TW565571B - Human serum albumin immunoglobulin E fusion polypeptides - Google Patents

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565571 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（！） ’ 本發明係有關融合多肽。其涉及包括IgE結合區和一 種人類血清清蛋白（HSA)組成份的融合多肽及其鹽。它還 涉及為製備該融合多肽的中間產物的多核苷酸和生理功能 等效物的多肽；其適宜的重組表達載體，相關的原核生物 和真核生物表達系統，以及合成融合多肽的方法。 免疫球蛋白E (IgE)和它的受體之間的相互作用在預 防人類寄生蟲傳染中扮演著重要的角色（M· Capron和八· Capron, Science 264 [1994] 876-1877)。然而，在工業國家中， 隨著衛生條件的提高，罹患寄生蟲病比隨環境變態原產生 的過量的IgE干擾IgE網路還少見，該變態原並導致的變 態反應和其它的IgE或IgE受體介導的疾病狀態。 IgE是啟動中間變態反應的初級抗體，是維持後期相 反應的主要參與者。IgE在B淋巴細胞中合成，在結合到 IgE的高親和性受體，亦即在變態反應效應細胞諸如肥大 細胞、嗜驗細胞和嗜曙紅細胞的表面發現的FCSRI之後發 揮它的作用。IgE還通過與它在抗原遞呈細胞例如朗格罕 氏細胞、B細胞和單核細胞上的受體結合發揮誘導物的功 能（G.C· Mudde 等人，Allergy 50 [1995] 193-199)。 當IgE分子通過IgE受體’ FcsRI，結合到變態反應效 應細胞的表面上時呈現出變態反應或條件，並通過變熊、反 應元變成交聯的，因此，在細胞中產生啟動細胞質顆粒的 脫顆粒的信號，伴隨著變態反應介體諸如組織胺、經色 胺、前列腺素和細胞因子的釋放，和隨之而產生的局部組 織水腫和炎症細胞的匯集。刺激變態反應和有關條件的另 請 先 閲 % 背 面 之 注 意 事 項

訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（2 ) / 一手段是IgE受體，FcsRI，與抗FcsRI的循環自身抗體的 相關症狀。

FcsRI —般以包含一個ex-鍵、一個β-鍵和兩個γ-鍵（亦 即”亞基”）的四體存在，雖然在單核細胞和朗格罕氏細胞上 不存有β-亞基。 已表明FcsRI的IgE結合位點被完全包含在它的α-亞 基（被稱為 FcsRIa)中（J. Hakimi 等人，J. Biol. Chem. 265 [1990] 22079-22081; U. blank 等人，J. Biol. Chem. 266 [1991] 2639-2646)。已經發現遺傳缺失整個a-亞基的重組”分離” 小鼠不能夠啟動對免疫刺激的免疫變態反應（D. Dombrowicz 等人，Cell 75 [1993] 969-976)。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

FcsRIa是分子量大約是60 kD的大量糖基化的多肽， 其包括疏水性跨膜區以及曝露於細胞外表面的親水性細胞 外（”外（ecto-)”）和細胞質區。FcsRIa的IgE結合能力已經 進一步被揭限於細胞外部分（J· Hakimi等人，[1990]，supra: Leder等人，美國第4,962,035號專利案）。藉由刪去跨膜部分 和其下游序列可製備一種可溶性、可被分泌的分子（C. Ra 等人，Int. Immunol. 5 [1993] 47-54);產生的基本上由人類 FcsRIa細胞外區組成的平截在生體内或生體外具有IgE結 合活性（M. Haak-Frendscho 等人，Immunol. 151 [1993] 351-358 :融合到平截的IgGl Η鏈C區域的FcsRIa的胺基酸殘 基 1-204 ; C· Ra 等人，[1993] supra^ ：在此的 FcsRIa 的殘 基1-172，相當於SEQ· ID· NO· 1的殘基26-197)。這個 片段的結構特徵包括二個可能的二硫橋鍵和七個可能的糖 5_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公羡） 565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 ) … 止它們結合到聯結細胞（cell-bound)FcsRIa上，並因此防止 和/或抑制變態反應和其相關的現象。 另外，已經發現藉由使用本發明的每分子包括多於一 個IgE結合區的融合多肽可以獲得igE結合活性的明顯改 善。例如，現已發現本發明的二聚體相對於本發明的“單 體”具有顯著提高的IgE結合活性。 在在此，術語”二聚體”是指本發明的擁有二個IgE結 合區的融合多肽。術語，，單體，，是指本發明的擁有一個IgE 結合區的融合多肽。單體或二聚體可以由單個或多個hsa 組成份所構成。例如，本發明的單體融合多肽可以包括在 胺基或者叛基末端上融合到HSA組成份的IgE結合區。另 一方面，單體可以包括在其二個末端上融合到HSA組份中 的IgE結合區。根據本發明的二聚體融合多肽可以包含例 如二個IgE結合區，其通過一個的羧基末端和另一個的胺 基末端融合到插入的HSA組成份中。另一方面，二聚體除 它的二個IgE結合區外可以包括多個HSA組成份。 另外已發現本發明的二聚體分子擁有出乎意料的令 滿意的活性。 飞 因此本發明的目的係提供包括至少一個融合到至少 個HSA組成份中的IgE結合區的融合多肽及其鹽；較二 是單體融合多肽，其中單個IgE結合區融合到一個或多 HSA組成份中，或是多聚體融合多肽，其中兩個或多個 結合區融合到至少-個脱組成份中；更佳的是擁有 IgE結合區和至少一個HSA組成份的二聚體。 人 的 個 IgE 個 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNsT^iFf2i〇><297公瘦 565571 A7 —-----—_B7__ 五、發明説明（5 ) 本發明的另一個目的係多核苷酸中間產物。 在此，術語，，被融合，，或，，融合”是指多肽，其中： (1) 將一個給定的功能區（亦即，IgE結合區）在它的羧 基末端藉由共價（較佳為肽，例如，醯胺）鍵結合到另一個 功能區（亦即，HSA組成份）的胺基末端或結合到其本身藉 由共價（較佳為肽）鍵結合到另一個功能區的胺基末端的連 接子（linker)肽上；和/或 (π)將一個給定的功能區（亦即，IgE結合區）在它的胺基 末端通過共價（較佳為肽，例如，醯胺）鍵結合到另一個功 能區（亦即，HSA組成份）的羧基末端或結合到其本身藉由 共價（較佳為肽）鍵結合到另一個功能性區的羧基末端的連 接子肽上。 類似地，當在本發明的多核苷酸中間產物方面被使用 時’ “被融合”意味著將編碼第一個功能區的核苷酸序列的 3'-[或5’-]末端通過共價鍵或者間接通過一個其本身較佳 在它的末端上共價鍵結合到編碼第一功能區的多核苷酸， 和編碼第二功能區的多核苷酸上的核苷酸連接子結合到各 自編碼第二個功能區的核苷酸序列的[或末端。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

較佳地，融合多肽或其鹽是單體或二聚體；當它是二 聚體時其包括二個融合到HSA組成份中的igE結合區，例 如’在其羧基末端上融合到HSA組成份胺基末端的第一 igE 結合區和其胺基末端融合到HSA組成份羧基末端的第二 IgE結合區。

本發明的融合多肽亦也可以包括除IgE結合區和hsA 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 565571 A7 ______B7 _____ 五、發明説明（6 ) … (請先閲讀背面之注意事項再 組成份外的其它功能區，例如全長或平截（例如，可溶的細 胞外片段）人體蛋白質，例如，細胞因子或尿激酶的胺基末 端片段。這些附加的功能區可以本身起連接子肽的作用， 例如用於將IgE結合區結合到另一個IgE結合區或HSA組 成份上；另一方面，它們可以位於融合分子中另外的地方， 例如，在其胺基或羧基末端。 本發明的融合多狀的例子由下式表示： I Ri-l-r2 II Rs-L-Ri III Ra-L-R^L-Rj IV RJ-L-RJ-L-R2

、?T V R2~L-R1 -L-R1 甘中 I為IgE結合區的胺基酸序列， R2為HSA組成份的胺基酸序列， 每個L獨立地是共價（較佳為肽）鍵，或是藉由共價（較佳為 肽）鍵結合到R:和/或r2末端的肽連接子， 從而上述的分子片段是直接可讀的，亦即左邊相當於分子 的胺基束端而右邊相當於羧基末端。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 現已發現當融合多肽藉由IgE結合區前導時IgE結合 處於高水平；亦即當IgE結合區組成成熟融合蛋白質的N_ 末端部分（諸如，在上述式I、ΠΙ和IV的化合物中）時。本 發明特別較佳的實施例包括上述式ΙΠ的二聚體，亦即其中 導致表達的蛋白質區域為其羧基末端融合到HSA組成份的 胺基末端的IgE結合區，反之，HSA組成份本身羧基末端 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公廣） 565571 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) …術語（前-IgER)表示 SEQ. ID· NO· 1 的殘基 MevLeiim 術語“ IgER，，表示前-lgEa的成熟形式和形成SEQ· ID· ν〇· 1的殘基Val26-Leu2()4(亦即，FcsRIa的細胞外區）。SE.Q> ID. NO. 2 :天然前-HSA的顯性形式的胺基酸 序且，(在此被稱為”前-HSA Γ)，包括殘基MetrLeu^p。 由SEQ· ID· NO· 2的殘基Asp25- Leu609表示成熟天然 蛋白質的顯性形式（在此被稱為” HSA I”）。 術語”前-HSA 11”表示天然的序列在黢基末端被平截 一個胺基酸（Leu609)，因此為SEQ. ID· NO· 2的殘基 Met^-Gly^os 〇 前-HSA II的成熟形式在在此被稱為”HSA II”，由SEQ. ID· NO· 2 的殘基 Asp25-Gly_ 表示。 SJLQ· ID· NO· 3 ：在實施例5中製備由質體R-H-R/SK #50的EcoRI片段編碼的胺基酸序列，包括在殘基1-204 的”前-IgER”序列；殘基205-211的連接子AlaSer(Gly)4Ser(以 下被稱為”L/);殘基212-795的HSA II序列；殘基796-799的連接子（Gly)3Ser(以下被稱為”L2”）；和殘基800-978 的” IgER”序列。 在此稱為”IgER-LrHSA II-L2-IgER”或者，另外稱 為”IgER-HSA-IgER二聚體”是以實施例7中所揭示的方式由 CHO表達的本發明的成熟二聚艘的融合多肽具有SEQ.ID. ΝΟ· 3的胺基酸序列Val26_Leu978。 S_EO· ID. NO. 4 ：實施例 5 的質體 R-H_R/SK #50 的 EcoRI片段的核苷酸序列，包括··在位置10-621編碼，，前- 11 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 565571 A7 B7 _ 五、發明説明（9 )

IgER”的多核苔酸序列；在位置622-642編碼L的寡核苷 酸；在位置643-2394編碼HSA II的多核苷酸序列；在位 置2395-2406編碼L2的募核苷酸；和在位置2407-2943編 碼”IgER”的多核菩酸；和在位置2944-2949具有二個終止 密碼子。 在編碼片段末端和在連接子區域中的限制部位點位於 位置 1-6 ; 622-627 ; 637-642 ; 2387-2393 ; 2401-2406; 和2950-2955上。Kozak序列在核：g：酸位置7-9上。 不同於共有HSA核苷酸序列的點突變位於位置804, 1239，1290, 1446, 1815, 20 64 和 20 79 上◊因為點突變在 擺動位置中，所以它們不影響胺基酸序列。 SE,Q. ID., NO, 5 ：麄基酸序列的天然前-HSA的顯性 塑式的核菩酸序列相對應於圖12和SEQ. ID. NO. 2。 gJLP· ID· NO· 6 ：全_長天然人FcsRIa的顯性形式的 莖棊酸序列，包括信號序列，係對應於圖13和SEQ· ID. NO. 1的胺基酸序列。 圖式說明 在下列圖式中，所示的分子是可直接閱讀的，亦即， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 左邊的相當於胺基（或5，-)末端和右邊的相當於羧基（或3f) 末端。 ua-c : 半衰期：在一段時間後（注射 後10至800分鐘）在生體内下列蛋白質濃度（皮莫耳 (picomoles)/每毫升的血清） (A)游離HSA I蛋白質，和

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（1()) … (B)在實施例7中所揭示的由CHO細胞製備的IgER 蛋白質（被稱為，，游離α鏈，，）和IgEn_Li_HSA nL2IgER二聚 艘融合多肽C被稱為，，IgER_HSA-IgER二聚體”）。 (c)根據注射後10分鐘時的金清漠度，與將來自（B) 的二聚體融合多肽rigE^HSHgER”）的血清半衰期校正到 1比較，來自（A)的游離HSA的血清半衰期。 mu過敗反應產生的外涂 在小鼠的靜脈注射如實施例7(對照組接受〇微克/公 斤）中所揭示製備的IgEi^LrHSA n_LfIgER多肽（”IgER_ HSA-IgER二聚體”）的系列稀釋液（1〇微克/公斤，5〇微克/ 公斤，或500微克/公斤）；面積：mm2 ;在藉由皮内注射 單克隆（monoclonal)老鼠IgE抗二硝基苯基（DNp)抗體和包 含1 %偶氮藍的DNP-牛血清清蛋白溶液的產生致敏作用之 前間隔為5、15或30分鐘。 里一5一：本發明的三個融合多肽的圖解示意圖（二個單 體和一個二聚體），同時也顯示出多肽連接子： I· 單體： (1·)包括經由L2(”GGGS”）融合到igER中的HSA II(在 圖中被稱為”HSA”）的HSA前導單體。編碼HSA π的位置 Leu0()7Gly_的核苷酸正如所示的一樣包含唯一的Mstn位 點’和編碼L2的GlySer的核苔酸包含BainHI部位（被編碼 的胺基酸下面被加上直線）； (2·)包括在其羧基末端上經由、（亦即”ASGGGGS”） 融合到HSA II(在圖中被稱為”HSA”）中的IgE前導區單體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐοχϋ公釐） (請先閲讀背面之注意事項再^^本頁) 訂

565571 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 編碼Li的募核苷酸分別包含一個Nhel位點和一個BamHI 位點（在h的被編碼胺基酸AiaSer和GlySer的下邊被加上 直線）。 II· 三聚體:包括第一個在其羧基末端上經由L融合到 HSAII(在圖中被稱為”HSA”）的胺基末端的IgER的Ig]£結合 前導區單體’其中其羧基末端經由L2融合到第二個IgER 中，同時限制部位在上述單體的編碼多核苷酸中ό 1 4 : f截全長人類FcεRIαcDNA(被稱為”IgE受體 cDNA”）&得到DNA的PCR以物，所得到的DNA編碼：⑴ IgEl [藉由募核苷酸#18被加至Fes Rla編碼鏈的5,末端的 BamHI位點；和藉由募核菩酸#19被加至非編碼鏈的3,末 端的終止密碼子和EcoRI和Sail位點] (ϋ)前-IgER [將SstI、EcoRI和Kozak位點加至FcsRIa編碼鏈的 ^末端的募核苷酸#20 ;在FcsRIoc的非編碼鏈中加入Notl 和Nhel(並缺失第二Nhel位點）的募核苷酸#31]; (iii)前-IgER [上述所使用的募核苷酸#20和#19]: (A·) ”前導HSA”：上述之⑴亞克隆（subcloning)到SK載體 中’得到在HSA II前導單體的構建中使用的克隆用載體τα 克隆pEKl ; (Β·) ’’前導IgER”：上述之（ii)亞克隆到SK載體中，得到用 於製備IgER-前導單體的構建物IgER/TA#i ; 請 先 閱 讀 背 Λ 之 注 意 事 項 再 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 B7_ ___ 五、發明説明（12 ) … (C·) ”單獨的IgER”：上述之（iii)亞克隆到SK載體中，得 到用於表達作為標準使用的成熟IgER的構建物igER FL/TA#34 〇 雙星號代表二個終止密碼子。 平截全長人類前-HSA I cDNA以產生編砥下列 序列的cDNA的PCR引物對:

⑴欺ϋ端融合到L。中的前-HSA II

[將Spel、EcoRI和Kozak序列加到編碼鏈的5,末端 的募核苷酸#24 ;在HSAII的3,末端加上編碼Mstll和 Hindlll部位的連接子的募核苷酸#28和#29]; (⑴融合到HSA II的5’東端部中的L2 [將Notl、Nhel、連接子和BamHI位點加至編碼鏈的 募核4酸#26 ’在非編碼鏈中包含n col位點的募核菩酸 #27]；

(iii)前-HSA I

[上述使用的募核苷酸#24 ;並將終止密碼子、Ec〇ri 和Hindlll位點加至非編碼鏈的3,末端的募核苷酸#25]; (A·) ’’前導HSA” ：將上述之⑴亞克隆到sk載體中，得到 用於構建HSAII前導單體的pEK7 ; (Β·) ”前導IgER”：將上述之（ii)亞克隆到sK載體中，得到 用於構建IgER前導單體的HSA/SK#5 ; (C·) ”單獨的HSA”：將上述之（⑴）亞克隆到SK載體中，得 到編碼用作標準的成熟天然人類血清清蛋白（亦即hsa、） 的 HSA/SK#17 〇 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' — -—— (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _____B7 五、發明説明（13 ) … 圖6 :人類金清清蛋白（HSA)序列測定寡核苔酸#1-10、12、16、17、22和30，用於測定在TA中克隆和 在連接到IgE結合片段之後材料的序列。 圖7 : IgE受體序列測定篡核苷酸#1}、13和23 , 用於測定在TA中克隆和在連接到HSA組成份之後材料的 序列。 圖8 : (A) 人類血清清蛋白的致突變寡核苷酸#14和 #15 ； (B) 用於構建融合多肽的PCR和連接子募核苷酸 #18-20、24-29 和 31 〇 里一HmgER /SK#49載體的椹逮，包括編碼前-HSA 11(在圖中被稱為’’HSA”）的多核苷酸，通過將pEKl的 BamHI、Sail 片段連接到 BamHI、Sail-切口的 pEK7 中， 該多核苔酸在3f末端上藉由編碼連接子l2 (在圖9中 用’’GGG”表示）的募核苷酸融合到編碼igER(在圖中被稱為 IgER)的多核答酸Y末端。 1 10 : !g.写尽_HSA/SK#1載體的槿逑，包括編碼前- IgER(在附圖中被硪為”IgER”）的多核苷酸，通過將igER /TA#1 的 SstI 、 Nhel 片段連接到 SstI 、 Nhel-切口的 HSA/SK#5中，該多核苷酸在3r末端上藉由連接子 (用”GGG”表示）的募核苷酸融合到編碼只5八11(，，1^八”）的 多核苷酸的末端。 里JJ一: HS/^IgER Pst Sal/SK#37 恭被的構建，包括 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "' 565571 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 __________ B7五、發明説明（14 ) 編碼HSAII (用”HSA3”標明）的多核苷酸，通過將HSA- IgER /SK#49的PstI、Sail片段連接到SK載體中。該多核苷酸 在Y末端上藉由編碼連接子l2(沒有表示）募核答酸融合到 編碼IgER(被稱為，，igER”）的多核苷酸的5'末端，還表示了 包括編碼前-IgER(被稱為”igER”）的多核5酸的載體R-H-R/SK#50的構建，該多核苷酸在τ末端上通過^的寡核苷 酸（未示出）融合到編碼HSA 11(稱為”HSA”）的多核苷酸的 5f末端’反之其通過l2的寡核苷酸（未示出）融合到編碼 IgER(被稱為”IgER”）的多核苷酸中。藉由將HSA_IgER pst Sal/SK#37 的 PstI、ΚρηΙ 片段連接到 PstI ΚρηΙ-切口的 IgER-HSA/SK#l 中。 :相當於 SEQ. ID· NO· 2 和 SEQ· ID. NO· 5 的人類血清清蛋白的核g酸序列和胺基酸序列。 Μ 13 ：相當於 SEQ· ID· NO. 1 和 SEQ· ID. NO· 6 的IgER的核苷酸序列和胺基酸序列。 Μ 14 ：相當於 SEQ· ID· NO· 3 和 SEQ. ID. NO. 4 的ll-H-R/SK#50的EcoRI片段的核苷酸序列和胺基酸序 及，其編碼R1-HSA-R1二聚體融合蛋白質。HSA序列用斜 體表示。連接子序列表示在較下的位置。不同於共有HS A 核苷酸序列的點突變在雙倍低的位置表示^因為點突變處 於擺動位置中，所以它們不致影響胺基酸序列。在片段末 端和在連接子區域的限制性位點在下面被劃上直線。 垦—15 :實施例7的純化的成熟融合多肽的SDS-PAGE ： ____17_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 _B7 ____ 五、發明説明（15 ) … 施用至凝膠的總量：8微克（第1道），6微克（第2 道），4微克（第3道）和2微克（第4道）；分子量標準： 97.4，66.2，45.31，21 ·5 和 14.4kDa(第 5 道）。 本發明涉及包含至少一種融合到至少一個HSA組成份 中的IgE結合區的融合多肽及其鹽。 術語”IgE結合區”是指能夠以一種防止IgE與它的受體 FcsRI結合的方式與哺乳類動物例如人類IgE結合或以其 他方式與其聯繫的胺基酸序列。 人類FcsRIoc的cDNA和得到的胺基酸序列是已知的 (J.kochan 等人，Nucleic Acids Research 16 [1988] 3584;和 Leder等人，美國第4,962,035號專利案）。人類FcsRIa編 碼NH2末端信號肽[胺基酸殘基（包括第一個蛋胺酸jMetr AU25]，個類似於免疫球蛋白的細胞外區（殘棊val26-Leu204)，一個疏水性的跨膜區域（殘基Gln205-ne224)，和一 個親水的細胞質尾部（殘基Ser225-Asn257)(請參考SEQ· ID· NO· 1)。在胞内加工期間酶切掉信號肽。在此包括天然人 類FcsRIot的顯性形式的全長胺基酸序列，如seQ.ID.N0· 1 ° 在此”IgER”表示SEQ. ID· NO· 1的胺基酸序列val26- Ι^ιι204 (編碼細胞外區）；術語”前-igER”表示seQ. ID. NO· 1 的殘基MetrLeu^i；編碼細胞外區下游的信號序列）。

IgE-結合區為例如一個與上述定義之IgER具有較佳至 少80%、較佳至少85%、更佳至少95%或最佳至少99%同 源性的胺基酸序列（所計算的同源性是以校準序列和插入 18 ί紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ι〇χ297公董) ' --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

565571 A7 B7 五、發明説明（16 ) 缺假使需要達到序列相同的最大百分數後，天然序列 與被改變的序列之間相同的百分數，天然分子的全部序列 長度的函數來計算）。 在本發明的融合多肽的小組中，IgE-結合區組成份是 (Xa) 其中（Xa)為： (a) IgER ;或 (b) 一種天然產生的IgER的等位基因，或 (Ο在羧基末端上藉由1-12(諸如1-1〇 , 1β7或1-4)胺基 酸平截的（a)或（b);或 (d) (a)、（b)或（c)的變異體。 變異體是指： - 藉由一個或多個高達至1〇(諸如1-7或1-5)個胺基酸 的缺失（它們不同於在羧基末端的平截）修飾的（a)、（b)或 (c) 的序列； - 在胺基酸序列内部插入總數多達10(諸如L5)個胺基 酸，或在每一個末端插入多達100個胺基酸；或 總數多達15(諸如1-5)個胺基酸的保守置換。 較佳的IgE-結合區是 (Xb) 其中（Xb)為： (a) IgER ;或 (b) 在羧基末端平截1-7個胺基酸的IgER ;或 (c) (a)或（b)的變異體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 請 閲 讀 背 面 之 項 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 B7 五、發明説明（17)

IgE-結合區更佳的是 (Xc) 其中（Xc)為= (a) IgER ;或 (b) 在羧基末端平截1-7個胺基酸的IgER(諸如參考SEQ. ID· NO. 1 的序列 Val26-Ala197)。

IgE-結合區最佳的是IgER。 較佳地，以可分泌多肽形式重組製備任何同源體、平 截體或變異體，亦即編碼1結合區的成熟肽序列可以從 宿主細胞中分泌，其中它（或前體形式，諸如前-形式）在宿 主細胞中從多核苷酸合成。 本發明的重組融合體的另一個主要組成人類血清清蛋 白（HSA)，構成極大量的血漿蛋白質，構成血m總蛋白質 含量的重量的60%。人類血清清蛋白的分子由分子量為 66.5kDa的585個胺基酸的單個非糖基化多肽鏈所組成。 清蛋白特有的特徵是其複雜的二硫鍵形式（F.F· Clerc等人， J. Chromatogr. 662 [1994] 245-259)。作為血清最大量的蛋白 質，在維持滲透體積莫耳濃度和血漿體積中，人類血清清 蛋白在整個人體中，特別是與它主要有關的腸和血室中廣 泛地分佈。而且，在人體它通過肝臟被緩慢地清除，在體 内表現出14至20天的半衰期（T· A· Waldmann，”Albumin Structure, Function and U$es?\ Pergamon Press (1977) 255-275)。人類血清清蛋白沒有酶或免疫功能。它是一種參與 各種天然和治療性分子的内源性運輸和轉移（H· Lu等人’ 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閱 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（18 ) FEBS Lett. 356 (1994) 56-59; WO 93/15199; EP 648 499; P. Yeh 等人，PNAS USA 89 (1992) 1904-1908 ; EP 413 622)。 人類細胞初始以前多肽原的形式合成血清清蛋白。當 蛋白質通過内質網腔時，除去18胺基酸（包括第一個蛋胺 酸）的信號序列，在N-末端剩下6胺基酸（主要形式： Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)，它們在該穿過分泌器官的運輸 期間或緊接著隨後，遭受蛋白酶解的切除。 眾所周知人類血清清蛋白是多形態的（D.C· Carter和J.X· Ho，Adv. Prot. Chem. 41 (1994) 153-203)。例如，清蛋白 Naskapi 以 Glu372 代替 Lys372，前清蛋白 Christchurch 具有改 變的前序列，例如Glu24代替Arg24(Latta等人，美國第 5，100,784號專利案）。 天然產生的蛋白質的顯性形式的完全胺基酸序列（在 此被稱為”前-HSA I原”）是已知的（A. Dugaiczyk等人，PNAS (1982) 71-75) (SEQ· ID· NO· 2)。成熟蛋白質的顯 性形式（“HSA Γ)由 SEQ· ID· NO· 2 的 Asp25-Leu609 表示。 本發明的融合多肽的HSA載體可以是與SEQ· ID· NO· 2(亦即HSA I)的殘基25-609具有至少80%，較佳至少 8 5%、更佳至少95%或最佳至少99%同源性的胺基酸序列 (同源性是以在校準序列和引入缺口，假使需要，獲得最大 百分數的序列相同後，天然序列和被改變的序列之間的相 同百分數，天然分子全部序列長度的函數來計算）。 在本發明的融合多肽的小組中，H S A組成份是 (Ya) ____ 21_ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

、1Τ 565571 Α7 Β7 五、發明説明（19 其中（Ya)為： (a) HSA I ;或 請 先 閲 讀 背 Λ 之 注 (b) 一種天然產生的（a)的等位基因，或 (Ο藉由在政基末端平截(諸如1-5，丄或幻胺基酸 的U)或（b);或 ⑷在胺基酸殘基n上終止的平截體⑷在此^是369 至 419，特别是 η 為 373、387、388、389、39〇 和 407(如揭示於美國第5,38〇,712專利案中）；或 (e) (a)、（b)、（c)或（d)的變異體。 變異體是指： - 藉由一個或多個高達10個（諸如1-7或1-5)胺基酸的 缺失（它們不同於在羧基末端的平截）修飾的（a)、（b)、（c) 或（d)的序列； - 在序列之内總數多達10個（諸如1-5)胺基酸的插入， 或多達100個胺基酸在任一末端上的插入；或 - 總數多達15(諸如1-5)個胺基酸的保守置換。 HSA組成份更佳的是 (Yb) 其中（Yb)為： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (a) HSA I ;或 (b) 一種天然產生的（a)的等位基因，或 (c) 在羧基末端平截1-10(諸如1-5，1或2)胺基酸的（a) 或（b);或 (d) U)、（b)或（c)的變異體。 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______B7____五、發明説明（2〇 ) ^ HSA組成份更佳的是 (Yc) 其中（Yc)是： U) HSA I ;或 (b) 在其羧基末端上平截1-10(諸如1-5，1或2)胺基酸 的HSAI(這樣平截的例子是” hsaii”，其是由SEQ.ID.NO· 2的Asp25-Gly608表示的胺基酸序列）。 在一個更佳的小組中，HSA組成份是HSA I或HSA 11，特別是HSA II。 特別較佳的是實施例7的融合多肽，尤其沒有前導序 列’亦即 SEQ· ID. NO· 3 的多肽 Val26-Leu978。 較佳地，用於製備本發明的融合多肽的天然HSA的任 何同源體、平截體或變異體將沒有酶功能；故將不能防止 或抑制IgE結合區與血清igE的結合。進一步較佳的是任 何同源性或變異艟將具有至少14天的血清半衰期。 對於IgE結合區或HSA組成份，術語，，保守置換，，表示 用其它的具有類似性能的一個或多個胺基酸取代，這樣預 計至少二級結構和較佳四級結構將大致上是不改變的^例 如’典型這樣的取代包括用丙胺酸或纈胺酸取代甘胺酸、 天冬酿胺取代縠胺醯胺、絲胺酸取代蘇胺酸和精胺酸取代 賴胺酸。所有的胺基酸（除甘胺酸外）較佳是天然產生的L_ 胺基酸。 較佳地，每個IgE結合區與IgER至少具有95%的同源 性，且每個HSA組成份與HSA I至少具有95〇/〇的同源性。 __ 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 --- (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

、?τ

565571 A7 _B7 五、發明説明（21 ) 在其它較佳的小組中： - 如上所定義，每個IgE結合區較佳是（Xa)，和每個HSA 組成份是（Ya)，或較佳是（Yb)，或更佳是（YC); - 如上所定義，每個IgE結合區較佳是（xb)，和每個HSA 組成份是（Ya)，或較佳是（Yb)，或更佳是（yc); - 每個IgE結合區較佳是（Xc)，和每個HSA組成份是 (Ya)，或較佳是（Yb)，或更佳是（YC)。 如上所定義，在其它較佳情況中，IgE結合區是igER 和HSA組成份是（Ya)，或較佳是（Yb)，或更佳是（yc)，和 最佳是HSA I或HSA II，特別是HSA II。 在此上述較佳情況也可以特別地用於每個式I、π、 III、IV和V的多肽中。 本發明較佳的多肽是那些包含第一個通過其羧基末端 與HSA II分子的胺基末端融合的iggR分子，其中hsa II 以其羧基末端與第二個IgER分子的胺基末端融合（IgER是 SEQ· ID· NO· 1 的殘基 Val26-Leu204 ;和 HSA II 是 SEQ· ID· NO· 2 的殘基 Asp25-Gly608)。 本發明特別較佳的多肽包括上述式ΠΙ的二聚體，其中 每個心是IgER和&是HSA II。特別較佳的是式ΠΙ的二聚 體，其中每個L是1至25胺基酸。 任何肽連接子（在本文式I至V中用”l”表示）較佳地可 以單獨折叠和具有IgE結合區的活性；沒有顯示產生有序 二級結構的傾向，該結構可以干擾IgE結合區或導致病患 的免疫反應，並具有可與IgE結合區相互作用的最小的疏 __ 24 本&張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4· ( 2⑴χ297公董） --- 一 (請先閲讀背面之注意事項再

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 _________B7 五、發明説明（22 ) 水性和電荷特徵。 月大連接子較佳是1至500個胺基酸；更佳是1至250 胺基酸；和更佳是1至1〇〇(諸如1至25、1至1〇、1至7 或1至4)個胺基酸。連接子較佳是直鏈的，亦即非支鏈的。 一般’包括Gly、Ala和Ser的肽連接子可望滿足連接子的 標準。例如，本發明的連接子包括：GlyGlyGlySer(在此 為 L!)和 AlaSerGlyGlyGlyGlySer(在此為”L2”）。也可以使 用各種其它長度和序列組成的連接子。 本發明也包括編碼本發明的肽連接子的募核苷酸。這 樣的募核苷酸應該是與編碼IgE結合區和HSA組成份的多 核苷酸一起”框内融合”，和較佳包括在分子中唯一的限制 性位點。”框内融合，，的意思是： (1) 在IgE結合區和HSA組成份的閱讀框中沒有由連接子 募核苗酸造成的移位；和 (2) 在IgE結合區的閱讀實框和HSA組成份之間沒有翻譯 終止。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明進一步包括新的融合多肽的生理功能等效物， 其一般是合成新多肽的中間產物。術語，，生理功能等效物” 較佳是指一個包含本發明的融合多肽的大分子，該大分子 已被加入有效表達和從特定宿主細胞分泌本發明成熟重組 融合多肽所必須或需要的這些胺基酸序列。這樣加入的序 列一般是在成熟多肽的胺基末端，並通常構成一個用於將 它們導入分泌通道的前導序列，並且一般是在多肽從該細 胞中分泌時和之前被酶切掉。可以從相關多肽的天然N-末 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2K)x 297公一 ' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 __ B7 五、發明説明（23 ) 端得到信號序列，或它可以從編碼分泌的蛋白質的宿主基 因獲得，或它可以從任何已知的用於提高感興趣的多肽分 泌的序列中獲得，包括合成序列和所有在，，前，，和，，原，，區之 間的組合。在信號序列和編碼成熟多肽的序列之間的接點 應該相當於宿主中的酶切位點。 在IgE結合區導致表達亦即在融合分子中其它編碼序 列的上游的融合多肽中，有利的是使用天然FcsRIa前導序 列（亦即 Meq + SEQ. ID. NO· 1 的 Ala2-Ala25)，這已被有效 地用於從哺乳類動物表達系統（例如CHO，COS)以及巴斯 德畢赤酵母(Pichia pastoris)中得到成熟多肽。 天然二聚體融合多肽IgER-L^HSA II-L2-IgER的生理功 能等效物的例子是：前-IgER-LrHSA II- L2-IgER。然而， 附加的前導序列不必要是人類FcsRIa的前導序列和可以 從任何合適的來源得到，只要它適合於從特定的宿主中有 效的表達/分泌成熟多肽。例如，HSA的前序列原也可以 用於製備上述之二聚體融合多肽，特別用於在酵母菌中的 表達。 在HSA組成份導致表達的本發明的融合多肽中，合適 的前導序列可以包括天然前導序列。例如，H S A的天然前 原一區域可以用於完成從哺乳類動物（諸如CHO、COS)細 胞或巴斯德畢赤酵母(Pic,hia pastoris)中分泌成熟的異種 多肽。 由HSA II-L2_IgER表示的成熟融合多肽的生理功能等 效物的例子是：前-HSA „-L2_IgER原。然而。其它前導序 __ : _______________________________26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 __B7 _____ 五、發明説明（24 ) 列對於HSA或對於宿主細胞來說不必要是天然的，可以產 生在特定的宿主中的成熟融合蛋白質有效表達（美國第 5,100,784號專利案；美國第5,330,901號專利案）。 本發明也包括為製備本發明的重組融合多肽的中間產 物的多核苷酸，包括編碼融合多肽或其生理功能等效物的 多核苷酸和編碼連接子肽的寡核苷酸，諸如圖8中所揭示 者。 作為另一目的，其提供一種製備上述定義的重組融合 多肽或其鹽的方法，其包括： (a) 用包含編碼上述定義的融合多肽或其生理功能等效 物的DNA的載體轉化為宿主細胞； (b) 在那個細胞中表達的該融合多肽或其生理功能等效 物，其中生理功能等效物多肽被修飾（諸如藉由信號序列的 酶切）以產生上述定義的融合多肽；和 (c) 從宿主細胞中回收產生的多肽，較佳作為分泌產物， 可選擇地為其鹽的形式。 本發明的另一目的係提供用於表達融合多肽的載體， 較佳為質體。這些載體包含編碼上述定義的多核誓酸或其 生理功能等效物的DNA。一般，能夠轉化可表達融合多肽 的微生物的適宜載體包括編碼融合多肽，與轉錄和翻譯調 節序列相連的核苷酸序列的表達載體，例如啟動子 (promoters),它們一起構成一個表達盒（cassette)。啟動子可 來自所用特定宿主的基因，或可以例如藉由生體外定點誘 變，或引入另外的控制單元，或合成序列修飾這些控制區。 •______ 27 本紙張尺纽财關家縣（CNS ) A4· ( 210X297公 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 _B7_____ 五、發明説明（25 ) 因此特定地用在本發明的表達盒還包括一種轉錄和翻譯終 止區，其在指定宿主中是功能性的，其位置在編碼雜交大 分子的序列的3f末端。除表達盒外，載體將包括一個或多 個能使轉化宿主被選擇的標誌基因p這樣的標誌基因包括 對抗生素具有抗性的標誌基因諸如G418。這些抗性基因 將在允許在給定宿主中表達合適的轉錄和翻譯信號的支配 下被應用。 更特別地，本發明的重組融合多肽的製備可以如下所 述地完成： A. 融合蛋白質表達載體的構建 在重組融合多肽的構建中，第一步是在克隆載體中亞 克隆部分融合多肽。在這種情況下，”克隆用載體”是一個 能夠在宿主原核細胞中自動複製的DNA分子，例如質體、 黏粒（cosmid)或噬菌體。克隆用載體一般包含一個或少量 的限制酶識別部位，在那裡外來DNA序列可以規定的方式 插入而不會喪失載體的必要生物功能，以及一個適用於鑒 定和選擇用克隆用載體轉化的細胞的標誌基因。一般，標 誌基因包括提供四環素抗性或胺苄青霉素抗性的基因。在 J. Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory ManuaL， 第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989])中揭示適 合的克隆用載體，和例如可以從各種不同的來源獲得。 在 A· Shimizii 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 [1988] 1907-1911 中揭示 FcsRIoc cDNA 克隆 pGEM-3-110B-l，和 其可以由 American Type Tissue Collection (ATCC stock (67566) 28 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS ) A4規格 (210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再頁)

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（26 ) 獲得。單鏈的人肝臟cDNA可以由Clontech (PCR-ready Quick Clone cDNA，Cat. D#7113-l)獲得。HSA序列是可從 GenBank 購得，登記號#$: V00495, J00078, L00132, L00133 〇 如實施例2中所揭示者，HSA cDNA可以藉由使用#24和 25募核苷酸的PCR擴增而獲得。 編碼合適的IgE結合區或HSA組成份DNA的多核苷酸 可以使用聚合酶鏈反應（PCR)進行製備。PCR使用單鏈 cDNA模板和募核苷酸引物的混合物。PCR的方法藉由已 知的方法進行（參見諸如C.R.M· Bangham，“The Polymerase Chain Reaction: Getting Started” in Protocols_in_j^man Molecular Genetics· Human Press [1991]，Ch，I，1-8 頁）。在盒 (kits)中使用的PCR盒和材料也可從各種來源所購得。盒 和使用方法進一步揭示於諸如美國第5,487,993號專利案 中。 藉由PCR或如果需要使用編碼已知信號肽序列的合成 募核苷酸可加入編碼信號泰的DNA序列。可以在框架中用 編碼融合多肽的N-末端的DNA序列框内亞克隆編碼異種 信號肽的DNA序列。 多核苷酸的融合可以藉由在中間載體上的亞克隆來完 成。另外，可將一個基因直接克隆到包含其它基因的載體 中。可以使用連接子和接合體連接DNA序列。 根據傳統的技術進行亞克隆，例如，藉由使用限制酶 切以得到合適的終止，使用鹼性磷酸酶處理以避免不希望 的DN A分子的連接，和用合適的連接酶連接❶這些操作的 29 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公A ) (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂

565571 A7 B7 五、發明説明（27 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 技術揭示於文獻中，並且在現有技術中是已知的。 B. 融合多肽的克隆表遠 然後，從克隆用載體中酶切克隆融合多肽，插入表達 載體中。一般合適的表達載體包含： (1) 原核DNA單元，其編碼細菌複製起點和抗生素抗性 標誌基因以提供在細菌宿主中表達裁體的生長和選擇； (2) 控制轉錄起始的真核DNA單元，諸如啟動子；和 (3) 控制轉錄物加工的DNA單元，諸如轉錄終止/多腺苷 酸化序列。 因此，本發明的另一目的係涉及用於表達本發明的融 合多肽中的載體，較佳是質體載體，其包含在此揭示的編 碼本發明的融合多肽的多核苷酸序列。合適的可以轉化原 核或真核細胞的表達載體包括（含有編碼融合分子，與根據 所用的宿主細胞選擇的轉錄和翻譯調節序列相連的核苷酸 序列）的表達載體。為了在大腸桿菌（E.coli)中表達，可以 使用例如在 M.W· Robertson，J. Biol. Chem. 268 (1993) 12736-12743中所揭示的載體。希望產物是形成二硫鍵的， 但不是糖基化的。為了在酵母菌中表達，可以使用表達載 體’例如提供的 pHIL-D2 (San Diego, CA，USA) Pichia pastoris 表達盒的Invitrogen (目錄#K1710-01)。希望蛋白質產物是形 成二硫鍵的和是糖基化的。其它合適的酵母菌表達系統包 括釀酒酵母 CSaccharomvces cerevisiae)和 Kluveromvces lactis)。對於在桿狀病毒中表達，載體諸如pAC36〇，pVL1392 和 PVL1393 (Invitrogen，San Diego, CA，USA)可用於昆蟲細胞 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（2丨GX297公釐 請 先 閲 讀 背 之 注 項 Η 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7_五、發明説明（28 ) 的感染，它預料會分泌糖基化和形成二硫鍵的產物。 一般，本發明的融合多肽是糖蛋白，特別地，當在哺 乳類動物細胞中表達時，本發明包括可處於任何糖基化， 或形成二硫鍵狀態的融合多肽。特別地，突變分析建議在 IgE受體α鏈的N-連接糖基化部位的第一、第二和第七位 置（A.Shimizu 等人，ENAS USA 85 [1988] 1907-1911，圖 2)(相當於SEQ· ID· NO· 1的胺基酸殘基46、67和191) 上的N-連接糖基化增加了 lgER分子和包含它的單髏和二 聚體的生物活性。最佳的表達系統是在其中所添加的任何 糖將最類似於衍生出多肽的天然分子中的糖的那些。已知 酵母菌和昆蟲細胞對糖蛋白的修飾不同於哺乳類動物細 胞，而大腸桿菌在分泌後不能加上糖分子。因此，在來自 任何這樣的表達系統的表達可產生對診斷應用（例如變態 反應性疾病的檢測）有用的蛋白質細胞時，表達這種作為治 療分子的產物，最佳的形式是在哺乳類動物細胞令表達或 可能地在轉基因哺乳類動物的乳汁中表達。 為了在哺乳類動物宿主中表達，在表達盒中使用的轉 錄和翻譯調節信號可以從病毒來源諸如腺病毒、中乳頭狀 瘤病毒或猴病毒中獲得，其中調節信號與具有高水平表達 的特殊基因有關。合適的轉錄和翻譯調節序列也可以從哺 乳類動物基因例如肌動蛋白、膠原、肌球蛋白和金屬硫蛋 白基因中獲得。轉錄調節序列包括足以控制哺乳動物細胞 RNA合成開始的啟動子區域。典型的哺乳類細胞的例子是 中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、SV40-轉化猴腎細胞（c〇s)、 31

(請先閲讀背面之注意事 --__ 項再頁} 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 B7 五、發明説明（29 )

HeLa、BHK、NIH瑞士鼠胚肪細胞、鼠、猴或人類成纖維 細胞、或鼠肝細胞瘤細胞。 為了在哺乳類動物中表達，優先的方法是從CHO細胞 分泌® CHO和人細胞都不加有通常在鼠細胞例如C127和 SP2/0細胞中表達的al，3-連接半乳糖殘基。對這種糖連接 的抗體存在於人類血清中[C.F· Goochee等人，BioTechnol. £ [1991] 1347-1355]，能夠影響從這些鼠細胞表達的重組產物 的半衰期，可得性和清除率。CHO、dhfr-細胞是二氫葉 酸還原酶（DHFR)的突變體，因此不能從頭合成嘌呤、胸苷 和甘胺酸。具有DHFR基因野生型複製的染色體整合質體 的複製數可以藉由將用這些質體轉化的細胞曝露於提高水 平的胺甲喋呤、葉酸類似物中來增加或擴大，其中葉酸類 似物爭奪結合在酶活性部位的葉酸。用於在CHO、dhfr-細 胞中的表達的合適載體是pMT2 (R.J. Kaufman等人，EMBOJ. 6 [1987] 187-193)。pMT2載體具有DHFR基因的野生型複 製，其中DHFR基因轉錄為具有外來基因的單個mRNA。 因此，在用提高濃度的胺甲喋呤對轉化CHO、dhfr-細胞 處理中，外來基因和DHFR基因二者同時被擴增。預期從 這些細胞中分泌的產物在哺乳類動物類型中是形成二硫鍵 和糖基化的。 使用各種技術包括磷酸鈣轉染、脂質體介導轉染、電 穿孔等可以將表達載體引入宿主細胞中。較佳地，選擇和 繁殖轉染細胞，其中表達載體被穩定地整合至宿主細胞中 俾產生穩定的轉化體。細胞可以在例如DMEM介質中培 32 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

It 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 _______ B7 五、發明説明（3〇 ) 養。分泌到介質中的多肽可在細胞轉染或藉由諸如抗生素 抗性選擇之後’接著建立穩定的細胞系後之24至72小時 的瞬時表達之後，藉由標準生物化學的方法回收。 傳統的從培養物中回收表達多肽的方法包括使用眾所 周知的生物化學技術分級分離培養物中的含多肽部分。例 如，已知用於蛋白質分級分離的凝膠過濾、凝膠層析、超 濾、電泳、離子交換或親和層析的方法可以被用於分離在 培養物中發現的表達蛋白質。此外，傳統的免疫化學方法， 例如免疫親和或免疫吸附也可以被採用。俾用於轉化、培 養、擴增、篩選和產物的製備和純化的技術也是眾所周知 的（例如請參閱 J· Sambrook 等人，[1989]，supra: R.J. Kaufman, Genetic Engineering： Principles and Plenum Press, Vol. i [1987] 156-198)。 本發明的融合多肽被表明可被治療性地用於治療哺乳 類動物，特別地是人類患有變態反應疾病的患者。融合多 肽的IgE-結合區與在肥大細胞、嗜鹼和朗格罕氏細胞中天 然存在的IgE受體爭奪IgE，這樣igE與施用的蛋白質結 合，而不能與變態反應效應細胞結合來介導變態性反應。 IgE-結合區也可以藉由與FcsRI的自身抗體結合而與IgE受 體-FcsRI競爭。 因此’本發明係提供一種藥物組合物，其用於競爭性 地與IgE(和/或FcsRI的自身抗體）結合，和/或抑制IgE的 產生，因此用於抑制性和/或預防性治療IgE_或IgE-受體介 導的棄亂’更具體地治療變態反應和與變態反應相關的疾 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）^ '~' (請先閲讀背面之注意事項再頁) 訂 565571 A7 B7 五、發明説明（ 31 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 病，例如異位性皮膚炎、異位性氣喘和慢性蓴麻疹。 或IgE受體·介導的紊亂” 1§£_或IgE受體·介導的 紊亂疋指與細胞結合的IgE受體一 FCsri與igE或FcsRI自 身抗體結合有關的紊亂，諸如典型變應性反應（”超-IgE綜 合症）如支氣管氣喘、異位性氣喘、枯草熱、花粉變態反 應、變應性鼻炎、異位性皮膚炎、濕疹、過敏反應以及慢 性蓴麻疹和非變應性Kimura，s疾病和其它的肺、皮膚或自 身免疫疾病。 特別地，異位性皮膚炎，異位性最引人注目表現之一， 是與高金清IgE水平有關的慢性炎症的皮膚病和一種對各 種環境變應原的致敏作用（Μ·-Α· Morren等人，J· Am· Acad· Dermatol,紅[1994] 467-473)。目前對異位性皮膚炎的治療 集中在使用含留族化合物的乳膏上，已經成功地使用環孢 菌素A治療特別嚴重的異位性皮膚炎（H Granlund等人，Br· J^Dermatol. 121 [1995] 106-112)，但是副作用限制這種治療 只能用於少數患者。一種抑制IgE的作用，諸如肥大細胞 的脫顆粒和由B細胞和其它抗原遞呈細胞產生的IgE介導 的抗原遞呈的製劑，將優於任何目前已知的對異位性皮膚 炎的治療，此外對其它較輕形式的變態反應也是有用的。 除異位性皮廣炎和異位性氣喘外，本發明的多肽還可 以用於治療或預防慢性蓴麻疹（CU)，其中借助於FcsRia 的激活作用的肥大細胞的脫顆粒起主要作用。本發明的融 合多肽與另外提議用於該疾病治療的抗-IgE單克隆抗體相 反，可以清除抗FcsRIa的循環自身抗體。 34 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __ ____B7__ 五、發明説明（32 ) 多肽係可以包括本發明的多肽，較佳為未修飾多肽或 其藥學上可接受的鹽以及在藥學上可接受載體或稀釋劑的 藥物組合物形式施予。 術語”鹽”特別地是指藥學上可接受的鹽，其由藥學上 可接受的非毒性酸製備以形成例如多肽鏈的胺基的酸加成 鹽，或由藥學上可接受的非毒性鹼製備以形成例如多肽鏈 的羧基的鹼性鹽。這樣的鹽可以作為中間鹽和/或本發明多 肽的胺基或羧酸未端的鹽形成。 合適的藥學上可接受的酸加成鹽是藥學上可接受的非 毒性有機酸、聚合酸或無機酸的加成鹽。合適的有機酸包 括乙酸、抗壞血酸、苯甲酸、苯磺酸、檸檬酸、乙基磺酸、 富馬酸、葡萄糖酸、穀胺酸、氫溴酸、氣化氫、異硫羰酸、 乳酸、馬來釀、蘋果酸、扁桃酸、甲基磺酸、黏酸、硝酸、 草酸、撲酸（pamoic)、泛酸、磷酸、水揚酸、破珀酸、硫酸、 酒石酸、和對-甲苯確酸以及聚合酸，諸如單寧酸或羧甲基 纖維素。合適的無機酸包括無機酸，諸如氣化氫、溴化氫、 硫酸、碟酸和靖酸。 合適的用於形成羧基鹽的無機鹼的例子包括鹼金屬鹽 如納、鉀和鋰鹽；鹼土金屬鹽如鈣、鋇和鎂鹽；和銨、銅、 亞鐵、兩鐵、鋅、亞錳、鋁和錳鹽。較佳的是銨、鈣、鎂、 卸和納鹽。藥學上可接受的適合於形成羧基鹽的有機鹼的 例子包括有機胺，例如三甲胺、三乙胺、三（正丙）胺、二 環己胺、β-(二曱基胺基）乙醇、三（羥甲基）胺基甲烷、三 乙醇胺、β-(三乙胺基）乙醇、精胺酸、賴胺酸、組胺酸、 本紙張尺度適用t^gT^r)_A4規格（加謂公慶） (請先閲讀背面之注意事項再 H; 訂

565571 A7 ^ ___B7 五、發明説明（33 ) N-乙基旅咬、hydrabamine、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡 萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗉、哌啶、咖 _驗和普魯卡因。 多肽的酸加成鹽可以傳統的方法藉由將多肽與一或多 §量所希望的無機或有機酸諸如氣化氫的接觸來進行製 備。可以藉由將多肽與一或多當量所希望的鹼諸如金屬氫 氧化物如氫氧化鈉，金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽如碳酸鈉或碳 酸氩鈉；或胺如三乙胺或三乙醇胺的接觸來方便地製備肽 的羧基鹽。 本發明因此也涉及包括一種上述所定義之新穎的融合 多肽或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋 劑的藥物組合物。載體較佳是不育、無致熱原、胃腸外可 接受的液體。纟、生理鹽水、含水葡萄糖和二醇是較佳的 液體載體或稀釋劑，特別地（當等滲壓時）用於可注射的溶 液。組合物可以是一種傳統製備的冷凍液。 該組合物可以全身地，亦即胃腸道外（諸如肌肉内、靜 脈内、皮下或真皮内）給藥，或藉由腹膜内給藥。對於胃腸 道外給藥，較佳i也是該融合多肽基本上溶於病人血清或血 漿中，例如在1毫升的血清或血漿中溶解至少丄毫克的多 亦可以藉由已知的局部給藥技術施用該組合物。合適 的製齊1形式的例子包括噴霧劑、滴眼溶液、滴鼻溶液和軟 膏例如可以這樣製備喷霧劑即將肽溶解在合適的溶劑 中將它裝入為按紐式噴霧器的嗔霧器中供傳統採用的吸入

In m _ (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 36 565571 五、發明説明（34) 治療之用。可以這樣製備〇pthalmic和滴鼻 組成份溶解在蒸餾k & 、亦即將活性 劑、熱滲壓劑、增稠割 _ ^ ^ ^ 1，例如緩衝 消毒劑，將混合物調整到沖為4至9。例如::= =#亦：_種由聚合物溶液諸如2%的含水m乙稀 ^合物和-種驗諸如2%的氩氧化鈉組成的混合物， 侍到-種凝膠，將一定量純化的融合多肽與該凝膠混合。 該組合物較佳的是皮下或胃腸道外給藥，特別血型地 是皮下給藥。 ' 本發明亦包括-種治療變態反應性疾病的方法，其包 括將治療有效量的本發明的融合多肽或及藥學上可接受的 鹽施用於需要此種治療的病患。在變態反應疾病發病過程 中（亦即當特別需要減輕症狀時）實施該治療方法；或作為 一種持續或預防性治療方法亦即在預期的1§£-或IgE受體_ 介導的紊亂，例如變態反應開始之前）。 考慮到例如欲治療疾病的程度或嚴重性、患者的年 齡、性別和症狀、治療的長短和特定的融合蛋白質的藥效、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由傳統方法決定的因素，根據該方法的有效劑量可以在大 的範圍中改變。 因為，各患者的IgE(以及FcsRI抗體）含量變化較大， 所以根據該方法的治療有效劑量可被最佳描述為以莫耳為 單位是血清IgE和FcsRI的抗體總量的5 X 1〇2和1 X 1〇4 倍之間，對患者可以以日為基礎一次或多次給藥進行治 療。也可以以月為基礎（或這樣以周為間隔亦是適合的）一 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（35 ) ~ 次或多次給藥形式施用該組合物。 對於一個一般病患（70公斤），合適的月劑量在每月大 約〇·5亳克本發明的融合多肽，諸如實施例7的二聚體的 較低劑量至大約500毫克的較高劑量之間改變，較佳大約 在1毫克至大約300毫克，更佳大約20毫克至大約250毫 克；通常一月一次或兩次地施用等分劑量。具有高血清IgE 濃度或處於早期治療階段的病者中可能需要較高的劑量範 圍，例如500毫克/月至2克/月。 給藥劑量和時間可以改變。在該疾病的治療中，在該 組合物開始給藥時可施用上述範圍的較高的劑量，並且與 後期給藥相比更頻繁地施用。正如上述所指明的一樣，藉 由測定病患jk清中的IgE和FcsRI抗體的濃度可以確定適 合的劑量。例如，在早期的發病過程中，在一般患者（7〇 公斤）中以200至500毫克多肽的周劑量施用本發明的融 合多肽，例如實施例7的二聚體。在血清IgE和FcsRI抗體 清除之後’治療手段可以降至周療程或每隔一周的療程， 同時劑量為每療程50微克至1〇〇毫克的多肽。 本發明的組合物可以單獨或與本發明其它的化合物或 另外的藥學試劑諸如抗組織胺或皮質類固醇類結合施用。 本發明亦包括本發明的融合多肽在任何標準形式的體 内診斷分析例如FcsRI中的用途，其用於測定在從人類病 患中得到的生物試樣諸如血液或組織試樣中的IgE或 FcsRI的自身抗體（例如在慢性蓴麻疹病患）中的水平。 HSA組成份有利地易於在EUSA形式的分析中以£或FcgRi ____ _38 本紙張尺度適用中國S家標準)八4胁（210X297公釐) -- (請先閲讀背面之注意事項 I-- 再ml本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 _______ 五、發明説明（36 ) 的自身抗體的結合和檢測◊在試樣中存在的IgE或自身抗 鱧的量可用於測定病患對該病患已經受到其影響的物質的 變態反應。還可以測定IgE或自身抗體水平以確定抗變態 反應治療的效果，以及在監測一段時間後病患的變態反應 狀況。 另外，本發明包括使用編碼本發明的融合多肽的多核 苷酸在人體中進行基因治療以治療jgE — 或IgE受體-介導的 奮的方法。基因治療方法包括藉由在病患中引入編碼本 發明的融合多肽的多核苷酸來修飾病患的細胞並表達來自 於這些的細胞的多肽。例如，首先從患者中去提取細胞， 然後在培養物中藉由插入多核苗酸對其進行遺傳修飾，並 將所得到的修飾細胞重新引入到病患中，從而本發明的多 肽被病患的細胞表達。 另一方面，可藉由直接插入編碼多肽的載體DNA在體 内修飾細胞。 合適的用於修飾的細胞包括内皮細胞或白血球細胞。 為了基因治療的應用，本發明的多核苷酸較佳係處於可調 卵（例如誘導）啟動子控制下。因此，使用已知的可調節啟 動子系統，可以使多肽的表達依賴於患者對外源因子中的 曝露。 本發明亦包括使用基因治療方法來製備將本發明的融 合多肽例如在乳汁中表達的非人類細胞重組或轉基因動 物。這樣修飾的非人類動物也構成本發明的一部分。有用 動物的例子包括小鼠、老鼠、兔子、豬、羊、山羊和牛， _ 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ胁（210X297公董) --- (請先閱讀背面之注意事項再^?^本頁) 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 __________五、發明説明（37 ) 已經用標準技術（例如D.R· Hurwitz等人，Transgenic Research 2 [1994] 365-375)使所有這些動物轉基因❶這些動物可以被 用於建立模型的目的或蛋白質的實際生產。特別地，本發 明涉及表達本發明的融合多肽的轉基因鼠、羊、牛或豬。 製備這樣的動物的方法是眾所周知的。編碼本發明的融合 蛋白質的多核苷酸可以在生體外或生體内被導入動物的體 細胞中以生產被遺傳修飾但不會將該遺傳修飾傳給後代的 體細胞重組動物。另一方面，可以將多核苷酸插入胚胎的 細胞中以生產能夠將表達本發明蛋白質的能力傳給後代的 轉基因動物。 用於基因治療的細胞轉染可以傳統的方式來完成，例 如借助於電穿孔、磷酸鈣沉澱反應、基於脂質體的方法、 皮下注射、顯微注射或通過，，基因搶，，的使用。基於質體的 載體較佳地含有用於在真核細胞中篩選具有細胞毒胺基糖 者G418的穩定的轉染子標誌基因，如新霉素基。 藉由將融合多肽的基因序列摻入反轉錄病毒載體完成 感染。這種摻入的各種不同的方法在現有技術中是已知 的。一種已經廣泛採用的方法是使用一種干擾老鼠的反轉 錄病毒來包裝該反轉錄病毒，和一種雙嗜性包裝細胞系來 製備感染雙嗜性病毒以用於感染靶供體細胞中。 藉由以下的描述實現本發明其它的特徵： 血清半衰期的生體内測定 一般方法： 在大約25克重的滩性SKHl/hr/hr Charles River小鼠中胃 40 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' "- (請先閲讀背面之注意事 1Γ 項再本頁) 訂

565571 經濟部中央標準局賀工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（38 ) 腸道外注射在無菌的無Ca2+、Mg2 + -PBS中稀釋的試驗用 蛋白質。將小鼠分組如下： - 組（i)，接受130微克（1 nmole)的融合多肽，諸如實施 例7中製備的二聚體IgE^L^HSA II-L2-IgER，或 - 組（ii)，接受 60 微克 IgER(2 nmole)，或 - 組（iii)，接受 65 微克 HSA 1(1 nmole)。 在注射後10分鐘、30分鐘、3小時、6小時和12小 時從每隻鼠中取出100微升的血液。藉由離心作用製備血 清。用a) IgE受體ELISA結合分析；b)抑制ELISA ;或 c) HSA夾層ELISA，以如下所示測定各種不同蛋白質的血 清漠度水平： a) IgER ELISA結合分析： 藉由下列Sandwich ELISA檢測IgE結合確定IgE血清 濃度··在4°C下將200ng人類IgE在增濕室中的100微升 塗覆緩衝液中的 COSTAR Strip Plate-8 井（Cambridge，MA， USA)中固定過夜。每井用300微升無Ca2+、 Mg2 + -PBS (卩117.2)沖洗兩次。在室溫下用200微升含5%35八（5丨811^) 的無Ca2+、Mg2 + -PBS阻斷平板1小時。再用300微升含 0.05%吐溫20(PBST)沖洗2次之後，加入稀釋在100微 升的1:10稀釋的（在無Ca2+、Mg2、PBS中）鼠血清中的試 樣，在室溫下孵育1小時。 用300微升PBS沖洗井兩次，在室溫下用100微升（lng) 的單克隆抗-人類IgE受體抗體諸如5H5/F8孵育1小時。 室溫下再一次用300微升PBST將井沖洗兩次，並用100 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再頁)

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565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（39 ) 微升的羊抗-鼠IgG-HRP (Biorad，1:2000稀釋在無Ca2+、 Mg2 + -PBS中）培育1小時。用300微升PBST將平板沖洗3 次，用100微升的ABTS(Biorad)底物測定辣根過氧化物酶 (HRP)結合物。在5分鐘後用100微升的3%草酸使反應停 止。用EASY READER光度計在405nm下測定顯色強度。 b) 抑制 ELISA ： 在4°C下，將100ng FcsRIa在增濕室中的100微升塗 覆緩衝液（〇·1Μ NaHC03，0.01% NaN3 ρΗ:9·6)中的 Nunc 96 井免疫平板（F96 Cert· Maxisorb)中固定過夜。用300微升 PBS、0.05%吐溫20(洗滌緩衝液）將每個井沖洗4次。對 於不同組的井，或者加入陰性對照物（50微升以1:25稀釋 在PBS、0.05%吐溫20，2%FCS中的鼠血清）、融合多肽 標準稀釋液系列，諸如IgER-LrHSA II-L2-IgER標準（從400 ng/ml至1.6ng/ml的稀釋液）或加入該試樣的稀釋液。將 標準和試樣稀釋在以1:25稀釋在PBS、0.05%吐溫20、 2%FCS中的鼠血清。此後立即加入50微升的在稀釋緩衝 液中為400ng/微升的人類IgE-生物素結合物並混合。在孵 育混合物中最終鼠血清稀釋度為1:50。 在37°C下培育2小時之後，用300微升洗滌緩衝液沖 洗平板4次，加入50微升以1:1000稀釋在稀釋緩衝液中 的鏈霉素親和素-鹼性磷酸酶結合物（Gibco)，並在37QC下 培育1小時。用300微升洗滌緩衝液沖洗平板4次，並在 加入100微升底物（磷酸對硝基苯酯的二乙醇胺緩衝液， pH9.8 [BIORAD])之後，在37°C下培育30分鐘之後用50微 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

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565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4〇 ) 升 2MNaOH終止反應。用 BIOMEK-1000 工作站（Workstation) 操作光度計在405nm下測定光密度。使用Beekman IMMUNOFIT ELISA測定表從標準曲線進行定量測定（4-參數對數曲線擬 合法）計算β 結合百分比= [〇D(試樣或標準值）/〇d(緩衝值）]Χ 100) c) HSA 夾層 ELISA ·· 在4°C下，將500ng單克隆抗鼠HSA (HSA-9)在增濕 室中的100微升塗布緩衝液（0.1M NaHC03，0.01%NaN3 pH: 9·6)中的Nunc 96井免疫平板（F96 cert· Maxisorb)中固定過 夜。用300微升洗滌緩衝液（PBS，0.05%吐溫20)將每個 井沖洗4次。加入100微升以1:1〇〇稀釋的鼠血清（PBS， 0.05%吐溫20、2%FCS =稀釋緩衝液）作為陰性對照物， 或加入100微升稀釋在以1:1〇〇稀釋的鼠血清中的標準樣 (lpg/ml至2ng/ml人類血清清蛋白，KABI)或樣品。在37°C 培育2小時之後，用300微升洗滌緩衝液沖洗平板4次， 並加入100微升稀釋在緩衝液中的lng/微升的兔子抗 HSA-生物素結合物。藉由使用CH-Seph4B-HSA的免疫親和 層析純化該抗HSA-生物素結合物，通過與鼠血清-瓊脂糖 的免疫吸附消除與鼠血清的交叉反應活性。在37°C下培育 2小時之後，用300微升洗滌緩衝液沖洗平板4次，加入 50微升以ldooo稀釋在緩衝液中的鏈霉親和素-鹼性磷酸 酶結合物（Gibco)並在37°C下培育1小時。用300微升洗 條緩衝液沖洗平板4次，在加入1〇〇微升底物（1毫克/毫 升峨酸對硝基苯酯的二乙醇胺緩衝液，pH 9.8 BIO = RAD) ___ 43 本纸張尺度適用中國國家標‘（CNS ) A4規格（21〇χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

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經濟部中央標準局員工消費合作社印$L 565571 A7 B7 五、發明説明（41 ) 後，在37°C下培育15分鐘後用50微升2MNaOH使反應 停止。用BIOMEK-1000工作站（Workstation)光度計在405nm 下測定光密度。使用Beckman IMMUNOFIT ELISA測定表從標 準曲線進行定量測定（4-參數對數曲線擬合法）。 結果· 在圖1(A)和（B)中給出作為注射後所經過時間的函數 的二聚體融合多肽IgER-LrHSA II-L2-IgER、游離IgER(稱 為”游離oc鏈”）或HSA 1(稱為”HSA”）的濃度，單位皮莫耳/ 毫升。 圖1(B)顯示在給藥之後僅在.大約10分鐘内可檢測到 游離受體，而在給藥大約12小時内一直可檢測到二聚體融 合多肽。 圖1(C)顯示HSA和二聚體融合多肽的相對清除率動 力學。在組織-血液分佈在第一個10分鐘穩定之後，二聚 體和HSA表現出幾乎相同的清除率曲線。這證實了藉由與 HSA融合可以大體上延長IgE-結合區的血清半衰期。 在小鼠中被動皮膚過敏反應（PCA)的抑制 一般方法： (a) 多肽的施用： 在致敏作用之前，在不同的時間間隔經胃腸道外將融 合多肽諸如在實施例7中由CH0細胞得到的IgE^L^HSA II-L2-IgER的10、50或500微克/公斤系列稀釋液注射到 體重大約25克的雌性SKH 1/hr/hr Charles River小鼠中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂 565571 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7—-----ϋ 五、發明説明（42 ) 根據在致敏作用前所注射的多肽量（亦即10微克/公 斤，50微克/公斤或500微克/公斤）所建立三組鼠。第四 組對照鼠經胃腸道接受200微克/公斤PBS以代替多肽。將 這四組鼠的每組都分成三個小組，其差別是化合物在胃腸 道外注射和用IgE使皮内致敏[下面的步驟（b)]之間的時間 間隔。測試的時間間隔是：5分鐘、15分鐘和30分鐘。 (b) 皮内致敏作用： 使老鼠麻醉並藉由4次皮内注射5ng每種單克隆鼠抗 二硝基苯（DNP)IgE 抗體的 10 毫升 PBS (BioMakor，Rehovot， Israel)在其背部皮膚使其過敏。在對照組中，在一位點中 皮内注射生理鹽水。 (c) 變態反應原攻擊： 致敏作用後90分鐘，再一次使鼠麻醉並藉由胃腸道外 注射含5 0微克的包含1 Q/o偶氦藍的二硝基苯-牛血清蛋白 (DNP-BSA)(Calbiochem-Behring，San Diego, USA)的溶液攻擊 該鼠。藉由測量由於溢血所造成的被染色試驗位點的直徑 定量PCA反應。 結果： 對於實施例7的成熟融合多肽（SEQ. ID, NO. 3的胺基 酸Val^LeU978)這些結果描述在圖2的柱狀圖表中。在濃 度為500微克/公斤時，二聚體融合多肽在所有應用的時間 點上’完全地阻斷PCA。在50微克/公斤，攻擊前3〇分鐘 時的處理產生36%的統計學上明顯的降低。在攻擊前工5 分鐘時，隨著10和50微克/公斤二聚體的施用看到一種趨 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' '--— (請先閱讀背面之注意事項 — -- 本頁) -訂· Λ 565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（43 ) 勢。因此，二聚體融合多肽在防止PCA方面是有效的。 實施本發明的方法和技術在現有技術中是已知的。因 為在此沒有特別地描述它們的製備，所以將要使用的化合 物、試劑、載體、細胞系等均是已知的且容易獲得或可以 傳統的方式由已知的和易於得到的材料獲得，或可以以傳 統的方式由已知的和易於得到的材料製備等效材料。 下列非限制性的實施例係說明本發明。所有溫度是攝 氏度。 材料和方法 PCR的擴大 可以使用任何適合的方法例如磷酸三酯或磷酸二酯方 法進行本發明的引物的從頭合成。 用於擴增特定核苷酸序列的方法和系統揭示於美國第 4,683，195號專利案和美國第4,683,202專利案中；和在 聚合酶鏈反應，Η·Α· Erlich 等人，Eds·，Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989]中。 在 PCR 之後，使用 QiaEx 方法（Qiagen，Inc·，Chatsworth， CA，USA)切除DNA片段並使其純化，然後亞克隆到TA載體 中[ΤΑ Cloning® Kit (Invitrogen) (product literature, Version 2· 2)]。用於製備PCR擴增的核苷酸的產物被示於圖8中。使 用測序酶方法（USB, Cleveland，OH，USA)對DNA進行序列測 定。 質體和試劊： 從 American Type Tissue Collection (ATCC Stock #67566) _____46___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) μ規格（21〇χ297公嫠） (請先閲讀背面之注意事項再iPF本頁) 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 A7 B7_______ 五、發明説明（44 ) 獲得 FcsRIa cDNA 克隆，pGEM-3-llOB-l (A· Shimizu 等人， Prm Nat· Acad. Sci· IJSA 85 [1988] 1907-1911)。由 Clontech (PCR-ready Quick Clone cDNA，Cat. D#7113-l)獲得單鏈人類 肝臟cDNA。HSA序列可得自GenBank登記號為#5 V00495， J00078，L00132 和 L00133 〇 由 Boehringer-Mannheim 或 Gibco/BRL 得到限制酶。從 Perkin-Elmer Cetus (PECI)或從 Boehringer-Mannheim 得到 Taq DNA 聚合酶0 由 Stratagene 得到 SK載體。 從 Invitrogen (San Diego, CA，USA; Catalog no. K1710-01 [1994]購得 pHIL-D2(請參閱 ”Pichia Expression Kit-Protein Expression - A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris - Version 3·0” [December 1994])(以下 被稱作 “ Invitrogen Manual”）〇 藉由將來自pUC8 (Pharmacia)的PstI至EcoRI連接子 克隆到pMT2的PstI和EcoRl位點中，從pMT2中得到 pXMT3 載體（Sambrook 等人（Eds·) [1989] supra) 〇 下面所用的標準技術係揭示於Sambrook等人，（Eds·) [1989] supra Φ 。 實施例A: ΤΑ克隆用載體 將質體pCR2分別與在實施例1和2中獲到的每種PCR 擴增產物連接。在下列反應混合物中使用T4 DNA連接酶 進行連接反應： 25mM 三羥甲基胺基甲烷-HC1 (pH 7·8) 47 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再頁) 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（45 ) 10mM MgCl2 ImM DTT ImM ATP 50ng 載體 DNA 100-200 ng PCR反應產物（非純化） 4 單位 T4 DNA 連接酶（New England Biolabs) 在被轉化為感受態細胞之前，在15°C下將每種反應混 合物保持18小時。 實施例1 : PCR擴增和FcsRIa cDNA克隆 使用Qiagen方法從pGEM-3-llOB-l中純化出FcsRIa cDNA。然後： (A) 為製備HSA-前導構建物，使用下列反應混合物係以 募核苷酸#18和#19(圖4、8)進行FcsRIot cDNA的PCR 擴增： 1 微升（5 0ng)的 FcsRIa cDNA ; 50皮莫耳每種募核苷酸#18和#19 5微升10XPCR緩衝液（PECI) 0.5微升20mM dNTP存貯溶液= 200μπι最終dNTPs濃度 0·5 微升（2.5U) Taq DNA 聚合酶（PECI) 50微升的水。 為了防止蒸發使用礦物油覆蓋反應混合物，並在Perkin Elmer Cetus DNA熱循環控制器型號480中使反應混合物進 行熱循環。對於該反應的循環條件是：加熱到95°C持續5 48 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） ' (請先閱讀背面之注意事項 丨^^-- 本頁) 訂

565571 A7 B7 五、發明説明（46 ) 分鐘，然後在94°C持續1.5分鐘進行3〇次循環，53cC持 續2分鐘，72°C持續3分鐘，隨後在72下延長3分鐘 並在4QC下浸泡過夜。 在電泳之後，藉由漠乙錠染色法確定〜5 5〇 bp的擴增 產物。該片段被亞克隆到PCR2載體中以產生編碼IgER的 pEKl(圖 4 ， 8B)。 (B) 為了製備IgE_前i構建I，根據上述（A)的方法進行 FcsRIoc cDNA的PCR擴增，除使用募核苷酸#2〇和#31 (圖 8B)之外。在0.7%瓊腊糖凝膠上電泳之後，藉由溴化錠染 色法確定〜600bp的擴增產物。該片段被克隆到pCR2載 體中以形成編瑪前IgER/TA#l (圖4)。 (C) 為了製備编瑪前-IgER的構逮物以表達成熟、被平截 的在分析中作為對照物使用的蛋白質，同上述（A) 一般使用 募核甘酸#20和#19(圖8B)進行FcsRIa cDNA的PCR擴 增。在電泳之後，藉由溴化錠染色法確定〜620 bp的擴增 產物。切下PCR片段並將其亞克隆到pcR II載體中以獲得 IgERFL/TA#34，其編碼前-IgE1^有終止密碼子（圖4)。 C請先閲讀背面之注意事項再本頁} 再本 -訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 复施例2 : EC R擴增和人類血清清蛋白cDNA的克降 為了獲得碥碼前-HSA II的序列，按照實施例（A)中的 一般方法用募核苷酸#24和#25 (圖8B)進行全長人類血清 清蛋白cDNA的PCR擴增。所得到的克隆HSA/TA#1具有 最類似於Genbank中的序列。在這種克隆中，發現在擺動 位置上的七個突變和一個導致在鹼基1333賴胺酸變為穀 49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2!0X297公釐） 565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______B7__五、發明説明（47 ) 胺酸的突變◊在擺動位置中的七個突變是：鹼基309 ·· A 突變為T ;鹼基744 : A突變為G ;鹼基795 : G突變為 A;鹼基951: G突變為A;鹼基1320 : C突變為T ;鹼 基1569 : A突變為C ;鹼基1584 : G突變為A(請參照 HSA/TA#1)。使用圖8A所示的寡核苷酸的定點誘變和Bio-Rad誘變劑噬菌體質體嵌合體生體外誘變盒（Bi〇rad，Cat #170-3581)將賴胺酸變為穀胺酸的突變校正回至Genbank 中的序列。該方法取決於尿嘧啶殘基在親代鏈中的摻入和 它們後來在被誘變鏈中的去除（T.A，Kunkel，Proc. Nat. Acad. ScL-UM82 [1985] 499-492)。因為在擺動位置中心點突變不 會改變被碥碼的蛋白質的天然胺基酸序列，所以不用校正 上述七個突變。在電泳之後，藉由溴化錠染色法確定〜 1.8kb的擴增產物。 將1.8kb產物亞克隆到pCR2載體中以形成HSA/TAmut #16，其被DNA序列測定證實含有完全的前-HSA II原序 列。 將HSA/TAmut #16亞克隆到作為Spel、Hindlll片段的 Bluescript SK 中，產生 HSA/SK #17(圖 5)。 (A) 為了製備HSA-前導構建物，用Mstll和Hindlll消化 HSA/SK#17以除去碥碼3’未端胺基酸（Leu6Q9)的核Ϊ酸序 列’並將上述定義之編碼連接子、的募核苷酸藉由激酶募 核苷酸#28和#29 (圖8B)，並以核酸混合和捆缚將這些片 段連接到線性化的HSA/SK #17的Mstll/Hindlll位點中而 在線性化的HSA/SK#17的3'未端導入上述碥碼連接子L2 50 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 _____B7___ 五、發明説明（48 ) 的寡核苷酸以產生編碼前-HSA II原與L2融合的pEK7(圖 8B)。藉由BamHI消化和經由序列分析檢查Miniprep DNA。 (B) 為了製備IgE-前導構建物，藉由使用募核苷酸#26和 #27(圖5,8)的PCR擴增碥碼前-HSA II原的HSA/SK#17。 募核苷酸#26從HSA中除去前序列原，在HSA5'未端加上 編碼k的募核苷酸。募核苷酸#27在HSA編碼序列的大約 核苷酸位置800處的天然產生的唯一 Ncol位點上終止。辑 據實施例1 (A)的方法進行PCR擴增。將藉由凝膠電泳分離 大約800bp的片段並將Qia亞克隆到pCR2載體中以獲得 克隆HSA Nco/TA#13，其序列藉由DNA序列測定證實。將 來自於該克隆的Ncol至Notl片段亞克隆到切口 Ncol和 Notl HSA/SK #17 DNA中，產生編碼與編碼HSA II的cDNA 的5’未端連接的h的HSA/SK #15(圖5)。 (C) 為了表達單獨的HSA，使用上述製備的HSA/SK #17 構建物。 實施例3 :編碼前-HSA原+連接子+IgER的融合構建物 HSA-IgER/Sk#29. 以BamHI和SalI消化pEK7(含有L2的前·HSAII原cDNA + 募核苷酸）和pEKl(含有IgER)。將由pEK7得到的1.8kb片 段磷酸酶化然後與從pEKl得到的550kb片段連接。製得 一種呈陽性的微量製備的#23，但是其被另一種未知的阻 礙HSA-IgER帶回收的質體污染。因此，以微量提取的#23 中純化出含有HSA-IgER融合的2.4kb Spel至Sail片段和 ____51 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印褽 A7 B7 五、發明説明（49) 包含載體DNA的2.9kb片段，並使它們連接在一起，產生 克隆HSA-IgE/SK#49(圖9)[發現載體位點正從被亞克隆的區 域的每一個未端上脫落，相對地，將來自於HSA-IgE/SK#49 的2,4kb Spel至sail片段亞克隆到Spel + Sall切口 Bluescript SK 中，產生 HSA-IgER/SK #22(未在圖中示出）]。 以DNA序列分析儀證實，如所預期的，HSA和連接子 與IgE受體DNA的連接序列和與載體DNA融合的未端序列 存在於 HSA-IgE/SK#22 中。 實施U :編碼IgER+前-HSA II原的融合構建物IgE-HSA/SK#! 用 SstI 和 Nhel 消化 HSA/SK #5 和 IgER/TA #1。藉由凝 膠電泳純化來自於IgE/TA #1的600 bp片段使其與切口和 磷酸酶處理的HSA/SK#5連接，產生克隆IgE-HSA/SK#l(圖 10) 〇

實施例5 :編碼前-IgER-L,-HSA II-L〇-LgER的融合構建物 R-H-R/SK #SQ 只有 IgER-HSA/SK#l 和 HSA-IgER/SK#49 的 HSA 區才 有的PstI位點被用於通過]^2的募核苷酸連接IgER和前-HSA II 原。用 PstI 和 Sail 消化 HSA/IgER/SK #49 和 Bluescript SK。將包含HSA II 3f部分、連接子和IgER序列的1.2kb 片段與 Pstl + Sall-切口 BluescriptDNA連接，產生 HSA-IgERPst Sal/SK #37(圖 11)，其用 PstI 和 ΚρηΙ 消化，並製備 1.2kb 52 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂

565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（50) 片段。 用PstI和ΚρηΙ消化IgER-HSA/SK#l DNA，分離含有載 體、IgER、連接子和半數HSA 5’的4.8kb片段，磷酸酶處 理與來自於HSA-IgER Pst Sal/SK #37的1.2kb片段連接。得 到所產生的二聚體構建物R-H-R/SK#50(圖11)。 复-座例6 :藉由Pichiapastoris轉染和培巷的HSAII-kiigER單體融合冬狀 藉由用EcoRI切割質體HSA/SK#49並分離2.4kb編碼 融合蛋白質的片段來製備編碼HSA II-L2-IgER的質體MB#2。 在用EcoRI和鹼性磷酸酶消化質體pHIL、D2後將該片段與 Elillla pastoris 表達載體 pHIL-D2 (Invitrogen)的唯一 EcoRI 位 點連接。藉由使用Notl消化使獲得的MB#2質體線性化， 並將其轉化在”Invitrogen Manual”中描述的his4GS115細胞。 篩選在甲醇中生長的組胺酸+轉化體。在甲醇上表現出緩 慢生長的菌株按照在”lnvitr〇gen Manual"中說明的一樣在最 低甘油培養基中生長至靜止相，藉由離心轉移至緩衝複合 甲醇培養基中，並生長4天。然後，藉由ELISA分析來自 該細胞的上清液確定HSA的存在和igE結合能力。從p. pastoris分泌得到的產物的IgE-結合能力以莫耳計等於 HSA濃度並具有全部生物活性。 ϋ例7 :藉由CHO細胞的轉染和培卷的igER-L^HSA imgER二聚艚融合多肽 53 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

訂

565571 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 A7 B7______五、發明説明（51 ) 藉由EcoRI消化R-H-R/SK #50(請參閱實施例5)和分離 編碼二聚體融合多肽的3kb EcoRI片段製備質體PXMT3-RIa-HSA-RIa(包含編碼前-18丑11-1^1-批八11-1^2-18£11的 SEQ· ID· NO· 4的多核苷酸）。在用EcoRI消化pXMT3和鹼性磷酸酶 處理之後使該片段與pXMT3的唯一 EcoRI位點連接。 將質體轉染入CH0DUKXB11細胞。這些細胞缺乏核苷 酸合成所需的功能性dhfr-基因（二氫葉酸還原酶）。因此，_ 將細胞保持在含10%的胎兒小牛血清（FCS)的oc +培養基 (MEM ALPHA MEDIUM與核糖核苷和脫氧核苷/Gibco)。為 了感染，在無Ca++-Mg+ +的PBS(CMF-PBS)中將該細胞沖洗兩 次，在CMF-PBS中將細胞濃度調到2 X 106細胞/亳升。 將0.8毫升的細胞懸浮液加到15微克的質體DNA中。 藉由使用BIO RAD Gene Pulser的電泳進行感染（電壓=ΐοοον ; 電容=25°F)。在轉染之後，將細胞在具有i〇%Fcs的15毫 升的α +培養基中培養3天。 位於PXMT3質體上的dhfr-基因為便於在核苷酸缺乏 的培養基中選擇重組細胞。在轉染後3天，將細胞置於含 10%透析的胎兒牛血清（FCSD)的ex -培養液（MEM ALPHA MEDIUM但無核糖核苷和脫氧核苷/Gibc〇)中。在培養2周 後’可看見重組細胞克隆。在基因擴增開始之前，將細胞 放在含10%FCSD的oc -培養液中進行4個另外的步驟。 在胺曱喋呤（MTX)存在下，擴增與其連接的dhfr和基 因’產生增強的轉基因表達。因此，在核苷酸缺乏的培養 液中選擇重組細胞之後，接著將其在20nM MTX存在下， _ 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "~ -一 (請先閲讀背面之注意事 .Ί- ----- I 4— ---- 項再本頁) 訂

565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（52 在含10%FCSD的a-培卷液Φ +立| 奸 刃瑨養履中培養。藉由逐步將胺甲喋呤提 高到ΙΟΟηΜ和500nMMTX完成進一步的擴增。 藉由將在含有1〇%FCS (GIBC〇)的心培養基中的庫（ρ〇〇ι) TV3-500 nM以9 X 1GVem2的密度接種到轉瓶中來製備蛋白 質。在接種之後5天收集第一次上冑&，然後轉換到無血 清α-培養基中^ 3天之後收集第二次收獲物得到總計i 升的用於純化的上清液。 從適合於無血清生長條件的庫T1/3-5〇〇 nM中產生的2 升上清液中純化出第二批材料。以5χ 1〇4細胞/毫升接種 細胞’在接種後6天收集上清液。 貧施例8 ：融合蛋白晳的純 卜. 藉由在固化的抗FcsRI單克隆抗體（例如5H5_F8 ;鼠 IgGl)上的免疫親和層析純化來自實施例7的培養物上清 液，根據標準技術製備和純化： a) 層析用載體的Μ備： 根據製造商的建議以10毫克抗體/毫升凝膠的密度將 單克隆抗體偶聯到CNBr_活化的瓊脂糖4Β (Pharmacia, Uppsala，Sweden)中。接著用乙醇將過量的反應基因封閉， 並將樹脂貯存於補充有0.02% NaN3的PBS中。 b) 親和層析： 將透明的培養物上清液以0.5毫升/分鐘的流速添加 在平衡於PBS中的5毫升的抗體柱上。用50mM檸檬酸、 140mMNaClpH2.70洗脫被吸收的材料。立即將含有級份 55 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂

5物71 A7 B7 1、發明説明（53 ) 的蛋白質值調節為7.0(NaOH)，隨後進行無菌過濾。 c) 定量/特性的描述： 藉由在280nm下測定30mM pH為2·70的（3-[N-嗎啉] 丙烷）磺酸（MOPS)中的天然組態的吸光度和其變性形式 (6M胍.HC1)的吸光度來確定二聚融合多肽的濃度。由色胺 酸、酪胺酸和胱酸殘基的數目使用表列的模型化合物中這 些胺基酸的吸收係數計算相應的莫耳吸收餘數，並用其校 正折疊和未折疊蛋白質之間的光密度差。融合蛋白質包含 17個色胺酸、40個酪胺酸和21個胱胺酸，其導致理論消 光係數為1508401^4111-1。藉由標準SDS-PAGE和藉由N· 未端自動氣相Edman降解序列測定和質譜法確定純化材 料的質量。根據SDS-PAGE(圖15)，多肽的表現分子量為 約140kDa進行遷移，表明大約28%的糖基化（沒有糖基化 的理論分子量：108,863.61 Da)。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（54 ) 序列表 (1) 一般信息: ⑴申請人： (A) 姓名：諾瓦提斯公司 (B) 街道：史瓦滋瓦達里215號 (C) 城市：貝士勞市 (E) 國家：瑞士 (F) 郵編：CH-4058 (G) 電話：61-324 5269 (H) 電傳：61-322 7532 (ii) 發明名稱：融合多肽 (iii) 序列數目：6 (iv) 電腦可讀形式： (A) 媒介類型：磁碟片 (B) 電腦：IBM PC compatible

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release #1.0, Version #1·30 (EPO) (v) 目前申請曰期： 申請案號：WOPCT/EP97/… (vi) 優先申請曰期： (A) 申請案號：US 08/690216 (B) 申請日期：26-JUL-1996 (2) SEQ ID NO· 1 的信息： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ⑴序列特徵： (A) 長度：257個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 螺旋數目：單鏈 (D) 拓撲學：直鏈 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假設：沒有 (iii)反義：沒有 (v) 片段類型：内部的 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（55 ) (xi)序列描述：SEQIDN0:1:

Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 1 5 10 15

Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gin Lys Pro Lys Val 20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg lie Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr 35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp 50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn lie 65 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gin His Gin 85 90 95

Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp 100 105 110

Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gin Pro Leu 115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val lie 130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn 145 150 155 160 lie Ser lie Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys 165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn lie 180 185 190

Thr Val lie Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gin Phe Phe lie 195 200 205

Pro Leu Leu Val Val 工le Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Phe lie 210 215 220

Ser Thr Gin Gin Gin Val Thr Phe Leu Leu Lys 工le Lys Arg Thr Arg 225 230 235 240

Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn Pro Lys Asn 245 250 255

Asn 257 58 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565571 A7 B7 五、發明説明（56 ) (2) SEQIDN0.2 的信息： ⑴序列特徵： (A) 長度：609胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) STRANDEDNESS :單鏈 (D) 拓撲學：直鏈 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假設：沒有 (iii)反義：沒有 (v)片段類型：内部的 (xi)序列描述·· SEQH)NO:2: (請先閱讀背面之注意事項 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Met Lys Trp Val Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45 lie Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys 210 215 220 59 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

本貢)

565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（57 ) Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie 275 280 285 Cys Glu Asn Gin Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu' Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 37 0 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu 工le Lys Gin Asn Cys 405 410 415 Glu Leu Phe Lys Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 · 470 475 480 Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 工le Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gin lie Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 ____60__ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項

本貢)

、1T

565571 A7 B7 五、發明説明（58 ) Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin 565 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 580 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 595 Leu 609

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 570 575 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 585 590 Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly 600 605 (2) SEQ ID NO· 3 的信息： (i) 序列特徵： (A) 長度：978胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) STRANDEDNESS ··單鏈 (D) 拓撲學：直鏈 (ii) 分子類型：蛋白質 (iii) 假設：沒有 (iii)反義：沒有 (v)片段類型：内部的 (xi)序列描述：SEQIDNO:3: (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 、-tv 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Met Ala Pro Ala Met Glu Ser 1 5 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val 20 Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn 35 Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn 50 55 Phe His Asn Gly Ser Leu Ser 65 70 Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp 85 n u 5 g s el r A X a V L n u lrevbV4 G L pT-l

Ly u u o r e e 3 y LLI· 1 o G 1 G1ICy5

0 1 s A ly 1 e 1 15 G s G G1

c*c TP* I 4 r 1 r 3 1 p'AT-lA

Pro Leu Arg 40 Phe Glu Ser Val Glu 120 Arg Leu

Thr Leu Leu Cys Val 10 Ala Val Pro Gin Lys 25 lie Phe Lys Gly Glu 45 Phe Glu Val Ser Ser 60 Glu Thr Asn Ser Ser 75 Gly Glu Tyr Lys Cys 90 Tyr Leu Glu Val Phe 105 Val Val Met Glu Gly 125 Asn Trp Asp Val Tyr 140 Lys Tyr Trp Tyr Glu 155 \ 0 vj I vj τχ ¢0 e 5 y a y s .15 s r a i LI L V L A H 9 A p V H a ο n r u n ron s n 1ro sh'6 1 Θ 11·ys A p 3 A T L G SI gla

Leu Val Thr Trp He 80 Gin Trp Leu lie Asn 160

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（59 ) lie Ser lie Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys 165 170 175 Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn lie 180 185 190 Thr Val lie Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Ala Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp 210 215 220 Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu lie Ala Phe Ala Gin 225 230 235 240 Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu 245 250 255 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn 260 265 270 Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val 275 280 285 Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys 290 295 300 Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn 305 310 315 320 Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr 325 330 335 Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu 340 345 350 lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe 355 360 365 Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp 370 375 380 Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly 385 390 395 400 Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys 405 410 415 Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin 420 425 430 Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp 435 440 445 Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys 450 455 460 Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys Glu Asn Gin Asp 465 470 475 480 Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu 485 490 495 62 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210父297公釐) (請先閲讀背面之注意事項

•本頁) 訂 565571 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印11 五、發明説明（60 ) Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp 500 505 510 Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys 515 520 525 Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu 530 535 540 Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu 545 550 555 560 Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp 565 570 575 Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val 580 585 590 Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gin 595 600 605 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 610 615 620 Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 625 630 635 640 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 645 650 655 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys 660 665 670 Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 675 680 685 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 690 695 700 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 705 710 715 720 His Ala Asp lie Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin lie Lys Lys 725 730 735 Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys • 740 745 750 Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 755 760 765 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 770 775 780 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Val 785 790 795 800 Pro Gin Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg lie Phe 805 810 815 Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu 820 825 830 63 (請先閲讀背面之注意事項

本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（61 ) Thr Lys

Val Ser Ser 835 Asn Ser Ser 850 Tyr Lys Cys 865 Glu Val Phe

Met Glu Gly

Asp Val Tyr 915 Trp Tyr Glu 930 Ser Gly Thr 945 Ser Glu Pro

Leu Asn Gin His Ser Asp 885 Gin Pro 900 Lys Val Asn His Tyr Tyr

Leu Asn 965

Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 840 845 lie Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu 855 860 Gin Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu 870 875 880 Trp Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val 890 895 Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp 905 910 lie Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr 920 925 Asn lie Ser 工le Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp 935 940 Cys Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu 950 955 960 lie Thr Val lie Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr 970 975

Trp Leu 97 8 厂^mi m HI In ϋϋ I ---^1 一^ml Ham ·ϋϋ 111 (請先閲讀背面之注意事項^|!寫本頁) « iBi—ϋ n^i ml flallBi 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 64 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（62

GAA^HCACCA ^TCGCTTOCAG 闩GGAA闩AGAA ο»οβο>Ω^^- 闩 I'GAAHATHG G^HAA^TGAGA 闩 O^TGCTTGAGG 800§ΩΗΩΗ AACCACAACA GGCAAAG闩GH CCGOGTGAGA TGGOHCCHGC ATTGGCG 闩 GHT? TATHHAAAGG CCACCAAAHG T?GAAT?GCCAA GTGAACC闩G闩 TGG闩GA闩GGA ACAAGGTGAT 闩0»-3CCATTAC GGCAG3GGA AG 闩 AC 闩 GGC^

CAHGGAAHCC AGCAG闩CCCH AGAGAAT?GTG GTT?CCACAAT >T?^»-3GAAGAC G闩ACC闩GGAA GGGCCAGCCC OITVTHA^AAG AAATGCCACA C闩AHGAGTOT TTGCTAGCGGT 3 (A) >卿：2955黪咖凉 s s.. S0.(c) STRANDEDZESS :难it (D)鈦钵嗍：i^§ $s.. σζ> (isMt冲：» 1 β.. »s ^i^.· ss(xi)^v^l銥声 SEQIDNO:4: (2) SEQ ID NO·私 sHiFl,: (請先閱讀背面之注意事項

本頁) CCTACT3AC CAGAAACCTA AC 闩 CT"TACA 闩 GGCAGCCT?闩闩 AGSGAGAAT G闩CT闩CAGTG CTCH 闩 CC^CA GAH3GGTGAAG GT^GAAGACA GAGCCCCT?CA GGAGG^3GGA 闩

TGTGTGTAGC AGGTCTCCHT 3AATGGGAA CAGAAGAGAC AOAAA闩GT?C> ACHGGCT?GCH GG 闩 GCCAT?GG C闩CTCAAGTA GHGGAACC^A ACAT^ACTGH CCGATGCACA 、\呑

經濟部中央標準局負工消費合作社印製 CHTACHG闩TC 60 GAACCCTCCA 120 CAA 闩闩 TCT?闩 T 1000 AAATHCAAG闩 2^0 GCACCAACAA 30〇 OCTHCAGGCC 360 T"TGGAGGAAC 420 CHGG闩ATGAG 480 C 闩 ACTGHACG 54l〇 AA闩AAAAGCe 600 CAAGAGH3GAG 660 5 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565571

A B 明説 明 發五 G 闩 TGCTTOATC 闩TTGO闩CAGT ACHGAA/r闩闩 G CATACOOHT?TT ATGOO^GAOTT GATGACAACC T'l'TOATGACA CCTT'ACTTHaT' GAATG*TTTGCC GATGAAGGGA GGAGAAAGAG GAGHH闩GCAG CATGGAGSC AATCAAGATT? TCOCAC^GCA GCTTGATTT'闩 G OSQOOSO^ 0 闩 GAGACH3闩 G CATGAATGCT T?TAATCAAAC ΟΤΑΤΊΆΟΊΊΌ

gghttaaaga AHOT^TCAGCA OAAAAACA闩G I'HGGAGACAA onsso»> OAAACOTTCCO ATGAAGAGAC ATGOCOCGGA AAGCHGCT?G> AGGOeTOG^C CTTTTCAAAGC AAGTTTCCAA TGOT闩GAATG CGAT3CCAG ^TTGCCGAAG^ 『TTGAAAGTAA HaTHTGTATGA CCAAGACATA ATGCCAAAG闩 AAAATTGTGA GTTACACCAA

闩闩TGGGAGAA GTGHCCATrrT HG^TGC 闩 GAH ATTATGCACA ACAAGAAC3 CCGAI^GGTG ATTTHT^GAAA ACTCCTI'T'TC TAAAGC3CC H3GOCAAACAG AHGGGCAGHA G»-3TrAG 闩 GACA TGOH3G>TGAC I'AAACHGAAG GGAAAATGAT GGAHGT闩闩GC Α/ΓΑ闩GCAAGA ΊΗ3ΑΑΑοοΑοτ? GHTCGATGAA ΩΟΙΓ 闩 Te 闩 AAG GAAAGTACCC

GAAAATTTCA GAAGATCATG GAGTCAGCTG GHI'GCAACTC GAGAGAAATG AGACCAGAGG AAATAO闩 T?>T HHTGCTAAAA 闩GCOHGTTGC AGACT'CAAG 闩 GOT?nGCCH3GA GATCTTACOA AGGGCGGACO GAATGSGTG GAGATGOC^G AAAAA3ATG AGGOATCC闩G Π 闩 AGAGAAGHa I'l'TAAACOTTC CAGC闩闩GGAG CAAGHGTCAA (請先閱讀背面之注意事項^ΙΡ^Γ本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 AAGCCT：闩 GGT? TAAAATHAGT AAAA 闩闩GTX5A 闩 TCG^GAAAC AATGCTl'Cl'TT T'l'GATGTGAH ATGAAATSC GGTATAAAGC OAAAGCHOGA GT?GOOAGTC 闩 GonAGAGATT* AA3CCACAC HT'GCCAAGTA AAAAACnHaCT? OTPGACTTTGCC 3GAGGCAAA ΑΤΊΆΟΊΌ:闩GTT Go闩GTGCCGC T?T?GT?GGAAGA AGTACAAATT CTCCAAOTOT? GT"rGATeGCC 720 GAJVTGAAGHA 780 CAAATCACyTT 8^0 C^ATGGH3GAA 900 GCAACACAAA 960 G^GCAC^GC^102 0 CAGAAGACAT 1080 T?GCTH3H3HACA Hl^o TGAACTT'CGG 1200 ΟΟΑΑΑΑΑΤΊ'Ί' 1260 闩COCAAAGCH 1320 GGAATGCrrGO 1380 TATCTTG^GAA 一私^ 0 GTTGGAAAAA 1500 TTTCATHaAGO 闩 1560 GGA 闩 GTCTTTC 1620 CGHGC闩GOTG 1680 TGCAGATCCT 1740 GCCTCAGAAT 1800 CCAGAATGCG 1860 TGTAGAG3C 1920 66 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2iOX297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（64

闩 OAAGAAAnc CCCTG3CAG AOGCOAGHAA 闩 GCTTl'TT'OAG ACT'GCAOT'I'G 3TATGGATG 3038000 GGATCOGTCC GGAGAGAATG 80300>0> AAA『闩HGAAG G^G 闩>C0*-3GG GAGGGCCAGC AT3ATTATA ACAAATGCCA GACT7VTGAGT CTATAGTAAG

^AGGAAAAGTT GGGCAGCAAA AAGACTTVrCT' ATTCCGTGGHC GTGACAGAGT CACCAAATGC CHCHGGAAG闩 CGA闩GAAACA ATGoAGAITVr AT?GoACAC 闩闩 ^TGAGCTT?GT GAAACACAAG ATHHCGCAGC TTI'T'GT'AGAG AGGAGGGTAA AAAACHT'GTP闩 CTOAGAAACC TAAGGI^CTCC TGAC^0H3闩 AC ATGTAA^GGG ATGGCAGCC闩闩HCAGAAGAG ACAGeGGAGA ATACAAAH3G 闩 AAG闩C闩闩CAG 闩GACHGGOHG000^0300^- ososoos AGGATGGTGA AGCTOI'CAAG CAGHTGAAGA CAGHGGAACC CTGAGCCCC^CAACATHAC 闩 ΑΑΤΤΓΟ 295LH

HGHHGHAAAC CHGAACCAGH T7GCACAGAA 闩 ^AnG 闩 TCCOA •-aCHGAGAAGG OOCAAGGOAA AAGHGC闩GOA GC闩GCAAGHC ^rrGAACOCH3c AACAAl'I'TCT' ACAAA闩円OAA 0>00>00»0 CHOCTTHCAGG GG^HGGAGGA 闩ACHGG闩ATG TAC^An 闩 GHA GTPAAT'AAAAG (請先閱讀背面之注意事項再β本頁)

、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

ATCCTGAAGC TAHGHG 闩 GT?T? CCHHGGHGAA AAGAGTTTAA AGAGACAAAT CAAAAGAGCA AGGCHGACGA »008003 CATGGAATAG T'TGAAGT'CAG GHT?闩 GAATAT AAG闩TAATGA COT?o»-aGCTGA AC^GGGATGT? AGAACCACAA CGGGCAAAGT? 3CCGCGTGA AAAAAGAAHG 1980 GCA闩GAGAAA 20^0 CAGGCGACCA 2100 闩GCTGAAACA 2160 CAAGAAAOAA 2220 AC 闩 GAAAGCI' 22000 TAAGGAGACC 23^0 AGGTTGGAGG^2400 AATATTTAAA 2仁60 T'TTCCACCAAA 2520 TTG 闩 GAATGOC 2580 GAG 闩 GAACCTT 2 6^0 GG闩GG闩GATG 2700 3ACAAGGTG 2760 CATCTCCATT 2820 G 闩 GGCAGCTTG 200000 GAAG^AcyrGG 2 9^0 67 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

565571 A7 ___·_ B7五、發明説明（65 )

(c) STRANDEDMESS :鴻璐 § £ (S今屮漪陆：DNA ai)翁擗··澌I »3 (xi)^v^l銥摔：SEQ ID NO: 5: ATGAAG 闩 GGG TAACC 闩^TA^HTOCCTHCH 闩 orpG 闩闩闩 OGTOGAGATGOACA CAAGAG 闩 GAG GAAAATTTCA AAGOOT'TGGI' GTT'GATT'GOC GAAGATCATG TAAAATTAGT'GAATGAAGl'A GAG»-3CAGOHG AAAATHG 闩 GA CAAATCACIT GTTTGCAACT'C Hl'OGI'GAAAC CH3ATGG 闩 GAA GAGAGAAATG AATGOH^CH3T?GCAACACAAA AGACCAGAGGHaTGATGHGAT GTCOACHGOH AAATACH3TAT ATGAAAITGC CAGAAGACAT T'^TTGCTAAAA GGTATAAAGC TGC闩闩ACA ^GCC^GT^GC CAAAGC闩OGA I'GAACl'闩OGG AGACTCAAAT GTGCCAGTCI' CCAAAAATIT (2)SEQIDN0.5s5i!F駟 (請先閱讀背面之注意事項

『本頁)

rprprporporprprp> GT?TGC 闩 c>闩 0 H^TTGC 闩 CAGT? AOTGAA闩闩闩G OATACOOH 闩一' ATGGO 闩 GACH0 GATGACAAOO HT^OATGACA COH^AO 闩 ΤΓΓΓ GAATGH^GOO GATGAAGGGA GGAGAAAGAG

GC^OGGCeHA GGTT闩AAAGA ATCT?闩 OAGCA CAAAAACATG TTGGAGACAA GC闩GHGCAAA OAAACC闩000 ATGAAGAGAC ATGOCCCGGA AAGC 闩 gohbga AGGC 闩 TCGTTC OT'HTCAAAGO 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 TT 闩 CCAGGGGH360 T^TTGGGAGAA 120 GT?G 闩 CCAT 闩闩 1000 TG闩AGC闩GAT 2^0 ATTATSACA 300 ACAAGAAST 3 60 OOGATHaGGTG 420 ->ΤΊΊ?Ί^Χ3ΑΑΑ 480 >0^-00330 5办 0 闩AAAGCTGOC 600 T'GOCAAAOAG 660 AT'GGGCAGT'G 720 8 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565571 A7 . _·_ B7五、發明説明（66 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 GCTCGCCHGA GCOAGAGATH HCCCAAAGCT GAGTTTGCAG AAGTTHCCAA GTHAG闩GACA 780 GATCTHACCA AAGTCCACAC GGAAHGCTGC CA闩GGAGATC TGCTTGAiVTG TGCHGATGAC 8^0 AGGGCGGACC nTGCCAAGHA HATCHGTGAA AATCAGGAHT CGA 闩nTCCAG^AAAC 闩 GAAG 900 GAivrGCHGTG AAAAACCHC闩 GT闩GGAAAAA TCCCACTGCA HTTGCCGAAGTr GGAAAATGAT 960 GAGATGnCHG OT?GACHTGCC HTCATTAGCH3GC^GATT 闩 THG»-3T?GAAAG 闩 AA GGAHG 闩 T?HGC 102 0 ΑΑΑΑΑΠΊΆΤΟ OT?GAGGCAAA GGATGT?CHH3C C^GGGCATTGT 闩 GAATA 闩 GCAAGA 10000 AGGC7VTCC 闩 GATTACHC 闩 GT CG 闩 GnT?GC 闩 G C^GAGAOTTTG CCAAGACATA 闩 GAAAOCACT' 1：U0 CTAGAGAAGH GOHGTTGCCGC HGCAGAT?COT CA^GAAT'Gnl' ATGCCAAAGT' G 闩闩 CGATGAA 1200 Ί'Ί'ΤΑΑΑΟΟΊ'Ο TI'GT'GGAAGA GCC»-3CAGAAT? HITWVTCAAAC AAAAn 闩 G»-3G>G0TT?T?^TAAG 1260 CAGC^TTGGAG AGTACAATVTT onAGAATTGCG OTATTAGT'I'C GH9TACACCAA GAAAGTACCC 1320 CAAG*rGH3CAA CTOOAACT'CT T?GT?AGAGGTC 闩 CAAGAAACC TAGGAAAAGT?GGGCAGCAAA 13 80 TXSI'TGHAAAC ATCO 闩 GAAGC AAAAAGAA 闩 G OCCIXSTGCAG AAGACTATCI'>闩000闩00闩0 一私^ 0 CHGAACCAGT? TATGHGHGTP闩 GCATGAGAAA AOGCCAGHAA GHGAOAGAGT CACAAAATGC 1500 TTGCACAGAGH CCTHGG^GAA CAGGOGACCA 闩GCTl-3闩TCAG C^CT'GGAAGT' OGATGAAACAMLnONo TACG 闩闩CCOA AAGAGHaTTAA HGOTGAAACAHgTOACO»-aT?co ATGCAGATAT ATGOACAC^^1620 H3C^GAGAAGG AGAGACAAiVT CAAGAAACAA AC 闩 GCACTTG»-3闩 GAGCT闩 GT? GAAACACAAG 16000 OCCAAGGCAA CAAAAGAGOA Acl'GAAAGOTT GT^ATGGATG A^TTTCGCAGC T^T^^GTAGAG 17^0 AAG 闩 GCTGCA AGGC 闩 GAOGA TAAGGAGACC HGC 闩 TT7GCOG AGGAGGG»-3AA AAAAC 闩円 G+闩 1800 GC^GCAAG*rc AAGC^GCC 闩 T AGGCTTTA 1002 7 (請先閱讀背面之注意事項

『本頁)

、1T t 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 565571 A7 B7 五、發明説明（67 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (2)SEQmN0.6s5if4: 3^塑恭萍" (>>渖：773 零_凉 (B)織陆：煞4t髁(c) STRANDEDNESS :飧饜(ii)今屮籲陆·· DNA si)菏？澌 si)碎煞：澌 s ^ia.·(总^湮銥离：SEQIDM0:6: ATGGCTOC^G COAT?GGAA 闩 concHaACI'OT'A CI^GHG^GTAG OCI'TACT'GI'H 0闩闩 CGC*-30CA 60 GAHGGOGTG 闩 TAGCAG闩 CCC TTCAGAAACO 闩 AAGG^C 闩 CCH HGAACCC 闩CCA^GGAATAGAMtoo ATATH3TAAAG GAGAGAA 闩 GTT GACTO 闩 TACA HGTAATGGGA ACAAT 闩 ΤΟΊΉ TGAAG^CAGH 180 T?CCACCAAAT GGTTCOACAA HGGCAGCCH 闩闩 OAGAAGAGACAAAT 闩 CAAG ΊΤΊΧ3ΑΑΤΑΊΤ 2^0 GHgGAATGCCA AATHI'GAAGA CAG 闩 GGAGAA HACAAATGTC AGCACOAACA AGHTAATGAG 3 00 AG^GAACCTG TGTACCHGGA AGHC 闩 TCAGH GACTTGGCT?GC 臼〇:0:闩円门>〇<30: OTC 闩 GCH3GAG 3 60 GT'GG^GATGG AGGGOCAGCO ^^AGGTTGCCAHG GH9TGGAGGAA C^GGGATGHG 420 ^ACAAGGTGA TTCTATTWTAA GGATGGTTGAA GC»-3c»-3OAAG 闩 AC*TGG 闩 ATGAGAACCACAAC 仁80 ATC 闩 CCATTA CAAATGCCAC AGITGAAGAC AG 闩 GGAACC^ACTAC 闩 GTAC GGGCAAAGHG 5^0 闩 GGCAGCTGG ACTATGAG 闩 C T?GAGOCCCTC AACATTACHG ΊΆΑΤΑΑΑΑΟΟ^0cgcgh3g>*g 600 AAGTACl'GGC ΤΑΟΑΑΤΊ'Ί'Ί'Ί' TATOCCAT^GH3TGG 闩 GGTGAl-3闩 CTGH 闩 TGC^GHaGGACACA ggo GGATTAITTAI'CT'CAACI'OA GCAGOAGGTCACATTTCT'CT?»-3GAAGATTrAA GAGAACCAGG 720 AAAGGC^TTCA GAC^TCTGAA CCCACATCCT AAGCCAAACC CCAAAAACAA C»-3G 773 (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐）

Claims (1)

1. 565m 修正 松9·’22補充 月曰 公告本; A8 B8 C8 D8 %年彳月》日 六、申請專利範圍 1. 一種包括IgE結合區和人類血清清蛋白（HSA)組成 份的融合多肽或其鹽，其多肽如SEQ· ID. No. 3所定義 者，意即，其具有序列如下： Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 15 10 15 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gin Lys Pro Lys Val 20 25 30 Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg lie Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr 35 40 45 Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp 50 55 60 Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn lie 65 70 75 80 Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gin His Gin 85 90 95 Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp 100 105 110 Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gin Pro Leu 115 120 125 Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val lie 130 135 140 Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn 145 150 155 160 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 71 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 565571 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 lie Ser lie Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys 165 170 175 Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn lie 180 185 190 Thr Val lie Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Ala Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp 210 215 220 Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu lie Ala Phe Ala Gin 225 230 235 240 Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu 245 250 255 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn 260 265 270 Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val 275 280 285 Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys 290 295 300 Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn 305 310 315 320 Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr 325 330 335 Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu 340 345 350 lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe 355 360 365 Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp 370 375 380 Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly 385 390 395 400 Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys 405 410 415 Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin 420 425 430 Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp 435 440 445 Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys 450 455 460 Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr He Cys Glu Asn Gin Asp 465 470 475 480 Ser He Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu 485 490 495 72 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565571 A8 墨T年1月Ά日修正 六、申請專利範圍 Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp 500 505 510 Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys 515 520 525 Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu 530 535 540 Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu 545 550 555 560 Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp 565 570 575 Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val 580 585 590 Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gin 595 600 605 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 610 615 620 Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 625 630 635 640 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 645 650 655 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys 660 665 670 Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 675 680 685 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 690 695 700 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 705 710 715 720 His Ala Asp He Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin lie Lys Lys 725 730 735 Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 740 745 750 Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 755 760 765 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 770 775 780 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Val 785 790 795 800 Pro Gin Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg lie Phe 805 810 815 Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu 820 825 830 73 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ---,---------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局具工消费合作社印製 565571 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 墨$年兮月々日修炙 六、申請專利範圍 Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 835 840 845 Asn Ser Ser Leu Asn lie Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu 850 855 860 Tyr Lys Cys Gin His Gin Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu 865 870 875 880 Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val 885 890 895 Met Glu Gly Gin Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn iTrp 900 905 910 Asp Val Tyr Lys Val He Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr 915 920 925 Trp Tyr Glu Asn His Asn He Ser He Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp 930 935 940 Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu 945 950 955 960 Ser Glu Pro Leu Asn lie Thr Val lie Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr 965 970 975 Trp Leu 97 8 ，或多肽如SEQ. ID_ No. 3的殘基Val26至Leu978所定 義者，意即，其具有序列如下： Val Pro Gin Lys Pro Lys Val 30 Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg lie Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr 35 40 45 Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp 50 55 60 Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn lie .65 70 75 80 Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gin His Gin 85 90 95 Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp 100 105 110 Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gin Pro Leu 115 120 125 Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val lie 130 135 140 Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn 145 150 155 160 74 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公藿〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 565571 § p年‘？月u曰修正 六、申請專利範圍 lie Ser lie Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys 165 170 175 Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn lie 180 185 190 Thr Val lie Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Ala Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp 210 215 220 Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu lie Ala Phe Ala Gin 225 230 235 240 Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu 245 250 255 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn 260 265 270 Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val 275 280 285 Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys 290 295 300 Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn 305 310 315 320 Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr 325 330 335 Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu 340 345 350 lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe 355 360 365 Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp 370 375 380 Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly 385 390 395 400 Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys 405 410 415 Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin 420 425 430 Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp 435 440 445 Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys 450 455 460 Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr He Cys Glu Asn Gin Asp 465 470 475 480 Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu 485 490 495 75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公« ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂.--------#. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565571 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 A8 墨％年1月A日修正 六、申請專利範圍 Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp 500 505 510 Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys 515 520 525 Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu 530 535 540 Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu 545 550 555 560 Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp 565 570 575 Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val 580 585 590 Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gin 595 600 605 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 610 615 620 Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 625 630 635 640 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 645 650 655 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys 660 665 670 Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 675 680 685 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 690 695 700 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 705 710 715 720 His Ala Asp lie Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin He Lys Lys 725 730 735 Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 740 745 750 Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 755 760 765 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 770 775 780 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Val 785 790 795 800 Pro Gin Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg lie Phe 805 810 815 Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu 820 825 830 76 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ▼-裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 565571 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 835 840 845 Asn Ser Ser Leu Asn lie Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu 850 855 860 Tyr Lys Cys Gin His Gin Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu 865 870 875 880 Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val 885 890 895 Met Glu Gly Gin Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp 900 905 910 Asp Val Tyr Lys Val lie Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr 915 920 925 Trp Tyr Glu Asn His Asn He Ser He Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp 930 935 940 Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu 945 950 955 960 Ser Glu Pro Leu Asn He Thr Val He Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr 965 970 975 Trp Leu 97 8 2_如申請專利範圍第1項所述之融合多肽或其藥學上 可接受的鹽當作藥物。 3· —種供預防和/或治療異位性皮膚炎、異位性氣喘或 慢性蓴麻疹之藥學組合物，其包括如申請專利範圍 第1項所述之多肽或其藥學上可接受的鹽以及藥學 上可接受的載體或稀釋劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線| 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 565571 面積(mm2) 0 s/kg -5.L5 ·30 3.η3.Π3.η 10Tlg/kg -5 3.Π -15 3.η .30 rrin

   50 pg/kg IgE^HSA'g^h.s -5 丨 15 nin3.η nin

   2 500 pg/kg .5 .15 —30 min rrin nin *Ρ6·§