JP3681402B2 - IgE結合ドメインおよびHSA成分から成る融合ポリペプチドおよびその診断薬ならびに治療薬としての用途 - Google Patents
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Description
本発明は融合ポリペプチドに関する。本発明はIgE結合ドメインおよびヒト結成アルブミン(HSA)成分から成る融合ポリペプチドおよびその塩に関する。本発明はまた、そのような融合ポリペプチドの調製における中間体であるポリヌクレオチドおよび生理的機能が等価のポリペプチド、それに対する適切な組換え発現ベクター、対応する原核もしくは真核細胞発現系、および該融合ポリペプチドの合成法に関する。
背景技術
免疫グロブリンE(IgE)とその受容体間の相互作用は、ヒトの寄生虫感染に対する防御において確定した役割をもつ(M.CapronおよびA.Capron,Science,264(1994)1876〜1877)。しかし、工業国においては衛生状態が改善されて、寄生虫との遭遇頻度が低下し、環境アレルゲンへ応答するIgEの過剰産生が起こってIgEネットワークを撹乱し、アレルギーおよび他のIgE−またはIgE−レセプター介在疾患の状態に至る。
IgEは即時型アレルギー応答の開始に関わる一次抗体であり、後期応答維持においての主要な参与物である。IgEはBリンパ球中で合成され、肥満細胞、好塩基球および好酸球などのアレルギーエフェクター細胞の表面に見出されるIgEに対しての高親和性レセプター、すなわち、FcεRIに結合してその効果を発揮する。IgEはまた、ランゲルハンス細胞、B細胞、単球などの抗原提示細胞上のレセプターに結合することにより誘発物質の機能を発揮する(G.C.Muddeら、Allergy,50(1995)193〜199)。
アレルギー応答または症状は、IgE分子がIgEレセプター、FcεRIを介してアレルギーエフェクター細胞の表面に結合し、アレルゲンが架橋して、それによって細胞中細胞質顆粒の脱顆粒を起こすシグナルを発し、それに伴ってヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジンおよびサイトカインなどのアレルギーのメディエイターを放出し、その結果、局所組織の浮腫、炎症細胞の流入が起きたときに現われ出る。アレルギーおよびそれとの関連症状を促進する別の手段は、IgEレセプター、FcεRIがFcεRIに対する循環系内自己抗体と相互作用する場合である。
FcεRIは通常、α−、β−および2個のγ−鎖(すなわち、サブユニット)から構成されるテトラマーであるが、単球およびランゲルハンス細胞ではβ−サブユニットを欠いている。
FcεRIのIgE結合部位はその全部がα−サブユニット内に含まれていることが示されている(FcεRIαについて参照)(J.Hakimiら、J.Biol.Chem.265(1990)22079〜22081;U.Blankら、J.Biol.Chem.266(1991)2639〜2646)。遺伝的に全α−サブユニットを欠失している組換え「ノックアウト」マウスはアレルゲンのチャレンジに対してアレルギー応答を開始し得ないことが見出されている(D.Dombrowiczら、Cell75(1993)969〜976)。
FcεRIαは分子量約60kDの高密度にグリコシル化されたポリペプチドであり、疎水性経膜ドメインならびに細胞の外表面に露出した親水性細胞外(「エクト−」(ecto-))および細胞質ドメインから構成されている。FcεRIαのIgE結合能は更にその細胞外部分に局在している(J.Hakimiら(1990)上記;Lederら、USP4,962,035)。経膜部分およびそれより下流の配列を切除することにより可溶性分泌可能分子を産生することができる(C.Raら、Int.Immunol.5(1993)47〜54)。生成する末端切除体は実質的にヒトFcεRIαの細胞外ドメインから成り、インビボおよびインビトロでIgE結合活性を示す(M.Haak−Frendschoら、Immunol.151(12993)351〜358、FcεRIαのアミノ酸残基1〜204が末端切除IgG1 H鎖C領域に融合;C.Raら(1993)上記、FcεRIα中の残基1〜172であって、配列番号1の残基26〜197に相当)。このフラグメントの構造的特徴は2個の潜在的ジスルフィド架橋と7個の潜在的グリコシル化部位を有することである(M.Haak−Frendschoら(1993)上記)。
それ故、実質的に細胞外ドメインから成るFcεRIαの末端切除体は、アレルギーエフェクター細胞上の高親和性レセプターに結合するのを防止するために、また、ヒトリンパ球における新規のIgE生合成を抑制するために、血清IgEに結合するように哺乳動物に治療的に投与することが可能である(Y.Yanagiharaら、J.Clin.Invest.94(1994)2162〜2165)。
しかし、哺乳動物のIgE−またはIgEレセプター−介在アレルギー性疾病の全身治療に対するFcεRIαの細胞外ドメインなどのIgE結合ポリペプチドの有効な使用が、循環系血漿からの急速なクリアランスによるインビボでの極端な一過性のために妨害されてしまう。医者と患者が接触してその10〜20%にIgEまたはIgEレセプター介在疾患が見積もられることを考慮すれば、効果的な治療がそのような症状にある患者にとって相当な利益となり、アレルギーおよびアレルギー関連症状などのIgEおよびIgEレセプター介在疾病の臨床治療に重要な進歩となる。
従って、長時間有効な血清寿命を有するIgE結合ポリペプチドを得ること、アレルギーの治療、とりわけ、アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、慢性蕁麻疹などの全身性治療における臨床用途の改善、ならびに効率的なコスト効果のある方法による活性の改善を得ることには利益がある。
発明の要約
今回見出されたのは、IgE結合ドメインをヒト血清アルブミン(HSA)成分に融合することにより、IgE結合活性を失うことなく、IgE結合ドメインのみに比較して血清中半減期の延長した融合ポリペプチドを入手することが可能であること、また、このものがIgE結合性ポリペプチドと成り得ることは、アレルギーおよび他のIgE介在疾病の全身治療に使用し得ることを示唆しているということである。全身投与IgE結合性ポリペプチドは血清IgEならびにIgEレセプターFcεRIαに対する循環系自己抗体に結合し、それらが細胞結合FcεRIαに結合するのを防止して、アレルギー反応およびその関連発症を防止および/または抑制する。
更に、IgE結合活性の著しい改善は、1分子当たり1個を超えるIgE結合ドメインから成る本発明融合ポリペプチドを用いることにより達成し得るということが見出された。例えば、本発明の二量体分子は、本発明の単量体に比較して有意に増大したIgE結合活性を示すことが見出された。
本明細書における用語「二量体」は2個のIgE結合ドメインを有する本発明の融合ポリペプチドを意味する。用語「単量体」は1個のIgEドメインを有する本発明の融合ポリペプチドを意味する。該単量体または二量体は単一または複数のHSA成分から構成されていてもよい。例えば、本発明の単量体融合ポリペプチドはHSA成分のアミノもしくはカルボキシ末端に融合したIgE結合ドメインから構成されていてもよい。また、該単量体はHSA成分の両端に融合したIgE結合ドメインから構成されていてもよい。本発明による二量体融合ポリペプチドは、例えば、2個のIgE結合ドメインが介在するHSA成分に一方のカルボキシ末端および他方のアミノ末端を介して融合したものから成る。また、二量体はその2個のIgE結合ドメインに加えて、複数のHSA成分から構成されていてもよい。
更に、本発明の二量体分子が予期せぬ好ましい活性を示すことが見出されている。
それ故、本発明は少なくとも1個のHSA成分に、少なくとも1個のIgE結合ドメインが融合しているものから成る融合ポリペプチドおよびその塩を目的とするものであるが、好ましくは単量体融合ポリペプチドを目的とするものであり、その場合、単一のIgE結合ドメインが1個またはそれ以上のHSA成分に融合したものである。また、多量体融合ポリペプチドを目的とするものであって、その場合、2個またはそれ以上のIgE結合ドメインが少なくとも1個のHSA成分に融合したものであり、より好ましくは2個のIgE結合ドメインと少なくとも1個のHSA成分を有する二量体である。
本発明は更にそのためのポリヌクレオチド中間体を目的とするものである。
本明細書での用語「融合した」または「融合」は以下のポリペプチドをいう。
(i)一定の機能を有するドメイン(すなわち、IgE結合ドメイン)がそのカルボキシ末端で、共有結合(好ましくは、ペプチド、すなわち、アミド)により、もう一方の機能ドメイン(すなわち、HSA成分)のアミノ末端に、あるいはそれ自体が共有結合(好ましくは、ペプチド)により他の機能ドメインのアミノ末端に結合したリンカーペプチドに結合しているか、および/または、
(ii)一定の機能を有するドメイン(すなわち、IgE結合ドメイン)がそのアミノ末端で、共有結合(好ましくは、ペプチド、すなわち、アミド)により、もう一方の機能ドメイン(すなわち、HSA成分)のカルボキシ末端に、あるいはそれ自体が共有結合(好ましくは、ペプチド)により他の機能ドメインのカルボキシ末端に結合したリンカーペプチドに結合している。
同様に、「融合した」を本発明のポリヌクレオチド中間体との関連で用いるときは、第一機能ドメインをコードするヌクレオチド配列の3'−[または5'−]末端が、第二機能ドメインをコードするヌクレオチド配列の5'−[または3'−]末端に共有結合により結合するか、あるいは間接的に、それ自体、好ましくはその末端において第一機能ドメインをコードするポリヌクレオチドと第二機能ドメインをコードするポリヌクレオチドに共有結合するヌクレオチドリンカーを介して結合することを意味する。
好ましくは、融合ポリペプチドまたはその塩は単量体または二量体であるが、それが二量体である場合には、HSA成分に融合した2個のIgE結合ドメインを含んでおり、例えば、第一IgE結合ドメインがそのカルボキシ端においてHSA成分のアミノ端に融合しており、第二IgE結合ドメインがそのアミノ端においてHSA成分のカルボキシ端に融合しているものである。
本発明の融合ポリペプチドはまた、IgE結合ドメインおよびHSA成分に加えて更なる機能を有するドメイン、例えば、ヒトタンパク質の全長または末端切除体(例えば、可溶性細胞外フラグメント)、例えば、サイトカイン類またはウロキナーゼのアミノ末端フラグメントなどを含んでいてもよい。これらの付加的機能ドメインはそれ自体リンカーペプチドとして機能するが、例えば、IgE結合ドメインをもう一個のIgEドメインに、またはHSA成分に結合する場合である。また、これらは融合分子の他の成分、例えば、そのアミノまたはカルボキシ末端に位置していてもよい。
本発明融合ポリペプチドの例は以下の式により表すことができる。
I.R1−L−R2
II.R2−L−R1
III.R1−L−R2−L−R1
IV.R1−L−R1−L−R2
V.R2−L−R1−L−R1
(但し、式中、
R1はIgE結合ドメインのアミノ酸配列であり、
R2はHSA成分のアミノ酸配列であり、
Lはそれぞれ独立に共有結合(好ましくは、ペプチド結合)またはペプチドリンカーであり、該リンカーは共有結合(好ましくは、ペプチド結合)によりR1および/またはR2の末端に結合しており、
この場合、上記分子フラグメントは方向性をもって読み取るもの、すなわち、分子のアミノ末端を左側に、カルボキシ末端を右側に読み取るものとする)。
融合ポリペプチドがIgE結合ドメインにより導かれている場合、すなわち、IgE結合ドメインが成熟融合タンパク(例えば、上記式I,III,およびIVの化合物)のN−末端部分を構成する場合には、IgE結合が高レベルにあることが見出されている。本発明の特に好ましい態様は、上記式IIIの二量体を含む。すなわち、発現を導くタンパク領域がIgE結合ドメインであり、そのカルボキシ末端でHSA成分のアミノ末端に融合しており、HSA成分それ自体のカルボキシ末端は順次第二のIgE結合ドメインのアミノ末端に融合している場合である。R1部分が1個より多い場合、あるいはR2部分が1個より多い場合、あるいはL部分が1個より多い場合には、必ずしもではないが、同一であることができる。
好ましくは、本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも1個の可溶性分泌可能哺乳動物のIgE結合ドメインが少なくとも1個のHSA成分に融合したもの、および製薬的に受け入れ可能なその塩であることを特徴とする。
更に、本発明はIgE−またはIgE−レセプター−介在疾病、特に、アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、慢性蕁麻疹などのアレルギー反応の予防および/または治療方法を目的とし、本発明の融合ポリペプチドまたは製薬的に受け入れ可能なその塩を、そのような治療を必要とする被験者に投与することから成り、更に、本発明の融合ポリペプチドまたは製薬的に受け入れ可能なその塩を少なくとも1種の製薬的に受け入れ可能な担体または希釈剤と共に含有する製剤組成物を目的とする。
更に、本発明は本発明融合ポリペプチドの合成中間体であり、生理的機能を有する該ポリペプチドの等価物を目的とし、該融合ポリペプチドまたは生理的機能を有するその上記等価物の製造中間体であるポリヌクレオチドを目的とし、それを構築するために使用するオリゴヌクレオチド中間体を目的とし、そのようなオリゴヌクレオチドによりコードされるペプチドを目的とし、融合分子を発現する組換えベクターを目的とし、原核細胞または真核細胞(とりわけ、哺乳動物)系の発現系を目的とし、更に、そのような発現系を用いて該融合ポリペプチドまたは生理的機能を有するその等価物を製造する方法を目的とする。
配列番号2の記載および関連の定義
配列番号1:シグナル配列を含む未変性ヒトFcεRIα全長の優性型アミノ酸配列
用語「pre-IgER」は配列番号1のMet1−Leu204残基をいう。用語「IgER」はpre-IgERの成熟型をいい、配列番号1のVal26−Leu204残基(すなわち、FcεRIαの細胞外ドメイン)を構成する。
配列番号2:Met1−Leu609残基を含む未変性プリプロHSA(以下prepro HSA Iという)の優性型アミノ酸配列
成熟未変性タンパク(以下「HSA I」という)の優性型は配列番号2のAsp25−Leu609残基により表される。
用語「prepro-HSA II」は未変性配列のカルボキシ末端からアミノ酸1個(Leu609)のみを切除したものを表し、従って、配列番号2のMet1−Gly608残基をいう。
Prepro-HSA IIの成熟型は、ここでは「HSA II」というが、配列番号のAsp25−Gly608残基により表される。
配列番号3:プラスミドR−H−R/SK#50のEcoRIフラグメントがコードするアミノ酸配列 実施例5において調製され、以下のものから構成される。残基1〜204の「pre-IgER」配列、残基205〜211のリンカーAlaSer(Gly)4Ser(以下「L1」という)、残基212〜795のHSA II配列、残基796〜799のリンカー(Gly)3Ser(以下「L2」という)、および残基800〜978n「IgER」の配列。
本発明の未変性二量体融合ポリペプチドをここでは「IgER−L1−HSA II−L2−IgER」、または代りに「IgER−HSA−IgER二量体」というが、実施例7に記載の方法でCHO細胞から発現され、配列番号3のアミノ酸配列Val26−Leu978を有する。
配列番号4:プラスミドR−H−R/SK#50のEcoRIフラグメントのヌクレオチド配列 実施例5のものであり、以下のものから構成される。10〜621位の「pre-IgER」をコードするポリヌクレオチド配列、622〜642位のL1をコードするオリゴヌクレオチド、643〜2394位のHSA IIをコードするポリヌクレオチド、2395〜2406位のL2をコードするオリゴヌクレオチド、および2407〜2943位の「IgER」をコードするポリヌクレオチド、ならびに2944〜2949位の2つの停止コドン。
コーディング・フラグメント末端およびリンカー領域の制限部位は1〜6、622〜627、637〜642、2387〜2393、2401〜2406、および2950〜2955位にある。コザック(Kozak)配列はヌクレオチドの7〜9位にある。
HSAヌクレオチド共通配列とは異なる点突然変異点は804、1239、1290、1446、1815、2064および2079にある。点突然変異点はゆらぎ点なので、それらはアミノ酸配列に影響しない。
配列番号5:未変性prepro−HSAからの優位型のヌクレオチド配列 図12および配列番号2のアミノ酸配列に対応する。
配列番号6 未変性ヒトFcεRIα全長の優性型のヌクレオチド配列 シグナル配列を含み、図13に相当し、配列番号1のアミノ酸配列に対応する。
図面の説明
以下の図において、表示した分子は方向性をもって読み取る。すなわち、左側がアミノ(または5'−)末端に対応し、右側はカルボキシ(または3'−)末端に対応する。
図1A〜C.マウスにおける血清半減期:一定時間(注射後10〜800分)後のインビボでのタンパク濃度(血清1ml当たりのタンパクのピコモル量)
(A)遊離のHSA Iタンパク質、および
(B)実施例7の記載に従ってCHO細胞から調製したIgERタンパク(「遊離のα鎖」という)およびIgER−L1−HSA II−L2−IgER二量体融合ポリペプチド(「IgER−HAS−IgER」二量体という)。
(C)(A)からの遊離HAS Iの血清半減期と(B)からの二量体融合ポリペプチド(「IgER−HAS−IgER」)の半減期とを、注射後10分での血清濃度を1に標準化して比較。
図2.受動皮膚アナフィラキシー反応からの血管外溢出
実施例7の記載に従って調製したIgER−L1−HSA II−L2−IgERポリペプチド(「IgER−HSA−IgER二量体)」を系列希釈し(10μg/kg、50μg/kg、または500μg/kg)、マウスに静脈投与した(対照群は0μg/kg投与)。mm2の領域。モノクローナル・マウスIgE抗ジニトロフェニル(DNP)抗体の皮内注射による感作の前に5分、15分または30分の間隔を置き、次いで、1%エバンズブルー含有ウシ血清アルブミン溶液をチャレンジした。
図3.本発明の3種融合ポリペプチドの図示表示
(2種の単量体および1種の二量体)ポリペプチド・リンカーと共に示す。
I.単量体
(1)L2(「GGGS」)を介してIgERに融合したHSA II(図中「HSA」と表示)から成るHSA−リーディング単量体。HSA IIのLeu607Gly608位置をコードするヌクレオチドは表示のごとくユニークMsrIIを含み、L2のGlySerをコードするヌクレオチドはBamHIを含む(下線はコードアミノ酸)。
(2)IgERがそのカルボキシ末端でL1(すなわち、「ASGGGGS」)を介してHSA II(図中「HSA」と表示)に融合したものから成るIgE結合ドメインリーディング単量体。L1をコードするオリゴヌクレオチドはNheI部位およびBamHI部位をそれぞれ含む(下線はL1のコードアミノ酸、AlaSerおよびGlySer)。
II.二量体
第一IgERがそのカルボキシ末端でL1を介してHSA II(図中「HSA」と表示)のアミノ末端に融合しているものから成るIgE結合ドメインリーディング二量体であり、該HSA IIのカルボキシ末端は、単量体について上述したように、コードポリヌクレオチド中に制限部位をもつ第二IgERにL2を介して融合している。
図4.ヒトFcεRIα cDNA全長を末端切除し、コード化DNAを得るためのPCRプライマー(「IgEレセプターcDNA」という):
(i)IgER
[オリゴヌクレオチド#18によりFcεRIαに対してのコード鎖5'末端に付加したBamHI部位;および停止コドンおよびオリゴヌクレオチド#19により非コード鎖の3'末端に付加したEcoRIおよびSalI部位]
(ii)pre−IgER
[SstI、EcoRIおよびKozak部位をFcεRIαに対してのコード鎖5'末端に付加するオリゴヌクレオチド#20;NotIおよびNheI(そして第二NheI部位を欠失させる)をFcεRIαに対しての非コード鎖に付加するオリゴヌクレオチド#31]
(iii)pre−IgER
[上述のように用いるオリゴヌクレオチド#20および#19]
(A)「HSA−リーディング」:上記(i)をSKベクターにサブクローニングして、クローニング・ベクターTAクローンpEK1とし、HSA II−リーディング単量体の構築に使用する。
(B)「IgER−リーディング」:(ii)をSKベクターにサブクローニングして、IgER/TA#1構築物とし、IgER−リーディング単量体の調製に使用する。
(C)「IgER単独」:(iii)をSKベクターにサブクローニングして、IgERFL/TA#34構築物とし、標準品として使用する成熟IgERの発現に使用する。
二重の星印は2つの停止コドンを表す。
図5.ヒトprepro−HSA I cDNA全長の末端を切除し、コード化cDNAを得るためのPCRプライマー対:
(i)カルボキシ末端でL2に融合したprepro−HSA II
[Spel、EcoRIおよびKozak配列をコード鎖5'末端に付加するオリゴヌクレオチド#24;MstIIおよびHindIII部位をコード化するリンカーをHSA IIの3'末端に付加するオリゴヌクレオチド#28および#29]
(ii)HSA IIの5'末端に融合したL1
[NotI、NheI、リンカーおよびBamHI部位をコード鎖に付加するオリゴヌクレオチド#26;非コード鎖中にNcoI部位を含むオリゴヌクレオチド#27]
(iii)prepro−HSA I
[上記のように用いたオリゴヌクレオチド#24;停止、EcoRIおよびHindIII部位を非コード鎖中の3'端に付加するオリゴヌクレオチド#25]
(A)「HSA−リーディング」:(i)をSKベクターにサブクローニングして、pEK7とし、HSA II−リーディング単量体の構築に使用する。
(B)「IgER−リーディング」:(ii)をSKベクターにサブクローニングして、HSA/SK#5とし、IgER−リーディング単量体の構築に使用する。
(C)「HSA単独」:(iii)をSKベクターにサブクローニングして、標準品として使用する成熟未変性ヒト血清アルブミンタンパク(すなわち、HSA I)をコード化するHSA/SK#17とする。
図6.ヒト血清アルブミン(HSAb)配列決定オリゴヌクレオチド#1〜10、l2、16、17、22および30;TAでクローン化した物質をIgE結合フラグメントに結合後、配列を決めるのに使用する。
図7.IgEレセプター配列決定オリゴヌクレオチド#11、13および23;TAでクローン化したフラグメントをHSA成分に結合後、配列を決めるのに使用する。
図8.
(A)ヒト血清アルブミン用変異原性オリゴヌクレオチド#14および#15。
(B)融合ポリペプチドを構築するためのPCRおよびリンカー・オリゴヌクレオチド#18〜20、24〜29および31。
図9.ベクターHSA−IgER/SK#49の構築:pEK1のBamHI、SalIフラグメントをBamHI.SalI−カットpEK7に連結することにより、リンカーL2(図9では「GGG」と表示)を介してIgERコード化ポリヌクレオチドの5'末端に、3'末端において融合したprepro−HSA II(図中「HSA」)をコードするポリヌクレオチドを含む。
図10.ベクターIgER−HSA/SK#1の構築:IgER/TA#1のSstI、NheIフラグメントをSstI.NheI−カットHSA/SK#5に連結することにより、リンカーL1(「GGG」と表示)を介してHSA II(「HSA」)コード化ポリヌクレオチドの5'末端に、3'末端において融合したpre−IgER(図中「IgER」)をコードするポリヌクレオチドを含む。
図11.ベクターHSA−IgER Pst Sal/SK#37の構築:HSA−IgER/SK#49のPstI、SalIフラグメントをSKベクターに連結することにより、L2用オリゴヌクレオチド(表示せず)を介してIgER(「IgER」と表示)コード化ポリヌクレオチドの5'末端に、3'末端において融合したHSA II(「HSA3」と表示)をコードするポリヌクレオチドを含む。ベクターR−H−R/SK#50の構築に示すように、L1用オリゴ(表示せず)を介してHSA II(「HSA」)コード化ポリヌクレオチドの5'末端に、3'末端において融合したIgER(「IgER」と表示)コード化ポリヌクレオチドを含む。該HSA IIコード化ポリヌクレオチドは順次L2用オリゴヌクレオチド(表示せず)を介してIgER(「IgER」)コード化ポリヌクレオチドに融合される。当該ベクターはHSA−IgER Pst Sal/SK#37のPstI、KpnIフラグメントをPstI.KpnI−カットIgER−HSA/SK#1に連結することにより調製される。
図12.ヒト血清アルブミンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列:配列番号2および配列番号5に対応する。
図13.IgE R のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列:配列番号1および配列番号6に対応する。
図14.R−H−R/SK#50のEcoRIフラグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列:配列番号3および配列番号4に対応し、R1−HSA−R1二量体融合タンパクをコード化。HSA配列はイタリック体で示す。リンカー配列は下部囲い中に示す。共通HSA核酸配列と異なる点変異は下部太枠内に示す。点変異はゆらぎ位置にあるため、アミノ酸配列には影響しない。該フラグメントの末端位およびリンカー領域の制限部位には下線を引いてある。
図15.実施例7の精製成熟融合ポリペプチドのSDS−PAGE
全量をゲルに添加:8μg(レーン1)、6μg(レーン2)、4μg(レーン3)、および2μg(レーン4)。分子量標準品:97.4、66.2、45、31、21.5、および14.4kDa(レーン5)。
詳細な記載
本発明は少なくとも1個のIgE結合ドメインを少なくとも1個のHSA成分に融合したことから成る融合ポリペプチドおよびその塩に関する。
用語「IgE結合ドメイン」は、IgEがそのレセプターFcεRIに結合するのを防止する様式で、哺乳動物、例えば、ヒトのIgEと結合する、あるいは関係することのできるアミノ酸配列をいう。
ヒトFcεRIαのcDNAおよび推定アミノ酸配列は既知である(J.Kochanら、Nucleic Acids Research 16(1988)3584;およびLederら、USP 4,962,035)。ヒトFcεRIαはNH2−末端シグナルペプチド[アミノ酸残基Met1−Ala25(最初のMetを含む)]、2個の免疫グロブリン様細胞外ドメイン(残基Val26−Leu204)、疎水性経膜領域(Gln205−Ile224)、および親水性細胞質尾部(残基Ser225−Asn257)(配列番号1参照)をコード化している。シグナルペプチドは細胞内プロセシングの間に切断される。未変性ヒトFcεRIαの優性型のアミノ酸全配列は本明細書に配列番号1として包含されている。
本明細書において、「IgER」は配列番号1のアミノ酸配列Val26−Leu204をいう(細胞外ドメインをコードする)。用語「pre−IgER」は配列番号1の残基Met1−Leu204をいう(細胞外ドメインのシグナル配列上流をコードする)。
IgE結合ドメインは、例えば、上記定義のIgERと少なくとも80%の相同性、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも95%、また、最も好ましくは少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸配列である(相同性は未変性配列と変性配列間の同一性%として、未変性分子全配列の長さの関数として計算するが、要すれば、該配列を整列させ、ギャップを入れた後、配列同一性の最大パーセントを求める)。
本発明の融合ポリペプチドのサブグループにおいて、IgE結合ドメイン成分は式(Xa)で表される。
(Xa)
但し、(Xa)は、
(a) IgER、または
(b) 天然に存在するIgERのアレレ、または
(c) (a)または(b)のカルボキシ末端において1〜12個(例えば、1〜10、1〜7または1〜4個)のアミノ酸の末端切除体、または
(d) (a)、(b)または(c)の変異体。
「変異体」の意味は以下のとおりである。
− 1ないしそれ以上であって10個までのアミノ酸(例えば、1〜7または1〜5個)の欠失により修飾した(a)、(b)または(c)の配列、
− アミノ酸配列内内部に総計10個までのアミノ酸(例えば、1〜5個)の挿入、または総計100個までのアミノ酸の両端への挿入、または
− 総計15個までのアミノ酸(例えば、1〜5個)保存置換。
該IgE結合ドメインは、より好ましくは、式(Xb)で表される。
(Xb)
但し、(Xb)は
(a) IgER、
(b) IgERカルボキシ末端における1〜7個のアミノ酸の末端切除体、または
(c) (a)または(b)の変異体。
該IgE結合ドメインは、更により好ましくは、式(Xc)で表される。
(Xc)
但し、(Xc)は
(a) IgER、または
(b) IgERカルボキシ末端における1〜7個のアミノ酸の末端切除体(例えば、配列番号1においての配列Val26−Ala197)。
該IgE結合ドメインは、最も好ましくはIgERである。
好ましくは、いずれの同族体、末端切除体または変異体も「分泌可能」ポリペプチドとして組換えにより調製される。すなわち、該IgE結合ドメインをコード化する成熟ペプチド配列は宿主細胞においてポリヌクレオチドから合成され(または予備的形成物などの前駆体として合成)、該細胞から分泌される。
本発明の組換え融合物の他の主要成分、ヒト血清アルブミン(HSA)は最も多量に存在する血漿タンパクであり、重量ベースで血漿中総タンパク含量の60%の寄与率である。ヒト血清アルブミン分子は、分子量66.5kDaの585アミノ酸から成る非グリコシル化ポリペプチド単鎖から成る。アルブミンに特異的な特徴はその複雑なジスルフィド結合様式である(F.F.Clercら、J.Chromatorg.662(1994)245〜259)。ヒト血清アルブミンは全身に広く分布しており、特に、腸内または血液内区画に分布し、血清の最も多量に存在するタンパクとして、浸透性および血漿容積の維持に主に関わっている。更に、それは肝臓内をゆっくりと通過し、ヒトでのインビボ半減期は14〜20日である(T.A.Waldmann,「アルブミン構造、機能および用途」、パーガモン・プレス(1977)255〜275)。ヒト血清アルブミンは酵素または免疫学的機能を欠いている。それは種々の天然ならびに治療上の分子の内在性輸送および送達に関わる天然の運搬体(キャリアー)である(H.Luら、FEBS Lett.356(1994)56〜59;WO 93/15199;EP 648499;P.Yehら、PNAS USA 89(1992)1904〜1908;EP 413622)。
ヒト細胞は最初、血清アルブミンをプレプロ型ポリペプチドの形態で合成する。シグナル配列である18個のアミノ酸(1番目のMetを含む)は、該タンパクが小胞体の内腔を通過するときに、N−端になお6個のアミノ酸(優性形では、Arg−Gly−Val−Phe−Arg−Arg)を残したまま除去され、次いで、それが更に分泌装置を通過する間または通過直後にタンパク分解切除を受ける。
ヒト結成アルブミンは多型性であることがよく知られている(D.C.CarterおよびJ.X.Ho,Adv.Prot.Chem.45(1994)153〜203)。例えば、アルブミン・ナスカピー(Naskapi)はGlu372の代りにLys372を有し、プロアルブミン・クリストチャーチ(Christchurch)は変性プロー配列、すなわち、Arg24の代りにGlu24を有する(Lattaら、USP 5,100,784)。
天然に存在する優性型の完全アミノ酸配列は既知であり、本明細書では「prepro-HSA I」という(A.Dugaiczykら、PNAS USA 79(1982)71〜75)(配列番号2)。成熟タンパク(「HSA I」)の優性型は配列番号2のAsp25−Leu609によって表される。
本発明融合ポリペプチドのHSAキャリアーは配列番号2の残基25〜609(すなわち、HSA I)との相同性が、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%であるアミノ酸配列のものである(相同性は未変性配列と変性配列間の同一性%として、未変性分子全配列の長さの関数として計算するが、要すれば、該配列を整列させ、ギャップを入れた後、配列同一性の最大パーセントを求める)。
本発明の成熟ポリペプチドのサブグループにおいて、HSA成分は、式(Ya)で表される。
(Ya)
但し、(Ya)は、
(a)、HSA I、または
(b) 天然に存在する(a)のアレレ、または
(c) (a)または(b)のカルボキシ末端において1〜10個(例えば、1〜5、または1または2個)のアミノ酸の末端切除体、または
(d) アミノ酸残基nで終了する(a)の末端切除体であって、nが369ないし419であるもの、特に、nは373、387、388、389、390および407であるものである(USP 5,380,712に記載)、または
(e) (a)、(b)、(c)または(d)の変異体。
「変異体」の意味は以下のとおりである。
− 1ないしそれ以上であって10個までのアミノ酸(例えば、1〜7または1〜5個)の欠失により修飾した(a)、(b)、(c)または(d)の配列、
− アミノ酸配列内内部に総計10個までのアミノ酸(例えば、1〜5個)の挿入、または総計100個までのアミノ酸の両端への挿入、または
− 総計15個までのアミノ酸(例えば、1〜5個)保存置換。
HSA成分は、より好ましくは、式(Yb)で表される。
(Yb)
但し、(Yb)は、
(a)、HSA I、または
(b) 天然に存在する(a)のアレレ、または
(c) (a)または(b)のカルボキシ末端において1〜10個(例えば、1〜5、または1または2個)のアミノ酸の末端切除体、または
(d) (a)、(b)または(c)の変異体。
HSA成分は、更により好ましくは、式(Yc)で表される。
(Yc)
但し、(Yc)は、
(a) HSA I、または
(b) HSA Iのカルボキシ末端において1〜10個(例えば、1個)のアミノ酸の末端切除体(そのような末端切除体の例は「HSA II」であり、そのアミノ酸配列は配列番号2のAsp25−Gly608で表される)。
更により好ましいサブグループにおいて、該HSA成分はHSA IまたはHSA IIであり、特に、HSA IIである。
特に好ましいのは実施例7の融合ポリペプチド、とりわけ、リーダー配列をもたない、すなわち、配列番号3のポリペプチドVal26−Leu978である。
好ましくは、本発明の融合タンパクを調製するために使用する未変性HSAの同族体、末端切除体または変異体は酵素機能を欠いており、IgE結合ドメインが血清IgEに結合するのを防止または抑制しない。更に好ましいのは、そのような同族体または変異体のいずれもが少なくとも14日の血清内半減期を有することである。
IgE結合ドメインまたはHSA成分においての用語「保存置換」(conservative substitution)は1個またはそれ以上のアミノ酸が同様の性質をもつ他のアミノ酸と置換することを意味するが、それによって少なくともその二次構造、好ましくは三次構造が実質的に変化しないことを期待するものである。例えば、代表的なそのような置換は、グリシンをアラニンまたはバリンに、グルタミンをアスパラギンに、スレオニンをセリンに、あるいはリジンをアルギニンに置換することである。すべてのアミノ酸は(グリシンを除き)、好ましくは、天然型のL−アミノ酸である。
好ましくは、各IgE結合ドメインはIgERとの相同性が少なくとも95%であり、また、各HSA成分のHSA I成分との相同性は少なくとも95%である。
他の好ましいサブグループにおいて、
− 各IgE結合ドメインは、上記の定義のとおり、好ましくは(Xa)であり、また、各HSA成分は(Ya)であり、より好ましくは(Yb)であり、更により好ましくは(Yc)である。
− 各IgE結合ドメインは、上記の定義のとおり、より好ましくは(Xb)であり、また、各HSA成分は(Ya)であり、より好ましくは(Yb)であり、更により好ましくは(Yc)である。
− 各IgE結合ドメインは、更により好ましくは(Xc)であり、また、各HSA成分は(Ya)であり、より好ましくは(Yb)であり、更により好ましくは(Yc)である。
更に具体的には、IgE結合ドメインはIgERであり、また、HSA成分は上記の定義のとおり(Ya)であり、より好ましくは(Yb)であり、更により好ましくは(Yc)であり、また、最も好ましくは、HSA IまたはHSA II、特に、HSA IIである。
上述の優先性はまた、本明細書の式(I),(II),(III),(IV)および(V)のポリペプチドに特に適用する。
本発明の好ましいポリペプチドは、IgERの第一分子がそのカルボキシ末端を介してHSA IIのアミノ末端に融合し、該HSA IIはそのカルボキシ末端を介してIgER第二分子のアミノ末端に融合したものから構成される(IgERは配列番号1の残基Val26−Leu204であり、HSA IIは配列番号2のAsp25−Gly608である)。
本発明の特に好ましいポリペプチドは上記式(III)の二量体を含み、その場合、各R1はIgERであり、R2はHSA IIである。とりわけ好ましいのは式(III)の二量体であり、その場合、Lは1〜25アミノ酸である。
ペプチド・リンカー(本明細書の式(I)〜(V)において「L」で表される)は、いずれも好ましくは、IgE結合ドメインの独立した折りたたみと活性を可能とし、IgE結合ドメインを妨害したり、あるいは患者に免疫反応を引起こす可能性のある定序二次構造形成の傾向がなく、且つ、IgE結合ドメインを妨害する可能性のある疎水性または電荷特性が最小のものである。
ペプチド・リンカーは、好ましくは、1〜500個のアミノ酸、より好ましくは1〜250、更に好ましくは1〜100個のアミノ酸(例えば、1〜25、1〜10、1〜7または1〜4個)のものである。該リンカーは、好ましくは線状、すなわち、非分枝状のものである。一般に、Gly、AlaおよびSerを含むペプチド・リンカーはリンカーとしての基準を満たすと期待される。例えば、本発明のリンカーは、GlyGlyGlySer(本明細書では「L1」)および
AlaSerGlyGlyGlyGlySer(本明細書では「L2」)を包含する。種々の他の長さおよび配列組成のリンカーもまた使用可能である。
本発明はまた、本発明のペプチド・リンカーをコード化するオリゴヌクレオチドを包含する。そのようなオリゴヌクレオチドはIgE結合ドメインおよびHSA成分をコード化するポリヌクレオチドと「フレーム内で融合する」必要があり、好ましくは、分子内に特異な制限部位をもつ。「フレーム内で融合する」という意味は、
(1)リンカー・オリゴヌクレオチドが原因となるIgE結合ドメインまたはHSA成分の読み枠にシフトがないこと、および
(2)IgE結合ドメインおよびHSA成分の読み枠間に翻訳終結がないことである。
本発明は更に、通常は新規ポリペプチドの合成中間体である新規融合ポリペプチドの生理的機能等価物を包含する。用語「生理的機能等価物」とは、本発明の融合ポリペプチドを含むより大きな分子をいい、該ポリペプチドに、特定の宿主細胞から本発明の成熟組換え融合ポリペプチドの有効な発現および分泌のために必要とするあるいは望ましいアミノ酸を付加したものである。そのような付加配列は、一般的に成熟ポリペプチドのアミノ末端にあり、通常分泌経路にそれらを方向づける役割を果たすリーダー(すなわち、シグナル)配列を構成し、通常は細胞からポリペプチドの分泌に際し、あるいはそれに先立って切断される。該シグナル配列は関連ポリペプチドの天然N−末端領域から誘導することができるか、あるいは分泌タンパク質をコードする宿主遺伝子から得ることができるか、あるいは対象ポリペプチドの分泌を増加させることの知られる配列から誘導することができるものであり、合成配列および「プリ−」および「プロ−」領域間のすべての組合わせを包含する。シグナル配列と成熟ポリペプチドコード化配列間の結合は宿主において開裂部位に相当する必要がある。
IgE結合ドメインが発現を「誘導する」、すなわち、成熟分子中の他のコード配列の上流に該ドメインが存在する場合の成熟ポリペプチドにおいて、未変性ヒトFcεRIα(すなわち、Met1+配列番号1のAla2−Ala25)のリーダー配列を利用するのが好都合であり、このものは哺乳動物の発現系(例えば、CHO、COS)から、同様に酵母(ピチア・パストリス(Pichia pastoris))から成熟ポリペプチドを得るために有効に使用されている。
成熟二量体融合ポリペプチドIgER−L1−HSA II-L2−IgERの生理的機能等価物の例は、pre−IgER−L1−HSA II−L2−IgERである。しかし、付加的リーダー配列は必ずしもヒトFcεRIαのものである必要はなく、特定の宿主細胞から成熟ポリペプチドの発現/分泌をもたらすのに適当であるならば、他の適当な起源から得てもよい。例えば、HSAのprepro−配列は、特に、酵母での発現では、上記二量体融合ポリペプチドを調製するのに使用してもよい。
HSA成分が発現を誘導する場合の本発明融合ポリペプチドにおいて、適当なリーダー配列は未変性リーダー配列を含んでいてもよい。例えば、HSAの未変性prepro−領域は、哺乳動物(例えば、CHO、COS)細胞または酵母(ピチア・パストリス(Pichia pastoris))から成熟非相同ポリペプチドの分泌を遂行するのに用いてもよい。
HSA II−L2−IgERで表される成熟融合ポリペプチドの生理的機能等価物の例は、prepro HSA II-L2−IgERである。しかし、他のリーダー配列は必ずしもHSAまたは宿主細胞にとって未変性である必要はなく、特定の宿主において成熟融合タンパク質を有効に発現することができる(USP 5,100,784、USP 5,330,901)。
本発明は、本発明の組換え融合ポリペプチドの製造中間体であるポリヌクレオチドをも包含し、これらは、例えば、図8に示すように、融合ポリペプチドまたは生理的機能等価物をコード化するポリヌクレオチドおよびリンカー・ペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドを包含する。
更なる側面として、下記工程から成る、上記の組換え融合ポリペプチドまたはその塩の製造法を提供する。
(a) 上記融合ポリペプチドまたはその生理的機能等価物をコード化するDNAを含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
(b) 該融合ポリペプチドまたはその生理的機能等価物をその細胞内で発現させる工程であって、その際に、該生理的機能等価ポリペプチドを修飾し(例えば、シグナル配列の切断により)、上記融合ポリペプチドを得る工程、および
(c) 生成するポリペプチドを宿主細胞から、好ましくは分泌物として、また、要すれば、その塩の形態で回収する工程。
本発明の更なる側面では、該融合ポリペプチドの発現に使用するベクター、好ましくはプラスミドを提供する。これらのベクターは上記ポリペプチドまたはその生理的機能等価物をコード化するDNAを含む。一般に、該融合ポリペプチドを発現し得る微生物を形質転換することのできる適当なベクターとしては、転写および翻訳制御配列、例えば、プロモーターなどに結合した融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含し、それらが一緒になって発現カセットを構成する。該プロモーターは使用した特定宿主の遺伝子から誘導してもよいし、または、そのような制御領域を、例えば、インビトロでの部位特異的変異誘発によって、付加的制御要素または合成配列により修飾してもよい。特に本発明で用いる発現カセットは、従って、企図した宿主中で機能し、混成マクロ分子をコード化する配列の3'末端に位置する転写および翻訳終了領域をも含む。発現カセットに加えて、該ベクターは形質転換した宿主の選択を可能とする1個または数個のマーカーを組込んでいる。そのようなマーカーはG418などの抗生物質に抵抗性を与えるマーカーを含む。これらの抵抗性遺伝子は所与の宿主における発現を可能とする適切な転写および翻訳シグナルの制御のもとに置かれる。
更に詳しくは、本発明組換え融合ポリペプチドの調製は、例えば、以下のように実施する。
A.融合タンパク発現ベクターの構築
組換え融合ポリペプチドの構築における第一工程は、クローニング・ベクター中に該融合ポリペプチド部分をサブクローンすることである。この関連において、「クローニング・ベクター」はプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなどのDNA分子であり、宿主原核細胞中で自己複製し得るものである。クローニング・ベクターは、外来DNA配列をベクターの基本的生物学的機能を失うことなく確定できる様式で挿入し得る通常1個または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニング・ベクターを形質転換した細胞の同定と選択に使用するのに適したマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は通常テトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性を付与する遺伝子を組込んでいる。適当なクローニング・ベクターは、J.Sambrookら(編集)、分子クローニング、実験室マニュアル、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されており、例えば、種々の供給源から得られる。
FcεRIα cDNAクローンpGEM−3−110B−1は、A.Shimizuら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(1988)1907〜1911に記載されており、アメリカン・タイプ・ティッシュ・コレクション(ATCCストック#67566)から入手できる。一本鎖ヒト肝臓cDNAはクローンテック(Clontech)から入手できる(PCR−対応クイック・クローンcDNA、Cat.D#7113−1)。HSAの配列はジーンバンク(GenBank)からアクセス#V00495、J00078、L00132、L00133として入手できる。HSA cDNAは実施例2に記載したオリゴヌクレオチド#24および25を用いるPCR増幅により入手できる。
適切なIgE結合ドメインまたはHSA成分DNAをコード化するポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して調製できる。PCRは一本鎖cDNA鋳型およびオリゴヌクレオチド・プライマーの混合物を利用する。該PCRの手法は周知の方法論に従い実施される(例、C.R.M.Bangham,ヒト分子遺伝学のプロトコールにおける「ポリメラーゼ連鎖反応、概説」、ヒューマン・プレス(1991)、第1章、p.1〜8)。PCRキットおよびキットに使用する材料は種々供給源から製品として入手可能である。キットおよびその使用法は例えば、USP 5,487,993に更に記載されている。
シグナルペプチドをコード化するDNA配列はPCRによって付加することができるが、要すれば、既知のシグナルペプチド配列をコード化する合成オリゴヌクレオチドを使用してもよい。非相同シグナルペプチドをコード化するDNA配列は、融合ペプチドのN−末端をコード化するDNA配列をもつフレーム内にサブクローン化する。
ポリヌクレオチドの融合は中間体ベクターのサブクローニングにより達成される。また、1つの遺伝子は他の遺伝子を含むベクター中に直接クローン化することができる。
サブクローニングは常用技法に従い実施されるが、例えば、制限酵素での消化により適切な末端を用意し、アルカリホスファターゼ処理によりDNA分子が不要の結合をするのを避け、次いで、適切なリガーゼで連結反応させる。このような操作技法は文献に記載されており、既知技術である。
B.融合ポリペプチドの発現クローニング
クローン化融合タンパクは次いでクローニング・ベクターから切断し、発現ベクターに挿入する。適切な発現ベクターは通常以下のものを含む。
(1) 細菌宿主中発現ベクターの生育および選択を準備する細菌複製起源および抗生物質抵抗マーカーをコードする原核細胞DNA要素、
(2) プロモーターなどの転写開始を制御する真核細胞DNA要素、および
(3) 転写終了/ポリアデニル化配列などの転写工程を制御するDNA要素。
従って、本発明の他の側面は、本発明融合ポリペプチドの発現に使用するベクター、好ましくはプラスミド・ベクターに関し、本発明融合ポリペプチドをコードする本明細書記載のポリヌクレオチドを含んでいる。原核細胞または真核細胞を形質転換できる適切な発現ベクターは、使用した宿主細胞に従って選択される転写および翻訳制御配列に結合した融合分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。大腸菌での発現には、M.W.Robertson、J.Biol.Chem.268(1993)12736〜12743により記載されたようなベクターが使用できる。生成物はグリコシル化ではなく、ジスルフィド結合していることが期待される。酵母での発現には、インビトロジェン(Invitrogen)(サンディエゴ、カリフォルニア、米国)が供給するpHIL−D2などの発現ベクター、ピチア・パストリス発現キット(カタログ#K 1710−01)を使用することもできる。タンパク生成物はジスルフィド結合を有し、グリコシル化されていることが期待される。他の適切な酵母発現系はサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびクルベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)である。バキュロウイルス(Baculovirus)での発現では、pAC360、pVL1392およびpVL1393(Invitrogen,サンディエゴ、カリフォルニア、米国)などのベクターが昆虫細胞の感染に有用であり、グリコシル化およびジスルフィド結合生成物を分泌することが期待される。
本発明の融合ポリペプチドは通常、特に、哺乳動物細胞中で発現した場合には糖タンパク質であり、本発明はグリコシル化またはジスルフィド架橋状態にあるいずれの融合ポリペプチドをも包含する。とりわけ、変異分析が示唆するところによると、IgEレセプターα鎖のN−連鎖グリコシル化部位の第1、第2および第7位置におけるN−連鎖グリコシル化(A.Shimizuら、PNAS USA 85(1988)1907〜1911、図2)(配列番号1のアミノ酸残基46、67および191に相当)がIgER分子および単量体およびそれを含む二量体の生物活性を増進する。最も好ましい発現系は、未変性分子のものに最も近い状態で糖鎖が付加していて、そこから該ポリペプチドを誘導するようなものである。酵母および昆虫細胞は哺乳動物細胞とは異なる糖タンパク質に修飾することが知られており、一方、大腸菌は分泌後糖分子を付加しない。従って、これら発現系のいずれからの発現も診断薬適用(例えば、アレルギー症状の検出)に有用なタンパク産物を産生することができる一方、治療用分子用途のこの産物を発現するための最良の形態は、哺乳動物中での発現、または可能であれば形質転換哺乳動物のミルク中での発現である。
哺乳動物宿主中での発現にとって、発現カセットに用いる転写および翻訳制御シグナルは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスまたはサルウイルスなどのウイルス源から誘導してもよく、この場合の制御シグナルは高レベルの発現を示す特定遺伝子と関連付ける。適切な転写および翻訳制御配列はまた、アクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネイン遺伝子などの哺乳動物遺伝子から得ることができる。転写制御配列は哺乳動物細胞でのRNA合成開始を指示するのに充分なプロモーター領域を組込んでいる。代表的な哺乳動物細胞の例はチャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞、SV40−形質転換サル腎臓細胞(COS)、HeLa、BHK、NIHスイスマウス胚細胞、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞、またはラット肝ガン細胞である。
哺乳動物細胞での発現において好ましい方法はCHO細胞からの分泌である。CHO細胞もヒト細胞もα1,3−連鎖ガラクトース残基を付加することはないが、C127およびSP2/0細胞などマウス細胞での発現では典型的なことである。この糖連鎖に対する抗体がヒトの血清に存在し[C.F.Goocheeら、BioTechnol.9(1991)1347〜1355]、これらのマウス細胞から発現される組換え産物の半減期、接近性、クリアランスなどに影響を与える。CHO、dhfr-細胞はジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)に対する変異体であり、それ故、プリン、チミジンおよびグリシンを初めから合成することができない。DHFR遺伝子の野生型コピーを担持する染色体的に合成したプラスミドのコピー数は、これらのプラスミドで形質転換した細胞を、酵素の活性部位に結合する葉酸と競合する葉酸類似体である増量レベルのメトトレキサート(metho-trexate)に触れさせることにより増加または増幅させることができる。CHO、dhfr-細胞での発現に適したベクターはpMT2である(R.J.Kaufmanら、EMBO J.6(1987)187〜193)。pMT2ベクターは野生型のDHFR遺伝子コピーをもち、これは単一mRNAとして外来遺伝子により転写される。それ故、形質転換したCHO、dhfr-細胞を高濃度メトトレキサートでの処理によって、外来遺伝子およびDHFR遺伝子共に同時に増殖される。これらの細胞から分泌される産生物は哺乳動物の様式においてジスルフィド結合形成およびグリコシル化が期待される。
発現ベクターは多様な技術を用いて宿主細胞に導入することができるが、その技術はリン酸カルシウム移入、リポソーム介在移入、電気穿孔法などである。好ましくは、移入した細胞を選択し増殖させるが、その場合、発現ベクターは宿主細胞染色体に安定に合体し、安定な形質転換体を生じる。該細胞は、例えば、DMEM培地中で培養する。細胞のトランスフェクション後あるいは抗生物質抵抗性などの選択に続く安定な細胞系の樹立後、24〜72時間の過渡的発現に続いて、培地中に分泌されたポリペプチドは標準的な生化学的手法により回収することができる。
発現されたポリペプチドを培地から回収する常用の方法は、周知の生化学技術を用いて培地のポリペプチド含有部分を分画することから成る。例えば、ゲル濾過、ゲルクロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、イオン交換またはアフィニティクロマトグラフィーなどのタンパク分画のために知られた方法を用い、培地中に見出される発現タンパク質を単離することができる。更に、通常の免疫化学的方法、例えば、免疫親和性または免疫吸収などの方法が実施できる。形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の生産と精製の技術もまた周知である(J.Sambrookら(1989)上記;R.J.Kaufman、遺伝子工学、原理と方法、プレナム・プレス、Vol.9(1987)156〜198)。
本発明の融合ポリペプチドは哺乳動物、とりわけ、ヒトのアレルギー患者を治療するための治療用途を企図するものである。該融合ポリペプチドのIgE結合ドメインは、IgEに対して肥満細胞、好塩基球およびランゲルハンス細胞に本来存在するIgEレセプターと競合し、その結果、IgEは投与したタンパクに結合し、アレルギー応答を仲介するこれらアレルギー作動細胞に結合できなくなる。IgE結合ドメインまたは、IgEレセプター、FcεRIとも競合して、FcεRIに対する自己抗体に結合する。
それ故、本発明はIgE(および/またはFcεRIに対する自己抗体)に競合的に結合する、および/またはIgEの産生を阻害する製剤組成物、および、従って、IgE−またはIgEレセプター−介在疾病、特に、アレルギーおよびアレルギー関連症状、例えば、アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息および慢性蕁麻疹などの抑制および/または防止治療のための製剤組成物を提供する。
「IgE−またはIgEレセプター−介在疾病」が意味することは、細胞結合IgEレセプター、FcεRIがIgEに、またはFcεRIに対する自己抗体に結合することと関連する疾病、例えば、気管支喘息、アトピー性喘息、枯草熱、花粉アレルギー、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、アナフィラキシーなどのアレルギー型反応(「IgE過剰症候群」)、ならびに、慢性蕁麻疹、および非アレルギー性キムラ病、および他の肺性、皮膚性または自己免疫疾患である。
とりわけ、アトピー性皮膚炎は最も劇的なアトピー徴候の一つであって、高い血清IgEレベルおよび種々の環境アレルゲンと関連する慢性炎症性皮膚疾患である(M.A.Morrenら、J.Am.Acad.Dermatol.31(1994)467〜473)。アトピー性皮膚炎に対する最近の治療はステロイド含有クリームの使用に集中しており、アトピー性皮膚炎の重症例ではシクロスポリンAでの治療が成功している(H.Granlundら、Br.J.Dermatol.132(1995)106〜112)が、副作用のためこの治療は少数の患者に制限されている。肥満細胞の脱顆粒およびB細胞および他の抗原提示細胞によるIgE介在抗原提示などのIgEの機能を阻害する薬剤は、現在知られたアトピー性皮膚炎の治療よりも優れており、更に、他の緩和なアレルギー型に対しても有用である。
アトピー性皮膚炎およびアトピー性喘息に加えて、本発明のポリペプチドは慢性蕁麻疹(CU)の治療または予防に使用することができるが、そこでは肥満細胞の脱顆粒がFcεRIの活性化を通して役割を果たしている。本発明の融合ポリペプチドはFcεRIαに対する循環系自己抗体を除去することができるが、これはこの疾患の治療に対して別法として提案されている抗−IgEモノクローナル抗体とは著しく異なるものである。
該ポリペプチドは製剤組成物の形態で、本発明のポリペプチドを、好ましくは未修飾ポリペプチド、またはその製剤学的に受容可能な塩として、製剤学的に受容可能な担体または希釈剤と共に投与することができる。
用語「塩」とは特に製剤学的に受容可能な塩をいい、製剤学的に受容可能な非毒性酸から調製して、例えば、ポリペプチド鎖のアミノ基の酸付加塩としたものであり、または製剤学的に受容可能な非毒性塩基から調製して、例えば、ポリペプチド鎖のカルボキシル基の塩基性塩としたものである。そのような塩は本発明ポリペプチドの内部塩として、および/またはアミノまたはカルボン酸末端の塩として形成されてもよい。
適切な製剤学的に受容可能な酸付加塩としては、製剤学的に受容可能な非毒性有機酸、ポリマー酸、または無機酸のものである。適切な有機酸の例は、酢酸、アスコルビン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマール酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イソチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、蓚酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、およびp−トルエンスルホン酸、ならびにタンニン酸またはカルボキシメチルセルローズなどのポリマー酸を含む。適切な無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸および硝酸などの鉱酸を含む。
カルボキシ基の塩を形成する適切な無機塩基の例は、ナトリウム、カリウムおよびリチウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム、バリウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、およびアンモニウム、銅、第一鉄、第二鉄、亜鉛、マンガン(II)、アルミニウムおよびマンガン(III)塩を含む。好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、およびナトリウム塩である。カルボキシル基の塩を形成する適切な製薬学的に受容可能な有機塩基の例は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ(n−プロピル)アミン、ジシクロヘキシルアミン、β−(ジメチルアミノ)エタノール、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリエタノールアミン、β−(ジエチルアミノ)エタノール、アルギニン、リジン、ヒスチジン、N−エチルピペリジン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、カフェインおよびプロカインなどの有機塩基を含む。
該ポリペプチドの酸付加塩は、該ポリペプチドを1当量以上の塩酸など所望の無機または有機酸と接触させることによる常法に従い調製し得る。該ペプチドのカルボキシル基の塩は、該ペプチドを1当量以上の水酸化金属塩基(例えば、水酸化ナトリウム)、炭酸金属または重炭酸金属塩基(例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム)、またはアミン塩基(例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミン)と接触させることによる常法に従い調製し得る。
本発明はまた、上記の新規融合ポリペプチドまたは製剤学的に受容可能なその塩を製剤学的に受容可能な担体または希釈剤と共に含む製剤組成物に関する。該担体は、好ましくは無菌の発熱物質不含、非経口投与可能な液体である。水、生理食塩水、デキストローズ水溶液、およびグリコールは、特に、(等張のときの)注射用溶液として好ましい液体担体または希釈剤である。該組成物は常法により調製した凍結乾燥品であってもよい。
該組成物は全身的に、すなわち、非経口的に(例えば、筋肉内、静脈内、皮下または皮内)、または腹腔内投与により投与することができる。非経口投与においては、該融合ポリペプチドが患者の血清または血漿に実質的に溶解すること、例えば、少なくとも1ミリグラムのポリペプチドが1ミリリットルの血清または血漿に溶解することが好ましい。
該組成物は局所投与のための既知技術によって投与することもできる。適切な投与形態の例としては、スプレー、点眼液、鼻腔液、および軟膏を含む。例えば、スプレー剤は該ペプチドを適当な溶媒に溶かし、それを通常吸入療法に使用するエアロゾルとして使用するスプレー容器に容れることにより製造することができる。点眼液または鼻腔液は該活性成分を蒸留水に溶かし、緩衝液、等張剤、増粘剤、保存剤、安定剤、界面活性剤または殺菌剤などの必要な助剤を添加し、その混合物をpH4ないし9を調整することにより製造することができる。軟膏は、例えば、2%カルボキシビニルポリマー水溶液などのポリマー溶液および2%水酸化ナトリウムなどの塩基から組成物を調製し、混合してゲルを得、次いでゲルを一定量の精製融合ポリペプチドと混合することにより得ることができる。
該組成物は、好ましくは皮下または静脈内、最も典型的には皮下投与する。
本発明はまた、本発明融合ポリペプチドまたはその製剤学的に受容可能な塩の治療上有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを特徴とするアレルギー症状の治療法を包含する。該治療法はアレルギー疾患の状態のときに(すなわち、徴候の軽減が特に要求されるとき)または継続的あるいは予防的処置として(すなわち、予期されるIgE−またはIgEレセプター−介在疾病、例えばアレルギー反応の徴候に先立って)実施する。
この場合の有効投与量は、例えば、治療すべき症状の程度または重症度、被験者の年齢、性および状態、治療期間、および個々融合タンパクの有効性、常套法により決定し得るファクターなどを考慮して広範囲に変化させることができる。
個々の被験者はそのIgE(同様にFcεRIに対する抗体)含量に大幅な変動があるので、この場合の治療上有効投与量は、モル比率で血清IgEおよびFcεRIに対する抗体の総含量の5x102倍と1x104倍の間にあるように記載するのが最もよい。患者は毎日の基準で単回または複数回投与により治療する。該組成物は月単位基準(またはそれが適切である場合には週の間隔)で、その場合にも単回または複数回投与により投与することができる。
平均的な被験者(70kg)に対しては、本発明融合ポリペプチドの、例えば、実施例7の二量体を便宜的に月に1度または2度、分割投与する場合の適当な月ごとの投与量を、約0.5mg/月の下方用量から約500mg/月の上方用量まで、好ましくは約1mg〜約300mg/月、より好ましくは約20mg〜約250mg/月の範囲とすることができる。より高い投与量範囲、例えば、500mg/月ないし2g/月の範囲は、患者が高血清IgE濃度を有する場合または初期治療期の場合に必要とされる。
投与量および投与時期は多様である。該組成物の最初の投与量は上記の範囲内で高用量であり、疾患治療の後期での投与回数よりもより頻回に投与される。適切な投与量は、上述のように、患者の血清中IgEとFcεRIに対する抗体含量を測定することにより決定することができる。例えば、疾患進行の初期においては、本発明の融合ポリペプチドは、実施例7の二量体のように、平均的患者(70kg)の場合、ポリペプチドを200〜500mgの1週用量で投与することができる。血清中IgEとFcεRIに対する抗体が除去された後は、治療方針を週単位または隔週ごとの治療に減じ、投与量を一回の治療につき50μgないし100mgのポリペプチド用量としてもよい。
本発明組成物は単独または本発明の他の化合物あるいは抗ヒスタミン剤もしくはコルチコステロイドなどの更なる医薬品と組み合せて投与することができる。
本発明はまた、標準的様式のインビトロ診断アッセイ、例えば、ELISAにおける本発明融合ポリペプチドの用途をも包含する。このアッセイにより、ヒト患者から得られる生物学的サンプル、例えば、血液または組織サンプル中のIgEまたはFcεRIに対する自己抗体のレベルを定量することができる。HSA成分はELISAフォーマット化アッセイによってIgEまたはFcεRIに対する自己抗体の結合と検出を有利に促進する。サンプル中に存在するIgEまたは自己抗体量は、患者が接触する物質に対しての患者のアレルギー応答度合いとして役立てることができる。IgEまたは自己抗体レベルは、抗アレルギー治療の効果を定量するために、また、患者のアレルギー状態を経時的にモニターするために測定することもできる。
本発明は更に、IgEまたはIgEレセプター介在疾病の治療のために、本発明融合ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを用いてヒトの遺伝子治療を実施する方法を包含する。遺伝子治療法とは、患者の細胞に本発明融合ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを導入し、そのような細胞からポリペプチドを発現させることにより患者の細胞を修飾することから成る。例えば、先ず患者から体細胞を取り出し、次いで該ポリヌクレオチドの挿入により培養物中で遺伝子的に修飾し、次いで得られた修飾細胞を患者に再導入するが、その際、本発明のポリペプチドを患者の細胞中で発現させる。
代りに、該細胞を、該ポリペプチドをコード化するベクターDNAの直接挿入によりインビボで修飾してもよい。
修飾のための適切な細胞は内皮細胞または白血球である。遺伝子治療への応用のために、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは制御可能な(例えば、誘発可能な)プロモーターの制御下にある。ポリペプチドの発現は、それ故に、既知の制御可能なプロモーターシステムを用いて、患者を外因性ファクターに接触させることにより成し得る。
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを、例えば、ミルク中に発現する非ヒトの体細胞組換えまたは形質転換動物を作製するための遺伝子治療法の利用を包含する。そのような修飾非ヒト動物もまた本発明の一部を形成する。有用な動物の例はマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびウシなどであり、これらのすべてを標準的な技法により形質転換する(例えば、D.R.Hurwitzら、Transgenic Research 3(1994)365〜375)。該動物類はモデルの目的あるいはタンパクの実生産に用いることができる。とりわけ、本発明は本発明の融合ポリペプチドを発現する形質転換マウス、ヤギ、ウシまたはブタに関係する。そのような動物の作製法は周知である。本発明の融合タンパクをコード化するポリヌクレオチドはインビトロまたはインビボで動物の体細胞に導入し、体細胞組換え動物を作製することができる。該動物は遺伝的に修飾されてはいるが、子孫にはその遺伝的修飾を伝えることができない。別法として、本発明タンパクの発現能を子孫に伝えることのできる形質転換動物作製のために、該ポリヌクレオチドを胚細胞に挿入することができる。
遺伝子治療用細胞のトランスフェクションは通常の方法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクチンを用いる手法、筋肉内注射、マイクロインジェクションまたは「遺伝子銃」の使用による方法などにより実施することができる。プラスミドをベースとするベクターは、真核細胞中での細胞毒性アミノグリコシドG418による安定な形質転換体選択のためのネオマイシン遺伝子などのマーカーを含んでいる。
感染は該融合ポリペプチド用遺伝子配列をレトロウイルス・ベクターに組込むことにより実施する。そのような組込み技術については種々の手法が知られている。広範に使用されているそのような手法の一つは、レトロウイルス詰込みのための欠陥マウス・レトロウイルス、および標的ドナー細胞で使用する感染性両種性ウイルス調製のための両種性パッケージング細胞を採用することである。
更なる特性化は、例えば、以下のように実施する。
血清半減期のインビボ定量
一般手法
体重約25gのメスSKH1/hr/hrチャールス・リバー・マウスに、無菌Ca+2、Mg+2不含PBSに希釈したタンパクを静脈内注射する。マウスを以下のグループに分割する。
− グループ(i)融合ポリペプチド、例えば、実施例7に従って調製した二量体IgER−L1−HSA II−L2−IgER 130μg(1nmole)を受容する、または
− グループ(ii)IgER 60μg(2nmole)を受容する、または、
− グループ(iii)HSA I65μg(1nmole)を受容する。
注射後、血液100μlを各マウスから10分、30分、3時間、6時間および12時間目に採取する。遠沈して血清を調製する。種々タンパクの血清濃度レベルを以下のように定量した。a)IgEレセプターELISA結合アッセイ。b)阻害ELISA。または、c)HSAサンドイッチELISA。
a)IgE R ELISA結合アッセイ
IgE血清濃度を以下のサンドイッチELISAによるIgE結合検出により定量する。ヒトIgE200ngをコースター(COSTAR)ストリップ・プレート−8ウエル(ケンブリッジ、マサチューセッツ、米国)のコーティングバッファー100μl中、加湿チャンバー内4℃で一夜固定化する。各ウエルを300μlのCa+2、Mg+2不含PBS(pH7.2)で2回洗浄する。プレートを5%BSA(シグマ)含有Ca+2、Mg+2不含PBS200μlで、室温1時間ブロックする。0.05%トゥイーン20含有Ca+2、Mg+2不含PBS(PBST)300μlで2回洗浄後、サンプルを1:10希釈マウス血清(Ca+2、Mg+2不含PBSに希釈)100μlで希釈して加え、室温で1時間培養する。
ウエルをPBS300μlで2回洗浄し、5H5/F8などのモノクロナール抗ヒトIgEレセプター抗体100μl(1ng)と共に室温1時間培養する。再びウエルをPBST300μlで2回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG−HRP(バイオラッド、Ca+2、Mg+2不含PBSで1:2000に希釈)と共に室温1時間培養する。プレートをPBST300μlで3回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)接合体を基質ABTS(バイオラッド)100μlで検出する。5分後、反応を3%蓚酸で停止する。色強度をイージーリーダー光度計により405nmで測定する。
b)阻害ELISA
FcεRIα100ngをヌンク96穴イムノプレート(F96 cert.Maxisorb)にコーティングバッファー(0.1M NaHCO3、0.01%NaN3、pH9.6)100μl中、加湿チャンバー内4℃で一夜固定化する。各ウエルをPBS、0.05%トゥイーン20(洗浄バッファー)300μlで4回洗浄する。異なるウエルのセットに、陰性コントロール(PBS、0.05%トゥイーン20、2%FCSで1:25に希釈したマウス血清50μl)、融合ポリペプチド標準品、例えば、IgER−L1−HSAII−L2−IgER標準品の希釈系列(400ng/mlから1.6ng/mlに希釈)またはサンプルの希釈系列のいずれかを加える。標準およびサンプルをPBS、0.05%トゥイーン20、2%FCSで1:25に希釈したマウス血清に希釈する。その後直ちに、希釈バッファー中のヒトIgE−ビチオン接合体溶液(400ng/μl)50μlを加え、混合する。培養混合物中の最終マウス血清希釈度は1:50である。
37℃2時間培養後、プレートを洗浄バッファー300μlで4回洗浄し、希釈バッファーに1:1000に希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ接合体(ギブコ)50μlを加え、37℃で1時間培養する。プレートを洗浄バッファー300μlで4回洗浄し、基質100μl(1mg/mlのリン酸p−ニトロフェニル/ジエタノールアミン・バッファー、pH9.8(バイオラッド))を添加した後、37℃30分培養して、2M NaOH50μlで反応を停止する。光学濃度をバイオメック−1000ワークステーション光度計により405nmで測定する。標準曲線からの定量的評価(4−パラメータ算定曲線適合)はベックマン・イムノフィットELISA評価プログラムにより実施する。計算式:
%結合=[OD(サンプルまたは標準値)/OD(バッファー値)]×100
C)HSAサンドイッチELISA
モノクローナル抗マウスHSA(HSA−9)500ngをヌンク96穴イムノプレート(F96 cert.Maxisorb)にコーティングバッファー(0.1M NaHCO3、0.01%NaN3、PH9.6)100μl中、加湿チャンバー内4℃で一夜固定化する。各ウエルを洗浄バッファー(PBS、0.05%トゥイーン20)300μlで4回洗浄する。陰性コントロールとして1:100希釈マウス血清(PBS、0.05%トゥイーン20、2%FCS=希釈バッファー)100μl、または標準品(1μg/ml〜2ng/mlヒト血清アルブミン、KABI)100μl、または1:100希釈マウス血清に希釈したサンプル100μlを加える。37℃2時間培養後、プレートを洗浄バッファー300μlで4回洗浄し、希釈バッファーに希釈したウサギ抗HSA−ビオチン接合体(1ng/μl)100μlを加える。抗HSA−ビオチン接合体はCH−Seph4B−HSAによる免疫アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、マウス血清との交差反応性をマウス血清−アガロースでの免疫吸着により除去する。37℃2時間培養後、プレートを洗浄バッファー300μlで4回洗浄し、希釈バッファーに1:1000に希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ接合体(ギブコ)50μlを加え、37℃で1時間培養する。プレートを洗浄バッファー300μlで4回洗浄し、基質100μl(1mg/mlのリン酸p−ニトロフェニル/ジエタノールアミン・バッファー、pH9.8(バイオラッド))を添加した後、37℃15分培養して、2M NaOH50μlで反応を停止する。光学濃度をバイオメック−1000ワークステーション光度計により405nmで測定する。標準曲線からの定量的評価(4−パラメータ算定曲線適合)はベックマン・イムノフィットELISA評価プログラムにより実施する。
結 果
二量体融合ポリペプチド、IgER−L1−HSA II−L2−IgER、遊離のIgER(「遊離α鎖」という)またはHSA I(「HSA」という)の濃度を注射後の経過時間の関数として、pmoles/ml血清で図1(A)および(B)中に示す。
図1(B)は遊離のレセプターは約10分間だけマウス血清中に検出可能であるが、二量体融合ポリペプチドは投与後約12時間なお検出可能であることを示す。
図1(C)はHSAおよび二量体融合ポリペプチドの相対的クリアランス速度を示す。最初の10分で組織血液分布の安定化の後、二量体とHSAは殆ど同じクリアランス曲線を示す。このことはIgE結合ドメインの血清中半減期がHSAに融合したことにより実質的に延長することができることを確認する。
マウスにおける受身皮膚アナフィラキシー(PCA)の抑制
一般手法
(a) ポリペプチドの投与
融合ポリペプチド、例えば、実施例7においてCHO細胞から得られたIgER−L1−HSA II−L2−IgER、10、50または500μg/kgの系列希釈液を、感作に先立ち種々の間隔で、体重約25gのメスSKH1/hr/hrチャールス・リバー・マウスに静脈注射する。
感作に先立ち注射したポリペプチドの量(すなわち、10μg/kg、50μg/kgまたは500μg/kg)により、マウスを3つのグループに分ける。コントロールマウスの第4グループはポリペプチドの代りに200μg/kgのPBSを静注する。マウスの4つのグループをそれぞれ3つのサブグループに分け、該化合物の静注とIgEでの感作[下記工程(b)]との間の間隔を変える。試験した間隔は、5分、15分および30分である。
(b) 皮内感作
マウスを麻酔し、PBS10ml中の各5ngのモノクローナルマウス抗ジニトロフェニル(NDP)IgE抗体を背部皮膚に4回皮内注射し感作する(バイオマコール、レホボット、イスラエル)。コントロールグループには食塩水を一方の部位に皮内注射する。
(c) アレルゲンのチャレンジ
感作の90分後、マウスを再び麻酔し、1%エバンズブルー含有ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン(DNP−BSA)(カルビオケム−ベーリング、サンディエゴ、米国)50μgを含む溶液を静注チャレンジする。PCA応答を溢血による染色テスト部位の直径測定により定量する。
結 果
実施例7の成熟融合ポリペプチド(配列番号3のアミノ酸Val26−Leu978)について、これらを図2の棒グラフに示す。二量体融合ポリペプチドは500μg/kgの濃度で、適用したすべての時点でPCAを完全にブロックする。50μg/kgでは、チャレンジ30分前の処理で統計学的に有意な36%の減少を示す。チャレンジ15分前では、10および50μg/kg双方の二量体投与で一つの傾向が見られる。このように、二量体融合ポリペプチドはPCAを防御するのに有効である。
本発明を実施するための手法および技法は技術上既知である。その調製については本明細書に特に記載しない限り、使用される化合物、試薬、ベクター、細胞系などは既知であり、容易に入手可能であるか、あるいは既知もしくは容易に入手可能な材料から常套方法により入手し得るか、あるいは既知もしくは容易に入手可能な材料から常套方法により調製し得るものである。
以下の非制限的実施例により本発明を説明する。温度はすべて摂氏で記載する。
材料と方法
PCR増幅
本発明のプライマーの新たな化学合成は、適切な方法、例えば、ホスホトリエステル法またはホスホジエステル法を用いて実施することができる。
特定の核酸配列を増幅する方法とシステムについては、USP 4,683,195およびUSP 4,683,202ならびにポリメラーゼ連鎖反応(H.A.Erlichら編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(1989))に記載されている。
PCRに続き、DNAフラグメントをQiaEx(キアジェン・インク・チャツウォース、カリフォルニア、米国)プロトコールにより除去、精製し、次いで、TAベクター[TA Cloning(商標)キット(インビトロジェン)(製品リスト、版2.2)]にサブクローンする。PCR増幅核酸の生成に使用したプライマーを図8に示す。DNAはセケナーゼ(Sequenase)法(USB、クリーブランド、オハイオ、米国)により配列決定する。
プラスミドおよび試薬
FcεRIα cDNAクローン、pGEM−3−110B−1(A.Shimizuら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(1988)1907〜1911)はアメリカン・タイプ・ティッシュ・コレクション(ATCCストック#67566)から入手する。一本鎖ヒト肝臓cDNAはクロンテック(PCR用クイック・クローンcDNA,カタログD#7113−1)より入手する。HSAの配列はジーンバンク(GenBank)からアクセス#V00495、J00078、L00132、L00133として入手できる。制限酵素はベーリンガー−マンハイムまたはギブコ/BRLから入手する。Taq DNAポリメラーゼはパーキン・エルマー・シータス(PECI)からまたはベーリンガー−マンハイムから入手する。SKベクターはストレートジーン(Strategene)から入手する。
pHIL−D2はインビトジェン(サンディエゴ、カリフォルニア、米国;カタログno.K1710−01(1994))から入手可能である(参照:「ピチア発現キット−タンパク質発現−ピチア・パストリス(Pichia pastoris)での組換えタンパク質の発現用方法のマニュアル−版3.0」(1994年、12月)(以下、「インビトロジェン・マニュアル」という)。
pXMT3ベクターはpUC8からのPstI〜EcoRIリンカー(ファルマシア)をpMT2のPstIおよびEcoRI部位にクローニングすることによりpMT2(Sambrookら(編集)(1989)上記)から誘導する(R.J.Kaufmanら(1987)上記)。
以下に用いる標準技法はSambrookら(編集)(1989)(上記)に記載されている。
実施例A:TAクローニングベクター
実施例1および2で得られるPCR増幅産物それぞれを別途プラスミドpCR2に結合する。連結反応は以下の反応混合物中、T4 DNAリガーゼを用い実施する。
25mMトリス−HCl(pH7.8)
10mM MgCl2
1mM DTT
1mM ATP
50ngベクターDNA
100〜200ng PCR反応産物(未精製)
4単位のT4 DNAリガーゼ(ニューイングランド・バイオラボ)
各反応混合物を適格な細胞に形質転換する前に、各反応混合物を18時間、15°に維持する。
実施例1:FcεRIα cDNAのPCR増幅およびクローニング
FcεRIα cDNAをキアジェン法によりpGEM-3-11B-1から精製する。次いで:
(A)HSA−リーディング構築物の調製。以下の反応混合物により、オリゴヌクレオチド#18および#19(図4、8)を用いてFcεRIα cDNAのPCR増幅を実施する。
FcεRIα cDNA 1μl(50ng)1μl、
オリゴヌクレオチド#18および#19 各50pmole
10x PCRバッファー(PECI)5μl、
20mM dNTPストック溶液0.5μl=200μM最終dNTP濃度
Taq DNAポリメラーゼ(PECI)0.5μl(2.5U)
水50μlまで。
反応混合物は蒸発を防止するために鉱油層を被い、パーキンエルマー・シータスDNAサーモサイクラー・モデル480で熱変換する。この反応のための変換条件:5分間95°に加熱、次いで、1.5分間94°、2分間53°、3分間72°で30サイクル、更に、72°での3分間の延長および4°での一夜浸水。
電気泳動に続いて、〜550bpの増幅産物を臭化エチジウム染色により確認する。フラグメントをPCR2ベクターにサブクローン化してIgERコード化pEK1を得る(図4、8B)。
(B)IgE−リーディング構築物を調製するために、FcεRIα cDNAのPCR増幅を、オリゴヌクレオチド#20および#31(図8B)を用いる以外は、上記(A)の手法に従って実施する。0.7%アガロースゲル上の電気泳動に続いて、〜600bpの増幅産物を臭化エチジウム染色により確認する。フラグメントをPCR2ベクターにサブクローン化してpre-IgERをコード化するIgER/TA#1(図4)を形成する。
(C)アッセイにコントロールとして使用する成熟、末端切除タンパクを発現するためのpre-IgERをコード化する構築物を調製するために、FcεRIα cDNAのPCR増幅を、オリゴヌクレオチド#20および#19(図8B)を用い、上記(A)の手法に従って実施する。電気泳動に続いて、〜620bpの増幅産物を臭化エチジウム染色により確認する。PCRフラグメントを除去し、PCRIIベクターにサブクローン化してpre-IgERをコード化し停止コドンがそれに続くIgERFL/T#34(図4)を形成する。
実施例2:ヒト血清アルブミンcDNAのPCR増幅とクローニング
prepro-HSA IIをコードする配列を得るために、実施例1(A)の一般手法に従い、ヒト血清アルブミンcDNA全長のPCR増幅をオリゴヌクレオチド#24および#25(図8B)により実施する。得られるクローンHSA/TA#1はジーンバンクの配列に最もよく似た配列をもっていた。このクローンにはゆらぎ位置に7個の変異と1333番塩基でリジンがグルタミン酸に替わる1個の変異が検出された。ゆらぎ位置の7個の変異は以下のとおりであった:塩基309、AからT;塩基744、AからG;塩基795、GからA;塩基951、GからA;塩基1320、CからT;塩基1569、AからC;塩基1584、GからA(HSA/TA#1に関して)。リジンからグルタミン酸への変異は、図8Aに示したオリゴヌクレオチドでの部位特異的変異およびバイオラッド・ミュータジーン・ファゲミッド・インビトロ変異誘発キット(バイオラッド・カタログ#170−3581)を用い、ジーンバンクの配列に補正し直した。この方法は親鎖にウラシル残基を包含させることと、続いて変異した鎖でそれを除去することにより行う(T.A.Kunkel,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82(1985)488〜492)。ゆらぎ位置での点変異はコード化タンパク質の未変性アミノ酸配列を変化させないので、上記7個の変異は補正しなかった。電気泳動の後、〜1.8kbの増幅産物を臭化エチジウム染色により確認する。
1.8kb産物をpCR2ベクターにサブクローン化しHSA/TA mut#16を形成させ、このものがprepro-HSA IIの完全配列を有することをDNA配列決定法により証明する。HSA/TA mut#16をSpeI,HindIIIフラグメントとしてのブルースクリプトSKにサブクローン化し、HSA/SK#17とする(図5)。
(A)HSA−リーディング構築物を調製するために、HSA/SK#17をMstIIおよびHindIIIで消化し、3'−末端アミノ酸(Leu609)コード化ヌクレオチド配列を除去する。次いで、上記リンカーL2コード化オリゴヌクレオチドを直鎖化HSA/SK#17の3'−末端に導入するが、オリゴヌクレオチド#28および#29(図8B)をキナーゼ処理し、これらのフラグメントを直鎖化HSA/SK#17のMstII/HindIII部位にアニールおよび連結してL2に融合したprepro-HSA II(図8B)を得る。MiniprepDNAはBamHI消化および配列決定によりチェックする。
(B)IgE−リーディング構築物を調製するために、prepro-HSA IIをコード化するHSA/SK#17を、オリゴヌクレオチド#26および#27(図5、8)によりPCR増幅する。オリゴヌクレオチド#26はHSAからprepro配列を除き、L1をコード化するオリゴヌクレオチドをHSAの5'末端に付加する。オリゴヌクレオチド#27はHSAコード配列の約800番のヌクレオチド位置にある天然産ユニークNcoI部位で終了している。PCR増幅は実施例1(A)における手法に従って実施する。ゲル電気泳動法およびキア(Qia)により単離した約800bpのフラグメントをpCR2ベクターにサブクローン化してクローンHSA Nco/TA#13とし、その配列をDNA配列決定により証明する。このクローンからのNcoI〜NotIフラグメントを切断したNcoIおよびNotI HSA/SK#17DNAにサブクローン化し、HSA IIコード化cDNAの5'−末端に結合したL1をコード化するHSA/SK#5(図5)を得る。
(C)HSAのみを発現させるために、上で調製したHSA/SK#17を採用する。
実施例3:prepro-HSA+リンカー+IgE R コード化融合構築物HSA-IgER/SK#22
pEK7(prepro-HSA IIcDNA+L2用オリゴヌクレオチド含有)およびpEK1(IgER含有)をBamHIおよびSalIで消化する。得られるpEK7からの1.8kbフラグメントをリン酸化し、pKE1から得られた550Kbフラグメントに連結する。一個の陽性miniprep#23を調製したが、HSA-IgERバンドの回収を妨げる他の未知プラスミドで汚染されていた。従って、HSA−IgER融合物を含む2.4kbのSpeI〜SalIフラグメントおよびベクターDNAを含む2.9kbフラグメントをminiprep#23から精製し、一緒に連結して、クローンHSA−IgE/SK#49(図9)とする[ベクター部位はサブクローン領域の両末端を欠失していることが判明したので、HSA−IgE/SK#49からの2.4kb SpeI〜SalIフラグメントをSpeIプラスSalI−切断ブルースクリプトSKにサブクローン化しHSA−IgE/SK#22とした(図には示さず)]。
HSAおよびリンカーとIgEレセプターDNAとの接合部配列、および融合物とベクターDNAとの末端配列は、DNA配列分析により証明されるようにHSA−IgE/SK#22に期待どおりに存在した。
実施例4:IgE R +prepro-HSA IIをコード化する融合構築物IgE−HSA/SK#1
HSA/SK#5およびIgER/TA#1をSstIおよびNheIで消化する。IgE/TA#1からの600bpフラグメントをゲル電気泳動により精製し、切断およびホスファターゼ処理したHSA/SK#5に連接し、クローンIgE−HSA/SK#1を得る(図10)。
実施例5:pre−IgE R −L 1 −HSA II−L 2 −IgE R コード化融合構築物R-H-R/SK#50
IgER−HSA/SK#1およびHSA−IgER/SK#49のHSA領域に特異なPstI部位は、IgERとprepro−HSA IIとをL2用オリゴヌクレオチドを介して結合するために使用する。HSA/IgER/SK#49とブルースクリプトSKをPstIおよびSalIで消化する。HSA IIの3'−部分、リンカーおよびIgER配列を含む1.2kbフラグメントを、PstIプラスSalI−切断ブルースクリプトDNAに接合し、HSA−IgER Pst Sal/SK#37(図11)として、これをPstIおよびKpnIで消化し、1.2kbフラグメントを調製する。
IgER−HSA/SK#1 DNAをPstIおよびKpnIで消化し、ベクター、IgER、リンカーおよびHSAの5'半分を含む4.8kbフラグメントを単離し、ホスファターゼ処理し、HSA−IgER Pst Sal/SK#37からの1.2kbフラグメントに接合する。その結果、二量体構築物R-H-R/SK#50が得られる(図11)。
実施例6:ピチア・パストリスのトランスフェクションと培養によるHSA II−L 2 −IgE R 単量体融合ポリペプチド
HSA II−L2−IgERコード化するプラスミドMB#2を、プラスミドHSA/SK#49をEcoRIで切断し、融合タンパクをコード化する2.4kbフラグメントを単離する。このフラグメントを、プラスミドpHIL−D2をEcoRIとアルカリホスファターゼ処理した後のピチア・パストリス発現ベクターpHIL−D2(インビトロジェン)のユニークEcoRI部位に接合する。得られるMB#2プラスミドをNotIでの消化により線状とし、「インビトロジェン・マニュアル」に記載どおりにhis4GS115細胞に形質転換する。His+形質転換体をメタノール上の生育によりスクリーニングする。メタノール上緩やかに生育する株を「インビトロフェン・マニュアル」に特定してあるように最小グリセロール培地中で定常期まで生育させ、遠沈により緩衝化複合メタノール培地に移し、4日間生育する。細胞からの上清を、次いで、HSAの存在について、およびIgE結合能についてELISAによりアッセイする。ピチア・パストリスから分泌され、得られた産物のIgE結合能はモル基準でHSA濃度に等価であり、完全に生物的に活性であった。
実施例7:トランスフェクションおよびCHO細胞での培養によるIgE R −L 1 −HSA II−L 2 −IgE R 二量体融合ポリペプチド
プラスミドpXMT3−RIα−HSA−RIα(pre-IgER−L1−HSA II−L2−IgERをコード化する配列番号4のポリヌクレオチド含有)を調製するに当たり、R−H−R/SK#50(実施例5参照)をEcoRIで消化し、二量体融合ポリペプチドをコード化する3kbのEcoRIフラグメントを単離する。このフラグメントを、予めEcoRIで消化し、アルカリホスファターゼ処理したpXMT3のユニークEcoRI部位に接合する。
このプラスミドをCHO DUKX B11細胞に移入する。これらの細胞はヌクレオシド合成に必要な機能的dhfr−遺伝子(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)を欠いている。それ故、細胞は10%ウシ胎仔血清(FCS)含有アルファ+培地(リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを有するMEM ALPHA MEDIUM/ギブコ)に保持する。トランスフェクションに際して、細菌をCa++-Mg++−不含PBS(CMF−PBS)で2度洗浄し、細胞濃度をCMF−PBS中2×106細胞/mlに調製する。細胞懸濁液0.8mlをプラスミドDNA15μgに加える。トランスフェクションはバイオラッド・ジーンパルサー(電圧=1000V、コンデンサー=25μF)を用いて電気穿孔法により実施する。トランスフェクション後、細胞を10%FCS含有アルファ+培地中で3日間培養する。
pXMT3プラスミドに所在するdhfr−遺伝子がヌクレオシド欠失培地での組換え細胞選択を可能とする。トランスフェクションの3日後、細胞を10%透析ウシ胎仔血清(FCSD)含有アルファ培地(リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含MEM ALPHA MEDIUM/ギブコ)に入れる。培養2週間後、組換え細胞コロニーが目視可能となる。細胞を4度の追加継代の間、遺伝子増幅開始まで10%FCSD含有アルファ培地に保持する。
メトトレキサート(MTX)の存在下、dhfrおよびそれに連結する遺伝子を増幅すると、導入遺伝子の発現が増大する。従って、ヌクレオシド欠失培地での組換え細胞の選択に続いて、10%FCSD含有アルファ培地中20nMのMTX存在下、培養する。メトトレキサートを段階的に100nMおよび500nM MTXに増加させ、更に増幅を達成する。
プールT1を3〜500nM濃度でローラーボトル中の10%FCS含有アルファ培地(ギブコ)に9×103/cm2の密度で種付けし、タンパクを産生させる。最初の上清を種付け5日後に収集し、血清不含アルファ培地に移す。第二収穫物をその3日後に収集し、合計1リットルの上清を精製用として得る。
第二バッチを、血清不含生育条件に適合させたプールT1/3〜500nMから誘導される上清2リットルから精製する。細胞を5×104/mlの濃度で種付けし、種付け6日後に上清を収集する。
実施例8:融合タンパク質の精製
実施例7からの培養上清を、標準技法により作製・精製した固定化抗−FcεRIモノクローナル抗体(例えば、5H5-F8、マウスIgG1)上の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。
a) クロマトグラフィー用支持体の調製
製造元の指示書に従い、モノクローナル抗体を10mg抗体/mlゲルの密度でCNBr−活性化セファロース4B(ファルマシア、ウプサラ、スゥエーデン)に結合する。次いで、過剰の活性基をエタノールアミンでブロックし、その樹脂を0.02%NaN3添加物PBS中に使用時まで保存する。
b) アフィニティークロマトグラフィー
澄明な培養上清をPBS平衡化抗体カラム(5ml)に0.5ml/minの流速で適用する。吸着された物質を50mMクエン酸、140mM NaCl,、pH2.70に流出する。タンパク含有フラクションを直ちにpH7.0(NaOH)に調整し、無菌濾過する。
c) 定量/特性化
二量体融合ポリペプチドの濃度は、30mM(3−[N−モルホリノ]プロパン)スルホン酸(MOPS)、pH7.0中での未変性コンフホメーションおよび6MグアニジンHClでの変性型につき、280nmでの吸収により決定する。対応するモル吸収係数を、モデル化合物におけるトリプトファン、チロシンおよびシスチンの一覧表化した吸収係数を用い、これらのアミノ酸数から計算し、折りたたまれたタンパクとほぐされたタンパクとの間の光学濃度の差につき補正する。融合タンパクは17個のトリプトファン、40個のチロシンおよび21個のシスチンを含み、理論的吸光係数は15084M-1cm-1となる。精製物の品質は標準SDS−PAGEにより、また、N−末端自動気相エドマン分解配列決定およびマス・スペクトル法により評価する。SDS−PAGE(図15)によると、該ポリペプチドは見かけの分子量約140kDaをもって転移し、約28%のグリコシル化を反映している(非グリコシル化の理論上MW:108,863.61 Da)。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:
(A)名称:ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
(B)通り:シュバルツバルトアレー215
(C)都市:バーゼル
(E)国:スイス
(F)郵便番号(ZIP):CH-4058
(G)電話番号:41-61-324 5269
(H)ファックス番号:46-61-322 7532
(ii)発明の名称:融合ポリペプチド
(iii)配列の数:6
(iv)コンピューター読解形式:
(A)媒介タイプ:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換性
(C)オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウエア:PatentIn Release #1.0,Version #1.25(EPO)
(v)現出願データ:
出願番号:WO PCT/EP97/....
(vi)優先権主張出願データ:
(A)出願番号:US 08/690216
(B)出願日:1996年7月26日
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:257アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列の記載:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:609アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列の記載:配列番号2:
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:978アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列の記載:配列番号3:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:2955塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列の記載:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:1827塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列の記載:配列番号5:
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:773塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列の記載:配列番号6:
Claims (7)
- 少なくとも1つのヒト血清アルブミン(HSA)成分に融合した、少なくとも1つの免疫グロブリンE(IgE)結合ドメインを含み、該IgE結合ドメインがIgERまたはpre-IgER(配列番号1)であり、そして該HSA成分がHSA-I、pre-pro-HSA-IまたはHSA-II(配列番号2)である、融合ポリペプチドまたはその塩。
- リーダー配列を有する実施例7のポリペプチド(配列番号3)または成熟型である実施例7のポリペプチド(配列番号3のVal26〜Leu978残基)である、請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその塩。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその塩の製造法:
(a)請求項1記載の融合ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
(b)該融合ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させる工程、および
(c)生成した融合ポリペプチドを該宿主細胞から、要すれば、その塩の形態で回収する工程。 - 請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその塩をコードするDNAを含むベクター、または請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその塩を発現する非ヒト体細胞組換えまたは形質転換動物。
- 医薬として使用するための、請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその医薬的に許容される塩。
- 請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその医薬的に許容される塩を、医薬的に許容される担体または希釈剤と共に含む、医薬組成物。
- 請求項1記載の融合ポリペプチドまたはその塩を含む、IgEまたはIgEレセプター介在疾患の処置用薬剤。
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