KR100502879B1

KR100502879B1 - ＩｇＥ결합 도메인 및 ＨＳＡ 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 진단 및 치료 용도

Info

Publication number: KR100502879B1
Application number: KR10-1999-7000621A
Authority: KR
Inventors: 메리 엘렌 디건; 필립 레이크; 헤르만 그람
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2005-07-25
Also published as: NO323611B1; CA2261562A1; IL128094A0; AU4202597A; NZ333908A; TR199900155T2; ID19420A; EP0917581A1; EP0917581B1; ES2300114T3; JP2000516089A; WO1998004718A1; ZA976666B; SK7799A3; TW565571B; AU722069B2; CN1229439A; AR008077A1; PT917581E; ATE383429T1

Abstract

본 발명은 임의로는 펩티드 링커를 통하여 하나 이상의 사람 혈청 알부민 성분에 융합되어 있는 하나 이상의 IgE-결합 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 그의 염, 특히 그의 아미노 및 카르복시 말단이 IgE에 대한 사람 고친화성 수용체 (FcεRIα) α-사슬의 세포외 도메인에 융합되어 있는 HSA 단백질을 포함하는 이량체 융합 폴리펩티드; 및 그의 제조 방법, 제조시의 중간 물질인 기능적으로 등가인 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 중간 물질, 및 그를 위한 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 IgE-매개 알레르기 질환 및 아토피성 피부염, 아토피성 천식 및 만성 두드러기과 같은 관련된 질병의 예방 및(또는) 치료에 사용된다.

Description

ＩｇＥ결합 도메인 및 ＨＳＡ 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 진단 및 치료 용도 {Fusion Polypeptide Comprising an IgE-Binding Domain and a HSA Component, and Their Diagnostic and Therapeutic Uses}

본 발명은 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 IgE-결합 도메인 및 사람 혈청 알부민(HSA) 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 그의 염에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 융합 폴리펩티드의 제조시의 중간 물질인 폴리뉴클레오티드 및 생리학적으로 기능적인 등가물인 폴리뉴클레오티드; 그를 위한 적절한 재조합 발현 벡터, 상응하는 원핵 세포 및 진핵 세포 발현 시스템 및 융합 폴리펩티드를 합성하는 방법에 관한 것이다.

면역 글로불린 E (IgE) 및 그의 수용체 사이의 상호 작용은 사람에서 기생체 감염에 대해 방어 기전에 있어서 확립된 역할을 갖는다 (M. Capron and A. Capron. Science 264 [1994] 1876-1877). 그러나, 위생 상태가 개선된 산업 사회에서는 기생체와 접하는 빈도가 환경 알레르겐에 반응하는 IgE의 과생산에 의한 IgE 네트워크의 교란 정도보다 적어서, 알레르기 및 다른 IgE- 또는 IgE-수용체 매개 질병 상태가 발생한다.

IgE는 즉각적인 알레르기 반응의 개시에 관계되는 1차 항체이며, 후기 반응을 유지하는데 관여하는 주요 요소이다. IgE는 B 림프구에서 합성되고 IgE에 대한 고친화성 수용체, 즉 FcεRI에 결합한 후에 그 영향을 나타내는데, 비만 세포, 호염기구 및 호산구와 같은 알레르기 작동체 세포의 표면에서 발견된다. 또한, IgE는 랑게르한스 세포, B 세포 및 단핵 세포와 같은 항원 표시 세포상에서 그의 수용체를 결합시켜 유도체 기능을 나타낸다 (G.C. Mudde et al., Allergy 50 [1995] 193-199).

알레르기 반응 또는 상태는 IgE 분자가 IgE 수용체인 FcεRI를 통하여 알레르기 작동체 세포의 표면에 결합하고 알레르겐에 의해 교차 결합되는 경우에 나타나고, 그에 따라 세포내에서 세포질 과립의 분해를 개시하는 신호전달이 유효하게 되고, 히스타민, 세로토닌, 프로스타글란딘 및 사이토카인과 같은 알레르기 매개체의 방출, 이어서 국소 조직 부종 및 염증성 세포의 유입이 수반된다. 알레르기 및 그와 관련된 상태를 자극하는 다른 수단은 IgE 수용체인 FcεRI와 FcεRI에 대한 순환 자가 항체의 상호 작용이다.

대체로 FcεRI는 α-, β- 및 2개의 γ-사슬 (즉, "소단위체")를 포함하는 4량체로서 존재하지만, 단핵 세포 및 랑게르한스 세포에는 β-소단위체가 존재하지 않는다.

FcεRI의 IgE 결합 부위는 그의 α-소단위체 (즉, FcεRIα)내에 완전히 함유되는 것으로 알려져 왔다 (J. Hakimi et al., J. Biol. Chem. 265 [1990] 22079-22081: U. Blank et al., J. Biol. Chem. 266 [1991] 2639-2646). 완전한 α-소단위가 유전적으로 결실된 재조합 "넉아웃 (knockout)" 마우스는 알레르겐 공격에 대해 알레르기 반응을 일으키지 않는 것으로 밝혀졌다. (D. Dombrowicz et al., Cell 75 [1993] 969-976).

FcεRIα는 글리코실화가 많이 된 분자량이 약 60 kD인 폴리펩티드이고, 소수성 트랜스멤브레인 도메인뿐만 아니라 세포의 외부 표면에 노출되어 있는 세포질성 도메인도 포함한다. FcεRIα의 IgE 결합 능력은 그의 세포외 부분에 더욱 국한되는 것으로 나타났다 (J. Hakimi et al. [1990], 상기 문헌: Leder et al., 미국 특허 제4,962,035호). 트랜스멤브레인 부분 및 그의 하류 서열을 잘라냄으로써 가용성의 분비될 수 있는 물질을 제조할 수 있고, 실질적으로 사람 FcεRIα 세포외 도메인으로 이루어진 생성된 절단물 (truncation)은 시험관내 및 생체외 IgE 결합 활성을 갖는다 (M. Haak-Frendscho et al., Immunol. 151 [1993] 351-358; 절단된 IgG1 H 사슬 C 영역에 융합된 FcεRIα의 아미노산 잔기 1-204번; C. Ra et al. [1993] 상기 문헌: SEQ. ID. NO. 1의 잔기 26-197번에 상응하는, FcεRIα의 잔기 1 - 172번). 이 단편의 구조적 특성은 2개의 강력한 이황화 결합(disulfide bridge) 및 7개의 강력한 글리코실화 부위를 포함한다 (M. Haak-Frendscho et al. [1993], 상기 문헌].

따라서, 알레르기 작동체 세포상의 고친화성 수용체에 결합하는 것을 막고, 또한 사람 림프구에서의 IgE 신생 (de nove) 합성을 억제하기 위해 IgE가 실질적으로 세포외 도메인으로 이루어진 FcεRIα의 절단물을 포유 동물에 치료학적으로 투여하여 혈청 IgE에 결합시킨다 (Y. Yanagihara et al., J. Clin. Invest. 94 [1994] 2162-2165).

그러나, 포유 동물에서 IgE- 또는 IgE 수용체-매개 알레르기 장애의 전신 치료를 위해 세포외 도메인과 같은 IgE 결합 폴리펩티드를 효과적으로 사용하는 것은 이들이 순환 혈장으로부터 신속히 제거되어 생체내에서는 극도로 짧게 존재하게 되므로 방해되어 왔다. IgE- 또는 IgE 수용체-매개 질병이 의사-환자간 접촉의 10 내지 20 %를 차지함을 고려할 때, 효과적인 치료는 그러한 상태의 환자에 대한 상당한 이익 및 알레르기 및 알레르기와 관련된 상태와 같은 IgE- 또는 IgE 수용체-매개 장애의 임상 치료에서의 중요한 진보를 가져온다.

따라서, 장시간의 유효 혈청내 수명을 가짐으로써 알레르기 치료, 특히 아토피성 피부염, 아토피성 천식 및 만성 두드러기에 개선된 임상 유용성뿐만 아니라, 효과적이고 비용 효과적인 방식으로 개선된 활성을 갖는 IgE 결합 폴리펩티드를 얻는 것이 유익할 것이다.

<요약>

본 발명자들은 IgE 결합 도메인을 사람 혈청 알부민 (HSA) 성분에 융합시킬 수 있음을 발견하였는데, 융합 폴리펩티드는 IgE 결합 활성을 손실시키지 않은채 IgE 결합 도메인 단독에 비해 혈청 반감기가 연장될 수 있고, 알레르기 및 다른 IgE-매개 장애의 전신 치료에 적용되는 IgE 결합 폴리펩티드가 만들어진다. IgE 결합 폴리펩티드를 전신 투여하면 혈청 IgE에 뿐만 아니라 IgE 수용체인 FcεRIα에 대한 순환 자가 항체에 대해 결합할 것이고, 그들이 세포 결합 FcεRIα에 결합하는 것을 예방하여 알레르기 반응 및 그와 관련된 증상이 예방 및(또는) 억제된다.

또한, 본 발명자들은 분자 당 1개 이상의 IgE 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 사용하여 IgE 결합 활성을 상당히 개선시킬 수 있음을 발견하였다. 예를 들면, 본 발명의 "이량체" 분자가 본 발명의 "단량체"에 비해 IgE 결합 활성이 상당히 증가된 것으로 밝혀졌다.

본 명세서에서 용어 "이량체"는 2개의 IgE 결합 도메인을 갖는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "단량체"는 1개의 IgE 결합 도메인을 갖는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 의미한다. 단량체 또는 이량체는 1개 이상의 HSA 성분으로 구성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단량체 융합 폴리펩티드는 그의 아미노 또는 카르복시 말단에서 HSA 성분에 융합된 IgE 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이와 달리, 단량체는 그의 양 말단에서 HSA 성분에 융합된 IgE 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이량체 융합 폴리펩티드는 예를 들면, 하나는 카르복시 말단을 통하여, 다른 하나는 아미노 말단을 통하여 개재하는 HSA 성분에 융합된 2개의 IgE 결합 도메인을 포함할 수 있다. 별법으로, 이량체는 2개의 IgE 결합 도메인 외에 다수의 HSA 성분을 포함할 수 있다.

또한, 예기치 않게 본 발명자들은 본 발명의 이량체 분자가 바람직한 활성을 가짐을 발견하였다.

그러므로, 본 발명은 하나 이상의 HSA 성분에 융합된 1개 이상의 IgE 결합 도을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 그의 염; 바람직하게는 1개 이상의 HSA 성분에 1개의 IgE 결합 도메인이 융합되어 있는 단량체 융합 폴리펩티드 또는 1개 이상의 HSA 성분에 2개 이상의 IgE 결합 도메인이 융합되어 있는 다량체 융합 폴리펩티드; 보다 바람직하게는 1개 이상의 HSA 성분에 2개의 IgE 결합 도메인을 갖는 이량체 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 중간 물질에 관한 것이다.

본 명세서에서 "융합된" 또는 "융합"이란 용어는

(i) 특정 기능성 도메인 (즉, IgE 결합 도메인)의 카르복시 말단이 공유 결합 (바람직하게는 펩티드, 즉 아미드)에 의해 다른 기능성 도메인 (즉, HSA 성분)의 아미노 말단에 결합하거나, 다른 기능성 도메인의 아미노 말단에 공유 결합 (바람직하게는 펩티드)에 의해 결합되는 링커 펩티드에 결합되어 있고(있거나),

(ii) 특정 기능성 도메인 (즉, IgE 결합 도메인)의 아미노 말단이 공유 결합 (바람직하게는, 펩티드, 즉 아미드)에 의해 다른 기능성 도메인 (즉, HSA 성분)의 카르복시 말단에 결합하거나, 다른 기능성 도메인의 카르복시 말단에 결합되어 있는 폴리펩티드를 의미한다.

유사하게, 본 발명의 폴리펩티드 중간 물질과 관련되어 사용된 경우의 "융합된"이란 제1 기능성 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3'-[또는 5'-] 말단이 제2 기능성 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 각각의 5'-[또는 3'-] 말단에 공유 결합에 의하거나 간접적으로는 바람직하게는 제1 기능성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 그 말단이 공유 결합되는 뉴클레오티드 링커를 통하여 결합되어 있음을 의미한다.

바람직하게는, 융합 폴리펩티드 또는 그의 염은 단량체 또는 이량체인데, 이량체인 경우에는 HSA 성분의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단이 융합된 제1 IgE 결합 도메인 및 그 HSA 성분의 카르복시 말단에 그의 아미노 말단이 융합된 제2 IgE 결합 도메인과 같은 HSA 성분에 융합된 2개의 IgE 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 융합 폴리펩티드는 IgE 결합 도메인 및 HSA 성분외에 예를 들면, 사이토카인 또는 우로키나아제의 아미노 말단 단편과 같은 전체 길이 또는 절단된 사람 단백질 (예를 들면, 가용성 세포외 단편)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부가적 기능성 도메인은 링커 펩티드로서 작용하는데, 예를 들면 IgE 결합 도메인을 다른 IgE 결합 도메인 또는 HSA 성분에 결합시키거나, 이와 달리 융합 분자내의 다른 곳, 예를 들면 그의 아미노 또는 카르복시 말단에 위치시킬 수 있다.

본 발명의 융합 폴리펩티드의 예를 하기 화학식으로 나타낸다.

I. R₁- L - R₂

II. R₂- L - R₁

III. R₁- L - R₂- L - R₁

IV. R₁- L - R₁- L - R₂

V. R₂- L - R₁- L - R₁

상기 식 중,

R₁은 IgE 결합 도메인의 아미노산 서열이고,

R₂는 HSA 성분의 아미노산 서열이고,

각각의 L은 독립적으로 공유 결합 (바람직하게는, 펩티드)이거나, 공유 결합 (바람직하게는, 펩티드)에 의해 R₁및(또는) R₂의 말단에 결합되는 펩티드 링커이며,

상기 분자 단편은 방향성있게 해독되는데, 즉 좌측은 분자의 아미노 말단에 상응하고 우측은 분자의 카르복시 말단에 상응한다.

본 발명자들은 융합 폴리펩티드가 IgE 결합 도메인에 의해 선도되는 경우, 즉, IgE 결합 도메인이 성숙한 융합 단백질 (예를 들면, 상기 화학식 (I), (III) 및 (IV))의 N-말단 부분을 구성하는 경우에는 IgE 결합이 높은 수준으로 일어나는 것을 발견하였다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 태양은 상기 화학식 (III)의 이량체를 포함하는 것인데; 즉 HSA 성분의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단이 융합된 발현 리더 단백질 영역이 IgE 결합 도메인이고, 이는 다시 제2 IgE 결합 도메인의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단이 융합되어 있는 경우이다. 1개 이상의 R₁잔기, 1개 이상의 R₂잔기 또는 1개 이상의 L 잔기가 존재하는 경우에, 이러한 잔기들은 동일할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 1개 이상의 HSA 성분에 융합되어 있는 1개 이상의 가용성의 분비되는 포유 동물 IgE 결합 도메인 및 그의 제약학적으로 허용되는 염을 포함한다.

또한, 본 발명은 IgE- 또는 IgE-수용체 매개 장애, 및 특히 아토피성 피부염, 아토피성 천식 및 만성 두드러기과 같은 알레르기 반응의 치료를 필요로 하는 환자에 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는 상기 장애의 예방 및(또는) 치료 방법 및 1종 이상의 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 합성시의 중간 물질인 본 발명의 융합 폴리펩티드의 생리학적으로 기능적인 등가물; 상기 정의된 융합 폴리펩티드 또는 그의 생리학적으로 기능적인 등가물을 제조하는데 있어서의 중간 물질인 폴리뉴클레오티드; 그를 제조 하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드; 그러한 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 펩티드; 융합 분자 발현용 재조합 벡터; 원핵 세포 또는 진핵 세포 (특히, 포유 동물 세포) 발현 시스템; 및 그러한 발현 시스템을 사용하여 융합 폴리펩티드 또는 생리학적으로 기능적인 등가물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

<서열 및 관련된 정의의 상세한 설명>

SEQ. ID. NO. 1: 전장 (full-length) 천연 사람 FcεRIα 우성 (dominant) 형태의 아미노산 서열.

용어 "pre-IgE^R"은 SEQ. ID. NO. 1의 Met₁-Leu₂₀₄ 잔기를 의미한다. "IgE^R"란 용어는 pre-IgE^R의 성숙 형태를 의미하며, SEQ. ID. NO. 1의 Val₂₆-Leu₂₀₄ 잔기 (즉, FcεRIα의 세포외 도메인)로 이루어진다.

SEQ. ID. NO. 2: Met₁-Leu₆₀₉ 잔기를 포함하는 천연 prepro-HSA (본 명세서에서 "prepro HSA I"로서 언급함)의 아미노산 서열.

천연 성숙 단백질의 우세 형태 (본 명세서에서 "HSA I"로서 언급함)는 SEQ. ID. NO. 2의 Asp₂₅-Leu₆₀₉잔기를 나타낸다.

용어 "prepro-HSA II"는 천연 서열의 카르복시 말단에서 아미노산 1개 (Leu₆₀₉)가 절단되어 SEQ. ID. NO. 2의 Met₁-Gly₆₀₈ 잔기를 나타낸다.

본 명세서에 "HSA II"로서 언급된 prepro-HSA II의 성숙 형태는 SEQ. ID. NO. 2의 Asp₂₅-Gly₆₀₈ 잔기를 나타낸다.

SEQ. ID. NO. 3: 실시예 5에서 제조되는 플라스미드 R-H-R/SK #50의 EcoRI 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열.

이는 1-204 번에 "pre-IgE^R" 서열을; 205-211번 잔기에 AlaSer(Gly)₄Ser (이하, "L₁"로 언급함) 링커를; 212-795번 잔기에 HSA II 서열을; 796-799번 잔기에 (Gly)₃Ser (이하, "L₂"로서 언급함) 링커를; 800-978번 잔기에 "IgE^R" 서열을 포함한다.

이하, "IgE^R- L₁- HSA II - L₂- IgE^R" 또는 "IgE^R - HSA - IgE^R 이량체"로 언급되는, 실시예 7에 기재되는 방법으로 CHO 세포로부터 발현된 본 발명의 성숙 이량체 융합 폴리펩티드는 SEQ. ID. NO. 3의 Val₂₆-Leu₉₇₈아미노산 서열을 갖는다.

SEQ. ID. NO. 4: 실시예 5의 플라스미드 R-H-R/SK #50의 EcoRI 단편의 뉴클레오티드 서열.

이는 10번 - 621번 위치에 "pre-IgE^R"을 코팅하는 폴리뉴클레오티드 서열을; 622-642번 위치에 L₁을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를; 643-2394번 위치에 HSA II를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를; 2395-2406번 위치에 L₂를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를; 2407-2943번 위치에 "IgE^R"을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 2944-2949번 위치에 2개의 정지 코돈을 갖는다.

코딩 단편의 말단 및 링커 영역의 제한 효소 부위는 1-6번, 622-627번, 637- 642번, 2387-2393번, 2401-2406번, 및 2950-2955번이다. 코작 (Kozak) 서열은 7번-9번 위치의 뉴클레오티드이다.

공통 뉴클레오티드 서열과 다른 점 돌열변이 위치는 804번, 1239번, 1290번, 1446번, 1815번, 2064번 및 2079번이다. 점 돌연변이는 워블 (wobble) 부위에 위치하기 때문에 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다.

SEQ. ID. NO. 5: 천연 prepro-HSA의 우성 형태의 뉴클레오티드 서열

이는 도 12 및 SEQ. ID. NO. 2의 아미노산 서열에 상응한다.

SEQ. ID. NO. 6: 전장 천연 사람 FcεRIα의 우성 형태의 뉴클레오티드 서열

이는 신호 서열을 포함하며, 도 13 및 SEQ. ID. NO. 1의 아미노산 서열에 상응한다.

하기 도면에서 지시된 분자는 방향성있게 해독되는 것으로, 즉 좌측은 아미노 (또는 5'-) 말단에 상응하고 우측은 카르복시 (또는 3'-) 말단에 상응한다.

도 1A 내지 C: 마우스에서의 혈청 반감기: (A) 자유 HSA I 단백질 및 (B) 실시예 7에 기재되는 바와 같이 CHO 세포로부터 제조되는 IgE^R 단백질 ("자유 알파 사슬"로 언급함) 및 IgE^R - L₁- HSA II - L₂-IgE^R 이량체 융합 폴리펩티드 ("IgE^R - HSA - IgE^R" 이량체로 언급함)의 장시간 (주입한지 10 내지 800 분 후)에 걸친 생체내 단백질 농도 (피코몰 단백질/㎖ 혈청). (C) 주입한 지 10 분 후의 혈청 농도에 대해 정규화하여 (B)로부터의 이량체 융합 폴리펩티드 ("IgE^R - HSA - IgE^R")와 비교한 (A)로부터의 자유 HSA I의 혈청 반감기.

도 2: 수동적 피부 과민 반응으로부터 초래되는 침윤 (extravasation) 실시예 7에 기재되는 바와 같이 제조되는 IgE^R - L₁- HSA II - L₂-IgE^R 폴리펩티드 ("IgE^R - HSA - IgE^R" 이량체)의 일련의 희석액 (10 ㎍/㎏, 50 ㎍/㎏ 또는 500 ㎍/㎏)을 정맥 투여한 마우스에서의 수동적 피부 과민 반응으로부터 초래되는 침윤 (extravasation)을 도시한 것으로 (대조군은 0 ㎍/㎏ 투입); 면적은 ㎟이고, 모노클론 마우스 IgE 항-디니트로페닐 (DNP) 항체를 피내 주사하고 이어서 1% 에반스 블루를 함유하는 DNP-소 혈청 알부민 용액을 투여하여 감작시키기 전에 5, 14 또는 30 분 간격.

도 3: 본 발명의 3개의 융합 폴리펩티드 폴리펩티드 링커를 갖는, 본 발명의 3개의 융합 폴리펩티드 (2개는 단량체이고, 1개는 이량체임)의 개략도.

I. 단량체:

(1) IgE^R에 대해 L₂("GGGS")를 통하여 융합된 HSA II (도면에서 "HSA"로 언급함)를 포함하는 HSA-리더 (leader) 단량체. HSA II의 Leu₆₀₇Gly₆₀₈ 부위를 코딩하는 뉴클레오티드는 지시된 단일 MstII 부위를 함유하고, L₂의 GlySer을 코딩하는 뉴클레오티드는 BamHI 부위 (이는 밑줄친 아미노산을 코딩함)를 함유하며;

(2) 카르복시 말단이 L₁(즉, "ASGGGGS")을 통하여 HSA II (도면에서 "HSA"로 언급함)에 융합된 IgE^R를 포함하는 IgE-결합 도메인-리더 단량체. L₁을 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 각각 NheI 부위 및 BamHI 부위 (이들은 각각 밑줄친 아미노산 AlaSer 및 GlySer을 코딩함)를 함유한다.

II. 이량체: 카르복시 말단이 L₁을 통하여 HSA II의 아미노 말단에 융합된 제1 IgE^R을 포함하는 IgE-결합 도메인-리더 이량체로서, 그의 카르복시 말단은 L₂를 통하여 제2 IgE^R에 융합되어 있으며, 단량체에서 기재한 바와 같이 코딩된 폴리뉴클레오티드내에 제한 효소 부위를 갖는다.

도 4: (i) 내지 (iii)을 코딩하는 DNA를 얻기 위해 전장 사람 FcεRIα cDNA ("IgE 수용체 DNA로 언급함)를 절단하기 위한 PCR 프라이머.

(i) IgE^R

[올리고뉴클레오티드 #18에 의해 FcεRIα 코딩 가닥의 5' 말단에 BamHI 부위가 부가되고; 올리고뉴클레오티드 #19에 의해 비-코딩 가닥의 3' 말단에 정지 코돈, EcoRI 및 SalI 부위가 부가되었음];

(ii) pre-IgE^R

[올리고뉴클레오티드 #20에 의해 FcεRIα 코딩 가닥의 5' 말단에 SstI, EcoRI 및 코작 부위가 부가되고; 올리고뉴클레오티드 #31에 의해 비-코딩 가닥의 3' 말단에 정지 코돈, NotI 및 NheI 부위가 부가되었음 (제2 NheI 부위가 제거되었음)]; 및

(iii) pre-IgE^R

[올리고뉴클레오티드 #20 및 #19를 상기된 바와 같이 사용하였음]:

(A) "HSA-리더": 상기 (i)을 SK 벡터내로 서브클로닝하여 HSA II-리더 단량체를 제조하는데 사용되는 클로닝 벡터 TA 클론 pEK1을 제공.

(B) "IgER-리더": 상기 (ii)를 SK 벡터내로 서브클로닝하여 IgE^R-리더 단량체를 제조하는데 사용되는 구조물 IgER/TA#1을 제공.

(C) "IgER 단독": 상기 (iii)을 SK 벡터내로 서브클로닝하여 표준 물질로서 사용되는 성숙 IgE^R의 발현에 사용되는 구조물 IgER FL/TA#34를 제공.

도 5: (i) 내지 (iii)을 코딩하는 cDNA를 얻기 위해 전장 사람 FcεRIα cDNA ("IgE 수용체 DNA로 언급함)를 절단하기 위한 PCR 프라이머쌍.

(i) 카르복시 말단이 L₂에 융합된 prepro-HSA II

[올리고뉴클레오티드 #24에 의해 코딩 가닥의 5' 말단에 SpeI, EcoRI 및 코작 부위가 부가되고; 올리고뉴클레오티드 #28 및 #29에 의해 HSA II의 3' 말단에 MstII 및 HindIII 부위를 코딩하는 링커가 부가되었음];

(ii) HSA II의 5' 말단에 융합된 L₁

[올리고뉴클레오티드 #26에 의해 코딩 가닥에 NotI, NheI, 링커 및 BamHI가 부가되고; 올리고뉴클레오티드 #27에 의해 비-코딩 가닥에 NcoI가 함유되었음]; 및

(iii) prepro-HSA I

[상기한 바와 같이 올리고뉴클레오티드 #24를 사용하였고; 올리고뉴클레오티드 #25에 의해 비-코딩 가닥의 3'-말단에 정지 코돈, EcoRI 및 HindIII 부위가 부가되었음].

(A) "HSA-리더": 상기 (i)을 SK 벡터내로 서브클로닝하여 HSA II-리더 단량체를 제조하는데 사용되는 pEK7를 제공.

(B) "IgER-리더": 상기 (ii)를 SK 벡터내로 서브클로닝하여 IgE^R-리더 단량체를 제조하는데 사용되는 HSA/SK#5를 제공.

(C) "IgER 단독": 상기 (iii)을 SK 벡터내로 서브클로닝하여 표준 물질로서 사용되는 성숙한 천연 사람 혈청 알부민 단백질 (즉, HSA I)을 코딩하는 HSA/SK#17제공.

도 6: TA내에 클로닝된 물질 및 IgE-결합 단편에 대한 결합부를 시퀀싱하는데 사용되는 사람 혈청 알부민 (HSA) 시퀀싱 올리고뉴클레오티드 #1 내지 10, 12, 16, 17, 22 및 30.

도 7: TA내에 클로닝된 물질 및 HSA 성분에 대한 결합부를 시퀀싱하는데 사용되는 IgE 수용체 시퀀싱 올리고뉴클레오티드 #11, 13 및 23.

도 8:

(A) 사람 혈청 알부민에 사용된 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드 #14 및 #15;

(B) 융합 폴리펩티드를 제조하는데 사용되는 PCR 및 링커 올리고뉴클레오티드 #18 내지 20, 24 내지 29 및 31.

도 9: pEK1의 BamHI,SalI 단편을 BamHI,SalI로 절단한 pEK7내로 라이게이션시킴으로써, 링커 L₂를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 (도 9에서 "GGG"로 나타냈음)를 통하여 -IgE^R를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (도면에서 "IgER"로 언급함)의 5'-말단에 3'-말단이 융합된 prepro-HSA II를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (도면에서 "HSA"로 언급함)를 포함하는 벡터 HSA-IgER/SK#49의 제조.

도 10: pEK1의 IgER/TA#1의 SstI,NheI 단편을 SstI,NheI로 절단한 HSA/SK#5내로 라이게이션시킴으로써, 링커 L₁에 사용된 올리고뉴클레오티드 ("GGG"로 나타냈음)를 통하여 HSA II를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ("HSA")의 5'-말단에 3'-말단이 융합된 pre-IgE^R을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (도면에서 "IgER"로 언급함)를 포함하는 벡터 IgER-HSA/SK#1의 제조.

도 11: HSA-IgER/SK#49의 PstI,SalI 단편을 SK 벡터내로 라이게이션시킴으로써, 링커 L₂에 사용된 올리고뉴클레오티드 (도시하지 않음)를 통하여 -IgE^R를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ("IgER"로 나타냄)의 5'-말단에 3'-말단이 융합된 HSA II를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ("HSA3"로 나타냄)를 포함하는 벡터 HSA-IgER Pst Sal/SK#37의 제조 및 L₁에 사용된 올리고뉴클레오티드 (도시하지 않음)를 통하여 HSA II를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ("HSA")의 5'-말단에 3'-말단이 융합되고, 다시 L₂에 사용된 올리고뉴클레오티드 (도시하지 않음)를 통하여 IgE^R을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ("IgER")에 융합된 pre-IgE^R을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ("IgER"로 언급함)를 포함하는 벡터 R-H-R/SK#50의 제조. 벡터는 HSA-IgER Pst Sal/sk#37의 PstI,KpnI 단편을 PstI,KpnI으로 절단된 IgER-HSA/SK#1내로 라이게이션시켜 제조한다.

도 12: SEQ. ID. NO. 2 및 SEQ. ID. NO. 5에 상응하는 사람 혈청 알부민의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열.

도 13: SEQ. ID. NO. 1 및 SEQ. ID. NO. 6에 상응하는 IgE^R의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열.

도 14: R₁- HSA - R₁ 이량체 융합 단백질을 코딩하는, SEQ. ID. NO. 3 및 SEQ. ID. NO. 4에 상응하는 R-H-R/SK#50의 EcoRI 단편의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. HSA 서열은 이탤릭체로 나타냈다. 링커 서열은 소문자로 나타냈다. 공통 HSA 핵산 서열과 다른 점 돌연변이는 진한 소문자로 나타냈다. 점 돌연변이는 워블 부분에 존재하기 때문에, 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다. 단편의 말단 및 링커 영역에 있는 제한 효소 부위는 밑줄을 쳐서 나타냈다.

도 15: 실시예 7의 정제된 성숙 융합 폴리펩티드의 SDS-PAGE

겔에 8 ㎍ (레인 1), 6 ㎍ (레인 2), 4 ㎍ (레인 3), 2 ㎍ (레인 4) 및 분자량 표준 물질 (97.4, 66.2, 45, 31, 21.5 및 14.4 kDa: 레인 5)을 전개시켰다.

본 발명은 하나 이상의 HSA 성분에 융합된 하나 이상의 IgE-결합 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.

용어 "IgE-결합 도메인"은 IgE가 그의 수용체인 FcεRI에 결합하는 것을 방해하는 방식으로 포유 동물, 예를 들면 사람 IgE와 결합할 수 있거나, 달리 연합할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다.

사람 FcεRIα의 cDNA 및 추정된 아미노산 서열은 공지되어 있다 (J. Kochan et al., Nucleic Acids Research 16 [1988] 3584; 및 Leder et al., 미국 특허 제4,962,035호). 사람 FcεRIα은 NH₂-말단 신호 펩티드 [(1번 Met를 포함하여) 아미노산 잔기 Met₁-Ala₂₅] 1개, 면역 글로불린 유사 세포외 도메인 (잔기 Val₂₆- Leu₂₀₄) 2개, 소수성 트랜스멤브레인 영역 (Gln₂₀₅-Ile₂₂₄) 1개, 친수성 세포질성 단부 (잔기 Ser₂₂₅-Asn₂₅₇) 1개를 코딩한다 (참조: SEQ. ID. NO. 1). 신호 펩티드는 세포내 과정 중에 절단된다. 천연 사람 FcεRIα의 우세 형태는 본 명세서에 SEQ. ID. NO. 1로서 포함된다.

본 명세서에서 "IgE^R"은 SEQ. ID. NO. 1의 아미노산 서열 Val₂₆-Leu₂₀₄ (세포외 도메인을 코딩함)을 의미하고, 용어 "pre-IgE^R"은 SEQ. ID. NO. 1의 Met₁- Leu₂₀₄ 잔기 (세포외 도메인의 상유 신호 서열을 코딩함)를 의미한다.

IgE-결합 도메인은 상기 정의된 IgE^R과 예를 들면, 80 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다 (상동성은 서열들을 정렬시키고, 필요에 따라 최대 서열 동일율을 얻기 위해 갭을 도입한 후에, 천연 분자의 전체 서열 길이의 함수로서 나타낸 천연 서열 및 변경된 서열 사이의 % 동일성으로서 계산된다).

본 발명의 융합 폴리펩티드의 하위 군에서, IgE-결합 도메인 성분은 (Xa)이다. 여기서 (Xa)는 (a) IgE^R; (b) 천연의 IgE^R의 대립 형질; (c) 1 - 12개 (예를 들면, 1 - 10개, 1 - 7개 또는 1 - 4개)의 아미노산에 의한 카르복시 말단에서의 (a) 또는 (b)의 절단물; 또는 (d) (a), (b) 또는 (c)의 변형체이다.

"변형체"란

- 10개 이하 (예를 들면, 1-5개)의 아미노산이 1번 이상 결실되어 변형된 (a), (b) 또는 (c)의 서열;

- 아미노산 서열내에 내부적으로 총 10개 이하의 아미노산 또는 어느 한 말단에 총 100개 이하의 아미노산의 삽입체; 또는

- 총 15개 이하 (예를 들면, 1-5개)의 아미노산의 보존적 치환체

를 의미한다.

바람직하게는, IgE-결합 도메인은 (Xb)이다. 여기서, (Xb)는 (a) IgE^R; (b) 1-7개의 아미노산에 의한 카르복시 말단에서의 IgE^R의 절단물; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 변형체이다.

보다 바람직하게는, IgE-결합 도메인은 (Xc)이다. 여기서, (Xc)는 (a) IgE^R; 또는 (b) 1-7개 (예를 들면, SEQ. ID. NO. 1을 참조하면 Val₂₆-Ala₁₉₇ 서열)의 아미노산에 의한 카르복시 말단에서의 IgE^R의 절단물이다.

가장 바람직하게는, IgE-결합 도메인은 IgE^R이다.

바람직하게는, 임의의 상동체 절단체 또는 변이체는 재조합에 의해 "분비가능한 (secretable)" 단백질로 제조되는데, 즉, IgE-결합 도메인을 코딩하는 성숙 펩티드 서열은 이 서열 (또는 pre-형태와 같은 전구체 형태)가 폴리뉴클레오티드로부터 합성되는 숙주 세포로부터 분비될 수 있다. 본 발명의 재조합 융합물인 사람 혈청 알부민 (HSA)의 다른 주요 구성 요소는 가장 많은 혈장 단백질이며, 혈장 단백질 총함량을 기준으로 60 중량%를 차지한다. 사람 혈청 알부민 분자는 분자량 66.5 kD인 585개의 아미노산으로된 글리코실화되지 않은 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 알부민의 특성은 복잡한 이황화 결합 형태이다 (F.F. Clerc et al., J. Chromatogr. 662 [1994] 245-259). 사람 혈청 알부민은 전신에 광범위하게 분포하고, 특히 장관 및 혈액에 분포하는데, 혈청에 가장 많은 단백질로서 주로 삼투압 및 혈장 부피를 유지하는데 관여한다. 더우기, 혈청 알부민은 간에서 천천히 제거되며, 사람에서는 생체내 반감기가 14 - 20일로 나타난다 (T.A. Waldmann, "Albumin Structure, Function and Uses", Pergamon Press [1977] 255-275). 사람 혈청 알부민은 효소 또는 면역 기능이 없다. 이것은 다양한 천연 분자뿐만 아니라 치료용 분자의 내생적 운반 및 전달에 관여한다 (H. Lu et al., FEBS Lett. 356 [1994] 56-59; WO 93/15199호; EP 648499호; P. Yeh et al., PNAS USA 89 [1992] 1904-1908; EP 413622호).

사람 세포는 처음에는 prepro-폴리펩티드 형태로 합성한다. 18개의 아미노산으로된 신호 서열 (Met₁을 포함)은 N-말단의 아미노산 6개 (우성 형태: Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)는 남겨놓은채 단백질이 내질 망상 조직의 관강을 통과할 때 제거되고, 이어서 분비 기구를 통한 운반 중 또는 운반 후에 즉시 단백질 분해에 의해 절단된다.

사람 혈청 알부민은 다형태성인 것으로 잘 알려져 있다 (D.C. Carter and J.X. Ho, Adv. Prot. Chem. 45 [1994] 153-203). 예를 들면, 알부민 나스카피 (Naskapi)는 Glu₃₇₂ 대신에 Lys₃₇₂를 가지며, 프로알부민 크라이스트처치 (Christchurch)는 변형된 pro- 서열인데, 즉 Arg₂₄ 대신에 Glu₂₄를 가진다 (Latta et al., 미국 특허 제5,100,784호).

본 명세서에서 "prepro-HSA I"로 언급되는 천연 단백질의 우세 형태의 완전한 아미노산 서열은 공지되어 있다 (A. Dugaiczy et al., PNAS USSA 79 [19982] 71-75) (SEQ. ID. NO. 2). 성숙한 단백질의 우성 형태 ("HSA I")는 SEQ. ID. NO. 2의 Asp₂₅-Leu₆₀₉로 나타낸다.

본 발명의 융합 폴리펩티드의 HSA 담체는 SEQ. ID. NO. 2의 25-609번 잔기와 80 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 99 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다 (즉, HSA I) (상동성은 서열들을 정렬시키고, 필요에 따라 최대 서열 동일율을 얻기 위해 갭을 도입한 후에, 천연 분자의 전체 서열 길이의 함수로서 나타낸 천연 서열 및 변경된 서열 사이의 % 동일성으로서 계산된다).

본 발명의 융합 폴리펩티드의 하위 군에서, HSA 성분은 (Ya)이다. 여기서 (Ya)는 (a) HSA I; (b) 천연의 (a)의 대립 형질; (c) 1-10개 (예를 들면, 1 - 5개, 1개 또는 2개)의 아미노산에 의한 카르복시 말단에서의 (a) 또는 (b)의 절단물; (d) 아미노 잔기 n번 (여기서, n은 369-419이고, 특히 373, 388, 389, 390 또는 407임)에서 종결시키는 (a)의 절단물; 또는 (e) (a), (b), (c) 또는 (d)의 변형체이다.

"변형체"는

- 10개 이하 (예를 들면, 1 - 5개)의 아미노산이 1번 이상 결실되어 변형된 (a), (b), (c) 또는 (d)의 서열;

- 아미노산 서열내에 내부적으로 총 10개 이하의 아미노산 (예를 들면, 1-5개) 또는 어느 한 말단에 총 100개 이하의 아미노산의 삽입체; 또는

를 의미한다.

바람직하게는, HSA 성분은 (Yb)이다. 여기서, (Yb)는 (a) HSA I; (b) (a)의 천연 대립 형질; (c) 1-10개의 아미노산 (예를 들면, 1-5개, 1개 또는 2개)에 의한 카르복시 말단에서의 (a) 또는 (b)의 절단물; 또는 (d) (a), (b) 또는 (c)의 변형체이다.

보다 바람직하게는, HSA 성분은 (Yc)이다. 여기서, (Yc)는 (a) HSA I; 또는 (b) 1-10개 (예를 들면, 1개)의 아미노산에 의한 카르복시 말단에서의 HSA I의 절단물이다 (그러한 절단물의 예는 "HSA II"로서, 아미노산 서열은 SEQ. ID. NO. 2의 Asp₂₅-Gly₆₀₈이다).

더욱 바람직한 하위 군에서, HSA 성분은 HSA I 또는 HSA II이며, 특히 HSA II이다.

특히 바람직한 것은 실시예 7의 융합 폴리펩티드로서, 특히 리더 서열이 없는, 즉 SEQ. ID. NO. 3의 Val₂₆-Leu₉₇₈ 폴리펩티드이다.

바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질을 제조하는데 사용되는 천연 HSA의 임의의 유사물, 절단물 또는 변형체는 효소적 기능이 결여되고, 혈청 IgE에 IgE-결합 도메인을 결합시키는 것을 방해하거나 억제할 것이다. 임의의 상기 유사체 또는 변형체가 14 일 이하의 혈청 반감기를 갖는 것이 더욱 바람직할 것이다.

IgE-결합 도메인 또는 HSA 성분에 관련하여 "보존적 치환체"란 용어는 1개 이상의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산에 의해 적어도 폴리펩티드의 2차 구조, 바람직하게는 3차 구조가 실질적으로 변화하지 않도록 치환된 것을 의미한다. 예를 들면, 대표적인 그러한 치환체는 글리신 대신에 알라닌 또는 발린을, 글루타민 대신에 아스파라긴을, 트레오닌 대신에 세린을, 리신 대신에 아르기닌을 포함한다. 모든 아미노산 (글리신은 제외함)은 바람직하게는 천연 L-아미노산이다.

바람직하게는, 각각의 IgE-결합 도메인은 IgE^R에 대해 95 % 이상, 각각의 HSA 성분은 HSA I에 대해 95 % 이상의 상동성을 갖는다.

다른 바람직한 하위 군에서,

- 상기 정의된 바와 같이, 각각의 IgE-결합 도메인은 바람직하게는 (Xa)이고, 각각의 HSA 성분은 (Ya), 바람직하게는 (Yb), 보다 바람직하게는 (Yc)이고;

- 상기 정의된 바와 같이, 각각의 IgE-결합 도메인은 보다 바람직하게는 (Xb)이고, 각각의 HSA 성분은 (Ya), 바람직하게는 (Yb), 보다 바람직하게는 (Yc)이고;

- 상기 정의된 바와 같이, 각각의 IgE-결합 도메인은 더욱 바람직하게는 (Xc)이고, 각각의 HSA 성분은 (Ya), 바람직하게는 (Yb), 보다 바람직하게는 (Yc)이다.

더욱 바람직한 하위 군에서, IgE-결합 도메인은 IgE^R이고, 상기 정의된 바와 같이 HSA 성분은 (Ya), 보다 바람직하게는 (Yb), 더욱 바람직하게는 (Yc)이고, 가장 바람직하게는 HSA I 또는 HSA II, 특히 HSA II이다.

상기에 나타낸 바람직한 것은 본 명세서의 화학식 (I), (II), (III), (IV) 및 (V)의 각각의 폴리펩티드에도 또한 적용된다.

본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 카르복시 말단을 통하여 HSA II의 아미노산 말단에 융합되어 있는 IgE^R의 제1 분자를 포함하는 것으로서, HSA II는 카르복시 말단을 통하여 IgE^R의 제2 분자의 아미노산 말단에 융합되어 있다 (IgE^R은 SEQ. ID. NO. 1의 Val₂₆-Leu₂₀₄ 잔기이고, HSA II는 SEQ. ID. NO. 2의 Asp₂₅-Gly₆₀₈ 잔기이다).

본 발명의 특히 바람직한 폴리펩티드는 각각의 R₁이 IgE^R이고 R₂가 HSA II인 상기 화학식 (III)의 이량체를 포함한다. 특히 바람직한 것은 각각의 L이 1-25개의 아미노산인 이량체이다.

바람직하게는, 임의의 펩티드 링커 (본 명세서의 화학식 (I) 내지 (V)에서 "L"로 나타냄)는 IgE-결합 도메인의 독립적인 폴딩 (folding) 및 활성을 허용하고; IgE-결합 도메인을 방해하거나 환자에서 면역학적 반응을 일으킬 수 있는 정돈된 2차 구조로 발달시키려는 경향과 무관하며; IgE-결합 도메인과 상호 작용할 수 있는 최소의 소수성 또는 전하 특성을 갖는다.

펩티드 링커는 바람직하게는 1-500개, 보다 바람직하게는 1-250개, 더욱 바람직하게는 1-100개 (예를 들면, 1-25개, 1-10개, 1-7개 또는 1-4개)의 아미노산이다. 링커는 바람직하게는 선형, 즉 분지되지 않은 형태이다. 일반적으로, Gly, Ala 및 Ser을 포함하는 펩티드 링커는 링커의 기준을 충족시키는 것으로 기대될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 링커는 GlyGlyGlySer (본 명세서 중의 "L₁") 및 AlaSerGlyGlyGlyGlySer (본 명세서 중의 "L₂")을 포함한다. 다양한 길이 및 서열 조성의 링커를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드 링커를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 IgE-결합 도메인 및 HSA 성분을 코딩하는 폴리펩티드와 함께 "프레임에 맞게(in frame) 융합"되어야 하고, 바람직하게는 분자내에 유일한 제한 효소 부위를 포함하여야 한다. "프레임에 맞게 융합된다는 것"은 (1) IgE-결합 도메인 또는 HSA 성분의 해독 프레임내 링커 올리고뉴클레오티드에 의해 쉬프트가 일어나지 않고; (2) IgE-결합 도메인 및 HSA 성분의 해독 프레임 사이에 번역 종결이 일어나지 않는 것을 의미한다.

본 발명은 신규 폴리펩티드의 합성에서의 통상의 중간 물질인 신규한 융합 폴리펩티드의 생리학적으로 기능적인 등가물을 추가로 포함한다. "생리학적으로 기능적인 등가물"이란 용어는 바람직하게는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 포함하는 큰 분자를 의미하는데, 이는 아미노산 서열이 특정 숙주 세포로부터 본 발명의 성숙 재조합 융합 폴리펩티드의 효과적인 발현 및 분비에 필요하거나 바람직하도록 가한다. 그렇게 가해진 서열은 대표적으로는 성숙 폴리펩티드의 아미노 말단이고, 통상적으로는 직접 그들을 분비 경로중으로 보내는 리더 (즉, 신호) 서열을 구성하며, 통상적으로는 세포로부터 폴리펩티드가 분비될 때 또는 분비되기 전에 절단된다. 신호 서열은 관련된 폴리펩티드의 천연 N-말단 영역으로부터 유래될 수 있거나, 또는 분비된 단백질을 코딩하는 숙주 유전자로부터 얻을 수 있거나 본 발명의 폴리펩티드의 분비를 증가시키는 것으로 공지된 임의의 서열로부터 유래될 수 있으며, "pre-" 및 "pro-" 영역 사이의 합성 서열 및 모든 조합을 포함한다. 신호 서열 및 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열 사이의 접합점은 숙주내에서 절단되는 부위에 상응해야 한다.

IgE-결합 도메인이 발현을 "선도"하는, 즉 융합 분자내에서 다른 코딩 서열의 상류에 존재하는 융합 폴리펩티드에서는, 천연 사람 FcεRIα의 리더 서열 (즉, SEQ. ID. NO. 1의 Met₁ + Ala₂-Ala₂₅)을 이용하는 것이 편리하며, 이것은 포유 동물 발현 시스템뿐만 아니라 효모 (Pichia pastoris)로부터 성숙 폴리펩티드를 얻는데 효과적으로 사용되어 왔다.

성숙 이량체 융합 폴리펩티드의 IgE^R- L₁- HSA II - L₂-IgE^R의 생리학적으로 기능적인 등가물의 예는 pre-IgE^R- L₁- HSA II - L₂-IgE^R이다. 그러나, 추가의 리더 서열은 사람 FcεRIα에는 필요하지 않으며, 임의의 적절한 공급원으로부터 얻을 수 있는데, 단 특정 숙주 세포로부터의 성숙 폴리펩티드의 효과적인 발현/분비에 적절한 경우이다. 예를 들면, HSA의 prepro- 서열은 상기 이량체 융합 폴리펩티드를 제조하는데, 특히 효모에서 발현시키는데 사용할 수도 있다.

HSA 성분이 발현을 선도하는 본 발명의 융합 폴리펩티드에 있어서, 적절한 리더 서열은 천연 리더 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, HSA의 천연 prepro- 영역을 포유 동물 (예를 들면, CHO 또는 COS) 세포 또는 효모 (Pichia pastoris)로부터 성숙 비균일 폴리펩티드의 분비를 성취시키는데 사용할 수 있다.

HSA II - L₂- IgE^R로 나타내는 성숙 융합 폴리펩티드의 생리학적으로 기능적인 등가물의 예는 prepro HSA II - L₂- IgE^R이다. 다른 리더 서열은 HSA 또는 숙주 세포에 대해 천연일 필요는 없지만, 특정 숙주내에서 성숙 융합 단백질의 효과적인 발현을 제공할 수 있다 (미국 특허 제5,100,784호; 미국 특허 제5,330,901호).

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 융합 폴리펩티드를 제조하는데 있어서 중간 물질인 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 예를 들면 도 8에 도시한 융합 폴리펩티드 또는 그의 생리학적으로 기능적인 등가물, 및 링커 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 추가의 일면으로,

(a) 숙주 세포를 제1항에 따른 폴리펩티드 또는 그의 생리학적으로 기능적인 등가물을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터로 형질 전환시키는 단계;

(b) 상기 숙주 세포내에서 폴리펩티드 또는 그의 생리학적으로 기능적인 등가물을 발현시켜 생리학적으로 기능적인 등가물인 폴리펩티드가 변형되어 제1항에 정의된 융합 폴리펩티드를 생성시키는 단계; 및

(c) 생성된 폴리펩티드를 숙주 세포로부터 회수하는 단계

를 포함하는, 상기 정의된 재조합 융합 폴리펩티드 또는 그의 염의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 추가의 일면으로, 융합 폴리펩티드의 발현에 사용하기 위한 벡터, 바람직하게는 플라스미드를 제공한다. 이러한 벡터는 상기 정의된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 생리학적으로 기능적인 등가물을 코딩하는 DNA를 포함한다. 보편적으로, 융합 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 미생물을 형질 전환시킬 수 있는 적절한 벡터는 프로모터와 함께 발현 카세트를 구성하는 전사 및 번역 조절 서열에 결합되어 있는 융합 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 프로모터는 사용된 특정 숙주의 유전자로부터 유래될 수 있거나, 그러한 조절 영역은 예를 들면 시험관내 위치 특이적인 돌연변이 유발, 추가의 조절 요소의 도입 또는 합성 서열에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명에 구체적으로 사용되는 발현 벡터는 의도한 숙주내에서 기능적이며 하이브리드 거대 분자를 코딩하는 서열의 3' 말단에 위치하는 전사 및 번역 종결 영역도 또한 포함한다. 벡터는 발현 벡터외에도 형질 전환된 숙주를 선별가능하게 만드는 1개 이상의 마커를 포함한다. 그러한 마커는 G418과 같은 항체에 내성을 부여하는 마커를 포함한다. 이러한 내성 유전자는 특정 숙주내에서의 발현을 가능하게 하는 적절한 전사 및 번역 신호의 제어하에 위치한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 재조합 융합 폴리펩티드를 예를 들면 다음과 같이 수행할 수 있다.

A. 융합 단백질 발현 벡터의 제조

재조합 융합 폴리펩티드를 제조하는 제1 단계는 클로닝 벡터내에 융합 폴리펩티드 부분을 서브클로닝하는 것이다. 이러한 의미에서, "클로닝 벡터"는 숙주 원핵 세포에서 자발적으로 복제될 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 박테리오파아지와 같은 DNA 분자이다. 전형적으로, 클로닝 벡터는 외래 DNA 서열이 벡터의 실질적인 생물학적 기능을 손상시키지 않은채 탐지가능한 양식으로 삽입될 수 있는 제한 효소 인식 부위뿐만 아니라, 클로닝 벡터를 사용하여 형질 전환된 세포를 확인하고 선별하기 위한 적절한 마커를 1개 또는 수 개 함유한다. 대표적으로, 마커 유전자는 테트라싸이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다. 적절한 클로닝 벡터는 문헌 [J. Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989])에 기재되어 있으며, 다양한 공급원으로부터 입수할 수 있다.

FcεRIα cDNA 클론 pGEM-3-110B-1은 문헌 [A. Shimizu et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85 [1988] 1907-1911]에 기재되어 있고, ATCC로부터 입수할 수 있다 (ATCC stock #67566). 단일 가닥의 사람 간 cDNA는 클론텍 (Clontech)으로부터 입수할 수 있다 (PCR-ready Quick Clone cDNA, Cat. #7113-1). HSA의 서열은 진뱅크 (GenBank)로부터 기탁 번호 VOO495, JOOO78, LOO132, LOO133하에 입수할 수 있다. HSA cDNA는 실시예 2에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 #24 및 25를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다.

적절한 IgE-결합 도메인 또는 HSA 성분 DNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 제조할 수 있다. PCR은 단일 가닥 cDNA 주형과 올리고뉴클레오티드 프라이머 혼합물을 사용한다. PCR은 잘 알려진 방법을 통해 수행한다. 참조: 문헌 [C.R.M. Bangham, "The Polymerase Chain Reaction: Getting Started" in Protocol in Human Molecular Genetics. Human Press [1991], Ch.I, p.1-8). PCR 키트 및 키트용 물질도 다양한 공급원으로부터 시판되고 있다. 사용하는 키트 및 방법이 예를 들면, 미국 특허 5,487,993호에 추가로 기재되어 있다.

신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 PCR에 의해, 필요한 경우에는 공지된 신호 펩티드 서열을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 가할 수 있다. 이종(heterologous)의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 융합 폴리펩티드의 N-말단을 코딩하는 DNA 서열과 프레임이 맞도록 서브클로닝한다.

폴리뉴클레오티드의 융합은 중간체 벡터내에 서브클로닝함으로써 성취할 수 있다. 이와 달리, 하나의 유전자를 다른 유전자를 함유하는 벡터중으로 직접 클로닝할 수 있다. 링커 및 어댑터를 DNA 서열을 결합시키는데 사용할 수 있다.

서브클로닝은 제한 효소에 의한 절단을 사용하여 적절한 말단을 제공하는것, 알칼리성 포스파타제로 처리하여 DNA 분자의 바람직하지 않은 결합을 억제하는 것 및 적절한 리가아제를 사용하여 라이게이션시키는 것과 같은 통상의 기술에 따라 수행한다. 그러한 제조 기술은 문헌에 기재되어 있으며 당 기술 분야에 공지되어 있다.

B. 융합 폴리펩티드의 발현 벡터

이어서, 클로닝된 융합 단백질을 클로닝 벡터로부터 잘라내어 발현 벡터 중으로 삽입한다. 적절한 발현 벡터는 대체로,

(1) 세균성 복제 기원을 코딩하는 원핵 세포 DNA 요소, 세균 숙주내에서의 생장 및 발현 벡터의 선별을 제공하는 내성 마커;

(2) 프로모터와 같은, 전사의 개시를 조절하는 진핵 세포 DNA 요소; 및

(3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사물의 프로세싱(processing)을 조절하는 DNA 요소를 포함한다.

그리하여, 본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현시키는데 사용하기 위한 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터에 관한 것으로, 이는 본 명세서에 개시된 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 원핵 세포 또는 진핵 세포를 형질 전환시킬 수 있는 적절한 발현 벡터는 사용되는 숙주 세포에 따라 선택되는 전사 및 번역 조절 서열에 결합되어 있는 융합 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서얼을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 대장균에서 발현시키기 위해서, 문헌 [M.W. Robertson, J.Biol.Chem. 268 [1993] 12736-12743)에 기재된 것과 같은 벡터를 사용할 수 있다. 생성물은 이황화 결합되나, 글리코실화되지는 않을 것으로 기대된다. 효모에서 발현시키기 위해서, 인비트로겐(Invitrogen)사 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 피키아 파르토리스 (Pichia pastoris) 발현 키트로 공급되는 pHIL-D2와 같은 발현 벡터를 사용할 수 있다. 단백질 산물은 디술파이드 결합되고 글리코실화되어 있을 것으로 기대된다. 다른 적절한 효모 발현 벡터 시스템은 사카로마이세스 세레비지 (Saccharomyces cerevisiae) 및 클루베로마이세스 락티스 (Kluveromyces lactis)를 포함한다. 바큘로바이러스에서 발현시키기 위해서는 글리코실화되고 디술파이드 결합된 생성물을 분비하는 것으로 기대되는, 곤충 세포를 감염시키는데 유용한 pAC360, pVL1392 및 pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA, USA)과 같은 벡터가 곤충 세포를 감염시키는데 유용하다.

본 발명의 융합 폴리펩티드는 통상적으로는 특히 포유 동물 세포에서 발현되는 경우에 당단백질이며, 본 발명은 임의의 글리코실화 또는 디술파이드 브릿지에 의한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 특히, 돌연 변이 분석은 제1 부위에서의 N-결합 글리코실화, IgE 수용체 α 사슬의 N-결합 글리코실화 부위의 제2 및 제7 부위 (A. Shimizu et al., PNAS USA 85 [1988] 1907-1911, 도 2) (서열 1의 46, 67 및 191번 아미노산 잔기에 상응함)가 IgE^R 분자 및 그를 포함하는 단량체 및 이량체의 생물학적 활성을 증직시키는 것을 시사하고 있다. 가장 바람직한 발현 시스템은 가해진 임의의 당이 폴리펩티드로부터 유래된 천연 분자의 것과 가장 유사한 것일 것이다. 효모 및 곤충 세포는 포유 동물 세포로부터 상이하게 당단백질을 변형시키는 것으로 공지되어 있으나, 대장균에서는 분비된 후에 당 분자가 부가되지 않는다. 그리하여 이러한 임의의 발현 시스템으로부터 발현시켜 진단용으로 유용한 단백질 생성물을 제조할 수 있고, 치료용 분자로서 사용하기 위한 생성물을 발현시키는 가장 바람직한 형태는 포유 동물 세포에서, 가능하게는 유전자 전환된 포유 동물의 우유에서 발현시키는 것이다.

포유 동물 숙주에서 발현시키기 위해서, 발현 카세트에 사용되는 전사 및 번역 조절 신호는 아데노바이러스, 소의 유두종 바이러스 또는 유인원 바이러스와 같은 바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있고, 조절 신호는 높은 발현 수준을 갖는 특정 유전자와 관련된다. 또한, 적절한 전사 및 번역 조절 서열은 액틴, 콜라겐, 미오신 및 메탈로티오네인 유전자와 같은 포유 동물 유전자로부터 얻을 수 있다. 전사 조절 서열은 포유 동물 세포에서 RNA 합성의 개시를 지시하기에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 대표적인 포유 동물 세포의 예는 CHO (Chinese hamster ovary) 세포, HeLa, BHK, NIH 스위스 마우스 배아 세포, 래트, 원숭이나 사람의 섬유아세포 또는 래트 혈종 세포이다.

포유 동물에서의 발현을 위해서, 바람직한 방법은 CHO 세포로부터 분비시키는 것이다. CHO 또는 사람 세포는 모두 C127 및 SP2/0 세포와 같은 쥐과 동물 세포에서의 발현에 전형적인 α1,3-결합 갈락토스 잔기를 가하지 않는다. 이러한 당 결합에 대한 항체는 사람 혈청에 존재하며 (C.F. Goochee et al., BioTechnol. 9 [1991] 1347-1355), 이러한 쥐과 동물 세포로부터 발현된 재조합 생성물의 반감기, 접근가능성 및 제거에 영향을 미칠 수 있다. CHO, dhfr-세포는 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR)의 돌연변이체이어서 푸린, 티미딘 및 글리신을 신생합성할 수 없다. DHFR 유전자의 야생형 카피를 갖는, 염색체상에 통합된 플라스미드의 카피수는 형질 전환 세포가 이러한 플라스미드에 노출됨으로써 증가되거나 증폭되어, 효소의 활성 부위에 결합하는 폴레이트와 경쟁하는 폴레이트 유사 물질인 메토트렉세이트의 수준을 증가시킬 수 있다. CHO, dhfr-세포에서 발현시키기에 적절한 벡터는 pMT2이다 (R.J. Kaufman et al., EMBO J. 6 [1987] 187-193). pMT2 벡터는 외래 유전자와 함께 단일 mRNA으로서 전사되는 DHFR 유전자의 야생형 카피를 갖는다. 그러므로, 형질 전환된 CHO, dhfr-세포를 증가시킨 농도의 메토트렉세이트로 처리하면, 외래 유전자 및 DHFR 유전자가 모두 동시에 증폭된다. 이러한 세포로부터 분비된 생성물은 포유 동물 양식으로 디술파이드 결합되고 글리코실화되는 것으로 기대된다.

발현 벡터를 인산칼슘 형질 감염, 리포솜-매개 형질 감염, 전기침공 등을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 바람직하게는, 형질 감염된 세포를 선별하여 증식시키는데, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈중에 안정하게 통합되어 안정한 형질 전환체를 생산한다. 세포를 예를 들면, DMEM 배지중에서 배양할 수 있다.

배지중으로 분비된 폴리펩티드는 예를 들면, 항생제 내성에 의해 선별한 후에 세포를 감염시키거나 안정한 세포주를 확립한 후 24 내지 72 시간 동안 일시적으로 발현시킨 후에 표준 생화학적 접근법에 의해 회수할 수 있다.

배양으로부터 발현된 폴리펩티드를 회수하는 통상의 방법은 잘 알려진 생화학적 기술을 사용하여 배양의 폴리펩티드 함유 부분을 분획화하는 것을 포함한다. 예를 들면, 단백질 분획용으로 공지된 것과 같은 겔 여과, 겔 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, 이온 교환 또는 친화도 크로마토그래피 방법을 사용하여 배양중에 발견되는 발현된 단백질을 단리할 수 있다. 이외에도, 면역 친화도 또는 면역 흡수와 같은 통상의 면역 화학적 방법으로 수행할 수 있다. 형질 전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제를 위한 기술도 잘 알려져 있다 (상기 문헌 J. Sambrook et al. [1989]: R.J. Kaufman, Genetic Engineering: Principle and Method, Plenum Press, Vol.2 [1987] 156-198).

본 발명의 융합 폴리펩티드는 포유 동물, 특히 사람 알레르기 환자를 치료하기 위한 치료 용도로 언급된다. 융합 폴리펩티드의 IgE-결합 도메인은 비만 세포, 호염기구 및 랑게르한스 세포상에 존재하는 천연 IgE 수용체에 대해 IgE와 경쟁하여, IgE가 투여된 단백질에 결합하고 이러한 알레르기 작동체 세포에 결합할 수 없게되어 알레르기 반응을 매개한다. 또한, IgE-결합 도메인은 FcεRI에 대한 자가 항체에 결합함으로써 IgE 수용체인 FcεRIα와 경쟁한다.

그리하여, 본 발명은 IgE에 경쟁적으로 결합하고(하거나) IgE의 생산을 억제하여 IgE- 또는 IgE-수용체 매개된 장애, 보다 구체적으로는 알레르기 아토피성 피부염, 아토피성 천식 및 만성 두드러기과 같은 알레르기와 관련된 상태의 억제 및(또는) 예방하는 약제학적 조성물을 제공한다.

"IgE- 또는 IgE-수용체 매개된 장애"란 세포에 결합된 IgE 수용체인 FcεRI를 IgE 또는 FcεRI에 대한 항체에 결합시키는 것과 관련된 장애를 의미하는 것으로, 예를 들면 기관지 천식, 아토피성 천식, 고초열, 꽃가루 알레르기, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 습진, 과민증뿐만 아니라 두드러기과 같은 알레르기 반응 형태 ("과-IgE 증후군") 및 비-알레르기성 키무라(Kimura's)병 및 다른 폐, 피부 또는 자가 면역 질병이다.

특히, 아토피가 가장 급격하게 증가하는 것 중의 하나인 아토피성 피부염은 높은 혈청 IgE 수준과 관련된 만성 염증성 피부 질병이며, 여러 환경의 알레르겐에 대한 감작 현상이다 (M.A. Morren et al., J. Am. Acad. Dermatol. 31 [1994] 467-473). 아토피성 비부염의 현행 치료법은 스테로이드 함유 크림을 사용하는 것에 집중되어 있으며, 심각한 아토피성 피부염의 경우에는 시클로스포린 A를 사용하여 성공적으로 치료되었지만 (H. Granlund et al., Br. J. Dermatol. 132 [1995] 106-112), 소수의 환자에서 부작용이 나타났다. 비만 세포 탈과립화 및 B 세포 및 다른 항원 제공 세포에 의한 IgE-매개된 항원 제공을 억제하는 작용제는 아토피성 피부염의 통상의 공지된 임의의 치료법보다 우수하며, 또한 다른 보다 온화한 형태의 알레르기에도 유용하다.

본 발명의 폴리펩티드는 아토피성 피부염, 아토피성 천식외에도, FcεRIα의 활성화를 통해 비만 세포 탈과립화가 역할하는 만성 두드러기 (CU)을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드는 질병을 치료하기 위해 달리 제안된 항-IgE 모노클론 항체와는 대조적으로, FcεRIα에 대한 자가 항체를 확실하게 순환시킬 수 있다.

폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 투여할 수 있다.

"염"이란 용어는 특히 폴리펩티드 사슬의 아미노기 등의 산부가염을 제조하기 위해 제약학적으로 허용되는 비독성 산 또는 폴리펩티드 사슬의 카르복실기 등의 염기염을 제조하기 위한 제약학적으로 허용되는 비독성 염기로부터 제조된 제약학적으로 허용되는 염을 의미한다. 그러한 염은 본 발명의 폴리펩티드의 내부염 및(또는) 아미노 또는 카르복실산 말단의 염으로서 제조할 수 있다.

적절한 제약학적으로 허용되는 산 부가염은 제약학적으로 허용되는 비독성 유기산, 중합체 산 또는 무기산의 산 부가염이다. 적절한 유기산의 예로는 아세트산, 아스코르브산, 벤조산, 벤젠술폰산, 시트르산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브롬화수소산, 염산, 이소티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 무크산, 질산, 옥살산, 파모산, 판토텐산, 인산, 살리실산, 숙신산, 황산, 타르타르산 및 p-톨루엔술폰산뿐만 아니라, 탄닌산 또는 카르복시메틸 셀룰로오스를 들 수 있다. 적절한 무기산으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 및 질산을 들 수 있다.

카르복실기의 염을 제조하는데 적절한 무기 염기의 예로는 나트륨, 칼륨 및 리튬염과 같은 알칼리 금속염; 칼슘, 바륨 및 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염; 및 암모늄, 구리, 제1철, 제2철, 아연, 망간, 알루미늄 및 아망간, 알루미늄 및 망간염을 들 수 있다. 바람직한 것은 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨염이다. 카르복실기의 염을 제조하는데 적절한 제약학적으로 허용되는 유기 염기의 예로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리(n-프로필)아민, 디시클로헥실아민, β-(디메틸아미노)에탄올, 트리(히드록시메틸)아미노메탄, 트리에탄올아민, β-(디메틸아미노)에탄올, 아르기닌, 리신, 히스티디엔, N-에틸피페리딘, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, 카페인 및 프로카인을 들 수 있다.

폴리펩티드의 산부가염은 폴리펩티드를 염산과 같은 1가 이상의 바람직한 무기산 또는 유기산과 접촉시킴으로써 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 펩티드의 카르복실기의 염은 펩티드를 금속 수산화물 염기, 예를 들면 수산화나트륨; 금속 탄산염 또는 중탄산염 염기, 예를 들면 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨; 또는 아민 염기, 예를 들면 트리에틸아민 또는 트리에탄올아민와 같은 1가 이상의 바람직한 염기와 접촉시켜 통상적으로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께, 상기 정의된 융합 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 담체는 바람직하게는 무균이고 발열 물질이 없으며 비경구적으로 허용되는 액체이다. 물, 생리 식염수, 수성 덱스트로스 및 글리콜이 특히 주사 용액으로 바람직한 액체 담체 또는 희석제이다. 조성물은 통상적으로 제조된 동결건조물일 수 있다.

조성물을 전신, 즉 비경구 (예를 들면, 근육내, 정맥지, 피하 또는 피내) 또는 복강내로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위해서, 융합 폴리펩티드는 환자 혈청 또는 혈장에서, 예를 들면 혈청 또는 혈장 1 ㎖에 폴리펩티드 1 ㎖이 용해되는 정도로 실질적으로 가용성인 것이 바람직하다.

조성물을 국소 투여용으로 공지된 기술에 의해 투여할 수도 있다. 적절한 투여 형태의 예로는 스프레이, 안약 용액, 비강 용액 및 연고를 들 수 있다. 예를 들면, 스프레이는 펩티드를 적절한 용액에 용해시킨 후 분무기에 넣어 통상적으로 사용되는 흡입 치료용 에어로졸로서 제공된다. 안약 또는 비강 용액은 활성 성분을 증류수에 용해시키고, 완충액, 등장성화제, 증점제, 보존제, 안정화제, 계면 활성제 또는 방부제와 같은 필요한 임의의 보조제를 첨가하고, 혼합물의 pH를 4 내지 9로 조절하여 제조할 수 있다. 연고는 예를 들면, 2 % 수성 카르복시비닐 중합체와 같은 중합체 용액 및 2 % 수산화나트륨과 같은 염기로부터의 조성물을 제조하고 혼합하여 겔을 얻고, 정제된 융합 폴리펩티드의 일정량을 겔과 함께 혼합하여 얻을 수 있다.

조성물을 바람직하게는 피하 또는 정맥내로, 가장 전형적으로는 피하로 투여한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염 치료 유효량을 알레르기 상태의 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는 상기 질병의 치료 방법을 포함한다. 치료 방법은 알레르기 질병 상태의 단계 동안에 실시하거나 (즉, 증상의 완화가 특히 필요한 경우에); 연속 또는 예방 치료로서 실시한다 (즉, 알레르기 반응과 같은 예견되는 IgE- 또는 IgE-수용체 매개된 질병이 발병하기 전에).

본 발명에 따른 유효 투여량은 치료할 상태의 정도 또는 심각도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료 기간, 융합 단백질의 효능 등을 고려하여 다양한 범위로 변화시킬 수 있고, 이는 통상의 방법으로 결정할 수 있다.

개개의 환자는 IgE (뿐만 아니라 FcεRI에 대한 항체)의 함량이 다르기 때문에, 본 발명에 따른 치료 유효 투여량은 혈청 IgE 및 FcεRI에 대한 항체의 총 함량의 5 x 10²내지 1 x 10⁴배 (몰 농도)로서 가장 잘 투여될 수 있다. 하루에 1회 이상 투여하여 환자를 치료할 수 있다. 조성물을 1개월 (또는 적절하다면 주 간격) 당 한번 투여할 수 있고, 또한 단일 또는 다수회로 투여할 수 있다.

평균 환자 (70 ㎏)에 적절한 월 투여량은 1개월 당 약 0.5 ㎎ 이하 내지 1개월 당 약 500 ㎎의 범위, 바람직하게는 1개월 당 약 20 ㎎ 내지 약 250 ㎎ 범위의, 실시예 7의 이량체와 같은 본 발명의 융합 폴리펩티드일 수 있고, 통상적으로는 1개월에 1 또는 2회로 분할 투여한다. 1개월 당 500 ㎎ 내지 1개월 당 2 g 등의 보다 높은 투여량 범위는 높은 혈청 IgE 농도 또는 초기 처리 단계를 갖는 환자에서 적용될 수 있다.

투여량 및 투여 시간을 변화시킬 수 있다. 조성물의 초기 투여는 상기 범위내에서 보다 높은 투여량으로 이루어질 수 있고, 치료 후반부보다 더욱 자주 투여할 수 있다. 적절한 투여량은 상기 지적된 바와 같이 환자의 혈청에서 IgE 및 FcεR을 측정하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 질병의 초기 단계에는 실시예 7의 이량체와 같은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 평균 환자 (70 ㎏)에서 주 1회로 폴리펩티드를 200 내지 500 ㎎으로 투여할 수 있다. 혈청 IgE 및 FcεRI에 대한 항체가 제거된 후에, 치료 섭생을 주 1회 또는 격주로 감소시킬 수 있고, 투여량은 1회 치료에 50 ㎍ 내지 100 ㎎ 범위이다.

본 발명의 조성물을 본 발명의 화합물 단독으로, 본 발명의 다른 화합물 또는 항히스타민 또는 코르티코스테로이드와 같은 추가의 약제학적 제제와 배합하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 사람 환자로 부터 얻은 생물학적 시료, 예를 들면 (예를 들면, 만성 두드러기 환자에서) 혈액 또는 조직 시료중의 IgE 또는 FcεRI에 대한 자가 항체의 수준을 결정하기 위한 ELISA와 같은 임의의 표준 형태의 시험관내 진단 분석에서의 본 발명의 융합 폴리펩티드의 용도를 포함한다. HSA 성분은 유리하게는 ELISA 형태의 분석에서 IgE 또는 FcεRI에 대한 자가 항체의 결합 및 검출을 용이하게 한다. 시료에 존재하는 IgE 또는 자가 항체의 양은 환자에 노출된 물질에 대한 환자의 알레르기 반응의 척도로서 제공될 수 있다. IgE 또는 자가 항체 수준을 측정하여 항 알레르기 치료의 유효성을 결정할 수 있고, 시간 경과에 따라 환자의 알레르기 상태를 모니터할 수 있다.

본 발명은 IgE- 또는 IgE 수용체- 매개된 질병의 치료를 위해, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 사람에서의 유전자 치료를 수행하는 방법도 또한 포함한다. 유전자 치료법은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 환자에 도입하고 그 세포에서 폴리펩티드를 발현시킴으로써 환자의 세포를 개질시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 먼저 체세포를 환자로부터 제거한 다음, 이에 폴리뉴클레오티드를 이에 삽입하여 배양중에서 유전적으로 개질시키고, 제조된 개질 세포를 환자에 재도입시켜 본 발명의 폴리펩티드를 환자의 세포에 의해 발현시킬 수 있다.

다른 방법으로는, 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 DNA를 직접 삽입함으로써 세포를 생체내 개질시킬 수 있다.

개질시키기에 적절한 세포로는 내피 세포 또는 백혈구를 들 수 있다. 유전자 치료를 위해서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 조절가능한 (예를 들면, 유도가능한) 프로모터의 제어하에 존재한다. 따라서, 폴리펩티드의 발현은 공지된 조절가능한 프로모터 시스템을 사용하는 외래 인자에 대한 환자의 노출에 의존할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 젖 등으로 발현시키는 사람이 아닌 체세포 재조합 또는 유전자 전환 동물을 제조하기 위해 유전자 치료 방법을 이용하는 것을 포함한다. 그러한 개질된 사람이 아닌 동물도 본 발명의 일부를 구성한다. 유용한 동물의 예로는 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 양, 염소 및 소를 들 수 있고, 이들은 모두 표준 기술을 이용하여 유전자 전환되었다 (D.R. Hurwitz et al., Transgenic Research 3 [1994] 365-375). 단백질의 용도 또는 실제 생산을 구상하는데 동물을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현시키는 유전자 전환 마우스, 염소, 소 또는 돼지에 관한 것이다. 그러한 동물을 만드는 방법은 잘 알려져 있다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 동물의 체세포 중으로 시험관내 또는 생체내 도입하여, 유전적으로는 개질되었으나 유전적 개질을 그의 자손에는 물려줄 수 없는 체세포 재조합 동물을 제조할 수 있다. 다른 방법으로는, 폴리뉴클레오티드를 유전자 전환 동물의 제조를 위해 배세포 중으로 삽입하여 본 발명의 단백질을 발현시키는 능력을 그의 자손에 물려줄 수 있다.

유전자 치료를 위해 예를 들면, 전기침공, 인산칼슘 침전, 리포펙틴-기재 방법, 근육내 주사, 미세주입 또는 "유전자 총"을 사용한 통상의 방법으로 세포의 형질 감염을 성취할 수 있다. 플라스미드-기재 벡터는 바람직하게는 진핵 세포에서 세포 독성 아미노글리코시드 G418을 사용하여 안정한 형질 전환체를 선별하기 위한 네오마이신 유전자와 같은 마커를 함유한다.

융합 폴리펩티드에 대한 유전자 서열을 레트로 바이러스 벡터중으로 삽입하여 감염시킬 수 있다. 여러 방법이 그러한 삽입에 관한 당 기술 분야에 공지되어 있다. 널리 사용되어온 한 가지 방법은 레트로 바이러스를 팩키징하기 위한 불완전한 쥐과 동물 레트로바이러스 및 표적 공여 세포를 감염시키는데 사용되는 감염 양쪽 주성 바이러스 레트로바이러스를 제조하기 위한 양쪽 주성 바이러스를 사용한다.

특성 분석을 예를 들어 다음과 같이 더욱 수행할 수 있다.

<생체내에서의 혈청 반감기의 측정>

일반적 방법:

중량이 약 25 g인 암컷 SKH1/hr/hr 찰스 리버 (Charles River) 마우스에 무균의 Ca++, Mg++가 없는 PBS중에 희석된 시험 단백질을 정맥 주사한다. 마우스를 다음과 같은 군으로 분류한다.

- (i)군: 실시예 7에서 제조되는 이량체 IgE^R - L₁- HSA II - L₂-IgE^R과 같은 융합 폴리펩티드 130 ㎍ (1 nmole)을 투여한 군,

- (ii)군: IgE^R 60 ㎍ (2 nmoles)을 투여한 군, 및

- (iii)군: HSA I 65 ㎍ (1 nmole)을 투여한 군.

주사한 지 10 분, 30 분, 3 시간, 6 시간 및 12 시간 후에 각각의 마우스로부터 혈액 100 ㎕를 채취하였다. 원심분리하여 혈청을 얻었다. 여러 단백질의 혈청내 농도 수준을 다음과 같이 a) IgE 수용체 ELISA 결합 분석, b) 억제 ELISA 또는 c) HSA 샌드위치(Sandwich) ELISA에 의해 결정한다.

a) IgE ^R ELISA 결합 분석:

IgE 혈청 농도는 IgE 결합을 검출한 후에 샌드위치 ELISA에 의해 결정한다: 사람 IgE 200 ng을 4 ℃의 습도 조절된 챔버중에서 8웰의 코스타 (COSTAR) 스트립 플레이트 8 (Strip Plate 8) (미국 매사츄세츠주 캠브릿지 소재) 중에서 코팅 완충액 100 ㎕ 중에서 밤새 고정화시킨다. 각각의 웰을 Ca++, Mg++가 없는 PBS (pH 7.2) 300 ㎕로 2회 세척한다. 플레이트를 실온에서 5 % BSA (Sigma)를 함유하는 Ca++, Mg++가 없는 PBS 200 ㎕로 1 시간 동안 블로킹하였다. 0.05 % 트윈 (Tween) 20을 함유하는 Ca++, Mg++가 없는 PBS (PBST) 300 ㎕로 2회 세척한 후에, (Ca++, Mg++가 없는 PBS중에) 1:10 희석된 마우스 혈청 100 ㎕중에 희석된 시료를 가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션(incubation)한다.

웰을 PBS 300 ㎕로 2회 세척하고, 5H5/F8과 같은 모노클론 항-사람 IgE 수용체 항체 100 ㎕ (1 ng)로 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 재차, 웰을 PBST 300 ㎕로 2회 세척하고, 염소 항-마우스 IgG-HRP (Biorad, Ca++, Mg++가 없는 PBS 중에 1:2000로 희석시킨 것) 100 ㎕로 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBST 300 ㎕로 3회 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 결합물을 ABTS (바이오래드(Biorad)사) 기질 100 ㎕로 검출한다. 5 분 후에 반응을 3 % 옥살산으로 중지시킨다. 발색 강도를 이지 리더 (EASY READER) 광도계를 사용하여 405 ㎚에서 측정한다.

b) 억제 ELISA

FcεRIα 100 ng을 4 ℃의 습도 조절된 챔버중에서 눙크 (Nunc) 96웰 면역 플레이트 (F96 cert. Maxisorb)중에서 코팅 완충액 (0.1 M NaHCO₃, 0.01 % NaN₃, pH 9.6) 100 ㎕로 고정화시킨다. 각각의 웰을 PBS + 0.05 % 트윈 20 (세척 완충액) 300㎕로 4회 세척 한다. 웰의 상이한 세트에 네가티브 대조군 (PBS + 0.05 % 트윈 20 + 2 % FCS중에 1:25로 희석시킨 마우스 혈청 50 ㎕), 일련의 융합 폴리펩티드 표준 물질 희석액, 예를 들면 IgE^R - L₁- HSA II- L₂-IgE^R 표준 물질 (400 ng/4㎖ 내지 1.6 ng/㎖) 또는 일련의 시료 희석액을 가한다. 표준 물질 및 시료를 PBS + 0.05 % 트윈 20 + 2 % FCS 중에 1:25로 희석된 마우스 혈청으로 희석한다. 그렇게 한 후 즉시, 희석 완충액 중의 사람 IgE-비오틴 결합물 (400 ng/㎕) 50 ㎕를 가하고 혼합한다. 인큐베이션 혼합물 중의 최종 마우스 혈청 희석율은 1:50이다.

37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척 완충액 300 ㎕로 4회 세척하고, 희석 완충액중에 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 접합체 (기브코(Gibco)사) 50 ㎕를 가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한 후에, 기질 (디에탄올아민 완충액중의 p-니트로페닐-포스페이트, pH 9.8, 1 ㎎/1 ㎖ [바이오래드사]) 100 ㎕를 가하고, 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 후에, 반응을 2 M NaOH 50 ㎕로 중지시킨다. 광학 농도를 바이오멕 (BIOMEK)-1000 워크스테이션 광도계를 사용하여 405 ㎚에서 측정한다. 표준 곡선 (4-파라미터 로지스틱 커브 피팅)으로부터의 정량 분석을 베크만 (Beckman) 이뮤노핏 (IMMUNOFIT) ELISA 분석 프로그램을 사용하여 수행하는데, 계산식은 다음과 같다.

결합율 (%) = [OD (시료 또는 표준 물질의 값)/OD (완충액 값)] x 100

c) HSA 샌드위치 ELISA

모노 클론 항-마우스 HSA (HSA-9) 500 ng을 4 ℃의 습도 조절된 챔버중에서 눙크 (Nunc) 96웰 면역 플레이트 (F96 cert. Maxisorb) 중에서 코팅 완충액 (0.1 M NaHCO₃, 0.01 % NaN₃, pH 9.6) 100 ㎕중에서 고정화시킨다. 각각의 웰을 세척 완충액 (PBS + 0.05 % 트윈 20) 300 ㎕로 4회 세척 한다. 1:100으로 희석된 마우스 혈청 (PBS, 0.05 % 트윈 20, 2 % FCS = 희석 완충액) 100 ㎕을 네가티브 대조군으로서 가하거나, 표준 물질 (1 ㎍/㎖ 내지 2 ng/㎖의 사람 혈청 알부민, KABI) 또는 1:100으로 희석된 마우스 혈청중에 희석된 시료 100 ㎕를 가한다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척 완충액 300 ㎕로 4회 세척하고, 희석 완충액으로 희석된 1 ng/㎕ 토끼 항-HSA-비오틴 결합물 100 ㎕를 가한다. 항-HSA-비오틴 결합물을 CH-Seph4B-HSA를 사용하여 면역 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하고, 마우스 혈청과의 교차 반응물을 마우스 혈청-아가로스를 사용하여 면역 흡수에 의해 제거한다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척 완충액 300 ㎕로 4회 세척하고, 희석 완충액 중에 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 결합물 (Gibco) 50 ㎕를 가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척 완충액 300 ㎕로 4회 세척한 후에, 기질 (디에탄올아민 완충액중의 p-니트로페닐-포스페이트, pH 9.8, 1 ㎎/1 ㎖ [Biorad]) 100 ㎕를 가하여 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 후에, 반응을 2 M NaOH 50 ㎕로 중지시킨다. 광학 농도를 비오멕-1000 워크스테이션 광도계를 사용하여 405 ㎚에서 측정한다. 표준 곡선 (4-파라미터 로지스틱 커브 피팅)으로부터의 정량 분석을 베크만 이뮤노핏 ELISA 분석 프로그램을 사용하여 수행한다.

결과:

주입 후에 경과한 시간의 함수로서, 이량체 융합 폴리펩티드인 IgE^R - L₁- HSA II - L₂-IgE^R, 자유 IgE^R ("자유 알파 사슬"로 언급함) 또는 HSA I ("HSA"로 언급함")에 대한 농도를 도 1(A) 및 (B)에 피코몰/㎖혈청으로 나타낸다.

도 1(B)는 자유 수용체가 약 10 분 동안 마우스 혈청에서 검출될 수 있을뿐인 반면, 이량체 융합 폴리펩티드는 투여한 지 약 12 시간 후에도 여전히 검출할 수 있음을 나타낸다.

도 1(C)는 HSA 및 이량체 융합 폴리펩티드에 대한 상대적 제거 속도론을 나타낸다. 처음 10 분 동안에 조직-혈액 분포가 안정화된 후에, 이량체 및 HSA는 거의 동일한 제거 곡선을 나타낸다. 이는 IgE-결합 도메인의 혈청 반감기가 HSA에 대한 융합에 의해 실질적으로 지연될 수 있음을 확인시켜 주는 것이다.

<마우스에서의 수동적 피부 과민 반응 (PCA)의 억제>

일반적 방법:

(a) 폴리펩티드의 투여:

10, 50 또는 500 ㎍/㎏의 일련의 융합 폴리펩티드, 예를 들면 실시예 7의 CHO 세포로부터 얻은 IgE^R - L₁- HSA II - L₂-IgE^R의 희석액을 중량이 약 25 g인 암컷 SKH1/hr/hr 찰스 리버 마우스에 감작시키기 전에 다양한 간격으로 정맥내로 주입한다.

3개의 마우스 군은 감작시키기 전에 주입시킨 폴리펩티드의 양 (즉, 10 ㎍/㎏, 50 ㎍/㎏ 또는 500 ㎍/㎏)에 의존하여 분류한다. 제4군인 대조군 마우스에는 폴리펩티드 대신에 정맥내로 PBS를 200 ㎍/㎏으로 투여한다. 4개의 마우스 군을 각각 3개의 하위군으로 나누는데, 이들은 IgE를 사용하는 화합물의 정맥내 주입 및 피내 감작 사이의 간격이 상이하다 (하기 단계 (b)). 시험된 간격은 5 분, 15 분 및 30 분이다.

(b) 피내 감작:

마우스를 마취시키고, PBS (BioMakor, Rehovot, Israel) 10 ㎖ 중의 각각의 모노클론 마우스 항-디니트로페닐 (DNP) IgE 항체 5 ng을 피내 주입하여 배면 피부중으로 4회 감작시킨다. 대조군에서는, 생리 식염수를 한 부위에 피내 주사입다.

(c) 알레르겐 챌린지:

감작시킨 지 90 분 후에, 마우스를 다시 마취시키고, 1 % 에반스 블루를 함유하는 디니트로페닐-소 혈청 알부민 (DNP-BSA) (Calbiochem-Behring, San Diego, USA) 50 ㎍을 함유하는 용액을 정맥내 주입에 의해 챌린징한다. PCA 반응을 침윤에 기인한 염색된 시험 부위의 직경을 측정하여 정량한다.

결과:

실시예 7의 성숙 융합 폴리펩티드 (SEQ. ID. NO. 3의 아미노산 Val₂₆-Leu₉₇₈)에 대한 결과를 도 2에 막대 그래프로 묘사한다. 500 ㎍/㎏의 농도에서, 이량체 융합 폴리펩티드는 사용된 모든 시점에서 PCA를 완전히 블로킹한다. 50 ㎍/㎏의 농도에서, 챌런징하기 30 분 전에 처리하면 통계적으로 유의적인 36 % 감소를 나타낸다. 챌린징하기 15 분 전에는, 이량체를 10 및 50 ㎍/㎏으로 투여함에 따라 경향이 나타난다. 따라서, 이량체 융합 폴리펩티드가 PCA를 억제하는데 유효하다.

본 발명을 수행하는 방법 및 기술은 당 기술 분야에 공지되어 있다. 그의 제조 방법이 본 명세서에 구체적으로 기재되어 있지는 않으나, 사용되는 화합물, 시약, 벡터, 세포주 등은 공지되어 있으며 쉽게 입수할 수 있거나, 그 등가물은 공지되고 쉽게 이용할 수 있는 물질로부터 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

하기 비제한적인 실시예를 들어 본 발명을 예시한다. 온도는 모두 ℃이다.

<재료 및 방법>

PCR 증폭:

본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포트리에스테르 또는 포스포디에스테르 방법과 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 화학 합성할 수 있다.

특정 핵산 서열을 증폭시키는 방법 및 시스템은 미국 특허 제4,683,195호, 미국 특허 제4,683,202호 및 문헌 [Polymerase Chain Reaction, H.A. Erlich et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재되어 있다.

PCR을 한 후에, DNA 단편을 잘라내어 QiaEx 프로토콜 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA., USA)을 사용하여 정제한 다음, TA 벡터 (등록상표 TA 클로닝 키트 (Invitrogen) (제품 문헌, 버전 2.2) 중으로 서브클로닝한다. PCR 증폭된 핵산을 제조하는데 사용하는 프라이머를 도 8에 기재한다. DNA를 시쿼나아제 방법 (USB, Cleveland, OH, USA)을 사용하여 시퀀싱한다.

플라스미드 및 시약:

FcεRIα cDNA 클론인 pGEM-3-110B-1 (A. Shimizu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 [1988] 1907-1988)을 ATTC (American Type Tissue Collection)로부터 입수한다 (ATCC 스톡 #67566). 단일 가닥 사람 간 cDNA를 클론텍으로 부터 입수한다 (PCR-ready Quick Clone cDNA, Cat. D#7113-1). HSA의 서열을 진뱅크 (GenBank)로부터 수납 번호 VOO495, JOOO78, LOO132 및 LOO133하에 입수할 수 있다. Taq DNA 폴리머라제는 퍼킨-엘머 세투스 (Perkin-Elmer Cetus, PECI) 또는 베링거-만하임 (Boehringer-Mannheim)으로부터 입수한다. SK 벡터를 스트라타진 (Stratagene)으로부터 입수한다.

pHIL-D2는 인비트로겐으로부터 입수할 수 있다 (San Diego, CA, USA; 카탈로그 # K1710-01 [1994]) (참조: "Pichia Expression Kit - Protein Expression - A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris - version 3.0" [1994년 12월]) (이하 "인비트로겐 매뉴얼"로 언급함).

pXMT3 벡터는 pUC8로부터의 PstI 내지 EcoRI 링커를 pMT2의 PstI 내지 EcoRI 부위중으로 클로닝함으로써 pMT2로부터 유래된다 (Sambrook et al., (Eds.) [1989] 상기 문헌; R.J. Kaufman et al., [1987] 상기 문헌).

하기하는 사용되는 표준 기술은 문헌 [Sambrook et al., (Eds.) 1989, 상기 문헌]에 기재되어 있다.

<실시예 A>: TA 클로닝 벡터

플라스미드 pCR2를 실시예 1 및 2에서 얻어지는 각각의 PCR 증폭 생성물과 개별적으로 라이게이션하였다. 라이게이션 반응을 하기 반응 혼합물 중에서 T4 DNA 리가아제를 사용하여 수행하였다.

25 mM 트리스-HCl (pH 7.8),

10 mM MgCl₂,

1 mM DTT,

1 mM ATP,

벡터 DNA 50 ng,

PCR 반응 생성물 (정제하지 않은것) 100 내지 200 ng, 및

T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs) 4 U.

각각의 반응 혼합물을 수용성 (competent) 세포중으로 형질 전환시키기 전에 15 ℃에서 18 시간 동안 유지시켰다.

<실시예 1>: FcεRIα cDNA의 PCR 증폭 및 클로닝

FcεRIα cDNA를 Qiagen 방법을 사용하여 pGEM-3-110B-1로부터 정제하였다.

(A) HSA-리더 구조물의 제조를 위해, FcεRIα cDNA의 PCR 증폭은 하기 반응 혼합물을 사용하여 올리고뉴클레오티드 #18 및 #19 (도 4 및 8)를 사용하여 수행하였다.

FcεRIα cDNA 1 ㎕ (50 ng),

올리고뉴클레오티드 #18 및 #19 각각 50 pmole,

10 x PCR 완충액 (PECI) 5 ㎕,

20 mM dNTP 스톡 (stock) 용액 0.5 ㎕ = 최종 dNTP 농도는 200 μM,

Taq DNA 폴리머라제 (PECI) 0.5 ㎕ (2.5 U), 및

물을 부피가 50 ㎕로 되도록 가함.

반응 혼합물 위에 미네랄 오일을 덮어 증발을 막고, 퍼킨 엘머 세투스 DNA 써모싸이클러 (thermocycler) 모델 480 중에서 써모싸이클링시켰다. 이 반응을 위한 싸이클링 조건은 95 ℃에서 5 분 동안 가열한 다음, 94 ℃에서 1.5 분, 53 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 3 분을 주기로 30 회 반복한 후에, 72 ℃에서 3 분 동안 연장시키고 4 ℃에 밤새 방치하는 것이다.

전기 영동하여 약 550 bp의 증폭된 생성물을 에티듐 브로마이드 염색으로 확인하였다. 단편을 PCR2 벡터중으로 서브클로닝하여 IgE^R을 코딩하는 pEK1을 제조하였다 (도 4, 8B).

(B) IgE-리더 구조물의 제조를 위해, FcεRIα cDNA의 PCR 증폭은 올리고뉴클레오티드 #20 및 #31 (도 8B 및 8C)을 사용한 것을 제외하고는 상기 (A)의 방법에 따라 수행하였다. 0.7 % 아가로스겔 상에서 전기 영동한 후에, 약 600 bp의 증폭된 생성물을 에티듐 브로마이드 염색에 의해 확인하였다. 단편을 PCR2 벡터중으로 서브클로닝하여 pre-IgE^R을 코딩하는 IgER/TA#1을 제조하였다 (도 4).

(C) 분석에서 대조군으로 사용할 성숙한 절단된 단백질을 발현시키기 위한 pre-IgE^R을 코딩하는 구조물을 제조하기 위해, FcεRIα cDNA의 PCR 증폭은 올리고뉴클레오티드 #20 및 #19 (도 8B 및 8C)를 사용하여 상기 (A)의 방법에 따라 수행하였다. 전기 영동한 후에, 약 620 bp의 증폭된 생성물을 에티듐 브로마이드 염색에 의해 확인하였다. PCR 단편을 잘라내어 PCR II 벡터중으로 서브클로닝하여 pre-IgE^R을 코딩하고 정지 코돈이 나오는 IgERL/TA #34를 제조하였다 (도 4).

<실시예 2>: 사람 혈청 알부민 cDNA의 PCR 증폭 및 클로닝

prepro-HSA II를 코딩하는 서열을 얻기 위해, 전체 길이의 사람 혈청 cDNA의 PCR 증폭을 실시예 1(A)의 일반적인 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 #24 및 #25 (도 8B 및 8C)를 사용하여 수행하였다. 생성된 클론 HSA/TA#1은 진뱅크의 서열과 가장 근접하게 닮은 서열을 가졌다. 이러한 클론에 있어서, 워블 부위의 돌연 변이 7개 및 1333번 염기에서 리신이 글루탐산으로 변화되어 생성된 돌연 변이 1개가 검출되었다. 워블 부위의 돌연 변이 7개는 309번 염기가 A에서 T로, 744번 염기가 A에서 G로, 795번 염기가 G에서 A로, 951번 염기가 G에서 A로, 1320번 염기가 C에서 T로, 1569번 염기가 A에서 C로, 1584번 염기가 G에서 A로 바뀐 것이다 (HSA/TA#1을 참조). 리신이 글루탐산으로 바뀐 돌연 변이는 도 8A에 도시된 올리고뉴클레오티드 및 바이오-라드 뮤타진 파지미드 (Mutagene Phagemid) 시험관내 돌연 변이 유발 키트 (Biorad, Cat #170-3581)를 사용하는 돌연 변이 유발에 의해 진뱅크내의 서열로 되돌려 바로잡을 수 있다. 이 방법은 모가닥 (parental strand)에서의 우라실 잔기의 삽입 및 돌연 변이된 가닥에서의 후속 제거에 의존하는 것이다 (T.A. Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 [1985] 488-492). 워블 부위에서의 점 돌연변이는 코딩된 단백질의 천연 아미노산 서열을 바꾸지 못하기 때문에, 상기 7개의 돌연변이는 정정되지 않았다. 전기 영동한 후에, 약 1.8 kb의 증폭된 생성물을 에티듐 브로마이드 염색에 의해 확인하였다.

1.8 kb 생성물을 pCR2 벡터중으로 서브클로닝하여 HSA/TA mut #16을 제조하였고, DNA 시퀀싱에 의해 완전한 prepro-HSA II 서열을 함유함을 확인하였다. HSA/TA mut #16을 SpeI, HindIII 단편으로서 블루스크립트 (Bluescript) SK 중으로 서브클로닝하여 HSA/SK #17을 제조하였다 (도 5).

(A) HSA-리더 구조물을 제조하기 위해, HSA/SK#17을 MstII 및 HindIII로 절단하여 3'-말단 아미노산 (Leu₆₀₉)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제거하고, 상기 규정한 바와 같이 링커 L₂를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 #28 및 #29를 키나아제 처리하고, 이 단편을 어닐링시키고, 선형화된 HSA/SK#17의 MstII/HindII 부위중으로 라이게이션시켜 선형 HSA/SK#17의 3'-말단에 도입시키고 (도 8B 및 8C), L₂에 융합된 prepro-HSA II를 코딩하는 pEK7을 제조하였다 (도 8B 및 8C). 미니프렙 (miniprep)한 DNA를 BamHI 절단 및 시퀀싱로 확인하였다.

(B) IgE-리더 구조물을 제조하기 위해, prepro-HSA II를 코딩하는 HSA/SK#17을 올리고뉴클레오티드 #26 및 #27 (도 5, 8)을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 올리고뉴클레오티드 #26은 HSA로부터 prepro 서열이 제거되고, L₁을 코딩하는 올리고 뉴클레오티드가 HSA의 5' 말단에 가해진 것이다. 올리고뉴클레오티드 #27은 천연적으로 HSA 코딩 서열의 약 800번 뉴클레오티드 위치에 유일한 NcoI 부위로 끝난다. PCR 증폭은 실시예 1(A)의 방법에 따라 수행하였다. 약 800 bp의 단편을 겔 전기영동 및 Qia로 단리하고, pCR2 벡터중으로 서브클로닝하여 클론 HSA Nco/TA #13을 제조하였고, 이를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 이 클론으로부터의 NcoI 내지 NotI 단편을 NcoI 및 NotI으로 절단된 HSA/SK #17 DNA 중으로 서브클로닝하여, HSA II를 코딩하는 cDNA의 5'-말단에 결합된 L₁을 코딩하는 HSA/SK#5 (도 5)를 제조하였다.

(C) HSA 단독으로 발현시키기 위해, 위에서 제조한 HSA/SK#17 구조물을 사용하였다.

<실시예 3>: prepro-HSA + 링커 + IgE^R을 코딩하는 융합 구조물 HSA-IgER/SK#22

pEK7 (prepro-HSA II cDNA + L₂에 사용된 올리고뉴클레오티드를 함유) 및 pEK1 (IgE^R을 함유)을 BamHI 및 SalI으로 절단하였다. pEK7로부터 얻은 1.8 kb 단편을 포스파타제로 처리한 다음, pEK1로부터 얻은 550 kb 단편에 라이게이션시켰다. 1개의 포지티브 미니프렙 DNA #23을 제조하였으나, HSA-IgE^R 밴드의 회수를 방해하는 또다른 미지의 플라스미드로 오염되어 있었다. 그리하여, HSA-IgE^R 융합물을 함유하는 2.4 kb의 SpeI 내지 SalI 단편 및 벡터 DNA를 함유하는 2.9 kb 단편을 미니프렙 #23으로부터 정제하고 서로 라이게이션시켜 HSA-IgE/SK#49 클론 (도 9)를 얻었다 (벡터 부위는 서브클로닝된 영역의 양 말단으로부터 소실된 것으로 밝혀져서, HSA-IgE/SK#49로부터의 2.4 kb의 SpeI 내지 SalI 단편을 SpeI 및 SalI으로 절단된 Bluescript SK 중으로 서브클로닝하여 HSA-IgE/SK#22 (도면에 도시하지 않음)를 제조하였다).

HSA 및 링커의 IgE 수용체 DNA와의 결합부위 서열 및 벡터 DNA를 갖는 융합물의 양 단부의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인된 바와 같이 HSA-IgE/SK#22로 예상되었다.

<실시예 4>: IgE^R + prepro-HSA II를 코딩하는 융합 구조물 IgE-HSA/SK#1

HSA/SK #5 및 IgE^R/TA #1을 SstI 및 NheI으로 절단하였다. IgE/TA#1로부터의 600 bp 단편을 겔 전기영동에 의해 정제하여, 절단되고 포스파타제 처리된 HSA/SK #5 중으로 라이게이션시켜 IgE-HSA/SK#1 클론 (도 10)을 얻었다.

<실시예 5>: pre- IgE^R- L₁- HSA II - L₂- IgE^R을 코딩하는 융합 구조물 R-H-R/SK#50

IgE^R-HSA/SK#1 및 HSA-IgE^R/SK#49의 HSA 영역에 유일한 PstI 부위를 L₂에 사용된 올리고뉴클레오티드를 통하여 IgE^R 및 prepro-HSA II에 결합시키는데 사용하였다. HSA/IgE^R/SK #49 및 Bluescript SK를 PstI 및 SalI으로 절단하였다. HSA II의 3' 부위를 함유하는 1.2 kb 단편, 링커 및 IgE^R 서열을 PstI 및 SalI으로 절단된 Bluescript DNA 중으로 라이게이션시켜 HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37 (도 11)을 얻었고, 이를 PstI 및 KpnI으로 절단하여 1.2 kb 단편을 제조하였다.

IgE^R-HSA/SK#1 DNA를 PstI 및 KpnI으로 절단하여 벡터, IgE^R, 링커 및 HSA의 5' 말단을 함유하는 4.8 kb 단편을 단리하고, 포스파타제로 처리하고, HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37로부터의 1.2 kb 단편에 라이게이션시켰다. 이량체 구조물인 R-H-R-/SK #50을 얻었다 (도 11).

<실시예 6>: 형질 감염에 의한 HSA II - L₂- IgE^R단량체 융합 폴리펩티드 및 피키아 패스토리스의 배양

HSA II - L₂- IgE^R을 코딩하는 플라스미드 MB#2는 플라스미드 HSA/SK#49를 EcoRI으로 절단하고, 융합 단백질을 코딩하는 2.4 kb 단편을 단리하여 제조하였다. 이 단편을 피키아 패스토리스 발현 벡터 pHIL-D2 (Invitrogen)의 유일한 EcoRI 부위중으로 라이게이션시킨 후에, 플라스미드 pHIL-D2를 EcoRI으로 절단하고 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. 생성된 MB#2 플라스미드를 NotI으로 절단하여 선형화하고, "인비트로겐 매뉴얼"에 기재된 바와 같이 his4 GS115 세포중으로 형질 전환시켰다. His+ 형질 전환체를 메탄올 상에서 생장시켜 스크리닝하였다. 메탄올 상에서 느린 생장을 나타내는 균주를 "인비트로겐 매뉴얼"에 상세히 나타나 있는 최소 글리세롤 배지중에서 정지기까지 생장시키고, 원심분리에 의해 완충된 복합 메탄올 배지로 옮겨 4일 동안 생장시켰다. 세포로부터의 상층액을 ELISA에 의해 HSA의 존재 및 IgE-결합 능력에 대해 평가하였다. 피.패스토리스로부터 분비되어 얻어진 생성물의 IgE-결합 능력을 HSA 농도 및 완전한 생물학적 활성에 대해 몰을 기준으로 평가하였다.

<실시예 7>: 형질 감염에 의한 IgE^R- L₁- HSA II - L₂- IgE^R이량체 융합 폴리펩티드 및 CHO 세포의 배양

플라스미드 pXMT3-RIα-HSA-RIα (pre-IgE^R- L₁- HSA II - L₂- IgE^R을 코딩하는 SEQ. ID. NO. 4의 폴리뉴클레오티드를 함유함)는 R-H-R/SK#50 (실시예 5 참조)을 EcoRI으로 절단하고, 이량체 융합 폴리펩티드를 코딩하는 3 kb EcoRI 단편을 단리하여 제조하였다. 이 단편을 pXMT3를 EcoRI으로 절단하고 알칼리성 포스파타제로 처리한 후에 pXMT3의 유일한 EcoRI 부위중으로 라이게이션시켰다.

플라스미드를 CHO DUKX B11 세포중으로 형질 전환시켰다. 이러한 세포는 뉴클레오시드 합성에 필요한 기능성 dhfr(디히드로폴레이트 리덕타제)-유전자가 결여되어 있다. 따라서, 세포를 10 % FCS (fetal calf serum)를 함유하는 알파+ 배지 (리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드를 함유하는 MEM ALPHA MEDIUM/ Gibco)중에 유지시켰다. 형질 전환시키기 위해, 세포를 Ca++, Mg++가 없는 PBS (CMF-PBS)로 2회 세척하고, 세포 농도를 CMF-PBS 중에서 2 x 10⁶개 세포/㎖로 조절하였다. 세포 현탁액 0.8 ㎖를 플라스미드 DNA 15 ㎍에 가하였다. 바이오라드 진 펄서 (Gene Pulser) (전압 = 1000 V; 커패시터 = 25 μF)를 사용하여 일렉트로포레이션으로 형질 전환시켰다. 형질 전환시킨 세포를 10 % FCS를 함유하는 알파+ 배지 15 ㎖중에서 3일 동안 배양하였다.

pXMT3 플라스미드상에 위치하는 dhfr-유전자에 의해 뉴클레오시드 결여 배지중에서 재조합 세포를 선별할 수 있다. 형질 전환시킨 지 3일 후에, 세포를 10 % 투석된 FCS (FCSD)를 함유하는 알파- 배지 (리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드를 함유하지 않는 MEM ALPHA MEDIUM/ Gibco) 중에 위치시켰다. 배양한 지 2주 후에, 재조합 세포 콜로니를 볼수 있었다. 유전자 증폭이 시작되기 전에 세포를 10 % FCSD를 함유하는 알파- 배지중에 추가의 4 계대 동안 유지시켰다.

메토트렉세이트 (MTX)의 존재하에, dhfr 및 그에 연관되어 있는 유전자를 증폭시켜 트랜스 유전자의 발현을 증가시켰다. 그리하여, 뉴클레오시드 결핍 배지중에서 재조합 세포를 선별한 후에, 10 % FCSD를 함유하는 알파- 배지중에서 20 nM MTX의 존재하에 배양하였다. 단계적으로 메토트렉세이트를 100 nM 내지 500 nM로 증가시켜 추가로 증폭시켰다.

단백질은 풀(pool) T1 (10 % FCS (GIBCO)를 함유하는 알파- 배지중dml 3-500 nM)을 9 x 10³/㎠의 밀도로 접종하여 제조하였다. 접종한 지 5일 후에 제1 상층액을 회수한 다음, 혈청을 함유하지 않는 알파- 배지로 교환하였다. 3일 후에 제2 수확물을 회수하여 정제시킬 상층액 총 1ℓ를 얻었다.

제2 배치를 풀 T1 (혈청을 함유하지 않는 생장 조건에 적응된 3-500 nM)으로부터 유리된 상층액 2ℓ로부터 정제하였다. 세포를 5 x 10⁴개 세포/㎖로 접종하고, 접종한 지 6일 후에 상층액을 회수하였다.

<실시예 8>: 융합 단백질의 정제

실시예 7로부터의 배양 상층액을 표준 기술에 따라 제조되고 정제된 고정화된 항-FcεRI 모노클론 항체 (예를 들면, 5H5-F8: 마우스 IgG1)상에서 면역 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

a) 크로마토그래피 지지체의 정제:

모노클론 항체를 제조자의 지시에 따라 CNBr-활성화된 세파로스 (Sepharose) 4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 10 ㎎ 항체/㎖ 겔의 밀도로 결합시켰다. 과량의 반응기를 에탄올아민에 의해 차단시키고, 수지는 사용할 때까지 0.02 % NaN₃를 함유하는 PBS 중에 저장하였다.

b) 친화도 크로마토그래피:

맑은 배양 상층액을 PBS중에서 평형시킨 5 ㎖ 항체 칼럼에 0.5 ㎖/분의 유속으로 가하였다. 흡수된 물질을 50 mM 시트르산 및 140 mM NaCl (pH 2.70)으로 용출시켰다. 단백질 함유 분획을 NaOH를 사용하여 즉시 pH 7.0으로 조절한 다음, 무균 여과하였다.

c) 정량 분석/특성 분석:

이량체 융합 폴리펩티드의 농도를 천연 형태는 30 mM (3-[N-모르폴리노]프로판)황산 (MOPS) (pH 7.0) 중에서, 또한 변성 형태는 6 M 구아니딘.HCl 중에서 280 ㎚에서의 흡광도로 결정하였다. 상응하는 몰 흡광도 계수는 모델 화합물에서의 트립토판, 티로신 및 시스틴의 도표로 작성된 흡광도 계수를 사용하여 이들 아미노산 잔기의 수로부터 계산하고, 폴딩 및 비(非)폴딩된 단백질간의 광농도 차이에 대해 보정하였다. 융합 단백질은 17개의 트립토판, 40개의 티로신 및 21개의 시스틴을 함유하였고, 이론적 흡광 계수는 150840/M·㎝였다. 정제된 물질의 양은 표준 SDS-PAGE 및 N-말단 기체상 에드만 (Edman) 자동 절단 시퀀싱 및 질량 분광법에 의해 평가하였다. SDS-PAGE (도 15) 전개시에, 폴리펩티드는 겉보기 분자량 약 140 kDa으로 이동하였는데, 이는 약 28 % 글리코실화를 반영하는 것이다 (글리코실화가 없으면 이론적 분자량이 108,863.61 Da임).

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Claims

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서열 3의 Val₂₆-Leu₉₇₈의 잔기로 정의되는 융합 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염.
제11항의 융합 폴리펩티드.
제11항의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드.
서열 4에 개시된 서열의 폴리뉴클레오티드.
1개의 사람 혈청 알부민 (HSA) 성분에 융합되어 있는 1개 또는 2개의 면역 글로블린 E (IgE)-결합 도메인을 포함하며, 상기 IgE-결합 도메인이

(a) 서열 1의 Val₂₆-Leu₂₀₄의 잔기로 정의되는 아미노산 서열; 또는

(b) 카르복시 말단에서 1-12개의 아미노산이 절단된 (a)의 절단물인

융합 폴리펩티드 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염.
제15항에 있어서, IgE-결합 도메인이 서열 1의 Val₂₆-Leu₂₀₄의 잔기로 정의되는 아미노산 서열인 융합 폴리펩티드 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염.
제15항에 있어서, HSA 성분이

(a) 서열 2의 Asp₂₅-Leu₆₀₉ 또는 Asp₂₅-Gly₆₀₈ 잔기로 정의되는 아미노산 서열;또는

(b) 카르복시 말단에서 1-10개의 아미노산이 절단된 (a)의 절단물인 융합 폴리펩티드 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염.
제17항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드.
제15항에 있어서, HSA 성분이 서열 2의 Asp₂₅-Gly₆₀₈ 잔기로 정의되는 아미노산 서열인 융합 폴리펩티드 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염.
제15항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드.
제20항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포.
융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

상기 세포에서 융합 폴리펩티드를 발현하는 단계; 및

숙주 세포로부터 염 형태일 수 있는 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 제15항의 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법.
하기 화학식 I, II, III, IV 또는 V의 융합 폴리펩티드 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 벡터:

<화학식 I>

R₁-L-R₂

<화학식 II>

R₂-L-R₁

<화학식 III>

R₁-L-R₂-L-R₁

<화학식 IV>

R₁-L-R₁-L-R₂

<화학식 V>

R₂-L-R₁-L-R₁

[여기서,

R₁은 서열 1의 Val₂₆-Leu₂₀₄의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 1의 Val₂₆-Leu₂₀₄의 잔기로 정의되는 아미노산 서열의 카르복시 말단에서 1-12개의 아미노산이 절단된 절단물로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드로, IgE가 그 수용체에 결합하는 것을 저해하도록 IgE 분자에 결합하는 폴리펩티드;

R₂는 서열 2의 Asp₂₅-Leu₆₀₉의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 2의 Asp₂₅-Leu₆₀₉의 잔기로 정의되는 아미노산 서열의 카르복시 말단에서 1-10개의 아미노산이 절단된 절단물로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드; 및

L은 독립적으로 공유결합이거나 또는 공유결합에 의해 R₁ 및 R₂ 말단에 결합되거나 또는 R₁ 말단에 결합되는 펩티드 링커임]