanej metody leczenia atopowego zapalenia skóry i w dodatku byłoby uzyteczne dla łagodniejszych form alergii.

Oprócz atopowego zapalenia skóry i astmy atopowej, polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane do leczenia lub zapobiegania przewlekłej pokrzywce (CU), w której odgrywa rolę degranulacja komórek tucznych poprzez FceRla. Polipeptydy fuzyjne według wynalazku mogą usuwać krążące przeciwciała przeciw FceRla w przeciwieństwie do przeciwciał monoklonalnych anty-IgE alternatywnie proponowanych do leczenia tej choroby.

Polipeptydy mogą być podane w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd według wynalazku, korzystnie niezmodyflkowany polipeptyd, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub rozcieńczalniku.

Określenie „sól” dotyczy w szczególności farmaceutycznie dopuszczalnych soli przygotowanych z farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych kwasów aby stworzyć kwaśne sole addycyjne np. grupy aminowej łańcucha polipeptydowego lub farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych zasad aby stworzyć zasadowe sole np. grupy karboksylowej łańcucha polipeptydowego. Takie sole mogą być wytworzone jako wewnętrzne sole i jako sole N- lub C-końca polipeptydu według wynalazku.

Odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne kwaśne sole addycyjne to sole farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych organicznych kwasów, kwasów polimerycznych, lub kwasów nieorganicznych. Przykłady odpowiednich kwasów organicznych obejmują octowy, askorbinowy, benzoesowy, benzenosulfonowy, cytrynowy, etanosulfonowy, fumarowy, glukonowy, glutaminowy, bromowodorowy, solny, izotionowy, mlekowy, maleinowy, jabłkowy, migdałowy, metanosulfonowy, mucynowy, azotowy, szczawiowy, pamoinowy, pantotenowy, fosforowy, salicylowy, bursztynowy, siarkowy, winowy, p-toluenosulfonowy jak i polimeryczne kwasy tak jak kwas taninowy lub karboksymetylocelluloza. Odpowiednie nieorganiczne kwasy obejmują kwasy mineralne takie jak solny, bromowodorowy, siarkowe, fosforowe i azotowy.

Przykłady odpowiednich nieorganicznych zasad zdolnych do tworzenia soli z grupą karboksylową obejmują zasadowe sole metali takich jak sole sodu, potasu i litu; sole ziem alkalicznych takich jak sole wapnia, baru i magnezu; i sole amonowe, miedzi, żelazawe, żelazowe, cynku, manganowe, glinowe i manganawe. Korzystne są sole amonowe, wapniowe, magnezowe, potasowe i sodowe. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych organicznych zasad odpowiednich do tworzenia soli grupy karboksylowej obejmują organiczne aminy, takie jak trimetyloaminą, trietyloaminą, tri(n-propylo)amina, dicykloheksylamina, p^etylamino)etanol, tris(hydroksymetylo)aminomotan, trietanolamina, p-(dietylamino)etanol, arginina, lizyna, histydyna, N-etylopiperydyna, hydrabamina, cholina, betaina, etylenoamina, glukozamina, metyloglukamina, teobromina, puryny, piperazyny, piperydyny, kofeina i prokaina.

Kwaśne sole addycyjne polipeptydów mogą być przygotowane w sposób konwencjonalny za pomocą skontaktowania polipeptydu z jednym Iub więcej ekwiwalentów pożądanych nieorganicznych lub organicznych kwasów takich jak kwas solny. Sole grup karboksylowych peprydu mogą być przygotowane konwencjonalnie przez skontaktowanie peptydu z jednym Iub wieloma ekwiwalentami pożądanej zasady takiej jak wodorotlenek metalu, np. wodorotlenek sodu; węglanem metalu lub kwaśnym węglanem metalu takim jak węglan sodu Iub kwaśny węglan sodu, lub zasadą aminową takąjak trietylamina i trietanolamina.

Wynalazek dotyczy więc farmaceutycznych kompozycji obejmujących nowy polipeptyd fuzyjny jak opisano powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalne sole wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Nośnik jest korzystnie jałowym wolnym od pirogenów płynem do podawania dojelitowo. Woda, sól fizjologiczna, wodna dekstroza i glikole są korzystnymi płynnymi nośnikami lub rozcieńczalnikami, szczególnie (gdy są izotoniczne) dla roztworów do wstrzykiwań. Kompozycja może być lizatem przygotowanym w sposób konwencjonalny.

189 415

Kompozycje mogą być podane ogólnoustrojowo, tzn. dojelitowo (np. domięśniowo, dożylnie, podskórnie Iub doskórnie) Iub przez podanie dootrzewnowe. Dla podania dojelitowo jest korzystne by polipeptyd fuzyjny był zasadniczo rozpuszczalny w surowicy Iub osoczu pacjenta tzn., że przynajmniej 1 miligram polipeptydu jest rozpuszczalny w mililitrze surowicy Iub osocza.

Kompozycja może być tez podana przez znane techniki podawania lokalnego. Przykłady odpowiedniego dawkowania obejmują spraye, roztworu oftalmologiczne, roztwory do nosa i maści. Na przykład można przygotować spray przez rozpuszczenie peptydu w odpowiednim rozpuszczalniku i umieszczenie go w sprayu aby służył jako aerozol do często stosowanej techniki inhalacyjnej. Można sporządzić roztwór oftalmiczny i nosowy przez rozpuszczenie aktywnego składnika w wodzie destylowanej, dodanie dowolnego wymaganego dodatkowego składnika, takiego jak bufor, czynnik izotonizujący, zagęszczacz, konserwant, stabilizator, czynnik powierzchniowo czynny, Iub antyseptyk, doprowadzając pH mieszaniny do 4 do 9. Można uzyskać maści np. przez przygotowanie kompozycji z roztworu polimeru, takich jak 2% polimer karboksywinylu i zasada, taka jak 2% wodorotlenek sodu, mieszając aby uzyskać żel i mieszając z żelem porcję oczyszczonego polipeptydu.

Kompozycję korzystnie podaje się podskórnie Iub dożylnie, i najbardziej typowo podskórnie.

Leczenie jest praktykowane w czasie stanu choroby alergicznej (tzn. gdy ulżenie objawom jest specyficznie wymagane) Iub jako ciągła Iub profilaktyczna terapia (tzn. przed wystąpieniem oczekiwanej choroby związanej z IgE Iub receptorem IgE takiej jak choroby alergiczne).

Skuteczna dawka w zgodzie z niniejszym może zmieniać się w szerokim zakresie biorąc pod uwagę np. stopień i ostrość traktowanego stanu, wiek, płeć i stan pacjenta, długość terapii i moc danego białka fuzyjnego, czynniki te można ustalić za pomocą konwencjonalnych metod.

Ponieważ poszczególne osoby bardzo różnią się pod względem ilości IgE (jak i przeciwciałami przeciwko FcsRI) terapeutycznie skuteczna dawka w zgodnie z tym może być najlepiej opisana jako między 5 x 10² i 1 x 10⁴ razy całkowita zawartość IgE i przeciwciała na FceRJ w surowicy w skali molarnej. Pacjent może być leczony raz na miesiąc (Iub takich odstępach tygodniowych, jakie mogą być odpowiednie) także w pojedynczych Iub wielokrotnych podaniach).

Dla przeciętnej osoby (70 kg) odpowiednia miesięczna dawka może być w zakresie od niższej dawki od około 0,5 mg miesięcznie do górnej dawki od około 500 mg miesięcznie, korzystnie od około 1 mg do około 300 mg, bardziej korzystnie od około 20 mg do około 250 mg miesięcznie, polipeptydu fuzyjnego według wynalazku, takiego jak dimer przykładu 7, wygodnie podanego w podzielonych dawkach raz czy dwa razy w miesiącu. Wyższe zakresy dawek około 500 mg miesięcznie do 2 g miesięcznie mogą być wskazane u pacjentów mających wysokie stężenia stężeń IgE we wczesnych fazach leczenia.

Dawki i czas administracji mogą być zmienione. Wstępne podawanie kompozycji może być przy wyższych dawkach wewnątrz powyższych zakresów i dawane bardziej często niż podawanie później w czasie choroby. Odpowiednie dawki mogą być określone przez pomiar zawartości IgE i przeciwciała na FceRI w surowicy pacjenta, jak wskazano powyżej. Na przykład wcześnie w trakcie choroby polipeptyd fuzyjny według wynalazku taki jak dimer przykładu 7 może być podany w tygodniowych dawkach 200-500 mg polipeptydu u przeciętnego pacjenta (70 kg). Po kliransie IgE z surowicy i przeciwciała na FceRI podawanie leku może być obniżone do cotygodniowych dawek Iub dawek co drugi tydzień, z dawkami w zakresie od 50 pg do 100 mg polipeptydu na podanie.

by

A el kib o e 1Un b w

V £7YJVŁO.11V LULAJ OU1.1.1V CUUU W PLYJll i 1711IUVJ 1 swk k o rpo cz rma ......

lYUlltpUŁ) VJV HHAAVJOZxV^,YJ W j VŁ kuirmn z innymi składnikami niniejszego wynalazku Iub dalszymi czynnikami farmaceutycznymi takimi jak antyhistaminy Iub kortykosteroidy.

Wynalazek także obejmuje zastosowanie polipeptydu fuzyjnego według wynalazku w oznaczeniu diagnostycznym in vitro dowolnego standardowego typu np. ELISA, aby ustalić poziom IgE Iub autoprzeciwciał na FceRI (np. u chorych z przewlekłą pokrzywką) w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta-człowieka, np. próbce krwi Iub tkanki. Składnik HSA korzystnie ułatwia wiązanie i wykrycie IgE i autoprzeciwciał na FceRI w oznaczeniu opartym na ELISA. Ilość IgE Iub autoprzeciwciał obecnych w próbce może służyć jako miara odpowiedzi

189 415 alergicznej pacjenta na substancję, na którą pacjent był eksponowany. IgE Iub poziomy przeciwciała mogą być mierzone aby określić skuteczność terapii przeciwalergicznej i monitorować alergiczny stan pacjenta w czasie.

Wynalazek dalej obejmuje zastosowanie polinukleotydu kodującego polipeptyd fuzyjny według wynalazku do wytwarzania leku do przeprowadzania terapii genowej. Sposób terapii genowej obejmuje modyfikację komórek pacjenta przez wprowadzenie do nich polinukleotydu kodującego polipeptyd fuzyjny według wynalazku i wyrażającego polipeptyd w takich komórkach. Na przykład somatyczne komórki można najpierw pobrać od pacjenta, zmodyfikować genetycznie w hodowli przez wstawienie polinukleotydu i powstałe zmodyfikowane komórki ponownie wprowadzić do pacjenta przez co polipeptyd według wynalazku jest wyrażany przez komórki pacjenta.

Alternatywnie komórki mogą być zmodyfikowane in vivo przez bezpośrednie wprowadzenie DNA wektora kodującego polipeptyd.

Odpowiednie do modyfikacji komórki mogą obejmować komórki śródbłonka Iub leukocyty. Dla zastosowania do terapii genowej polinukleotyd według wynalazku jest korzystnie pod kontrolą regulowanego (tzn. indukowalnego) promotora. Ekspresja polipeptydu może być więc uzależniona od ekspozycji pacjenta na czynnik zewnętrzny stosując znane regulowalne układy promotorowe.

Wynalazek także obejmuje stosowanie metod terapii genowej do przygotowania zwierząt posiadających zrekombinowane komórki somatyczne Iub transgenicznych wyrażających polipeptydy luz.yjne według wynalazku np. w mleku. Takie modyfikowane zwierzęta także stanowią część wynalazku. Przykłady pożytecznych zwierząt obejmują myszy, szczury, króliki, świnie, owce, kozy oraz bydło, z których wszystkie uczyniono transgenicznymi stosując techniki standardowe (np. D.R. Hurwitz i wsp. Transgenic Research 3 (1994) 365-375). Zwierzęta mogą być stosowane do celów modelowych Iub do produkcji białka. W szczególności wynalazek dotyczy transgenicznej myszy, kozy, krowy Iub świni wyrażającej polipeptyd fuzyjny według wynalazku. Metody wytwarzania takich zwierząt są dobrze znane. Polinukleotyd kodujący białko fuzyjne według wynalazku może być wprowadzony do somatycznych komórek zwierząt, in vitro Iub in vivo, aby uzyskać zwierzęta posiadające zrekombinowane komórki somatyczne, które są zmodyfikowane genetycznie, ale które nie mogą przekazywać modyfikacji genetycznej potomstwu. Alternatywnie Polinukleotyd może być wstawiony do komórek zarodków do produkcji zwierząt transgenicznych zdolnych do przekazywana zdolności do ekspresji białek wynalazku potomstwu.

Transfekcja komórek do terapii genowej może być przeprowadzona w sposób konwencjonalny, np. poprzez elektroporację, strącanie fosforanem wapnia, procedury opartej na lipofektynie, iniekcji domięśniowej, mikroinjekcji Iub zastosowania „armatki genowej”. Wektory oparte na plazmidach korzystnie zawierają marker taki jak gen neomycyny dla selekcji stabilnych transfektantów za pomocą cytotoksycznego aminoglikozydu G418 w komórkach eukariotycznych.

Infekcję uzyskano przez włączenie sekwencji genetycznej polipeptydu fuzyjnego do wektora retrowirusowego. Znane są różne procedury w tej dziedzinie dla takiego włączani. Jedna taka procedura, która była szeroko stosowana wykorzystuje defektywny mysi retrowirus do pakowania retrowirusa, i amfitroficzną pakującą linię komórkową aby przygotować zakaźne amfitroficzne wirusy do stosowania w zakazaniu docelowych komórek dawcy.

Dalsza charakteryzacja może być przeprowadzona np. w sposób następujący:

Określenie okresu porto wieź nęci o w surowicy in vivo

T) »-» z4 rt /-» Kinll/n νζΛ’-»,-»! ζΊ»Λζ1 Γ» ΖΊ + z·» »»¥ »1 *-» » TJDC w · 1 «« - J Z^-' biaiku ivpviviivza7hu oiup jipppjppp p ppo wOiiPjmi UU Ud żylnie samicom myszy SHK/hr/hr Charles River ważącym około 25 g. Myszy dzielono na następujące grupy:

- Grupa (i) otrzymująca 300 pg (1 nmol) polipeptydu fuzyjnego; np. dimeru IgE - L1-HSA II - L2 - IgE^R przygotowanego jak w przykładzie 7, Iub

- Grupa (ii) otrzymująca 60 pg IgER (2 nmole) Iub

- Grupa (iii) otrzymująca 65 pg HSA I (1 nmol).

100 pl krwi pobrano z każdej myszy po 10 minutach, 30 minutach, 3 godzinach, 6 godzinach i 12 godzinach po wstrzyknięciu. Surowicę przygotowano przez wirowanie. Stężenia

189 415 różnych białek w surowicy określano za pomocą a) oznaczenia ELlSA wiązania lgE receptor; b) ELlSA inhibicyjnej; lub c) HSA ELlSA typu „sandwicz” w sposób następujący:

a) oznaczenie wiązania lgE^R techniką ELlSA

Stężenie lgE w surowicy oznaczono przez wykrywanie wiązania lgE za pomocą następującej techniki ELlSA „sandwicz”: 200 ng ludzkiego lgE unieruchomiono w studzienkach płytek COSTAR Strip (Cambridge, MA., USA) w 100 ul buforu do powlekania w wilgotnej komorze w 4° przez noc. Każdą studzienkę płukano dwukrotnie 300 μΐ PBS wolnego od Ca2 * i Mg +, pH 7,2. Płytki blokowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą 200 ul PBS wolnego od Ca2⁺, Mg + zawierającego 0,05% Tween 20 (PBST), próbki rozcieńczano w 100 μl PBS wolnego od Ca2+, Mg + (rozcieńczonego 1:10) dodano mysią surowicę i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Studzienki płukano dwa razy 300 μl PBS i inkubowano z 100 μl (1 ng) monoklonalnego przeciwciała anty-ludzki receptor lgE takiego jak 5H5/F8 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie, studzienki płukano dwukrotnie 300 μΐ PBST i inkubowano ze 100 ul koziej antymysiej lGP-HRP (Biorad, rozcieńczone 1: 2000 w PBS wolnym od Ca2+ i Mg²') przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki płukano trzykrotnie 300 μl PBST i wykrywano koniugaty z peroksydazą z chrzanu za pomocą 100 μΐ substratu ABTS (Biorad). Reakcję hamowano po 5 minutach za pomocą 100 μΐ kwasu szczawiowego. lntensywność barwy mierzono za pomocą fotometru EASY READER przy 405 nm.

b) ELlSA inhibicyjna

100 ng FcsRIa immobilizowano w lmmunopłytkach Nunc o 96 studzienkach (F 96 cert Maxisorb) w 100 μl buforu powlekającego (0,1 M NaHCOj, 0,01% NaN3 pH 9,6) w wilgotnej komorze przy 4°C przez noc. Każdą studzienkę płukano 4 razy za pomocą 300 μl PBS, 0,05% Tween 20 (bufor do płukania). Do różnych zestawów kieszonek dodawano albo negatywną kontrolę (50 μl surowicy mysiej rozcieńczonej 1:25 w PBS, 0,05% Tween 20, 2% FCS), serię rozcieńczeń standardu polipeptydu fuzyjnego np. lgER - L1- HSA ll - L2 - lgER (rozcieńczenia od 400 ng/ml do 1,6 ng/ml) lub seryjne rozcieńczenia próbek dodawano. Standard i próbki rozcieńczano w mysiej surowicy rozcieńczonej 1:25 w PBS, 0,05% Tween 20, 2 % FCS. Bezpośrednio potem dodawano 50 μl koniugatu 400 ngtyl ludzkiej lgE-biotyny w buforze do rozcieńczeń i mieszano. Końcowe rozcieńczenie mysiej surowicy w mieszaninie inkubacyjnej wynosiło 1:50.

Po inkubacji przez dwie godziny w 37°C płytki płukano 4 razy 300 μl buforu do płukania, i dodano 50 μl koniugatu streptawidyna-fosfataza alkaliczna (Gibco) rozcieńczonego 1:1000 w buforze do rozcieńczeń i inkubowano jedną godzinę w 37°. Płytki płukano 4 razy 300 μί buforu do płukania i po dodaniu 100 μl substratu (1 mg/ml p-nitrofenylofosforanu w buforze dietyloaminowym, pH 9,8 (BlORAD)) reakcję stopowano po inkubacji przez 30 minut w 37°C za pomocą 50 μl NaOH. Gęstości optyczne mierzono fotometrem stacji roboczej BlOMEX-1000 przy 405 nm. Jakościową ocenę z krzywych standardowych (dopasowywanie krzywych logistycznych 4-parametrowe) przeprowadzano za pomocą programu Beckmana lMMUNOFlT ELlSA. Obliczenia:

% wiązania = [OD (próbka lub wartość standardu) / OD (wartość buforu)] x 100

c) ELlSA Sandwich HSA

500 ng monoklonalnej antymysiej HSA (HSA9) immobilizowano w lmmunopłytkach Nunc o 96 studzienkach (F 96 cert. Maxisorb) w 100 μl buforu powlekającego (0,1 M NaHCO3, 0,01% NaN3 pH 9,6) w wilgotnej komorze przy 4°C przez noc. Każdą studzienkę płukano 4 razy za pomocą 300 μl buforu do płukania (PBS, 0,05% Tween 20). 100 (ii) suro• · · · · '11 r\r\ ZT\Tł n r\ r\rf\/ τ o r\ syn/ 1 r* _ i · ' · \ wicy mysiej rozcieńczonej 1.100 (rBS 0,05%, iween 20, 2% roa = ouior do rozcieńczania) jako kontrolą negatywną lub 100 μl standardu (1 ng/ml - 2 ng/ml ludzkiej albuminy surowiczej, KAB) lub 100 μί próbki rozcieńczonej w 1:100 surowicy mysiej. Po inkubacji przez dwie godziny w 37°C płytki płukano 4 razy 300 μl buforu do płukania i dodano 100 μl 1ng/pl koniugatu anty-HSA-biotyna królika. Koniugat anty-HSA-biotyna oczyszczano przez chromatografię immunopowinowactwa z CH-Seph4B-HSA i reakcje krzyżowe z mysią surowicą usuwano za pomocą immunoabsorpcji na mysiej surowicy-agarozie. Po inkubacji przez dwie godziny w 37°C płytki płukano 4 razy 300 μί buforu do płukania i dodano 50 μl koniugatu streptawidyna-fosfataza alkaliczna (Gibco) rozcieńczonego 1: 1000 w buforze do rozcieńczeń

189 415 i inkubowano przez jedną godzinę w 37°C. Płytki płukano 4 razy 300 μΐ buforu do płukania i po dodanie 100 μl substratu (1 mg/ml p-nitrofenylofosforan w buforze dietanolaminowym, pH 9,8 BIO-RAD) reakcją hamowano po inkubacji przez 15 minut w 37°C z 50 μl 2 M NaOH. Gęstości optyczne mierzono za pomocą fotometru stacji roboczej BIOMEK przy 405 nm. Ilościową ocenę z krzywej standardowej (4-para metrowe logistyczne dopasowywanie krzywej) przeprowadzono programem do oceny Beckman IMMUNOFIT ELISA.

Wyniki

Stężenia dla dimerycznego peptydu fuzyjnego IgER - L1 - HSA II - Li- IgER; wolnego IgER (określanego jako wolny łańcuch „alfa”) Iub HSA I (określanego jako „HSA”) jako funkcja upływu czasu po iniekcji są podane w pikomolach/ml surowicy w fig. 1 (A) i (B).

Figura 1 (B) przedstawia, ze tylko wolny receptor jest wykrywalny w surowicy mysiej przez około 10 minut, podczas gdy dimeryczny polipeptyd fuzyjny jest nadal wykrywalny po około 12 godzinach po podaniu.

Figura 1 (C) pokazuje względną kinetykę kliransu dla HSA i dimerycznego polipeptydu fuzyjnego. Po stabilizacji rozmieszczenia w tkance-krwi w czasie pierwszych 10 minut, dimer i HSA wykazują nieomal identyczne krzywe kliransu. To potwierdza, że okres półtrwania w surowicy domeny wiążącej IgE może być znacząco przedłużony przez fuzję z HSA.

Hamowanie biernej anafilaksii skóry (TCA) u myszy (a) podanie peptydu

Seryjne rozcieńczenia polipeptydu fuzyjnego, np. IgER- L1 - HSA II - Li - IgER uzyskanego z komórek CHO w przykładzie 7, wstrzykiwano dożylnie samicom myszy SKHl/hr/hr Charles River ważącym około 25 g w różnych odstępach przed uczulaniem.

Ustalono trzy grupy myszy w zależności od ilości wstrzykniętego polipeptydu przed uczuleniem (tzn. 10 μg/kg, 50 μg/kg Iub 500 μg/kg). Czwarta grupa kontrolnych myszy otrzymała 200 μg/kg dożylnie PBS zamiast polipeptydu. Każda z czterech grup myszy została podzielona na trzy podgrupy, które różnią się przedziałem między wstrzyknięciem dożylnym związku i doskórnym uczuleniem IgE (etap (b) poniżej). Badanie odstępy to 5 minut, 15 minut i 30 minut.

(b) uczulenie doskórne

Myszy znieczulano i uczulano w skórze grzbietu przez 4 doskórne zastrzyki po 5 ng każdy monoklonalnej mysiego przeciwciała anty-dimtrofenylo (DNP) IgE w 10 ml PBS (BioMakor, Rehovot, Izrael). W grupie kontrolnej sól fizjologiczną wstrzykiwano doskórnie w jednym miejscu.

(c) prowokacja alergiczna minut po uczuleniu myszy ponownie znieczulano i prowokowano przez dożylne wstrzyknięcie roztworu zawierającego 50 μg dinitrofenolo-albuminy surowiczej bydlęcej (DNP-BSA) (Calbiochem-Behring, San Diego, USA) zawierającego 1% Evans blue. Odpowiedź PCA określano ilościowo przez pomiar średnicy zabarwionego badanego miejsca w wyniku wynaczynienia.

Wyniki

Są one podane na histogramie na fig. 2 dla dojrzałego polipeptydu fuzyjnego z przykładu 7 (aminokwasy Vali6-Leu979 SEQ. ID. NO.3). W stężeniu 500 μg/kg dimeryczny polipeptyd fuzyjny całkowicie blokuje PCA we wszystkich punktach czasowych po podaniu. Przy 50 μg/kg traktowanie po 30 minutach przed prowokacją daje statystycznie znaczące zmniejszenie o 36%. Przy 15 minutach przed prowokacją widać pewien trend z podaniem zarówno 10 i 50 μg/kg dimeru. Tak więc, dimeryczny polipeptyd fńzyjny jest skuteczny w zapobieganiu PCA

Procedury i techniki dla wykonania niniejszego wynalazku są znane w dziedzinie. O ile ich przygotowanie nie jest tu specyficznie opisane, związki, odczynniki, wektory, linie komórkowe itp. które mają być stosowane są znane i łatwo dostępne Iub mogą być uzyskane w sposób konwencjonalny ze znanych i łatwo dostępnych materiałów, Iub równocenne materiały mogą być przygotowane w konwencjonalny sposób ze znanych i łatwo dostępnych materiałów.

Następujące nieograniczające przykłady ilustrują wynalazek. Wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza.

189 415

Materiały i metody

Amplifikacja PGR

Synteza primerów de novo może być przeprowadzona z zastosowaniem dowolnej odpowiedniej metody, na przykład metod fosfotriestrowej Iub fosbodiestrowej.

Metody i systemy amplifikacji specyficznej sekwencji kwasu nukleinowego są opisane w USP 4'683'195 i USP 4'683'202 i w Polymerase Chain Reaction. H.A. Ehrlich i wsp., red. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Po PCR fragmenty DNA wycinano i oczyszczano stosując protokół QiaEx (CJuiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) a następnie subklonowano do wektora TA (TA Cloning® Kit (Invitrogen) (literatura o produkcie, wersja 2.2)). Primery stosowane w generowaniu kwasów nukleinowych zamplifikowanych PCR przedstawiono na fig. 8. DNA sekwencjonowano stosując metodę z Seguenase (USB, Cleveland, OH. USA).

Plazmidy i odczynniki

Klon cDNA FcsRIa, pGEM-3-110B-1 (A. Shimizu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 1907-1911 uzyskano z American Type Tissue Collection (ATCC #67566). Jednoniciowy cDNA ludzki uzyskano od Clontech (PCR-ready Ouick Clone cDNA, Cat. D#113-1). Sekwencja HSA jest dostępna pod numerami dostępu GenBank V00495, J00078, L00132 i LOO 133. Enzymy restrykcyjne uzyskano od Boohringer-Mannhoim Iub Gibco/BRL. Polimerazę DNA Tag uzyskano od Perkin-Elmer Cetus (PECI) Iub od Boehringer-Mannheim. Wektor SK uzyskano od Stratagene.

pHIL-D2 jest dostępny od Invitrogen (San Diego, CA, USA; nr katalogu K1710-01 (1994)) (patrz ..Pienia Expression Kit - Protein Expression - A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia Pastoris - Yersion 3.0” (grudzień 1994) (dalej określany jako „instrukcja Invitrogen”).

Wektor pXMT3 pochodzi od pMT2 (Sambrook i wsp. (red) (1989) powyżej) przez klonowanie linkera Pstl do EcoRI z pUC8 (Pharmacia) w miejscach Pstl i EcoRI pMT2 (R.J. Kaufman i wsp. (1987) powyżej).

Standardowe techniki były jak opisano w Sambrook i wsp. (red) (1989) powyżej.

Przykład A: Wektor do klonowania TA

Plazmid pCR2 zligowano oddzielnie z każdym z produktów amplifikacji PGR uzyskanych w przykładach 1 i 2. Reakcje ligacyjne sporządzono stosując ligazę DNA T4 w następującej mieszaninie reakcyjnej:

mM Tris-HCI (pH 7,8) mM MgCI2 mM DTT mM ATP ng DNA wektora

100-200 ng produktów reakcji PCR (nieoczyszczonych) jednostki ligazy DNA T4 (New England Biolabs)

Każdą mieszaninę reakcyjną trzymano w 15° przez 18 godzin przed przeniesieniem do komórek kompetentnych.

Przykład 1: Amplifikacja za pomocą PCR i klonowanie cDNA cDNA FceRla oczyszczono z pGEM-3-110B-1 stosując metodę Ouiagen. Następnie:

(A) Do przygotowania konstruktu z wiodącym HSA. Amplifikację PCR cDNA FceRla przeprowadzono oligonukleotydami #18 i #19 (fig. 4, 8) stosując następującą mieszaninę reakcyjną:

pl (50 ng) FceRla cDNA;

pmoli każdego z oligonukleotydów #18 i #19 pl 10x buforu do PCR (PECI)

0,5 pl 20 mM roztworu wyjściowego dNTP = 200 pM stężenie końcowe dNTPs

0,5 pl (2,5 U) Taq polimerazy DNA (PECI).

woda do 50 pl

Na mieszaninie reakcyjną nawarstwiano olej mineralny aby zapobiec parowaniu, i poddawano termocyklom w termocyklerze Perkin Elmer Cetus model 480. Warunki cyklizacji dla

189 415 tej reakcji to: podgrzać 95° przez 5 minut, następnie 30 cykli 94° przez 1,5 minut, 53° przez 2 minuty, 72° przez 3 minuty, a następnie trzyminutowe przedłużenie w 72° i pozostawienie przez noc w 4°.

Po elektroforezie zamplifikowany produkt około -5500 bp potwierdzano za pomocą barwienia bromkiem etydyny. Fragment subklonowano do wektora PCR2 aby uzyskać pEKl kodujący IgE^R (fig. 4, 8B).

(B) Do przygotowania konstruktu IgE-wiodący: amplifikację klonu cDNA FcsRIa przeprowadzono według procedury (A) powyżej z wyjątkiem tego, ze stosowano oligonukleotydy #20 i #31 (fig. 8B). Po elektroforezie w 0,7% żelu agarozowym, stwierdzono obecność produktu ok. 600 bp za pomocą barwienia bromkiem etydyny. Fragment subklonowano w wektorze PCR23 aby stworzyć IgER/TA#1 kodujący pre-IgE^R (fig. 4).

(C) Dla przygotowania konstruktu kodującego pre-IgE^R aby wyrazić dojrzałe skrócone białko do stosowania jako kontrolę w oznaczeniach, przeprowadzono amplifikację PGR cDNA FcsRIa według procedury (A) powyżej z oligonukleotydami #20 i #19 (fig. 8B). Po elektroforezie, potwierdzono obecność produktu ok. 620 bp za pomocą barwienia bromkiem etydyny. Fragment PCR wycięto i subklonowano w wektorze PCR23 aby stworzyć IgERFL/TA#34 kodujący pre-IgE^R po którym następuje kodon stop (fig. 4).

Przykład 2. Amplifikacja za pomocą PCR i klonowanie cDNA albuminy surowicy ludzkiej

Aby uzyskać sekwencję kodującą prepro-HSA II, przeprowadzono amplifikację PCR cDNA albuminy surowicy ludzkiej za pomocą oligonukleotydów #24 i #25 (fig. 8B), według ogólnej procedury przykładu 1 (A). Powstały klon HSA/TA#1 miał sekwencje, najbardziej zbliżoną do sekwencji w GenBank. W tym klonie wykryto siedem mutacji w pozycji tolerancji i jedną mutację, która spowodowała zmianę, lizyny na kwas glutaminowy w nukleotydzie 1333. Siedem mutacji w pozycji tolerancji to były: zasada 309 A na T; 744 A na G; 795 G na A; 951 G na A; 1320 C: na T; 1569 A na C; 1584 G na (względem HSA/TA#1). Mutacje, lizyna do kwasu glutaminowego naprawiono z powrotem do sekwencji w GenBanku stosując mutagenezę ukierunkowaną z oligonukleotydami pokazanymi na fig. 8A i Biorad Mutagene Phagemid in Vitro Mutagenesis Kit (Biorad, kat. # 170-351). Metoda ta opiera się na włączaniu reszt uracylu w nici rodzicielskiej i ich następnym usuwaniu z mutagenizowanej nici (TA Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488-492. Ponieważ mutacje punktowe w miejscach tolerancji nie zmieniają natywnej sekwencji aminokwasów kodowanego białka, powyższych siedmiu mutacji nie korygowano. Po elektroforezie zamplifikowany produkt o wielkości ok. ~ 1,8 kb potwierdzano za pomocą barwienia bromkiem etydyny.

Produkt 1,8 kb podklonowano do wektora pCR2 aby stworzyć HSA/TA mut #16, w którym sprawdzono przez sekwencjonowanie DNA obecność całej sekwencji prepro-HSA II. HSA/TA mut# 16 subklonowano do pBluescript SK jako fragment Spel, HindIU dając HSA/SK#17(fig. 5).

(A) Dla przygotowania konstruktu HSA wiodący: HSA/SK#17 strawiono MstII i HindIII aby usunąć sekwencję kodującą 3' końcowy aminokwas (Leu.609); oligonukleotyd kodujący linker L2 jak zdefiniowano powyżej, wprowadzono na 3' końcu zlinearyzowanego HSA/SK#17 przez ufosforylowanie oligonukleotydów #28 i #29 (fig. 8B) i hybrydyzację i ligację tych fragmentów do miejsc MstU/Hindlll zlinearyzowanego HSA/SK#17 aby uzyskać pEK7 kodujący prepro-HSA II w formie fuzji z L2 (fig. 8B). Minipreparaty DNA sprawdzono przez trawienie BamHI i sekwencjonowanie.

(B) Aby przygotować konstrukt IgE-wiodący: HSA/SK#17 kodujący preproHSA II amplifikowano za pomocą PGR z oligonukleotydami #26 i ^27 (fig. 5, 8). Oligonukleotyd #26 usuwa sekwencję prepro z HSA i dodaje Oligonukleotyd kodujący Li na 5' końcu HSA. Oligonukleotyd #27 koduje unikalne naturalnie występujące miejsce Ncol w około pozycji 800 nukleotydu sekwencji kodującej HSA. Amplifikację PCR przeprowadzono według procedury w przykładzie 1(A). Fragment około 800 bp izolowany za pomocą elektroforezy w żelu, a Qia subklonowano do wektora pCR2 aby dać klon HSA Nco/TA#13, którego sekwencję sprawdzono za pomocą sekwencjonowania DNA. Fragment od Ncol do Notl tego klonu subklonowano do DNA HSA/SK#17 trawionego Ncol i Notl dając HSA/SK#5 (fig. 5) kodujący L1 połączony z 5' końcem cDNA kodującego HSA II.

189 415 (C) Dla ekspresji samego HSA, wykorzystano konstrukt HSA/SK#17 przygotowany powyżej.

Przykład 3. Konstrukt fuzyjny HSA-IgER/SK#22 kodujący prepro-HSA + linker + IgER pEk7 (zawierający cDNA prepro-HSA II + oligonukleotyd dla 1,2) i pEKl (zawierający

IgER) strawiono BamHI i Sali. Uzyskany fragment 1,8 kb z pEK7 poddano działaniu fosfatazy i następnie zligowano z fragmentem 550 bp uzyskanym z pEK1. Przygotowano jeden dodatni mini-preparat, #23 ale był on zanieczyszczony innym plazmidem, co uniemożliwiło izolację prążka HSA-IgE^R. Dlatego też z minipreparatu #23 oczyszczono fragment 2,4 kb Spel Sali zawierający fuzją HSA-IgER i fragment 2,9 kb zawierający wektor i zligowano je razem, co dało klon HSA-IgE/SK#49 (fig. 9) (stwierdzono, że brakuje miejsc wektora z jednego z końców subklonowanego obszaru, tak wiać fragment 2,4 kb Spel Sali z HSA-IgE/SK#49 subklonowano do Bluescript SK trawionego Spel i Sali co dało HSA-IgE/SK#22 (nie pokazane na figurach).

Sekwencja styku HSA i linkera z DNA receptora IgE i sekwencje końców fuzji z DNA wektora były jak oczekiwano w HSA-IgE/SK#22, co sprawdzono na podstawie sekwencjonowania DNA.

Przykład 4. Konstrukt fuzyjny IgE-HSA/SK#1 kodujący IgER + prepro-HSA H

HSA/SK#5 i HSA-IgER/TA#1 strawiono Sstl i Nhel. Fragment 600 bp z IgE/TA#l oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu i zligowano z HSA/SK#5 strawionym i poddanym działaniu fosfatazy uzyskując klon IgE-HSA/SK#1 (fig. 10).

Przykład 5. Konstrukt fuzyjny R-H-R/SO50 kodujący pre-HSA-IgER - L1- HSA II -L2- ^IgER·· . . .R , . _{T R} ,

Miejsce Pstl unikalne dla regionu HSA IgE^R-HSA/SK#1 i HSA-IgE ^R/SK#49 stosowano aby połączyć IgER i prepro - HSA II poprzez oligonukleotyd dla L2. HSA/IgE^R/SK#49 i Bluescript SK strawiono Pstl i Sali. Fragment 1,2 kb zawierający 3' część HSA II, linker i sekwencję IgER zligowano z DNA Bluescript przeciętym Pstl i Sali dając HSA-IgER Pst Sal/SK#37 (fig. 11), który strawiono Pstl i KpnI i przygotowano fragment 1,2 kb.

IgER-HSA/SK#1 strawiono Pstl i KpnI i fragment 4,8 kb zawierający wektor, IgER, linker i 5' część HSA izolowano, poddawano działaniu fosfatazy i ligowano z fragmentem 1,2 kb z HSA-IgER Pst Sal/SK#37. Uzyskano dimeryczny konstrukt R-H-R#50 (fig. 11).

Przykład 6. Monomeryczne polipeptydy fuzyjne HSA II - L1 - IgER przez transfekcję i hodowlę Pichia pastoris

Dimeryczny peptyd HSA II - L2 - IgER przygotowano przez przecięcie plazmidu HSA/SK#49 EcoRI i izolację fragmentu 2,4 kb kodującego białko fuzyjne. Fragment ligowano w unikalnym miejscu EcoRI wektora ekspresyjnego Pichia pastoris pHIL-D2 (Imdtrogen) po trawieniu plazmidu pHIL-D2 EcoRI i działaniem fosfatazą alkaliczną. Powstały plazmid MB#2 linearyzowano przez trawienie Notl i transformowano nim komórki GS 1145 jak opisano w „Instrukcji Invitrogen”. U transformantów His+ badano wzrost na metanolu. Szczepy wykazujące wolny wzrost na metanolu hodowano w minimalnej pożywce glicerolowej jak podano w „Instrukcji Invitrogen” do fazy stacjonarnej, przenoszono za pomocą wirowania do złożonej buforowanej pożywki metanolowej i hodowano przez 4 dni. W supernatancie z komórek sprawdzano za pomocą ELISA obecność HSA i zdolność do wiązania IgE. Zdolność do wiązania IgE uzyskanego produktu wydzielanego z P. pastoris była równoważna molowo ze stężeniem HSA i była ona w pełni czynna biologicznie.

Przykład 7. Dimeryczny polipeptyd fuzyjny IgE5- L1 - HSA II - L2 - IgER przez transfekcję i hodowlę komórek CHO

Plazmid pXMT3_-RI«-HSA-RIa (zawierający sekwencję nolinukleotydową SEQ.ID.N0.4 kodującą IgE - L1 - HSA II - L2 - IgER) przygotowano przez strawienie R-HR/SK#50 (patrz przykład 5) EcoRI i izolację 3 kb fragmentu kodującego dimeryczny polipeptyd fuzyjny. Ten fragment zligowano w unikalnym miejscu EcoRI pXMT3 po trawieniu pXMT3 EcoRI i działaniu fosfatazą alkaliczną.

Plazmid transfekowano do komórek CHO DUKX Bil. Komórkom tym brakuje funkcjonalnego genu dhfr (reduktaza dihydrofolianu) wymaganej do syntezy nukleozydów. Tak więc, komórki utrzymuje się w pożywce Alpha+ (MEM ALpHA MEDIUM z rybonukleozydami i deoksyrybonukleozydami/Gibco) zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą (FCS).

189 415

Do transfekcji komórki płukano dwukrotnie w PBS wolnym od Ca++ i Mg'+' (CMF-PBS) i stężenie komórek doprowadzono do 2x10⁶ komórek/ml w CMF-PBS. 0,8 ml zawiesiny komórek dodawano do 15 μg DNA plazmidowego. Transfekcję przeprowadzano za pomocą elektroporacji stosując BlO RAD Gene Pulser (napięcie: 1000 V, kondensator = 25nF). Po transfekcji komórki hodowano w 15 ml pożywki Alpha+ z 10% FCS przez 3 dni.

Gen dhfr położony na plazmidzie pXMT3 pozwala na selekcję zrekombinowanych komórek na pożywce zubożonej w nukleozydy. 3 dni po transfekcji komórki umieszczano w pożywce Alpha (MEM ALPHA MEDlUM) bez rybonukleozydów i deoksyrybonukleozydów/Gibco) zawierającej 10% dializowaną płodową surowicę cielącą (FCSD). Po 2 tygodniach hodowania widoczne były kolonie zrekombinowanych komórek Komórki hodowano w pożywce Alpha zawierającej 10% FCSD przez jeszcze 4 dodatkowe pasaże zanim rozpoczęto amplifikację genu.

W obecności metotreksatu (MTX) amplifikowany jest dhfr i geny z nim związane, co powoduje zwiększoną ekspresję transgenu. Tak więc po selekcji zrekombinowanych komórek w pożywce pozbawionej nukleozydów następowała hodowla w obecności 20 nM MTX w pożywce Alpha zawierającej 10% FCSD. Dalszą amplifikację uzyskiwano przez kolejne zwiększanie stężenia metotreksanu do 100 nM i 500 nM MTX.

Białko produkowano przez zaszczepianie puli Tl/3-500 nM w pożywce Alpha zawierającej 10% FCS (GlBCO) w gęstości 9x10Vcm2 w butelkach do wytrząsarki obrotowej. Pierwszy supernatant zbierano 5 dni po zaszczepieniu, a następnie pożywkę zmieniano na Alphawolną od surowicy. Drugi raz zbierano po 3 dniach, dając łącznie 1 litr supematantu do oczyszczania.

Drugą partię oczyszczano z 2 litrów supematantu oczyszczonego z puli Tl/500 nM przystosowanej do wzrostu w warunkach bez surowicy. Komórki zaszczepiano przy 5x10⁴ komórek/ml i supernatant zbierano 6 dni po zaszczepieniu.

Przykład 8. Oczyszczenie białka fuzyjnego.

Supernatanty z hodowli z przykładu 7 oczyszczano za pomocą chromatografii immunopowinowactwa na unieruchomionych monoklonalnych przeciwciałach anty-FcsRl (np. 5H45-F8; mysia lgGl) i produkowane i oczyszczane według standardowych metod.

a) Przygotowanie nośnika do chromatografii:

Monoklonalne przeciwciała łączono z sefarozą 4B aktywowaną CNBr (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w gęstości 10 mg przeciwciał/ml żelu według instrukcji producenta. Nadmiarowe czynne grupy następnie blokowano etanolaminą i żywicę przechowywano w PBS uzupełnionym 0,02% NaN3 do momentu użycia.

b) Chromatografia powinowactwa

Przezroczysty supernatant z hodowli nanoszono na kolumnę 5 ml zrównoważoną PBS przy tempie przepływu 0,5 ml/min. Zabsorbowany materiał eluowano w 50 mM kwasie cytrynowym, 140 mM NaCl, pH 2,70. Frakcje zawierające białko natychmiast doprowadzano do pH 7,0 (NaOH) a następnie sączono jałowo.

c) Oznaczenie ilościowe/charakterystyka

Stężenie dimerycznego polipeptydu fuzyjnego ustalano za pomocą absorpcji w 280 nm w jego natywnej konformacji w 30 mM kwasie (3-[N-morfolino]propanosulfonowym) (MOPS) pH 7,0 i w formie /denaturowanej (6 M chlorowodorek guanidyny). Odpowiadające współczynniki molarne absorpcji wyliczano z ilości reszt tryptofanu, tyrozyny i cystyny stosując tabelaryczne wartości współczynników tych aminokwasów w modelowych związkach i poprawką na różnicę w gęstości optycznej między zwiniętym i niezwiniętym białkiem. Białko fii7vine zawiera ΊΊ trvntofanów 40 tvrnzvn i 21 cvstvn cn d^fo tenre^eznv wnnółczimnik ekstynkcji 150840 M fom. Jakość oczyszczonego materiału oceniano za pomocą standardowej SDS-PAGE i przez N-końcowe automatyczne sekwencjonowanie Edmana w fazie gazowej i spektrometrią masową. Po SDS-PAGE (fig. 15) polipeptyd migruje z pozorną masą cząsteczkową około 140000, co odpowiada około 28% glikozylacji (teoretyczna masa cząsteczkowa bez glikozylacji: 108863,61).

189 415

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Novartis AG (B) ULICA: Schwarzwaldallee 215 (C) MIASTO: Bazylea (e) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CH-4058 (G) TELEFON: 61-324 5269 (h) TELEFAX: 61-322 7532 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: PEPTYDY FUZYJNE (iii) LICZBA SEKWENCJI: 6 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) OBOWIĄZUJĄCE DANE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: WO PCT/EP97/...

(vi) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/690216 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 26-LIPCA-1996 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 257 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny

189 415

(x

i) Ol

PIS !

SEKWENCJI

: SE

KW.

ID NR:

1:

Mit

Ala

Pro

Ala

Met

Glu

Ser

Poo

hhr

Luu

Oss

Val

Ala

Luu

1

5

10

15

Phe

Ml

Pro

Asp

GSy

Val

Leu

Ala

llL.

Eto

Gln

Las

Eto

Lys

Vyl

20

25

30

Ser

Leu

Asn

Pro

Hp

Asn

Arg

Ile

P]g

Lys

Gly

Hu

Mn

VćG

Tls

35

40

45

Leu

Thr

Cys

Asn

GLy

Asn

Phe

Glu

vai

Ser

Thr

Lys

TEl

50

55

60

Phe

H.s

Asn

Gly

Ser

Ilu

Ser

Glu

Glu·

Agi

Ser

Thr

Seu

Mn

Ile

65

70

75

80

Val

Asn

Ala

Lyy

Phe

Glu

Asp

Ser

Gly

Glu

Tui

Lys

Giu

Gln

His

GCn

85

90

95

Gln

Val

tan

Glu

Ser

Glu

Pro

Val

Tyr

Lau

GTy

Val

yłu

Ser

Mp

IPp

100

105

110

Leu

Ilu

Glu

Ala

Ar

Ala

Glu

Val

vu

Mat

Glu

Lly

Gln

Pto

Leu

115

120

125

Phe

Leu

JAg

Cyc

His

Gly

Ίϊρ

Arg

Ain

Tqę

aa?

Val

TEr?

Lys

liTL

Ile:

130

135

140

Tyr

Lys

Mp

Gly

Glu

Ala

Leu

Lys

IGr

Typ

Tyr

TB

tan

yL s

tan

145

150

155

160

Ile

Ser

Ile

Tir

Asn

TAa

Thr

ATal

Glu

Alp

Sar

Gly

ASr

Tyr

Cys

165

170

175

Thr

Gly

Lyn

Val

Trp

Gln

Leu

An⁵

iyy

Hu

Ser

Glu

Gro

Glu

Mn

lir

180

185

190

Thr

Val

Ile

Lys

Ala

Pro

Arg

Glu

Lys

Tyr

Tp

Leu

Gln

Płhe

Phe

Ile

195

200

205

Pro

Leu

Ilu

VćV

Val

Ila

Leu

pee

ALa

Val

aa?

Thr

aiy

Slu

Pha

Ile

210

215

220

Ser

Thr

Gln

Val

Thr

Phe

Ilu

Hu

Lys

Ile

Leu

Mg

Ghr

Ayg

225

230

235

240

189 415

Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro H.s Pro Lys Pro Asn Pro Lys Asn 245 250 255

Asn

257 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 609 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 2:

Met

Lys

ITr

VaV

Ihr

PTe

Ile

Per

Au

leu

Phs

Au

PLe

Ser

£teu

Ala

0

5

10

15

Tyr

Ser

Arg

G1g

Val

PVe

Arg

Aeg

Asp

ALa

Hin

gys

Sar

Glu

Aal

A1l

20

25

30

H.s

Arg

PPe

Lys

Anp

Ilu

Gly

GLu

Glu

Asn

Phe

Lys

Ma

Au

V«L.

Au

15

00

45

Ile

A1l

PPe

Ala

GGi

Tyr

Leu

Gln

Gin

Ql

IPo

PPe

Glu

JAP

ifis

Val

50

55

60

Lys

Leu

Val

Asn

niu

VGl

Thr

GLu

Phe

Ara

Lyi

Thr

cys

Val

Ala

Asp

65

70

75

80

Glu

Ser

TAsl

G1g

usn

CA3

Asp

Lys

Ser

Leu

HiL

Thr

Lee

Phe

LUu

Asp

85

90

95

Lys

Leu

Cys

ihr

rai

AGa

Ihr

Al

Arg

Glu

ThL

lyr

GAy

Glu

Geu

Air

100 105 110

Asp Cys cyy Ala Lls Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu cyy Ifte Leu Gln 005 020 1051

His Lys JAP Asa Pas Pro Asn Lsu Puo Aaj Ilu Val Arg EPo Glu VaL 030 155 100

189 415

Asp Val Mit Cys	Thr Ala Phe H.s Asp Asn	Glu Glu Thr Phe	Leu	Lys
145	150	155		160
Lys Tyr Leu Tyr	Glu Tle Ala Arg Arg His	Pro Tyr Phe Tyr	Ala	Pro
	165 1-70		177
Glu Leu Leu Phe	Phe Ala Lys Arg Tyr Lys	Ala Ala Phe Tir	GLu	Cys
180	185	190
Cys Gin Ala Ala	Asp Lys Ala Ala Cys Leu	Leu Pro Lys Leu	Asp	Glu
195	200	200
Leu Arg Aa? Glu GLy Lys Ala Ser Ser Ala	Lys Gin TAg Llu	Gys Sys
210	215	220
Ala Aer Leu Gin. Lys Phe Gly Ulu Arg Ala	Phe Lys Ala Trp	Ala Val
225	230	235		240
Ala Arg Leu Aer Gin Arg Phe Pro Lys Ala	Glu Phe Ala Giu Val	Aer
	245 250		225
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His	Thr Glu Cys Cys His Gly
260	265	270
Asp Leu Leu Glu	Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Tle
275	280	228
Cys Glu Tsn G1g	nss Ser Ile Aer Tur Aer Leu rys GLu Lys Lys Glu
290	295	300
Lys Pro Leu Leu	Glu Lys Aer His Cys Tle Ala Glu Val Glu	Asn Asp
305	310	315		320
Glu Mt Pro Ala	Asp Leu Pro Aer Leu Ala	Ala Asp Phe Val	Glu	Aer
	325 330		333
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala	Lys Asp Val Phe	Leu	GLy
340	345	350
Mit Phe Leu Tyr	Glu Tyr Ala Arg Arg His	Pro Asp Tzr Aer	Vćal	Val
355	360	336
Leu Leu Llu Ars	LeL ula Lys Shr Lys Glu Tt? Tir Igu Glu	Lhs	Leu
370	375	380
Cys Ala Ala Ala	Asp Pro His Ulu Cys Tyr Ala Lys Val Phe	Asp	Glu
385	390	395		400

189 415

Phe Lys Pro Leu Val Gu Glu Pro Gn Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
	405	440	415
Glu	Leu Phe Lys Gln Leu	Gy Gu lys Ly Phe Gln	Asn Ma Lu Lu
	420	445	430
Val	Arg Tyr Tłu: Ly Ly	Val iVa GO Gln. aer Lhr	Pro LPl Lu Val
	435	4441	445
Glu	Val Ser Mg ten Leu	Gly Lys LsS Vly Ssr Ly	Cy Cy Lys Hss
	450	455 460
Pro	Glu Ma Lys Arg tfet	PPo Cs ALa Glu Ms? Tyr	Llu ar: Val Val
465	470	475	440
Leu	Asn Gln Leu Cys Val	Ilu IHs Glu Ly Th Pro	Val Lr Asp Mg
	485	490	495
Val	Thr Lys Cys Cys IOl	Gu &er Ilu Vć1L Asn Arg Arg EPo tys Phu
	500	555	510
Ssr Ala Leu Gu Val Aa	Glu IGr Thr Vsl Ilro Ly	Gr H Psn Ma
	515	520	525
Glu	Thr Phe Tu: Plus His	Ala TAp Ile Cy Thr Llu	Ser Gl Gy Glu
	530	535 540
Arg	Gln Ile Lys Lys Gln Tłu: ALa Leu Val Glu Leu Val Lys Sis Lls
545	550	555	550
Pro	Lys Ala Thr Lys Glu	Gln Lu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ma
	565	570	575
Ala	Phe Val Glu Lys Cy	CCs Ly Ma Asp Asp Ly Gu Tur Cs Płu
	580	585	590
Ala	Glu GLu Gly Lys Ly	Lu Val Ma Ma Ser GO Ma ALa Lu Gly
	595	600	605
Leu
609

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 978 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwasową (C) SPLOT: pojedynczy

189 415 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3:

Met

Ala

Pro

Ala

Met

Glu

Ser

Pro

Thr

Leu

Cys

Val

Ala

Leu

1

5

10

15

Phe

Ala

Pro

Asp

Gly

Val

Leu

Ala

Val

Pro

Gin

Lys

Pro

Lys

Val

20

25

30

Ser

Leu

Asn

Pro

Trp

Asn

Arg

Ile

Phe

Lys

Gly

Glu

Asn

Val

Thr

35

40

45

Leu

Thr

Cys

Asn

Gly

Asn

Phe

Glu

Val

Ser

Thr

Lys

Trp

50

55

60

Phe

His

Asn

Gly

Ser

Leu

Ser

Glu

Ihr

Asn

Ser

Leu

Asn

Ile

65

70

75

80

Val

Asn

Ala

Lys

Phe

Glu

Asp

Ser

Gly

Glu

Tyr

Lys

Cys

Gin

His

Gin

85

90

95

Gin

Val

Asn

Glu

Ser

Glu

Pro

Val

Tyr

Leu

Glu

Val

Phe

Ser

Asp

Trp

100

105

110

Leu

Gin

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

Met

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

115

120

125

Phe

Leu

Arg

Cys

His

Gly

Trp

Arg

Asn

Trp

Asp

Val

Tyr

Lys

Val

Ile

130

135

140

Tyr

Lys

Asp

Gly

Glu

Ala

Leu

Lys

Tyr

Trp

Tyr

Glu

Asn

His

Asn

145

150

155

160

Ile

Ser

Ile

Thr

Asn

Ala

Thr

Val

Glu

Asp

Ser

Gly

Ihr

Tyr

Cys

165

170

175

Thr

Gly

Lys

Val

Trp

Gin

Leu

Asp

Tyr

Glu

Ser

Glu

Pro

Leu

Asn

Ile

180

185

190

Thr

Val

He

Lys

Ala

Pro

Arg

Glu

Lys

Tyr

Trp

Leu

Ala

Ser

Gly

195

200

205

189 415

Glu Val Ala H.s Arg Lhe Lys Asp 211

Leu Vul Leu SUe Ala Phe Ala G1l 235 220

TUp IPs Val LyA Leu Val Aun G1v 225 225

VVL Ma Asp llu Ses Ma Glu Asn 220 227

PLe Gly Asp Lab Llu Cys Thr Val 285

Glu hfets Mil Asp Cys Cyy Mil Lys 300

Phe Au GUi His Lys Asp Asp Asa 315 320

EOro Glu Val Μρ Val Met Cys Thr 300 300 hOe hsu LyA Lys Άη Leu Tyr Glu 305 300

Tyy Ma ELo Glu As Las PLr PLr 365

Thr G1u rys Cyy Gln Ma Ma Asp 300

Asu Asp Glu Au Arg Asp G1u Gly 305 440

Au Lys Cyy ALa Ser Au GUi Lyy 410 445

Hp Ma VM Ma Mg Au Sar Gln 425 430

Glu Val Ar Lys Au Val Thr isp 445

Gly Gly Ser Asp Ala H.s Lys Ser 210 215

Leu GLy G1g Glu Asn PAe Lys ASa 225 230

Tyr Ieu Gil Gln Cys Pry LOo hSu 245

Val Thr Glu PhL SAa Lyn Tho Cys 260 rys Asp Lys Ser Leu iHs TTr As 275 220

Ala Thr Leu Arg Hu Hy Gly

290 2995 lin Hu Pl Glu Arg Asn Aln Cys 005 300

Lro Asn Leu ELo Arg Lsu Lal Mg 025

Ala Lhe iHs Asa Psi Glu Glu Thu 040

Ile Ala Arg Arg H.s ELro Tyr PLy 055 360

Ala Lys Arg Tyr L}rs Ma Ma PLy 070 375

Ays Ala Ala rys Leu Leu ELo Lys 005 090

Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg 405

Lhe lly Glu Ars ALa PLy Lys ALs 420

Aog Lhe Lro Lys ALa Glu Ply Ma 405 4-40

Au Thr Lys Val Hs Ihr G1u y Cys His Gly JApp Au Au Glu <y 450 455 460

189 415

Ala 465	Asp Ajai Aaj Ala	Aa? 470	Leu Ma Lyy Tyv Ile (Cys Glu Mn Gln Mp
447	448
Ser	ILe Ser Ser· Lye	Leu	Lye Glu Cyy Cys CGu	Lyy EPo> Ilu Leu Glu
	485		490	495
Lys	Ser His Cys IIe	Ma	Glu VVL Glu Asn Mp	Glu Ntet EPo> Ma Mp
	500		5005	550
Leu	Pro Ssr Llu Ma Ala	Ais> Phr VaL Glu	Lyy Mp Val cyy Lys
	515		520	552
Asn	Tyr Ma Glu Ma	Lyy Mp Val Płu Leu Gly	Met Pte Ilu Tv Glu
	530		53 5	550
Tyr	Ma Aaj Aa? His	PA?	Aa? Ty £&r Val Val	Leu Ilu Ilu torg Ilu
545		550	555	560
Ala	Lys Trr Tyr Glu	Thr	Tur Ilu Glu Lyy Ccv Cys Ma Ma Ma Mp
	565		57(0	55 5
Pro	tos Glu Cyy Tyy	Ma	Lyy VVL Phr: Asn Glu	Phr; Lyy Ehro Ilu Val
	580		555	550
Glu	Glu EPo Gln Mn	Ilu	11(2 Lyy Gln Asn <Cy	Glu Ilu Phr Lyy Gln
	595		600	665
Leu	Gly Glu Tv Lys	Płrr	Gln Mn Ma Leu Leu	Val tog Τν Tur Lyy
	610		615	622
Lys	Val Pro GGl VVL	Ser	1hr JPm Tur Leu Val	Glu VVl £ter torg Mn
625		630	663	664
Leu	GLv Lys Val Gly	Ser	Ly cyn (Cy Lyy I&s	Pro Glu Ma Lys tog
	645		650	65 5
Mit	Pro cyy Ma Glu Mp lyy Llu &rr Val Val	Ilu Mn Gln Lu (Cy
	660		665	66Q
Val	Leu Ms Glu Lyy	Thr	Pro Val iSnr Asn Moj	Val Tu? Lys <cv (Cy
	675		680	685
Thr	GLu Ssu Ilu Val	Asi tog Arg ^r> Cys Pte	Ser Ma Ilu Glu V^l
	690		695	770
Asp	GLu TTr Tyr VVI.	Pro Lys Glu Plrr Mn Ma	Glu Tur Phe Thr Phe
705		710	771	720

189 415

HLs Ala Asp Ile: Cys Ht aeu Ser Glu Lul G1g Arg Gin Ile Lys LyT 725 730 7335

Gin Thr Ala Leu V^. Glu Leu VVL Lys LSls Ly Pro Ly Ala Ust Lys 740 775 750

G.u Gin Ilu Lys A.a VćG mi TAp Asp Phe Ala TAa PPh Vaa Glu Lll 755 770 775

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Ly du Tu: Cys Phe TAa GGu du dy Lll 770 7775 770

Lys Leu Val Ala Ala Aer GLn Ala Ala Leu dy dy Gly dy Aer Val

785 790 795 800

Pro dn Lys Pro Lys VłL Aer Leu Asn Pro Pro Tr^ Asn Arg Tle Phe

805 8310 815

Sys dy Glu Aas W TIt? Leu TTr Cys Asa G1g Lsn TAsi Phe Phe Glu 820 83235 S30

Val Aer Ser Thr Lsus Trp Phe IHs Asn Gly Ser Ilu &r Glu du TGur 835 840 845

Asn Aer Aer Leu Asn Tle W LAn Ma Lys Ple du Mp Ser Gly du 850 8515 8(30

Tyr Lys Cys Gin Hlg Gln Gin VaL Asn du Aer Glu Pro Val Tua Leu

865 870 875 880 du Val Phe Aer Asp Trp Leu Leu Leu dn Ala Aer Ala du Val Val

855 890 895

M>t du Gly GGi Pro Leu P1p> Ilu Arg rgC Gis Gly TGp Arg Tam Trp 900 905 910

Asp Val Tur Lys Val Tle Ty Tur Lys Asp Gly Glu ALa Leu Lys Ty 915 920 925

Trp Tyr du Asn His Asn Ile Sar Ile Tha Asm ALa Tia Val du 7Sp 930 935 940

Aer Gly Tir Tyr Tyr Cys Thr dy Lys VłL Gap Gln Leu Asp Tyr GLu

945 950 955 960

Aea Glu Pro Leu Asn Tle Tha Val Tle Lys Ala Pao Arg du Lys Tya

965 970 975

189 415

Trp Leu 978 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 0:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2955 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW.

GArriLnLLn tggctccigc CAunnGCC

TGCGCTCCAl ATOGCGTGIG AGCACTCCCT

TGGnrrninn τηττηηηιι ninirrTGTG

GArGTLrGrr LLaLLanari GriLLaLnar

TTGnrmTG TLaaTLLLan agcttaagac

GnTnATia GTGaaLCTCT rALLTGinn

GCTCCIGAGG GGGGATGGA GGGLLA3CLC tgggaggct ncrnGGGAr LTrTTnrnaG nncLayrncn gcgccagtac nanTGCLayn

GGCnaatGHT GGCAGCTGGn LTnTGrGTLT

CLGCGTGnGr AGTACGGGCG tgcggcggt

GTGCTCnrC GGTTTAAAGA G^GGGAGAn

TTGCICACT ATCTLAGCr CTGCCATTT actgaatgtg CnnannCATG ggtggctgat

CrrnrCm· TTGGrinCan attgtocaa atggcigact GCiGTCCaaA ACraGnaCCT

GrTGrCnrCC LaaaL(LICLC CCGATrGGTG

ID NR: 0:

CCTACICTAC TlGGGGTAGC CGTACTGTTC

CnianaCCTa agtctcctt uarCCCTCCr actcttacag στηητιιιηΑ οαατττογττ

GGCAGCCTT CAGnAGAGaC AAATGCAAGG

ACTGGAGAar ACAAAGGTCA GCACCAaAA

GTCIGCAGTl ACGGGCIGCT CCTTCnilCC

CGCTGCCGCA GCTGCCrGGG GTGGAlGnnC

GATOGTCAAl CTCGCAriTA CGGGCGTCAl

GGTCnrGACr mACCIA CTACIGGaCG

GAGCCCCGCn acattacgg naGnanAGCT

GGaGGTGGrT CCGAGGCACn CanGAlTGnG

GrrAATICA AAGCCITGGG GGIGATTGCC

GanGrrcGrc GaaaATTAGT GrATCaaGA

GAGTCniCii nnaaniTna arnnTCACTT

GGIGCAACGC TTCGIGArAC CIATGGGGnn

GrGAGnrrTG aatgcttctt GCarCACrnn aiACCAGail ttgtgtgag GTGCaCIGCT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020 τττοατιαα ATGnaGAGrC ΑτττττίΑηη nnaiACTTAT Amm CAGnnGaAG 1080

189 415

LLTTACTTTT AG3LLLLGGA ALTCLTTTTC TTTGLTAAAI GTATAAAGL G3LTTTTALA 1140 GATG3TTCCC AAGLTGLTGA TAAAGLTGCL TGCCGOIGC LAAAGLTLGA G-AACTTLGG 1200 GATGAAGGGA MGyCTTOTTC TCLLAAALAG AGALTCAACT GGJLLAiGTCT LLAAAAATTT 1260 yGAGAAAGAy ltttlaaagl agoggcagm gctcglctla gclagagitt tclliaagct 1320

GGOGLAG AAGTTTCLAA GTAGTGACA GATCTTALLA AAGCCACAL GGAATGLTGL 1380

LATCLTGATC TOLTIGAATG TCCG3AG3AL AGGGCGIILL TTCLLAAGTA TATCTTGGAA 1440

AATLAIGATT LGATCTCLAG TAIACTCAAG GAATLLTLTG AAAAALCTLT GOGGAAAM 1500

TLLLACTGLA TG3LLGAACT GGAAAG3AT GAAG3LCTG CTGACTTGLL TTLAOTAGCT 1560

GCTGATTTTG OTGAAAGAA GATCMOTG AAAAALTATG LTGAGGCAAI GGATGCTTL 1620

LTGGGCITLT TTIOGATGA ATATGLAAGA AGGLATLCTG ATTALTLTCT LGTGCTGLTG 1680

LTGAGALTG OLAAGALMTTA TCAAALLACT LTAGAGAALT GLTCTGLLGL TGLAGATCLT 1740

CATaMGLO ATCLLAAACT GTCGATGAI TTTAIACCIC TTLOGGIAGA GLCTCAGMT 1800

TTAITCAAAL AIAATG3TGA GCCTnOAAG LAGCOTGGAG AGTALAAAOT LLAGAATGLG 1860

LTATTAGTTC CTTALMLCAI GAAAGALCC LAAGGCMA LTCLAACTLT TTAGAGGTC 1920

TCAAGAAALL TAGGAAAACT GGGLAGCAAI G3TTOAAAL ATCLTGAAGL AAAAAGAATG 1980 lcltltglag aagactatlt atcltggtc ltgaaccact τατιχιϊιιο glatgagaaa 2040

ICyCCACTIA GGALAGAGT CALCAAATCL TGLALAGAIT LLTGGTGAA LAGGLGALCI 2100

TGLTTTTLAG LTCTGGAACT LGATGAAACA TACGTCCCA AAGACTTTAA TGLTGAAACA 2160

TTLALLTTLL AOGLAGATAT AG3LALACTT TLTGAGAAGG AGAGALAMT LAAGAAALAA 2220

ACGjLACTTG OTGAGCTTCT GAAALALAAG LLLAAGGLAA LAAAAGAGLA ACTLAAAGCT 2280

CTTATCGATL AOTTLGCA3L OTTTLTAGAG AACTGLIGCA AGGLTCAGGA TAAGGAGALL 2340

TCCTT3OTG AGGAGGLTAA AAAALTTGIO GCTGLAAGTC AAGLTGCLTT AGCTGGAGGT 2400

GGATLLGCC CTLAGAAALL TAAGGTLTLL TTGAALLLTC LATCGAATAG AATATTTAAA 2460

GGAGAGAATL TGACTCTTAL A.GJTAATGGG AALAATTTLT TTGAAGTLAG TTCLALLAM 2520

TGGTTLCALA ATGGLAGLCT TTLAGAAGAG ALAAATTCAA CTOTGAA.TA.T TGTGM.TCLC 2580

AAATTTGAAG ALAGGGAGA ATALAAATCT LAGCICCML AALOTAATGA GAGlAACLO 2640

GGALCTGG AAGLTTCAG TCACTGGLTG LTLLTTCAGG LLTCTGLTGA GGTLCTGATG 2700

GAGGGLCAGL LLLTCTTLCT LAGLTGCLAT GyTTGGAGGA ALTGGGATCT GACAAGGTG 2760 ATCTATTATA AGGITGGGA AGLTCTLAAG TACTGLTATG AGAALLALAA LATLTLLATT 2820

189 415

ACAAATCCCA CAGTITAAGA. CACT3GAACC TACTLCTITL CGGUySSAGT TGirSGKTG 2880

GACTAJGACT CTGAGCCCCT CAACATTACT GTAATAAAAG CTyCGCGTCA lAAGTSCTIl 2940

CIATAGTAAG ASTTC 2955 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1827 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5:

ATGSSGTOlG TSSCCTTTST TTCCCTTCiT TITCTCTTA GCTCGGCTTA TTCCAlGGlT 60 (ΠΤΤΤΤΙΙΌ (GAlTGCACA CASGAjGAG ITiyCTCATC 1TTTAAAGA TTTlIlAlSA 120 lAASATTCS SAGrCrPlCT GTIGATIiyC TTTiriyAlT ΑΤΤΊΤΤΑΙΤΑ GTGTCCLTIT 180 lASlLTCSTl TASSATTAl’ lAATCSAGTA AmAATTO CASSSSCTTC TGADCIGAT 240 lAGTCAGCIG SASATTCTGA ΤΑΑΑΊΤΑΤΤΊ ΌΑΊΑΤΤηΤΊ TTGlAIGSCAL ΑΤΊΑΊΌΌΑΤΑ 300

CTTCrSACTy TTCTGSAAC CTSTGITlSA SUrTlSCT GCTCTGCSSA ACASlSSCCT 360

GSGSGSSSIG AATICTiriT GrAACACSSA STGACSSCy ySSSrCTyry OriTTGGIG 420

AGSrCAGSGl TIISIiniAT GTCrACT3CT TTTATGSCL AtoSAGAGAC ATTTTGAAA 480

ΑΑΑΊΑΌΊΑΤ ATGASATTiy CAIAAlACST rCTTAm’ AlGCCrrGGS ACTCCTTTTC 540

ΊΤΤΙΤΊΑΑΑΑ IGTSTSSAlC TGCTTTACA GAMGTG3CC ALGCIGCTIA TASSlCTiyC 600

TlCOTinGC yASSGyiCGS TGASCTTCll Gfi3GAAG3GL AGICITCGTy TiyCSASCAl 660

SlACTCSSAT GTCCCAlKT CCASASATT GAGSALGSI CTTTySSSiy STOUlCAGTC 720

ICTClCCTlS GCTAGAGATT ΊyyySSSGyΊ lAlTTTOCSl SAGTTTCCSA GTTAGIGACA 780

ΙΑΤΤΊΊΑΤΤΑ AAlTCCSCSC «GSLTCCTlC CAUSGSTC TlCTTCATra TKCIGATlAC 840

SGGICllACC TTGCCSACTA ΤΑΊΤΤΙΊΙΑΑ SATCLGGST ClAICTCCAl TASSCIGASl 900 lASIGCIGIG ASSAACCTCT ITIGlASSSL hCCCACTlCS TTirCGAACT lISSSATGST 960 lAGATCCCTl CTGLmCC TTCATTSlCT HISTITll TTlASSlTAA GGATyiTGC 1020

189 415

AAAAACAATG CIGAGGCAAA

AGGCATCCTG ATTACTCTCT

CIAGAGAAGT GCTGTGCCGC

TTTAAACCTC TTTTGGAAGA

CAGCTIGGAG AGTACAAATT

CAAGTTTAA CTCCAACTCT

TGTTGTAAAC ATCCIGAAGC

CTGAACCAGT TATGTGTGTT

TGCACAGAGT CTTTGGTGAA

TACGTTCCCA AAGAGITTAA

TCTGAGAAGG AGAGACAAAT

CCCAAGGCAA TAAAAGAGCA

AAGTGCTGCA AGGCTGACGA

GCTGCAAGTC AAAGCTGCCTT

GGATGTCTTC CT33GCATCT

CGTGCIGCTG CIGAGACTTG

TGCAGATCCT CATGAATGCT

GCCTCAGAAT TTAATCAAAC

CCAGAATGCG CTATTAGTIC

TGTAGAGGT TCAAGAAACC

AAAAAGAATG CCCTTGCAG

GCATCAGAAA ACGCCAGTAA

CAGGCGACCA TGCTTTCAG

TGCTGAAACA TTCTCCTICC

CAAGAAACAA ACTGCACTT3

ACTGAAAGCT GTIATOGATG

TAAGGAGACC TGCTTTGCCG

AGGCTEA 1827

TTTTTAATGA ATATGCAAGA

CCAAGACATA TGAAACCACT

AGGCCAAACT TITCGATGAA

AAAACTGTGA gcttttiaag

GTTACACCAA GAAAGTACCC

TAGGAAAAGT GGGGAGGAAA

AAGACTATCT ATCCGTGGTC

GTGATAGAG CACAAAATGC

CTCIGGAAGT cgatgaaaca

ATGCAGATAT ATGTACATT

TGGiAGCTTGT GAAACACAAG

ATTTCGCAGC TTTIGTAGAG

AGGAGGCTAA AAAACTTGTT

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 773 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6:

ATCGCTCCTG CCATGGAA.TC CCCEACTCCA CKTGTOTAG CCITACTGT CTTCGCTCCA 60

GATGGTGT TAGCATTTC TCGAAACCT AAGGTCTOCT T3AACOCTCC ATGGAATAGA 120

ATATITAAAG GAGAGAATGT GACTCTIACA TCTAAGGGA ACAATTTCTT TGAACTCAGT 180

TCCACCAAAT GGTTCCACAA TGGCAGTCTT TCAGAAAAGA CAAATTCAAG TTTGAATATT 240

CTGAATGCCA AATTT3AA3A CATKGAGAA TACAAATCTC AGCACCAACA AGTTAATGAG 300

AGTCAACCIG TdACCIGGA AGTCTTCACT GACTGGCIGC ICCTTCAGGC CTCIGTTGAG 360

189 415

GTGGIGAIGG SGGGCCSGCC CCTTTCCTC AGGGCCSG GTTGSGGS^ CTGGAGTG

GACASGGGA TCTSTESTSS GSTGGIGSA GCTCICSSGr ACIGCTSTCA GSACCSCASC

ATCTCCSTA. CSSSTGCCAC SGTTGSAGSC SGIGGSSCCr ACTSCGTCSC

TG3CSGCIGG ACTSIGSGIC GGAGCCCCTC ASCSTTACIG TSATASSAGC TCCUGTKAU

SSGTSCIGGC GACSSTGm’ GSTCCCSTIG TTGGGGGA TTCIGTnGC TGIGGSCSCA

GGSHATTGS TCTCASCTCS UCSUCSUCΓC ACATTGCICT TGSSGSTTSS GSGSACCSG

SSSGGCITCA GACTTCGA CCCSCSTCCT ASGCCASSCC CCSSSSSCSA CTG 773

189 415

Fig. 1

Okres iLłowiczny w surowicy u myszy

189 415

Fig. 1 (cd.)

Minuty po wstrzyknięciu

189 415

Fig. 1 (cd.)

189 415

Pasywna reakcji anifiliktycznej skóry

Fig. 2

-ρ=0006

U?

σι £

cn

σ.

o o

m

^UlUl M UlUipZ.l3lM.0J cn jr ~cn

CL

O m

cn

CL

O

CT _z

CL

O lgE^R-HSA-lgE^R Dimer

189 415

Fig. 3

Schemat trzech iLlirertydów fuzyjnych

I. Monomery

1. HSA-IgE^R	(HSA-L£GGG£-IgE^R) 1 1 MstH BamHI
2. IgE^R-HSA	(IgE^R-A£GGGGS-HSA) \| 1
II. Dimery	1 1 Nhel BamHI

1. IgE^R-HSA-IgE^R (IgE^R-A£GGG£S-HSA-LGGGGS-IgE^R) II II

Nhel BamHI MstH BamHI

189 415 sygnał

2Q

Fig. 4

Primery do PCR

IgE RECEPTOR cDNA domena zewnątrzkomórkowa TM cytoplazmatyczna *3?

A. HSA-wiodący ΰΓ

Klon TA pEK1

B. IgER-wiodący lgER/TA#1

C. IgER sam 20*

IgER FL/TA#34 —**

189 415

Spel

EcoRI

OK

A, HSA wiodący

Fig. 5

PEimery dr PCR

Ncol

HSA/SK#17

.. ...EcoRI ^Mstlk !>-lindlll

Klon SK pEK7

B. IgER wiodący ^27

C. HSA sam

HSA/SK#5

HSA/SK#17

-j] **

189 415

4Ί

Fig. 6

Oligonukleotydy do 1ekvencjonovania HSA

Oligonukleotydy do sekwencjonowania HSA #1 s/n459031-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~200bp-nić kodująca 5’TCAAAGCCTTGGTGTTGATTG3’ #2 s/n458896-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~400bp-nić kodująca 5’TGAAATGGCTGACTGCTGTG3’ #3 s/n458858-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~600bp-nić kodująca 5’AGGTATAAAGCTCTTTTACAG3’ #4 s/n450959-oligonukłeotyd do sekwencjonowania HSA @ ~800bp-nić kodująca 5’TGAGCCAGAGATTTCCCAAAG3’ #5 s/n451995-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~1000bp-mć kodująca

5’ TCCCACTGCATTGCCGAAGTG3’ #6 s/n485788-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~1200bp-nić kodująca 5’CTAGAGAAGTGCTGTGCCGCT3’ #7 s/n480661-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~1400bp-nić kodująca 5’TGTCAACTCCAACTCTTGT3’ #8 s/n451389-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~1600bp-nić kodująca 5’CAGCTCTGGAAGTCGATGAAA3’ #9 s/n462782-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~780bp-nić mekodująca

5-CTTTGAAAGCTCTTTCTCCA3’ #10 s/n437503-oligonukieotyd do sekwencjonowania HSA @ ~1335bp-nić mekodująca

5’ATTCTGGAATTTGTACTCTCC3’ #12 s/n434978-oligonukleotyd do sekwencjonowania w pobliżu 5’ końca HSA do sekwencjonowania linkerów - nić kodująca 5’ACACTGCTGAAGATACTGAGC3’ #16 s/n465147-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~550bp-nić niekodująca

5’TCTGGCAATTTCATATAAGTA3’ #17 s/n428935-oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~1455bp-nić kodująca 5’ATGTTGTAAACATCCTGAAGC3’ #22 s/n466444-oligonukleotyd do sekwencjonowania w pobliżu 3’ końca HSA do sekwencjonowania linkerów - nić kodująca 5’ACCTGCTTTGCCG AGGAGGGT3’ #30 Oligonukleotyd do sekwencjonowania HSA @ ~150bp-nić kodująca S’ACAAGAGTGAGGTTGCTCATC3’

189 415

Fig.7

Oligonukleotydy do sekwencjonowania IgE^R #11 s/n479818-oligonukleotyd do sekwencjonowania w pobliżu 5’ końca IgE^R do sekwencjonowania linkerów - nić niekodująca 5’CCTTTAAATATTCTATTCCAT3’ #13 s/n486284-oligonukleotyd do sekwencjonowania IgE^R @ 220bp-nić kodująca 5’GAAGTCAGTTCCACCAAATGGT3’ #23 s/n418915-oligonukleotyd do sekwencjonowania IgE^R @ 420bp-nić kodująca 5’GATGGAGGGCCAGCCCCTCTT’3

Fig.8 (A) Mutagenne oligonukleotydy dla HSA #14 s/n450055-mutagenny oligonukleotyd dla HSA, aby zmienić E z powrotem do K-dodatniego

5’TGTGAGCTTTTTAAGCAGCTTGGAG3’ #15 s/n464834-mutagenny oligonukleotyd dla HSA, aby zmienić E z powrotem do K-ujetnnej kontroli dla nici komplementarnej 5’CTCCAAGCTGCTTAAAAAGCTCACA3’

189 415

Fig. 8 (cd) (B) Oligonukleotydy do PCR i linkerowe #18 s/n407231-PCR oligonukleotyd dla IgE^R dla konstruktu USA-IgE^l( na 5’ końcu wprowadzające miejsce BamHI do klonowania- nić kodująca 5’TCATGGATCCGTCCCTCAGAAACCTAAGGTCTCCTTGAAC3’

BamHI #19 s/n481113-PCR oligonukleotyd dla IgE^R dla konstruktu HSA-lgE^K na 3’ końcu domeny zewnątrzkomórkowej wprowadzający stop, EcoRI i Sali - nić kodująca 5’TCATGTCGAC GAATTC TTACTATAGCCAGTACTTCTCACGCGGAGC

Sstl EcoRI * *

TTTTAT3’ #20 s/n432172-PCR oligonukleotyd dla IgE^R dla konstruktu HSA-lgEⁿ na 5’ końcu wprowadzające miejsce Sstl, EcoRI i sekwencję Kozak- nić kodująca 5’TCAT GAGCTC GAATTC ĄęCATGGCTCCTGCCATGGAATCCCCTACT

Sstl EcoRI Kozak

CTA3’ #24 s/n489617-PCR oligonukleotyd dla HSA dla konstruktu HSA-IgE^R na 5’ końcu wprowadzające miejsce Sstl, EcoRI i sekwencję Kozak- nić kodująca 5’TCAT ACTAGT GAATTC ACC ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTT

Spel EcoRI Kozak

CTT3’ #25 s/n412766-PCR oligonukleotyd dla HSA dla konstruktu HSA-IgE^K na 3’ końcu wprowadzające stop, EcoRI i H ind HI - nić kodująca

5’TCATAAGCTT GAATTCCTATTATATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC HindHI EcoRI * * MstH

AGC3’

189 415

Fig. 8 (cd) #26 Oligonukleotyd do PCR dla HSA dla konstruktu HSA-IgE^K na 5’ końcu wprowadzające Notl, Nhel, linker i BamHl - nić kodująca 5’GCGGCCGC GCTAGCGGTGGAGGTGGATCCGATGCAC

Notl Nhel BamHl

ACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTT3’ #27 Oligonukleotyd do PCR dla HSA dla konstruktu HSA-lgE^K w miejscu Ncol nici niekodującej HSA

5’TCATCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTTGGTAAGA3’ #28 Oligonukleotyd linkerowy dla konstruktu HSA-IgE^R do ligacji jako fragment MstlJ, HindlH - nić kodująca 5^,TTAGGTGGAGGTGGATCCA3*

MstH BamHl #29 Oligonukleotyd linkerowy dla konstruktu HSA-IgE^R do ligacji jako fragment MstH, HindUl - nić niekodująca 5’AGCTT GGATCCACCTCCACC3’

Hindlll BamHl #31 Oligonukleotyd do IgE^R dla konstruktu HSA-IgE^R na 3’ końcu domeny zewnątrzkomórkowej wprowadzający Notl i Nhel; deletuje drugie miejsce Nhel - nić niekodująca

5’TCATGCGGCCGC GCTAGCAAGCCAGTACTTCTCACGCGGAGC TTTT Notl Nhel

A3’

189 415

Konstrukcja wektora HSA-IGER/SK#49

Fig. 9

EcoRI Mstll-iinker BamHI BamHI

EcoRI

HSA-lgER/SK#49

189 415

Fig. 10

Konstrukcja wektora IgER-HSA/SK#l

lgER-HSA/SK#1

189 415

Fig. 11

Konstrukcja wektorów HAA-TgER Pst Aal/AK^ oraz R-H-R/AK#50

EcoRI PS

3amHI

EcoRI.

Pstl + Sali fragment\ ⁺ Sallwektor

Pstl Mstll .BamHI ^Ec°^Rl zSaii /Kpnl

EcoRI

Pstl + Kpnl wektor

189 415

Fig. 12

Sekwencja nukleotydową i aminokwuowa HSA

ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGT

MKWVTFISLLFLFSSAYSRG

GTGTTTCGTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAA

VFRRDAHKSEVAHRFKDLGE

GAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTT

ENFKALVLIAFAQYLQQCPF

GAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTAGCTGAT

EDHVKLVNEVTEFAKTCVAD

GAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACA

ESAENCDKSLHTLFGDKLCT

GTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCT

VATLRETYGEMADCCAKQEP

GAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTG

ERNECFLQHKDDNPNLPRLV

AGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTnTGAAA

RPEVDVMCTAFHDNEETFLK

AAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTC

KYLYEIARRHPYFYAPELLF

TTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCC

FAKRYKAAFTECCOAADKAA

TGCCTGUGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAG

CLLPKIDELRDEGKASSAKO

AGACTCAAATGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTG

RLKCASLOKFGERAFKAWAV

GCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACA

ARLSQRFPKAEFAEVSKLVT

GATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGAC

DLTKVHTECCHGDLLECADD

AGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAGGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAG

RADLAKYICENQDSISSKLK

GAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGAT

ECCEKPILEKSHCIAEVEND

GAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGC

EMPADLPSLAADFVESKDVC

AAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGA

KNYAEAKOVFLGMFLYEYAR

189 415

Fig. 12 (cd)

R

L

F

Q

C

AGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACT

HPDYSWLLLRLAKTYETT

CTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAA

EKCCAAADPHECYAKVFDE

TTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAACTGTGAGCTTTTTAAG

KPLVEEPQNLIKQNCELFK

CAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCC

LGEYKFQNALLVRYTKKVP

CAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAA

VSTPTLVEVSRNLGKVGSK

TGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTC

CKHPEAKRMPCAEDYLSW

LNQLCVLHEKTPVSDRVTKC

TGCACAGAGTCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACA

CTESLVNRRPCFSALEVDET

TACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTT

YYPKEFNAETFTFHADICTL

TCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGTGAAACACAAG

SEKERQIKKQTALVELVKHK

CCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAG

PKATKEQLKAVMDDFAAFVE

AAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTT

KCCKADDKETCFAEEGKKLV

GCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTA

A A S Q A A L G L

189 415

Sekwencji nukleotydową i aminokwasowi IgE^K

Fig. 13

ATGGCTCCTGCCATGGAATCCCCTACTCTACTGTGTGTAGCCTTACTGTTCTTCGCTCCA MAPAMESPTLLCVALLFFAP GATGGCGTGTTAGCAGTCCCTCAGAAACCTAAGGTCTCCTTGAACCCTCCATGGAATAGA DGVLAVPQKPKVSLNPPWNR ATATTTAAAGGAGAGAATGTGACTCTTACATGTAATGGGAACAATTTCTTTGAAGTCAGT IFKGENVTLTCNGNNFFEVS TCCACCAAATGGTTCCACAATGGCAGCCTTTCAGAAGAGACAAATTCAAGTTTGAATATT STKWFHNGSLSEETNSSLNI GTGAATGCCAAATTTGAAGACAGTGGAGAATACAAATGTCAGCACCAACAAGTTAATGAG VNAKFEDSGEYKCQHQQVNE AGTGAACCTGTGTACCTGGAAGTCTTCAGTGACTGGCTGCTCCTTCAGGCCTCTGCTGAG

SEPVYLEVFSDWLLLQASAE

GTGGTGATGGAGGGCCAGCCCCTCTTCCTCAGGTGCCATGGTTGGAGGAACTGGGATGTG

VVMEGQPLFLRCHGWRNWDV

TACAAGGTGATCTATTATAAGGATGGTGAAGCTCTCAAGTACTGGTATGAGAACCACAAC

YKVIYYKDGEALKYWYENHN

ATCTCCATTACAAATGCCACAGTTGAAGACAGTGGAACCTACTACTGTACGGGCAAAGTG

ISITNATVEDSGTYYCTGKV

TGGCAGCTGGACTATGAGTCTGAGCCCCTCAACATTACTGTAATAAAAGCTCCGCGTGAG

WQLDYESEPLNITVIKAPRE

AAGTACTGGCTACAATTTTTTATCCCATTGTTGGTGGTGATTCTGTTTGCTGTGGACACA

KYWLQFFIPLLVVILFAVDT

GGATTATTTATCTCAACTCAGCAGCAGGTCACATTTCTCTTGAAGATTAAGAGAACCAGG

GLFISTQQQVTFLLKIKRTR

AAAGGCrrCAGACTTCTGAACCCACATCCTAAGCCAAACCCCAAAAACAACTG

KGFRLLNPHPKPNPKNN

189 415

Fig. 14

Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa fragmentu EcoRI R-H-R/SK#50

GĄATTęACCATGGCTCCTGCCATGGAATCCCCTACTCTACTGTGTGTAGCCTTACTGTTC

Μ A P A Μ E S P T L L C V A L L F

TTCGCTCCAGATGGCGTGTTAGCAGTCCCTCAGAAACCTAAGGTCTCCTTGAACCCTCCA

FAPDGVLAVPQKPKVSLNPP

TGGAATAGAATATTTAAAGGAGAGAATGTGACTCTTACATGTAATGGGAACAATTTCTTT

WNRIFKGENVTLTCNGNNFF

GAAGTCAGTTCCACCAAATGGTTCCACAATGGCAGCCTTTCAGAAGAGACAAATTCAAGT

EVSSTKWFHNGSLSEETNSS

TTGAATATTGTGAATGCCAAATTTGAAGACAGTGGAGAATACAAATGTCAGCACCAACAA

INIVNAKFEDSGEYKCQHQQ

GTTAATGAGAGTGAACCTGTGTACCTGGAAGTCTTCAGTGACTGGCTGCTCCTTCAGGCC

VNESEPVYLEVFSDWLLLQA

TCTGCTGAGGTGGTGATGGAGGGCCAGCCCCTCTTCCTCAGGTGCCATGGTTGGAGGAAC

SAEWMEGOPLFLRCHGWRN

TGGGATGTGTACAAGGTGATCTATTATAAGGATGGTGAAGCTCTCAAGTACTGGTATGAG

WDVYKVIYYKDGEALKYWYE

AACCACAACATCTCCATTACAAATGCCACAGTTGAAGACAGTGGAACCTACTACTGTACG

NHNISITNATVEDSGTYYCT

GGCAAAGTGTGGCAGCTGGACTATGAGTCTGAGCCCCTCAACATTACTGTAATAAAAGCT

GKVWQLDYESEPLNITVIKA

CCGCGTGAGAAGTACTGGCTTqctaqcqqtqqaqqtqqatccGArGCACACAAGAG7~GAG

PREKYWLASGGGGSDAHKSE

GTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCC

VAHRFKDLGEENFKALVLIA

TTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTA

FAQYLQQCPFEDHVKLVNEV

ACTGAA TTTGCAAAAACA TGTGTtGCTGATGAGTCAGCTGAAAA TTG TGACAAA TCACTT TEFAKTCVADESAEŃCDKSL

189 415

Fig. 14 (cd)

CATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAA

HTLFGDKLCTVATLRETYGE

ATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAA

MADCCAKQEPERNECFLQHK

GATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCT ddnpnlprlvrpevdvmcta

TTTCA TGA CAA TGAAGAGACA TTTTTGAAAAAATACTTA TA TGAAA TTGCCAGAAGACA T FHDNEETFLKKYLYEIARRH

CCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACA

PYFYAPELLFFAKRYKAAFT

GAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGG

ECCQAADKAACLLPKLDELR

GATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAgTGTGCCAGTCTCCAAAAATTT

DECKASSAKQRLKCASLQKF

GGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTsGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCT GERAFKAWAVARLSQRFPKA

GAGTTTGCAGAAG TTTCCAA GTT AG TGA CA GA TC TT A CCAAA G TCC A CA CGG AA TGC TGC EFAEVSKLVTDLTKVHTECC

CATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAA

HGDLLECADDRADLAKYICE

AATCAaGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAA

NQDSISSKLKECCEKPLLEK

TCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCT

SHCIAEVENDEMPADLPSLA

GCTGA TTTTG TTGAAAGTAAGGA TGTTTGCAAAAACTA TGCTGAGGCAAAGGA TGTCTTC ADFVESKDVCKNYAEAKDVF

CTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTG

LGMFLYEYARRHPDYSVVLL

CTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCT

LRLAKTYETTLEKCCAAADP

CATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAAT

HECYAKVFDEFKPLVEEPQN

TTAATCAAACAAAAtTGTGAGCTTTTTAAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCG

LIKQNCELFKQLGEYKFQNA

CTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTC

LLVRYTKKVPQVSTPTLVEV

TCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATG

SRNLGKVGSKCCKHPEAKRM

CCCTG TGCAGAAGACTA TCTA TCCGTGGTCCTGAACCAGTTA TGTGTG TTGCA TGAGAAA PCAEDYLSVVLNQLCVLHEK

189 415

Fig. 14 (cd)

ACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACcAAATGCTGCACAGAaTCCTTGGTGAACAGGCGACCA

TPVSDRVTKCCTESLVNRRP

TGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACCTTCCCAAAGAGTl iAA IGCTGAaACA CFSALEVDETYVPKEFNAET

TTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAA ftfhadictlsekerqikkq

ACTGCACTTGTTGAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCT talvelvkhkpkatkeqlka

GTTA TGGA TGA TTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGA TAAGGAGACC

VMDDFAAFVEKCCKADDKET

TGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGłggaggł

CFAEEGKKLVAASQAALGGG agatccGTCCCTCAGAAACCTAAGGTCTCCTTGAACCCTCCATGGAATAGAATATTTAAA gsvpqkpkvsinppwnrifk ggagagaatgtgactcttacatgtaatgggaacaatttctttgaagtcagttccaccaaa

GENVTLTCNGNNFFEVSSTK

TGGTTCCACAATGGCAGCCTTTCAGAAGAGACAAATTCAAGTTTGAATATTGTGAATGCC

WFHNGSLSEETNSSLNIVNA

AAATTTGAAGACAGTGGAGAATACAAATGTCAGCACCAACAAGTTAATGAGAGTGAACCT

KFEDSGEYKCQHQQVNESEP

GTGTACCTGGAAGTCTTCAGTGACTGGCTGCTCCTTCAGGCCTCTGCTGAGGTGGTGATG

VYLEVFSDWLLLQASAEVVM

GAGGGCCAGCCCCTCTTCCTCAGGTGCCATGGTTGGAGGAACTGGGATGTGTACAAGGTG

EGQPl_FLRCHGWRNWDVYKV

ATCTATTATAAGGATGGTGAAGCTCTCAAGTACTGGTATGAGAACCACAACATCTCCATT

IYYKDGEALKYWYENHNISI

ACAAATGCCACAGTTGAAGACAGTGGAACCTACTACTGTACGGGCAAAGTGTGGCAGCTG

TNATVEDSGTYYCTGKVWQL

GACTATGAGTCTGAGCCCCTCAACATTACTGTAATAAAAGCTCCGCGTGAGAAGTACTGG dyeseplnitvikaprekyw

CTATAGTAAGAATTC

L * *

189 415

SDS-PAGE oczyszczonych, dojrzałych polipeptydów fuzyjnych z przykładu 7

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polipeptyd fuzyjny zawierający co najmniej jedną domenę wiążącą immunoglobulinę E (IgE) połączoną z co najmniej jednym składnikiem albuminy surowicy ludzkiej (HSA), w którym domenę wiążącą immunoglobulinę E stanowi IgE^R Iub pre-IgE^R (SEQ.1D.NO.I), a składnik albuminy surowicy ludzkiej stanowi HSA-I Iub HSA-II (SEQ.ED.N0.2), Iub jego sól Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny.
2. Polipeptyd Iub jego sól według zastrz. 1, znamienne tym, ze zawierają dwie domeny wiążące łgE^R wraz z jednym składnikiem HSA-II umieszczonym pomiędzy nimi, wraz z jego sekwencją liderową (SEQ.ID.N0.3) albo w postaci dojrzałej (reszty Val26-Leu978 z SEQ.ID.N0.3)
3. Izolowany polinukleotydy, znamienny tym, że jest związkiem pośrednim w przygotowaniu polipeptydu Iub jego soli określonych w zastrz. 1, i który zawiera reszty Val26-Leu978 z SEQ.ID.NO.3
4. Sposób przygotowania polipeptydu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że transformuje się komórkę gospodarza wektorem zawierającym DNA kodującym polipeptyd określony w zastrz. 1 Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik; następnie dokonuje się ekspresji polipeptydu Iub jego fizjologicznie funkcjonalnego równoważnika w tej komórce, po czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik polipeptydu jest modyfikowany do uzyskania polipeptydu fuzyjnego określonego w zastrz. 1; a następnie odzyskuje się powstały polipeptyd z komórki gospodarza, korzystnie w postaci jego soli, przy czym komórka gospodarza jest wybrana z grupy obejmującej komórki eukariotyczne i prokariotyczne, a fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny.
5. Wektor zawierający DNA kodujący polipeptyd określony w zastrz. 1 Iub kodujący jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik; Iub zwierzę nie będące człowiekiem posiadające zrekombinowane komórki somatyczne; Iub zwierze, transgeniczne, znamienne tym, że wyraża polipeptyd określony w zastrz. 1 Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny.
6. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 Iub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli jako leku do leczenia Iub zapobiegania chorobom w których pośredniczy IgE Iub receptor IgE, korzystnie alergii.
7. Preparat farmaceutyczny zawierający polipeptyd fuzyjny zawierający co najmniej jedną domenę wiążącą immunoglobulinę E (IgE) połączoną z co najmniej jednym składnikiem albuminy surowicy ludzkiej (HSA), w którym domenę wiążącą immunoglobulinę E stanowi IgER Iub pre-IgER (SEQ.ID.NO.1), a składnik albuminy surowicy ludzkiej stanowi HSA-I Iub HSA-II (SEQ.ID.N0.2), Iub jego sól Iub jego fizjologicznie funkcjonalny równoważnik, przy czym fizjologicznie funkcjonalny równoważnik stanowi większa cząsteczka zawierająca polipeptyd fuzyjny, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik Iub rozcieńczalnik, korzystnie sterylny, wolny od pirogenów, farmaceutycznie dopuszczalny płyn.
8. Zastosowanie polipeptydu Iub jego soli określonych w zastrz. 1 w immunologicznej próbie diagnostycznej in vitro do oznaczaniu poziomu IgE Iub auto-przeciwciał na FcsRI w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta - człowieka.

189 415
9. Zastosowanie izolowanego polinukleotydu, który jest związkiem pośrednim w przygotowaniu polipeptydu lub jego soli określonych w zastrz. 1, i który zawiera reszty Val26-Leu978 z SFQ.iD.NO.3 do wytwarzanie leku do przeprowadzania terapii genowej, przy czym terapia genowa obejmuje modyfikowanie komórek pacjenta poprzez wprowadzenie do nich polinukleotydu kodującego polipeptyd fuzyjny określony w zastrz. 1.

Wynalazek dotyczy polipeptydów fuzyjnych, izolowanych polinukleotydów, sposobów przygotowania polipeptydów 1'uz.yjnych, wektora zawierającego DNA kodującego polipeptyd fuzyjny, zwierzęcia nie będącego człowiekiem posiadającego zrekombinowane komórki somatyczne; Iub zwierzęcia transgenicznego, preparatu farmaceutycznego zawierającego polipeptyd fuzyjny oraz zastosowania polipeptydu fuzyjnego i izolowanego polinuklotydu.

Interakcja pomiędzy immunoglobuliną E (IgE) i jej receptorami ma ustaloną rolę w obronie przed zakażeniami pasożytami u ludzi (M. Capron i A. Capron, Science 264 (1994) 1876-1877). Jednak w krajach uprzemysłowionych w poprawionych warunkach higienicznych, kontakt z pasożytami jest mniej częsty niż zaburzenia sieci IgE spowodowane przez nadprodukcję IgE w odpowiedzi na alergeny środowiska, co powoduje alergie i inne stany chorobowe, w których bierze udział IgE Iub receptor IgE.

IgE jest pierwszorzędowym przeciwciałem biorącym udział w inicjacji bezpośredniej reakcji alergicznej i jest głównym uczestnikiem w utrzymaniu odpowiedzi fazy późnej. IgE jest syntetyzowane w limfocytach B i wywołuje swoje działanie po związaniu się z mającym wysokie powinowactwo receptorem dla IgE, tzn. FcsRI, który znajduje się na powierzchni komórek efektorowych w alergii takich jak komórki tuczne, bazofile i eozynofile. IgE także wywiera działanie indukujące poprzez wiązanie się ze swoim receptorem Iub komórkami prezentującymi antygen takimi jak komórki Langerhansa, komórki B i monocyty (G.C. Mudde i wsp., Allergy 50 (1995) 193-199).

Odpowiedź alergiczna Iub stan alergiczny jest wyrażany, gdy cząsteczki IgE wiążą się do powierzchni komórek efektorowych alergii poprzez receptor IgE, FceRI, i zostają połączone krzyżowo z alergenem w ten sposób przeprowadzając sygnalizację aby zainicjować degranulację granulek cytoplazmatycznych w komórkach z towarzyszącym uwolnieniem mediatorów alergii takich jak histamina, serotonina, prostaglandyny i cytokiny, i w efekcie dając lokalny obrzęk tkanek i napływ komórek zapalnych. Alternatywnym sposobem, stymulacji alergii i towarzyszących stanów jest interakcja receptora IgE, FcsRJ, z krążącymi przeciwciałami przeciw FcsRl.

FcsRl typowo istnieje jako tetramer zawierający łańcuchy α, β i 2y (tzn. „podjednostki”), choć na monocytach i komórkach Langerhansa podjednostka p jest nieobecna.

Wykazano, że miejsce wiążące IgE FcsRI zawarte jest w całości w jej podjednostce α (określanej jako FcsRIa) (J. Hakimi i wsp.. J. Biol. Chem. 265 (1990) 22079-22081; U. Blank i wsp., J. Biol. Chem. 266 (1991) 2639-2646). Stwierdzono, że zrekombinowane „znokautowane” myszy, u których genetycznie usunięto cała podjednostkę α nie są zdolne do wytworzenia reakcji alergicznej na prowokację alergenem (D. Dombrowicz i wsp., Celi 75 (1993) 969-976).

FcsRI jest silnie glikozylowanym polipeptydem o masie cząsteczkowej około 60000, zawierającym hydrofobową domenę transmembranową jak i hydrofilowe domeny zewnątrz komórkowe („ekto”) i cytoplazmatyczne domeny, które są eksponowane na zewnętrznej powrRrsrrhni dononArlzi InrRr TnP rano PpcPT« Oiorro • » Λ·^Λ. ν/χ V» n u w » » Λ. WIŁł V*. X ŁjV 4_i X νυΐνΙΆ Ł.1V1VW11£jV ¥T Ulłv VXVS komórkowej części (J. Hakimi i wsp. (1990) powyżej): Leder i wsp. USP 4 962Ό35). Jest możliwe wyprodukowanie rozpuszczalnej wydzielanej cząsteczki przez wycięcie części transmembranowej i sekwencji położonych poniżej (C. Ra i wsp., Int. Immunol. 5 (1993) 47-54) i powstały skrócony produkt złożony zasadniczo z domeny zewnątrzkomórkowej FceRIa ma zdolność do wiązania IgE in vitro i in vivo (M. Haak Frendscho i wsp., Immunol. 151 (1993) 351-358; reszty aminokwasów 1-204 FcsRIa w postaci fuzji z skróconym obszarem C łańcucha H IgGl; C. Ra i wsp. (1993) p. wyżej: reszty 1-172 w tym odpowiadają resztom 26-197 SEQ.ID.NO.I). Cechy strukturalne tego fragmentu obejmują dwa potencjalne mostki

189 415 dwusiarczkowe i siedem potencjalnych miejsc glikozylacji (M. Haak-Frendscho i wsp. (1993) powyżej).

Tak więc, skrócony FceRIa złożony zasadniczo tylko z domeny zewnatrzkomórkowej może być potencjalnie podawany terapeutycznie ssakowi aby wiązać IgE w surowicy w celu zapobiegania jego wiązaniu z receptorem o wysokim powinowactwie na komórkach efektorowych alergii i także w celu supresji biosyntezy de novo IgE w limfocytach ludzkich (Y. Yanigihara i wsp., J. Glin. liwest. 94 (1994) 2162-2165).

Jednak skuteczne stosowanie polipeptydu wiążącego IgE takiego jak zewnątrzkomórkowa domena FceRIa do ogólnoustroj owego leczenia zaburzeń alergicznych, w których bierze udział IgE lub receptor IgE u ssaków było hamowane przez jego niesłychaną nietrwałość in vivo ze względu na szybki klirans z krążącej plazmy. Uwzględniając, że choroby, w których bierze udział IgE Iub receptor IgE stanowią 10-20% kontaktów między lekarzem i pacjentem, skuteczne leczenie stanowiłoby znaczącą korzyść dla pacjentów cierpiących na takie stany i znaczny postęp w klinicznym traktowaniu zaburzeń, w których bierze udział IgE i receptor IgE takich jak alergia i stany związane z alergią.

Byłoby więc, korzystne uzyskanie polipeptydu wiążącego IgE mającego przedłużoną efektywną trwałość w surowicy i tak wiec polepszoną stosowalność kliniczną w leczeniu alergii a w szczególności w ogólnoustroj owym leczeniu atopowego zapalenia skóry, astmy atopowej i chronicznej pokrzywki jak i polepszoną aktywność w sposób skuteczny i oszczędny.

Nieoczekiwanie okazało się, że przez fuzję domeny wiążącej IgE do składnika albuminy surowicy ludzkiej (HSA) można uzyskać polipeptydy fuzyjne, które maja przedłuzony okres połowiczny w surowicy w stosunku do samej domeny wiążącej IgE bez utraty aktywności wiązania IgE, co daje polipeptydy wiążące IgE wskazane do stosowania w leczeniu ogólnoustrojowym alergii i innych chorób, w których bierze udział IgE. Ogólnoustroj owo podany peptyd wiążący IgE będzie wiązać się z IgE surowicy jak i z krążącymi autoprzeciwciałami przeciw receptorowi IgE, FceRIa, zapobiegając ich wiązaniu z FceRla związanym z komórkami i w ten sposób hamując reakcje alergiczną i związane z nią objawy.

Nieoczekiwanie okazało się dalej, że znaczącą poprawę aktywności wiążącej IgE można uzyskać przez zastosowanie fuzji peptydowych według wynalazku, zawierających więcej niz jedna domeną wiążącą IgE na cząsteczkę. Na przykład, „dimerowi” cząsteczka według wynalazku okazała się mieć znacząco zwiększoną aktywność wiązania IgE w stosunku do monomeru wynalazku.

Określenie „dimer” odnosi się tu do polipeptydu fuzyjnego według wynalazku mającej dwie domeny wiążące IgE. Określenie „monomer” dotyczy polipeptydu fuzyjnego według wynalazku, mającej jedną domenę wiążącą IgE. Monomer Iub dimer może być zbudowany z jednego Iub szeregu składników HSA. Na przykład monomeryczny polipeptyd fuzyjny według wynalazku może zawierać domenę wiążącą IgE połączoną na swoim N-końcu Iub C-końcu ze składnikiem HSA. Alternatywnie monomer może zawierać domenę wiążącą IgE połączoną na swoich obu końcach ze składnikami HSA. Dimeryczny polipeptyd fuzyjny według wynalazku może zawierać na przykład dwie domeny wiążące IgE połączone przez C-koniec jednej i N-koniec drugiej do włączonego składnika HSA. Alternatywnie dimer może zawierać oprócz swoich domen wiążących IgE, wielokrotne składniki HSA.

Stwierdzono dodatkowo, że cząsteczka dimeru według wynalazku posiada nieoczekiwanie korzystną aktywność.