KR100361058B1 - 골발육촉진성단백질의돌연변이체 - Google Patents

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Abstract

골 발육 촉진성 단백질 (BMP) 의 돌연변이형태를 코오딩하는 DNA 분자가 밝혀졌다. BMP 의 돌연변이 형태는 박테리아에 의해 생성될 수 있으며, 생물학적으로 활성이 있는 BMP 의 단일이합체 또는 이형이합체를 생성하기 위해 재폴딩 될 수 있다. 또한, 이러한 돌연변이체 BMP를 제조하는 방법이 밝혀졌다.

Description

골 발육 촉진성 단백질의 돌연변이체
본 발명은 골 발육 촉진성 단백질의 돌연변이체에 관한 것이다. 이러한 돌연변이체는 박테리아 세포 배양으로 부터 불용성 형태로 생성되는 생물학적으로 활성이 있는 이합체형 재조합 골 발육 촉진성 단백질의 증진된 제조 방법에 특히 유용하다.
발명의 배경
포유동물내로 삽입될시에 골이나 연골 형성을 유발할 수 있는 것으로, 당 기술 분야에서 골 발육 촉진성 단백질 (BMPs)로 알려진 수많은 단백질이 최근들어 확인되고 있다. 예를들어, 미합중국 특허 제 5,013,649호에 첨부된 참고문헌에서 Wang과 그의 동료들은, 소와 인간의 골 발육 촉진성 단백질 2A (지금부터는 골 발육 촉진성 단백질-2 로 표시함) 및 2B (지금부터는 골 발육 촉진성 단백질-4로 표시함)을 코오딩하는 DNA 서열과; 그러한 DNA 서열에 의해 코오딩되는 대응 단백질을 기술하고 있으며, 그리고 상기 BMP-2A (지금부터는 BMP-2 로 표시함) 및 BMP-2B(지금부터는 BMP-4로 표시함) 의 재조합 생성 방법을 기술하고 있다.
미합중국 특허 제 5,106,748호에 첨부된 참고문헌에서 Wozney 과 그의 동료들은, 소와 인간의 골 발육 촉진성 단백질-5 (BMP-5)의 DNA 및 아미노산 서열과, 이와함께 BMP-5 단백질의 재조합 생성 방법을 기술하고 있다. 미합중국 특허 제 5,187,076호에 첨부된 참고문헌에서 Wozney과 그의 동료들은, 소와 인간의 골 발육촉진성 단백질-6(BMP-6) 의 DNA 서열, 아미노산서열 및 이의 재조합 생성방법을 밝히고 있다. 미합중국 특허 제 5,141,905호에 첨부된 참고문헌에서 Rosen과 그의 동료들은, 골 발육 촉진성 단백질-7 (BMP-7, 경우에 따라 OP-1로 칭함)의 DNA 및 아미노산 서열과, 그리고 BMP-7의 재조합 생성 방법을 기술하고 있다. PCT 공개 제 WO 91/18098 호에는 BMP-8 을 코오딩하는 DNA 서열이 기술되어 있다. PCT 공개 제 WO 93/00432 호에는 BMP-9을 코오딩하는 DNA 서열이 기술되어 있다. 이러한 참고 문헌들은 본 발명의 참고문헌으로 첨부되어 있다. 이러한 단백질은 포유동물에 있어서 골 및 연골의 손상 및 장애의 치료에 대한 광범위한 의학적 적용가능성이 있을것으로 예상된다. 이러한 골 발육 촉진에 대한 예상되는 의학적인 요구를 만족시키기 위해서는, 생물학적으로 활성이 있는 단백질이 상당량 필요할 것이다.
골 발육 촉진성 단백질의 재조합 생성은 진핵 및 원핵세포 배양 시스템 모두에서 가능하다. 박테리아같은 원핵세포에서 이형 단백질의 재조합 생성에 있어서 공통적으로 발생하는 것은 봉입체로 알려진 세포내 불용성 침전체의 형성이다. 일반적으로, 박테리아는 정확하게 이형 단백질들 코오딩하는 DNA 서열을 전사하고 해독할 수 있지만, 이러한 원핵세포는 가용성 형태로의 생성을 가능하게끔 몇몇 이형 단백질을 충분하고도 정확하게 폴딩 (folding) 할 수 없다. 특히, 이러한 것은 골 발육 촉진성 단백질과 같은 진력 생물 유래 단백질의 원핵 생물내 발현에 적용된다. 잘못 폴딩된 이형 단백질의 형성은 재조합 포유류 단백질을 생성하기 위한 박테리아 발효의 상업적 이용을 어느 정도 제한하였다. 박테리아내에서 생성될때, 재조합 골 발육 촉진성 단백질이 응집되어 있고 생물학적으로 비활성 형태인 봉입체로 종종 비슷하게 발견된다.
박테리아 봉입체로 부터 정확하게 폴딩된 이형 단백질을 수득하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 이러한 방법들은 일반적으로 봉입체로 부터 단백질을 용해시키고, 그 다음 변성촉진제를 이용하여 완전하게 단백질을 변성시키는 것과 관련된다. 시스테인 잔기가 단백질의 1차 아미노산 서열내에 존재할 경우에, 이황화 결합의 정확한 형성을 가능케 하는 환경 (산화환원 시스템) 에서 재폴딩이 이루어지는 것이 경우에 따라 필요하다. 재폴딩에 대한 일반적인 방법이, 문헌 "Kohno,Meth. Enzym., 185:187-195(1990)" 에 기재되어 있다.
유럽 특허 제 0433225 호에서는 변성촉진제 및 산화환원 시스템 이외에 세제 형태의 용해제로 사용되는 변형가능한 성장 인자 β (TGF-β)-유형 단백질을 재폴딩시키는 방법을 기술하고 있다. 상기 유럽 특허 제 0433225 호에서는 이 문헌에 공표된 방법을, 일반적으로 TGF-β 족에 포함되는 구성원 사이의 유사성 정도를 기초로 하여 볼때, "TGF-β-유형 단백질"을 재폴딩시키는데 적용할 수 있는 가능성을 예측하고 있다. 그러나, 본 발명의 발명자들은, 유럽 특허 제 0433225 호에 공표된 방법을 박테리아에 의해 생성되는 BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7에 적용할 경우에 원인은 알 수 없지만 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 이합체 단백질이 바람직하지 않게 낮은 수율로 생성됨을 밝혀내었다.
발명의 요약
비록 박테리아에 의해 생성될 경우 약간의 골 발육 촉진성 단백질이 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-8 과같은 이합체 단백질을 생산하지 못한다 하더라도, 이러한 단백질의 어떤 돌연변이 형태는 상기와 같은 단백질을 생산할 수 있음이 예기치않게 밝혀졌다. 또한, 비록 이러한 단백질의 야생형이 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 이형 이합체를 바람직하지 않게 낮은 수율로 생성하지만, 골 발육 촉진성 단백질의 어떤 돌연변이 형태는 본발명의 방법에 의해 증진된 수율과 우수한 양으로 BMP-2/5 이형 이합체 및 BMP-2/6 이형이합체와 같이 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 이형 이합체를 생산할 수 있다는 것이 예기치 않게 추가적으로 밝혀졌다.
따라서, 하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 BMP-4의 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 형태를 생산하기 위한 박테리아를 이용한 생성 발법에 유용한 BMP-4 의 돌연변이 형태를 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 BMP-2/5, BMP-2/6, BMP-2/7 및 BMP-2/8 이형 이합체의 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 형태를 생산하기 위한 박테리아를 이용한 생성 방법에 유용한 BMP-5, BMP-6, BMP-7 및 BMP-8 의 돌연변이 형태를 포함한다.
그 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 골 발육 촉진성 단백질의 상기 돌연변이 형태를 코오딩하는 DNA 서열을 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 증진된 재폴딩 특성을 가지는 골 발육 촉진성 단백질의 다른 돌연변이체를 얻는 방법과, 그리고 이러한 방법에 의해 수득되는 돌연변이 단백질을 포함한다.
서열의 간단한 설명
서열 ID 번호 : 1 은 BMP-2 를 코오딩하는 누클레오티드 서열이다.
서열 ID 번호 : 2 는 BMP-2 에 대한 아미노산 서열이다.
서열 ID 번호 : 3 은 BMP-4 를 코오딩하는 누클레오티드 서열이다.
서열 ID 번호 : 4 는 BMP-4 에 대한 아미노산 서열이다.
서열 ID 번호 : 5 는 BMP-5 를 코오딩하는 누클레오티드 서열이다.
서열 ID 번호 : 6 은 BMP-5 에 대한 아미노산 서열이다.
서열 ID 번호 : 7 은 BMP-6 을 코오딩하는 누클레오티드 서열이다.
서열 ID 번호 : 8 은 BMP-6 에 대한 아미노산 서열이다.
서열 ID 번호 : 9 는 BMP-7 를 코오딩하는 누클레오티드 서열이다.
서열 ID 번호 : 10 은 BMP-7 에 대한 아미노산 서열이다.
서열 ID 번호 : 11 은 BMP-8 을 코오딩하는 누클레오티드 서열이다.
서열 ID 번호 : 12 는 BMP-8 에 대한 아미노산 서열이다.
제 1 도는 BMP-2, 4, 5, 6, 7 및 8 의 서열을 비교한 도면이다.
본 발명에 따라, 재조합 골 발육 측진성 단백질-4 (BMP-4)(서열 ID 번호 : 3 및 4); BMP-5 (서열 ID 번호 : 5 및 6); BMP-6 (서열 ID 번호 : 7 및 8); BMP-7 (서열 ID 번호 : 9 및 10); 및 BMP-8 (서열 ID 번호 : 11 및 12)의 돌연변이 형태는 박테리아로 부터 BMP 단일 이합체 또는 이형 이합체의 대량 생성 및 생물학적으로 활성이 있는 이합체 분자로 재폴딩시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는, 107 잔기 (즉, 서열 ID 번호 : 3의 319 내지 321 누클레오티드) 인 글루탐산을 코오딩하는 3 개의 누클레오티드가 아스파르트산을 코오딩하는 3개의 누클레오티드로 치환 (예를들어, 돌연변이에 의해 통해 또는 인위적으로) 된 것을 제외하고는 BMP-4 를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, BMP-5 또는 BMP-6 (즉,서열 ID번호 : 5 또는 7 의 166 내지 168 누클레오티드) 의 56 잔기, 또는 BMP-7 (즉, 서열 ID 번호 : 9 의 187 내지 189 누클레오티드) 의 63 잔기인 알라닌을 코오딩하는 3 개의 누클레오티드가 히스티딘을 코오딩하는 3 개의 누클레오티드로 치환 (예를들어, 돌연변이에 의해 또는 합성하여) 된 것을 제외하고는 BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7을 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는, BMP-8 의 63 잔기 (즉, 서열 ID 번호 : 11 의 187 내지 189 누클레오티드) 인 세린을 코오딩하는 3 개의 누클레오티드가 히스티딘을 코오딩하는 3개의 누클레오티드로 치환 (예를들어, 돌연변이에 의해 또는 인위적으로) 된 것을 제외하고는 BMP-8를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자로 구성된다.
추가적으로, 본 발명은 107 잔기인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 것을 제외하고는 BMP-4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 정제된 조성물로 구성된다. 이 변형된 BMP-4 단백질은 BMP-4 (△107 Asp)로 명칭될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 BMP-5, BMP-6의 56 잔기, 또는 BMP-7의 63잔기인 아미노산 알라닌이 히스티딘으로 치환된것을 제외하고는 BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 정제된 조성물로 구성된다. 상기 변형된 BMP-5 단백질은 예를들어, BMP-5 (△56 His) 로 명칭될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 BMP-8 의 63 잔기인 아미노산 세련이 히스티딘으로 치환된 것을 제외하고는 BMP-8의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 정제된 조성물로 구성된다. 상기 변형된 BMP-8 단백질은 예를들어, BMP-8(△63 His) 로 명칭될 수 있다.
여기서 사용되는 바와같이, "상호 관계가 있는" 이라는 용어는 다음을 의미한다. BMP-2는 각각의 길이가 114 아미노산인 폴리펩티드 사슬의 이합체로 구성됨이 알려져 있다. 비슷하게, BMP-4는 각각의 116 아미노산인 폴리펩티드 사슬의 이합체로 구성되어 있다. BMP-5 및 BMP-6 각각은, 각사슬의 길이가 132 아미노산인 폴리펩티드 사슬의 이합체로 구성된다. BMP-7은 각각의 길이가 139 아미노산인 폴리펩티드 사슬의 이합체로 구성된다. BMP-8은 각각의 길이가 139 아미노산인 폴리펩티드 사슬의 이합체로 구성됨이 알려져 있다. 19 잔기(BMP-4의 21 잔기와 상호 관계가 있는)인 루이신 부터 114 잔기인 아르기닌 잔기까지의 BMP-2아미노산은 21 잔기인 루이신 부터 116 잔기인 아르기닌까지의 BMP-4아미노산과 상당히 유사하다. 비슷하게, BMP-2 의 루이신 19부터 BMP-2 의 아르기닌 114 까지의 BMP-2 아미노산은, BMP-5 및 BMP-6 의 루이신 36 부터 히스티딘 132 까지의 아미노산, 및 BMP-7 의 루이신 43 부터 히스티딘 139 까지의 아미노산, 그리고 BMP-8 의 루이신 43 부터 히스티딘 139 까지의 아미노산과 상당히 유사하다. 따라서, BMP-2 의 19 잔기인 루이신은, BMP-4 의 21 잔기, 그리고 BMP-5 및 BMP-6 의 36 잔기, 그리고 BMP-7 의43 잔기, 그리고 BMP-8 의 43 잔기와 상호 관계가 있다고 말한다. 비슷하게, BMP-2 의 105 잔기인 아스파르트산은 BMP-4 의 107 잔기인 글루탐산과 상호 관계가 있다고 말하고, 그리고 BMP-2 의 39 잔기인 히스티딘은 BMP-5 및 BMP-6 의 56 잔기인 알라닌 및 BMP-7의 63 잔기인 알라닌, 그리고 BMP-8 의 63 잔기인 세린과 상호 관계가 있다고 말한다. 또 다르게는, TGF-β 의 112 아미노산 서열이 상호 관계가 있는 아미노산을 정하기 위한 기준점으로 사용될 수 있다.
제 1 도를 살펴봄으로써, BMP-2 및 BMP-4 가 첫번째 시스테인(BMP-2 의 14 잔기; 상호 관계가 있는 BMP-4 의 16 잔기) 을 시점으로 하여 상당한 유사성이 있다. 단지 상호 관계가 있는 8 개의 잔기만이 다르다. 이들은 각기, BMP-2 의 15, 39, 46, 73, 95, 96 및 105 잔기이다. 그렇지만, 출원인은, 수용할 수 있는 양으로 BMP-2를 재폴딩하는데 효과적인 유럽 특허 제 0433225 호에 공표된 방법이 박테리아에 의해 생성되는 BMP-4 에 적용될 경우에 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 이합체 단백질이 바람직하지 않게 낮은 수율로 생성된다는 사실을 발견하였다. 출원인은 이러한 잔기의 첫번째 4 개 (N-말단) 가 상기 BMP-2 잔기와 비슷하고, 반면에 이러한 잔기의 마지막 4 개 (C-말단) 는 상호 관계가 있는 BMP-4 잔기 ("BMP-2/BMP-4" 로 칭함) 와 비슷한 분자를 구축하였다. 실시예 2에 기재된 바와같이, 출원인은 BMP-4/BMP-2 는 우수한 양으로 재폴딩되지만, BMP-2/BMP-4 는 그렇지 않다는 것을 발견하였다.
본 발명은 BMP-4 를 코오딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다. 여기서, 적어도 107 잔기인 글루탐산 아미노산을 코오딩하는 누클레오티드 서열이아스파르트산을 코오딩하는 BMP-2 의 상호 관개가 있는 누클레이티드 서열로 치환된다. 게다가, 107 의 글루탐산 잔기가 서열이 BMP-2 의 상호 관계가 있는 아스파르트산 잔기로 치환되는 한, 치환BMP-4 의 다른 누클레오티드 서열이 BMP-2의 상호 관계가 있는 누클레오티드 서열로 치환될 수 있음을 생각할 수 있다. 이러한 DNA 분자는 가공적(chimeric) 일 수 있다. 즉, BMP-2 코오딩 서열 및 BMP-4 코오딩 서열 부분이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 알려진 손쉬운 방법을 통해 서로 연결될 수 있다. 또 다르게는, 이러한 DNA 분자는 화학적 방법과 같은 합성에 의해 또는 돌연변이를 통해 구축될 수 있다. 일단 형성된 DNA 분자는 그 기술 분야에서 알려진 방법들을 통해 그 자체끼리 (단일이합체) 또는 BMP 족의 다른 구성원 끼리( 이형이합체) 이합체를 형성할 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 BMP-5, BMP-6, BMP-7, 또는 BMP-8 을 코오딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다. 여기서, BMP-5 또는 BMP-6의 56 잔기, 또는 BMP-7 또는 BMP-8 의 63 잔기인 알라닌 아미노산을 코오딩하는 누클레오티드 서열을 BMP-2 의 상호 관계가 있는 누클레오티드 서열로 치환한다. 게다가, BMP-8 의 56 위치인 알라닌 잔기 (BMP-7 의 63), 또는 63 위치의 세린 잔기가 BMP-2 의 상호관계가 있는 히스티딘 잔기로 치환되는한, BMP-5, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-8의 다른 누클레오티드 서열이 BMP-2 의 상호 관계가 있는 누클레오티드 서열로 치환될 수 있음을 생각할 수 있다. 이러한 DNA 분자는 가공적일 수 있다. 즉, BMP-2 코오딩 서열 및 BMP-5, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-8 은 코오딩 서열 부분이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 알려진 손쉬운 방법을 통해 서로 연결될수 있다. 또 다르게는, 이러한 DNA 분자는 화학적 방법과 같은 합성에 의해 또는 돌연변이를 통해 구측될 수 있다. 일단 형성된 DNA 분자는 그 기술 분야에서 알려진 방법들을 통해 이합체화될 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 증진된 재폴딩 특성을 가지는 골 발육 촉진성 단백질 (BMP)의 다른 돌연변이체를 얻는 방법과, 그리고 이러한 방법에의해 수득되는 돌연변이 단백질을 포함한다. 이러한 방법은, 첫째 여기에 기재된 재폴딩 방법을 사용할시에 잘 재폴딩되는 것으로 알려진 BMP의 아미노산 서열 (BMP+)과 이러한 방법을 사용할시에 잘 재폴딩되지 않는 BMP 의 아미노산 서열 (BMP-) 을 비교하고, 상호 관계가 있는 아미노산 위치의 차이를 결정하는 것을 포함한다. 다음에, BMP-의 아미노산 서열이, BMP+의 상호 관계가 있는 아미노산과 다른 하나 이상의 아미노산이 BMP+의 상호 관계가 있는 아미노산으로 치환되도록 변경된다. 예를들어, 이러한 변형된 아미노산은, 1개 이상의 누클레이티드에 있어서의 돌연변이 발생에 의하여 또는 DNA 서열이 변형된 BMP-단백질을 발현시킬 수 있도록 BMP 에 대한 아미노산 서열을 코오딩하는 DNA 서열에서의 치환에 의하여 형성될 수 있다.
다음에, 상기 변형된 BMP-단백질의 재폴딩 능력을 테스트한다. 이러한 방법은, 재폴딩에 있어서의 차이에 중요한 그러한 아미노산 잔기를 확인하기 위해, BMP+ 및 BMP-의 서열이 다른 각각의 아미노산 위치에서 반복적으로 실시할 수 있다. 더군다나, BMP-아미노산 서열의 많은 변경은, 변형된 BMP-단백질의 재폴딩을 추가적으로 증진시킬수있도록 아미노산 잔기를 BMP+유래의 상호관계가 있는 아미노산으로 치환을 이룰수 있다. 이러한 변형 역시 BMP-단백질, 그리고 이를 코오딩하는 DNA 서열 또한 본 발명의 범위내이다.
단백질 및 핵산의 돌연변이 유발 방법은 알려져 있다. 예를들어, 문헌 "Sanbrook etal.,Molecular cloning : A Laboratory Manual,2nd ed. (Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1990)"에 알려져 있다. 추가해서, 주어진 아미노산 잔기를 코오딩하는 하나 이상의 3 누클레오티드가 존재할 수 있다는 것이 알려져 있다. 예를들어, 히스티딘 잔기는 CAT 또는 CAC 에 의해 코오딩 될 수 있으며, 아스파르트산 잔기는 GAT 또는 GAC 에 의해 코오딩 될 수 있다. 문헌 " Lehninger,Biochemistry,(Worth Publishers, N.Y., N.Y.)" 을 참조.
어떠한 박테리아 종이라도 본 발명의 방법으로 재폴딩하기 위한 재조합 BMP를 생산하는데 이용할 수 있다. 바람직하게는, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus Subtilis) 가 BMP를 포함하는 봉입체를 생산하는데 이용된다. 보다 바람직하게는, 슈도모나스 (Pseudomonas)가 본 발명의 방법으로 재폴딩하기 위한 BMP 함유 봉입체를 생산하는데 이용된다.
가장 바람직하게는 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 가 본 발명의 방법으로 재폴딩하기 위한 BMP 함유 봉입체를 생산하는데 이용된다.
이. 콜리 (E. coli) 에 속하는 균주가 이형단백질을 발현할 수 있는한, 이러한 균주는 본 발명의 방법으로 재폴딩하기 위한 BMP를 생산하는데 이용될 수 있다. 하나의 바람직한 균주로, 이. 콜리 균주인 GI 724 (A.T.C.C. 수탁번호 55151) 가 본 발명의 방법으로 재폴딩 하기위한 BMP를 생산하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 BMP 의 돌연변이 형태는 알려진 방법을 사용하여 박테리아내에서 생성될 수 있다. 박테리아 발현을 최적화 하기위해, BMP 의 돌연변이 형태의 N -말단 서열을 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 예를들어, 포르밀 -메티오닌과 글루타민사이 결합의 분열이 이. 콜리에서 비효율적이기 때문에, 천연의 성숙 BMP-2 단백질의 N -말단 (Met-gln-ala-lys)은, 이. 콜리내에서 BMP-2 생성에 보다 적합한 N -말단 (Met-ala-lys-his)을 생산하기 위해 글루타민 잔기의 제거를 통해 변형된다. 다른 박테리아 종은, 그 박테리아 종으로부터 획득되는 BMP 돌연변이체의 수율을 극대화하기 위해 유사한 변형을 필요로 할 수 있다. 이러한 변형은 본 발명 속한 기술분야에서 통상의 기술수준에 있는 자에게 잘 알려져 있다. BMP-4를 코오딩하는 서열 ID 번호 : 3 ; BMP-5를 코오딩하는 서열 ID 번호 : 5 ; BMP-6을 코오딩 하는 서열 ID 번호 : 7 ; BMP-7을 코오딩하는 서열 ID 번호 : 9, 또는 BMP-8을 코오딩하는 서열 ID 번호 : 11 의 변형 또는 비변형된 누클레오티드 서열을, 박테리아내에서 그러한 이형 단백질의 발현 및 형질전환에 적합한 플라스미드내로 삽입될 수 있다. 박테리아발현 플라스미드가 선택된 박테리아내에서 BMP 와 같은 이형 단백질의 발현을 조작할 수 있는한, 그 종류에는 상관없이 이용될 수 있다. 선택가능한 박테리아 종에는 비. 서브틸리스, 슈도모나스 (Pseudomonas) 에 속하는 종, 그리고 이. 콜리 가 포함된다.
이러한 종 각각에 대한 적합한 플라스미드가 당기술분야에 알려져있다. 박테리아내에서 BMP 의 생성을 위하여, 적합한 벡터가 문헌 "Taniguchi et al., PNAS : USA, 77:5230 ∼ 5233 (1980)" 에 기술되어 있다.
박테리아 발현 플라스미드는 통상의 방법을 이용하여 컴피텐트 박테리아 세로내로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환체는, 항생제 저항성이 선택력으로 사용될때 적절한 항생제를 포함하는 배지상에서의 성장, 또는 영양요구성이 선택력으로 사용될때 적절한 영양분이 결핍된 배지상에서의 성장을 통해 선택된다. 이형단백질의 발현은 통상의 방법을 이용하여 최적화될 수 있다. 이렇게 해서 수득된 BMP 는 파쇄되고 원심분리된 세포의 팰럿내에서 발견될 수 있는 불용성이며, 굴절성이 있는 봉입체내에 존재할 것이다.
그 다음, 이렇게 해서 수득된 봉입체는 변성제를 이용하여 용해시키거나, 또는 아세트산이나 트리플루오르 아세트산을 통한 산성화에 의해 용해된다. 변성제를 이용하여 용해되면, β - 머캅토에탄올이나 디티오트레이톨과 같은 환원제가 상기 변성제와 함께 첨가된다. 단백질이 산성화에 의해 용해될 경우에, 단백질은 산성화되기 전에 환원되어야 한다.
상기 용해된 이형 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 교환 크로마토그래피, 또는 역상 고수행 액체 크로마토그래피와 같은 통상의 크로마토그래피 방법을 이용하여 추가적으로 정제할 수 있다.
그 다음, BMP 함유 용액을 크로마토그래피 버퍼를 제거하기 위해 부피를 감소시키거나 또는 진공건조 시키고, 1 ∼ 100 ㎍/ml 농도의 단백질을 얻기 위하여 배지 [적절한 배지는 50 mM Tris, 1.0 M Nacl, 2 % 3 - (3 - 클로올아미도프로필) 디메틸 암모니오 - 1 - 프로판 - 황산염(CHAPS), 5mM EDTA, 2mM 글루아티티온 (환원) 1mM 글루타티온 (산화) ; 약 8.5 정도의 pH ; 재용해에 적합할 수 있는 이외의 배지는 명세서상의 다른 곳에서 기술된 또 다른 종류의 재폴딩 버퍼를 포함한다 (예를들어, 구아니딘, 요소, 아르기닌)]내에서 재용해시킨다. 예를들어, 1 mg/ml까지의 보다 고농도의 단백질이 본발명에 따라 재폴딩될 수 있으나, 침전물 또는 응집물이 100 ㎍/ml이상의 단백질 농도에서 존재하며, 그리고 활성 BMP 단일이합체 또는 이형이합체의 수율은 상기에 따라서 감소될 수 있다. 이형이합체 생성을 위하여, 상술한 절차가 동등한 양의 2개 플라스미드를 이용하여 수행되는데, 2개 플라스미드 각각은 구별되는 BMP의 암호 서열을 포함한다 (예를들어, BMP-2를 코오딩하는 pALBP2, 그리고 BMP-X (여기서, X는 5, 6, 7 또는 8임)를 코오딩하는 pALBPX). 플라스미드는 분리해서 배양되고, 그리고 결과로서 생겨나는 봉입체는 여기에 기재된 방법에 따라 용해되고 재폴딩된다. 재폴딩된 단백질 단량체는 동등한 비율로 서로 혼합되고, 전술한 바와같이 처리된다. 이형이합체를 위해서, 배지는 재폴딩 버퍼로 CHAPS를 사용한다. 결과로서 생겨나는 이합체 단백질이 BMP-2/X 의 이형 단백질 뿐만 아니라 BMP-2의 단일 이합체를 포함하는 것이 관찰된다. 이러한 종들은 당업계에 알려진 결과를 통하여 서로를 분리해낼 수 있다. BMP 이형 이합체의 생성은, 본원 발명의 참고 문헌으로 포함되어 있는 공개문헌인 제 WO 93/09229호에 보다 상세히 기재되어 있다.
단백질을 재폴딩하기 위하여, 다음의 조건 및 배지가 사용될 수 있다 : 50 mM Tris, 1.0M Nacl, 2% 3 - (3 - 클로올아미도 - 프로필) 디메틸 암모니오 - 1 - 프로판 - 황산염 (CHAPS), 5mM EDTA, 2mM 글루아타티온 (환원) 1mM 글루타티온 (산화) ;약 8.5정도의 pH. 약간 변형된 것으로, 예를들어 디지토닌과 같은 비 -이온성 세제, 또는 3- (3 -클로올아미도프로필) 디메틸암모니오 - 1 - 프로판 - 술폰산염 (CHAPSO) 이나 N-옥틸 글루코시드와 같은 양이온성 세제를 포함하는 다른 세제가 본 발명에 이용될 수 있다. 당 기술분야의 당업자라면, 상기의 조건 및 배지가, 예를들어 아래에 기술하는 바와같이, 바뀔수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 변경 및 변형은 본 발명의 범위내이다. BMP는 활성 상태에서 이황화 결합이 되어 있기 때문에, 본 발명의 방법에서는 티올/이황화 결합의 형성을 가능케 하는 산화환원 시스템을 포함하는 것이 유용하다. 이러한 산화환원 시스템의 여러개가 알려져 있다. 예를들어, 글루타티온, 디티오트레이톨, β -머캅토에탄올, β -머캅토메탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 형태가, 환원제 대 산화제의 비율이 악 1:10 ∼약 2:1 범위에서 산화환원 시스템으로 사용될 수 있다. 글루타티온 산화환원 시스템이 사용될 때, 환원 글루타티온 대 산화 글루타티온의 비율은 0.5 대 5 가 바람직하며 ; 1 대 1 이 보다 바람직하며 ; 2 대 1 이 가장 바람직하다.
추가적인 변형으로 요소, 구아니딘, 아르기닌과 같은 다른 재폴딩제 및 다른 재폴딩 수단이, 본 발명의 돌변변이체로 정확히 재폴딩된 단백질을 생산하기 위하여 이용될 수 있다.
일반적으로, 변성 촉진제가 1 ∼ 9M 범위의 농도로 사용된다. 요소가 재폴딩제일 경우에, 약 0.1M ∼ 3M 범위의 농도로 존재하는 것이 바람직하며, 약 0.5M ∼ 2.5M 또는 약 1.0M ∼ 2.0M 농도가 보다 바람직하다. 구아니딘 염화수소가 재폴딩제로 사용될 경우에, 초기에 고농도로, 예를들어 7 ∼ 8M 농도로 첨가하고, 그 다음에 구아니딘 농도를 재폴딩을 유발할 수 있도록 감소시키는 것이 바람직하다. 구아니딘 농도의 감소는 희석에 의해 순간적으로, 또는 투석에 의해 점진적으로 일어날 수 있다. 바람직하게는, 구아니딘 농도는 최종농도가 약 1.5M 미만, 또는 보다 바람직하게는 약 1M 미만으로 감소된다. 구아니딘 농도가 점진적으로 감소될 때, 구아니딘은 재폴딩된 단백질로부터 완전하게 제거될 수 있다. 구아니딘의 희석은 투석보다 바람직하다. 아르기닌이 재폴딩제로 사용될때, 아르기닌은 약 0.4M ∼ 1.5M 의 농도로 존재하는 것이 바람직하며, 약 0.6M ∼ 1.25M, 또는 약 0.6M ∼ 1.0M의 농도로 존재하는 것이보다 바람직하다.
재폴딩제에 부가하여, 본 발명의 방법은 염의 일부를 사용할 수 있다. CHAPS 와 같은 세제가 사용될때, 염의 일부는 염화나트륨이 바람직하고, 약 0.5 ∼ 2.0 M 의 농도가 바람직하며, 약 1.0M 의 농도가 바람직하다. 요소가 재폴딩제일 경우에, 염의 일부는 염화나트륨이 바람직하며, 약 0.25M ∼ 2M 의 농도가 바람직하다. 보다 바람직하게는, 요소가 재폴딩제일 때 염화나트륨은 약 0.5M ∼ 1.5M 범위의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게는, 요소가 재폴딩제일 때, 염화나트륨이 약 0.75M ∼ 1.25M 범위의 농도로 존재한다. 구아니딘이 재폴딩제로 사용될때, 염화나트륨의 농도는 구아니딘 농도가 증가함에 따라 증가되어야 한다. 예를들어 0.2M 구아니딘에서 재폴딩하기 위해서는, 최적의 염화나트륨 농도의 범위가 0.25 ∼ 0.5M 이며,반면에 1.0M 구아니딘에서 재폴딩하기 위해서는, 최적의 재폴딩을 위해 1.0 ∼ 2.0 M 의 염화나트륨이 필요하다.
요소가 재폴딩제일 때, 본 발명의 재폴딩 반응 pH는 약 7.5 ∼ 11 이 바람직하며 ; 보다 바람직하게는 약 8.5 ∼ 10.5이다. CHAPS 와 같은 세제가 재폴딩제로 사용될 때, 바람직한 pH 는 약 8.5 이다.
구아니딘이 재폴딩제로 사용될 때, pH 는 약 7.5 ∼ 9.5 가 바람직하고 ; 약 8.5 가 보다 바람직하며 ; 그리고 약 9.5 가 가장 바람직하다.
아르기닌이 재폴딩제로 사용될 때, pH 는 약 8 ∼ 10 이 바람직하고 ; 약 8.5 ∼ 10 이 보다 바람직하며 ; 그리고 약 9.5 ∼ 10 이 가장 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 재폴딩 반응은 약 4℃ ∼ 23℃ 범위의 온도에서 수행된다. 보다 바람직하게는, 재폴딩 반응은 4℃에서 수행된다. 본 발명의 재폴딩 반응은 완성될때까지 계속 진행되는 것이 가능하며, 바람직하게는 약 16 시간 정도이다.
수득된 골발육 촉진성 단백질의 재폴딩 정도는, 비환원 및 환원조건하에서 나트륨 도데실 황산염 - 폴리아크릴아미드 전기염동 (SDS-PAGE)를 통해 추적된다. BMP-4 단일이합체는, 비환원 조건하의 16% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 약 30kD의 밴드로 나타날 것이다 ; 그리고 BMP-4 단량체는 환원 조건하에서 약 13kD 의 밴드로 나타난다. BMP-2/5 이형이합체는 비환원 조건하의 16% SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 약 35kD의 밴드로 나타날 것이며 ; BMP-2 단량체는 환원 조건하에서 약 13kD의 밴드로 나타나며 ; 그리고 BMP-5 단량체는 환원 조건하에서 약 15kD의 밴드로 나타난다. BMP-2/6 이형이합체는 비환원 조건하의 16% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 약 35kD 의 밴드로 나타날 것이며; BMP-2 단량체는 환원조건하에서 약 13kD 의 밴드로 나타나며 ; 그리고 BMP-6 단량체는 환원 조건하에서 약 15kD 의 밴드로 나타난다. BMP-2/7 이형이합체는 비환원 조건하의 16% SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 약 35kD의 밴드로 나타날 것이며 ; BMF-2 단량체는 환원 조건하에서 약 13kD 의 밴드로 나타나며 ; 그리고 BMP-7 단량체는 환원 조건하에서 약 15kD의 밴드로 나타난다.
재폴딩된 골발육 촉진성 단백질의 생체외 생물학적 활성은, 실시예 9 에 설명된 W-20 분석법에 의해 추적된다. 표식세포라인으로 W-20-17 골수기질세포의 사용은, 이러한 세포가 BMP의 처리후에 골아 세포유형의 세포로 전환되는 것에 기초를 둔다 [R. S. Thies etal., Journal of Bone and Mineral Research5(2): 305 (1990) ; 및 R. S. Thies etal., Endocrinology130: 1318 ∼ 1324 (1992)]. W-20-17 세포는 메사츄세츄, 보스톤소재의 아동병원내 Dr. D. Nathan 의 실험실에서 연구자들에 의해 클론된 성장한 생쥐로부터 유래된 골수 기질 세포 라인이다. BMP 로 W-20-17 세포를 처리하면, (1) 알칼리 포스주타제 생성이 증가되고, (2) cAMP 에 자극되는 부갑상선 호르몬의 유도, 그리고 (3) 세포에 의한 오스테모칼신 (osteocalcin) 합성이 유도된다. (1) 및 (2) 가 골아세포 표현형과 연결된 특성을 나타내는 반면에, 오스테오칼신을 합성하는 능력은 성숙된 골아세포에 의해서만 나타나는 표현형 특성이다.
더군다나, 현재까지 W-20-17 기질세포의 골아세포 유형 세포로의 전환은 단지 골발육 촉진성 단백질의 처리만을 통해 관찰되어 왔다. 재폴딩된 골 발육 촉진성 단백질의 생체외 생물학적 활성은, 실시예 10 에 설명된 것으로, 여기서는 " Rosen-변형 Sampath-Reddi 분석 " 으로 칭하는 분석으로, 문헌 "Sampath and Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 6591-6595 (1983) "에 기재되어 있는 래트 골 형성 분석의 변형판에 의해 추적된다.
실시예 1
CHAPS 시스템을 이용한 BMP-4 의 재폴딩
-80℃ 에 저장된 세포 1.0g 을 측정한다. 용액 (3.4 ml 100 mM Tris, 10mM EDTA, pH 8.5)을 첨가한다. 상기 용액을 세포가 잘 현탁될때까지 와동시킨다. 이소프로판올내 100mM PMSF 40㎕를 첨가한다. 세포를 후렌치 프레셔셀 (French pressure cell)내에서 1000 psi 로 파쇄시킨다. 봉입체는, 팰럿을 형성하기 위해 에펜도프 (Eppendorf) 원심분리기로 20 분 동안, 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 옮긴다. 하나의 팰럿 (전체 4 개 중에서) 에, pH 8.5이고 250 mM DTT를 함유하며 가스가 제거된 8.0 M 구아니딘 염화수소, 0.5 M 트리스, 5mM EDTA를 포함하는 용액 1.0 ml를 첨가한다. 상기 팰럿을 용해시키고, 아르곤을 30 초 동안 액체상에 주입한다. 다음, 상기 용액을 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이트 (incubate) 시킨다. 불용성 물질은, 23℃에서 에펜도프 원심분리기를 통해 2 ∼ 3 분 동안에 펠렛으로 된다. 0.5 ∼ 1.0 ml 의 상층액은 수펠코 (Supelco) 2cm 보호카트리지 (LC-304) 상에 주입시키고, 그리고 35 분 이상, 0.1 % TFA에서 1 ∼ 70 % 의 아세토니트릴 농도구배로 용출한다. BMP-4 는 30 분 내지 32 분 사이에서 용출된다. 분획을 한데모으고, 단백질 농도를 A280 대 0.1 % TFA를 통해 결정하는데, 이때 아미노산 함량에 기초한 이론 흡광계수를 이용한다.
BMP-4 풀의 충분한 양을 10 ㎍ 의 단백질을 제공하기 위해 냉동 건조시킨다. 잔여물을 재용해 시키기 위해 유리 증류수 5㎕를 첨가한후, 다음에 재폴딩 혼합액 (트리스, 염, CHAPS 등) 100 ㎕을 첨가한다. 상기 용액을 부드럽게 혼합하고 23℃ 에서 1 ∼ 4 일간 저장한다. 이합체 형성은, 2.5 시간 동안 125 볼트에서 노벡스사 16% 트리신 겔 상에서 정제수의 유동을 통해 평가되고, 이어서 코마시에 블루 (Coomassie Blue) 염색 및 탈색시킨다.
실시예 2
다른 BMP 이합체의 재폴딩
제 1 도를 살펴봄으로써, BMP-2 및 BMP-4가 첫번째 시스테인(BMP-2의 14잔기 ; BMP-4의 상호관계가 있는 16 잔기)를 시점으로 하여 상당히 유사하다는 것을 알 수 있다. 단지 8 개의 상호관계가 있는 잔기가 다를 뿐이다. 이러한 것은 각각 BMP-2의 15, 39, 46, 73, 96, 96 및 105 잔기에서 이다.
그렇지만, 출원인은, 수용할 수 있는 양으로 BMP-2 를 재폴딩하는데 효과적인 유럽 특허 제 0433225호에 공표된 방법이 박테리아에 의해 생성되는 BMP-4에 적용될 경우에 정확히 폴딩되고, 생물학적으로 활성이 있는 이합체 단백질이 바람직하지 않게 낮은 수율로 생성된다는 사실을 발견하였다. 출원인은 이러한 잔기의 첫번째 4 개 (N-말단) 가 상기 BMP-2 잔기와 비슷하고, 반면에 이러한 잔기의 마지막 4 개 (C-말단) 는 상호 관계가 있 BMP-4 잔기 ("BMP-2/BMP-4"로 칭함)와 비슷한 분자를 구축하였다. 또한, 출원인은 이러한 잔기의 N-말단 4 개가 BMP-4 와 비슷하고, 반면에 이러한 잔기의 C-말단 4개가 BMP-4 잔기 ("BMP-4/BMP-2") 와 비슷한 분자를 구축하였다.
이러한 분자들을 상기 야생형의 BMP-4에 대해 기술한 바와같이 처리하였다. 겔에서 적절한 대조 단백질이 함께 유동되었다 (예를들어, 야생형 BMP-4 다음에 BMP-4 돌연변이체 ; BMP-2 및 BMP-5(△56 His) 에 대한 대조구로서 함께 섞인 BMP-2 및 야생형 BMP-5)
야생형 BMP-4는 재폴딩이 잘되지 않았다. BMP-4/BMP-2 가 우수한 수율로 재폴딩되는 반면에, BMP-2/BMP-4 는 그렇지 못하다. BMP-4 (△107 Asp) 단일 이합체는 야생형 BMP-4에 비하여 우수한 양으로 재폴딩 된다.
BMP-2/BMP-5 이형이합체는 재폴딩이 잘되지 않는다. BMP2/BMP5(△39 His) 이형이합체는 BMP-2/BMP-5에 비하여 우수한 양으로 재폴딩된다.
BMP-2/BMP-6 이형이합체는 재폴딩이 잘되지 않는다. BMP2/BMP5(△39 His) 이형이합체는 BMP-2/BMP-6에 비하여 우수한 양으로 재폴딩된다.
실시예 3
이. 콜리에서 BMP 의 발현
다음의 주요 특징을 포함하는 발현벡터 pALBP 2-782를 이. 콜리에서 BMP-2의 생성을 위해 구축하였다. 누클레오티드 1 ∼ 2060 은, 숙주세포 균주에 항생제인 암피실린에 대한 내성을 제공하는 β - 락타마제에 대한 유전자, 및 colEl -유래 복제기점을 포함하는 서열을 포함하는 플라스미드 pUC-18 [Norrander et al., Gene26: 101 - 106 (1983)]으로부터 유래하는 DNA 서열을 포함한다. 누클레오티드 2061 - 2221 은, 3 개의 작동자 서열 OL1, OL2 및 OL3를 함유하는 박테리오파아지 λ[Sanger etal., J. Mol. Biol.162; 729 - 773 (1982)] 의 좌방향 주 프로모터 (pL) 에 대한 DNA 5 서열을 포함한다. 작동자는 λcI 억제 단백질에 대한 결합위치며, 상기 λcI 억제 단백질의 세포내 수준은 pL 로부터의 전사 개시량을 조절한다. 누클레오티드 2222 - 2723은, 문헌 " Sanger etal., J. Mol. Biol.162; 729 - 773 (1982) 에 기재된 바와같은 박테리오 파아지 람다로부터 유래된 서열 누클레오티드 35566 내지 35472 및 38137 내3l 38361 사이41 포함된 강한 리보좀 결합 서열을 포함한다.
누클레오리드 2724-3133 은, 3' - 비해독서열의 부가적인 62 누클레오티드와 함께 성숙 BMP-2 단백질을 암호하는 DNA 서열을 포함한다. 누클레오티드 3134 - 3149 는, 제한엔도누클레아제 (endonuclease) 자리를 포함하는 "링커 " DNA 서열을 제공한다. 누클레오티드 3150 - 3218 은 이. 콜리aspA 유전자의 전자 종결 서열에 기초한 전사종결서열을 제공한다 [Takagi et al., Natl. Acids Res. 13:2063-2074 (1985)] 뉴클레오티드 3219-3623 은 pUC-18에서 유래된 DNA 서열이다. 당분야에서 알려진 제한 엔도뉴칼레오티드 및 방법을 이용하여, pALBP2-781 내 함유된 BMP-2 의 코딩서열을 이.콜리에서 생성되도록 의도된 다른 BMP를 코딩하는 서열로 쉽게 대체할 수 있다. pALB2-781 플라스미드에서의 이러한 치환과 함께, 다음의 실시예들의 본 발명의 모든 BMP 들을 발현시키고 재폴딩하는데 사용될 수 있다. 플라스미드 pALBP2-781 은 이. 콜리 숙주세포균주인 GI724 (F,lacI q,lacp L8, ampC::λcI+) 내로, " Dagert and Ehrlich, Gene6:23(1979) " 의 절차에 의해 형질전환되었다. GI 724 (ATCC 수탁번호 55151) 는ampC지점에서 염색체내로 안정하게 통합되어진 야생형λcI 억제인자 유전자의 복제를 포함하는데, 이는 살모넬라 티피뮤리움 (Samonella typhimurim) 의trp프로모터/작동자 서열의 전사조절하에 놓여져 왔다. GI724 에서, λCI 단백질은, 상기 기재된 IMC 와 같은 카자미노산 (casamino acid) 으로 보충된 최소배지나 최소배지와 같은 트립토판 -결핍 배지에서 성장하는 동안에만 제조된다. GI 724 배양에 트립토판을 첨가하면,trp프로모터가 억제되고 λCI 의 합성이 차단될것이며, pL 프로모터가 세포내에 존재한다면, 점차적으로 pL 프로모터로부터 전자의 유도가 초래될 것이다. 형질전환체는 IMC 배지를 포함하는 1.5% w/v 한천 플레이트상에서 선별된다. IMC 배지는 M9 배지[Miller. " Experiment in Molecular Genetics, " Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] 로 구성되며, 1mM MgSO4, 0.5% w/v 글루코스, 0.2% w/v 카자미노산 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된다. 그리고 pALBP2-781 로 형질전환된 GI724 는, 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 IMC 배지에서 A550값이 0.5 가 되도록 37℃ 에서 성장되었다. 다음에 트립토판을 최종농도 100 ㎍/ml 로 첨가하고, 배양액을 암피실린 함유 배지상에서 4 시간더 배양하였다. 이시간 동안에 BMP 단백질이 전체 세포 단백질의 대략 10%까지 축적되며, 이들 모두는 "봉입체" 분획내에존재한다.
상기 기술된 바와같은 이. 콜리 형질전환체로부터 수득된 냉동 세포 팰럿 9g을 TE 8.3 (100:10) 버퍼 (100mM Tris-HCl pH8.3, 10mM Na2EDTA, 1mM 페닐메틸설포닐 플로라이드 [PMSF]) 30 ml 에 녹였다. 세포를 마이크로플루이다이저TM[모델 # MCF 100T]을 통한 3회의 이송으로 파쇄하였다. 상기 파쇄물을 TE 8.3 100:10 버퍼로 약 120 ml 로 희석하였다. 봉입체 물질의 팰럿을 15,000 × g에서의 원심분리를 통해 획득하였다. 상층액을 옮기고, 봉입체 물질을 1% Triton-X100 을 포함하는 TE 8.3 (100:10) 50 ml 에 현탁시켰다. 재현탁된 봉입체를 15,000 ×g에서 10 분 동안 원심 분리하고, 그리고 상층액을 다른 곳으로 옮겼다. 팰럿을 1% 디티오트리에톨 (DTT)를 함유하는 TE 8.3 (20 : 1) 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH8.3, 1mM Na2EDTA, 1mM PMSF) 에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 Wheaton 유리 균일화기로 균일화 시킨후에, 빙초산으로 pH 2.5로 산성화시키고, 그 다음 15,000 × g에서 25 분간 원심 분리하였다. 이러한 원심분리로부터 상층액을 모으고, 20 ml 인크리멘트 (Increment) 로 세파로즈 S-100TM크기 배제 칼럼 (83cm × 2.6cm ;욕조) 상에서 크로마토그래피를 하였다. 상기 세파로스 S-100TM칼럼은 1.4 ml/분의 유속으로 1% 아세트산의 이동상으로 유동되었다. BMP-2단량체에 해당되는 분획이 280 nm 의 흡광도에 의해 검출되었으며, 그리고 컴퓨터를 이용하여 18200M-1cm-1의 흡광계수 및 분자량 (12777달톤)을 계산하였다. 이러한 크기배제 칼럼으로 함께 모아진 물질은 재폴딩반응을 위한 출발물질로 사용되었다.
또 다르게는, 세포를 상기와 같이 파쇄하였지만, 초기의 봉입체 물질 팰럿을 100 mM DTT를 포함하는 8M 구아니딘 - HCl, TE 8.5 (100 :10) 버퍼 (100mM Tris-HCl pH 8.5, 10mM Na2EDTA) 에 용해시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트 시켰다. 이러한 물질을 실온에서 15분간 12,000 × g 로 원심분리하였다. 상층액을 C4 분석 RP-HPLC(역상 - 고수행 액체 크로마토그래피) 칼럼 (Vydac 214TP54) 상에 주입하고 1% B 버퍼 (A 버퍼 - 0.1 % 트리플루오르아세트산, B-버퍼=95% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오르 아세트산 [TFA]) 로 평행시켰으며, 유속은 1ml/분이었다. 5분후에, 1% ∼ 70% 사이의 B 버퍼 (A 버퍼로 희석) 선형 농도 구배가, 단백질이 용출되는 시간인 35 분 이상 유동되었다. 단백질은 280 nm 의 흡광도로 추적했다. BMP-2 분획피크 (25분 ∼ 35분 사이에 용출)를 한데 모았다. 그 농도를 280 nm 에서의 흡광도로 정했으며, 그리고 컴퓨터를 사용하여 상기 나타낸 바와같이 흡광계수 및 분자량을 계산했다. 이러한 RP-HPLC C4 칼럼으로 모아진 물질은 또한 재폴딩 반응을 위한 출발물질로 이용되었다.
실시예 4
요소 / 염화나트륨에서 이. 콜리 생성 BMP-2 의 재폴딩
1% 아세트산내 또는 0.1% TFA, 30 ∼ 40% 아세토니트릴을 포함하는 역상 버퍼내 BMP-2 단백질을 고속 진공기를 이용하여 건조시키거나, 부피를 감소시키고, 0.01 % TFA 수 ㎕ 로 재용해 시키고, 5 분 ∼ 10 분동안 완전히 용해되도록 하였다. 8M 요소, 100 mM 2 - (N - 시클로헥실아미노) -에탄술폰산 [CHES] pH 9.5, 5mM EDTA를 포함하는 버퍼를 TFA내 BMP-2에 첨가하고, 희석전에 실온 (RT, 대략 23℃)에서 20 분간 배양케 하였다. 사용된 단백질 농도는, 희석된 상태에서 최종 BMP-2 농도가 10 ∼ 100 ㎍/ml 이 되도록 하는 그러한 값이다. 폴딩 버퍼의 최종 조건은, 100 mM CHES, 5mM EDTA, 및 사용된 요소 농도에 대한 바람직한 염농도를 포함하고 있다. 요소, 염화나트륨, pH 및 산화환원 조건의 여러 범위가 BMP-2 재폴딩 조건을 최적화하기 위해 테스트되었다.
요소/염화나트륨에서 이. 콜리 생성 BMP-2의 재폴딩을 16% 트리신 -나트륨 도데실 황산염 폴리아크릴아미드 전기영동 (SDS-PAGE)을 사용하여 환원 및 비환원 조건하에서 분석하였다.
재폴딩은, BMP-2가 비환원 조건하에서 적절한 분자량의 이합체로 나타나고, 환원 조건하에서 적절한 분자량의 단량체로 나타날 때 양성으로 기록되었다. 재폴딩된 BMP-2의 수율은 루마시에 블루 또는 실버 염색 겔 상에서 밴드를 스캐닝함으로써 결정되었다. 재폴딩된 BMP-2 이합체의 생물학적 활성은 하기 실시예 9 및 10의 분석을 이용하여 테스트하였다. 요소 및 염화나트륨에서 이. 콜리 생성 BMP-2의 재폴딩은 1.0 ∼ 2.0 M 범위의 요소 및 0.75 ∼ 1.25 M 범위의 염화나트륨에서 최적으로 일어났다. 배지 강도의 SDC-PAGE 밴드는 0.5 ∼ 1.0 M 및 2.0 ∼ 2.5 M 범위의 요소농도 그리고 0.5 ∼ 0.75 M 및 1.25 ∼ 1.5 M 범위의 염화나트륨의 농도내에서 관찰되었다. 재폴딩된 BMP-2에 상응하는 희미한 밴드가 0.1 ∼ 0.5 M 및 2.5 ∼ 3 M 범위의 요소농도 그리고 0.25 ∼ 0.5 M 및 1.5 ∼ 2 M 범위의 염화나트륨 농도에서 발생되는 것이 관찰되었다. BMP-2의 재폴딩은 7.5 ∼ 11 범위의 pH 내에서 발생하였으며, 8.5 ∼ 10.5 범위의 pH에서 보다 우수한 재폴딩이 발생하였고, 9 ∼ 10 범위 pH에서 최적의 재폴딩이 발생하였다.
실시예 5
구아니딘/염화나트륨에서 이. 콜리 생성 BMP-2 의 재폴딩
1% 아세트산내 또는 0.1% TFA, 30 ∼ 40% 아세토니트릴을 포함하는 역상 버퍼내 BMP-2 단백질을 고속 진공기를 이용하여 건조시키거나 또는 아세토니트릴을 제거하여 부피를 감소시키고, 0.01% TFA 4 ㎕로 재용해시키고, 5 ∼ 10 분 동안 완전히 용해되도록 하였다. 8M ∼ 8.5M 구아니딘 HCl (구아니딘), 100 mM CHES pH9.5, 5mM EDTA를 포함하는 용액을 TFA내 BMP-2에 첨가하고, 희석전에 실온에서 20 ∼ 30 분간 배양케하였다. 사용된 단백질 농도는 희석된 상태에서 최종 단백질농도가 10 ∼ 100 ㎍/ml이 되도록 하는 그러한 값이다. 구아니딘/BMP 용액은 적절한 양의 염화나트륨 및 50 ∼ 100 mM CHES pH9.5, 5mM EDTA, 2mM 환원 글루타티온 (GSH), 1mM 산화 글루타티온(GSSG)를 함유하는 냉각 폴딩버퍼(아이스 상태)로 희석하였다. 샘플은 아이스 상태 동안에 아르곤으로 버블링되었으며 (15초), 그리고 4℃ 에 보관하였다.
구아니딘에서 이. 콜리 생성 BMP-2의 재폴딩을 실시예 4에서 진술한 바와같이 트리신- SDS - PAGE를 이용하여 환원 및 비환원 조건하에서 분석하였다.
구아니딘에서 이. 콜리 생성 BMP-2 의 재폴딩은, 0.18 ∼ 1.0 M 구아니딘의 범위에서 최적으로 일어났다. 배지 강도의 SDS-PAGE 밴드는, 0 ∼ 0.18 M 및 1.0∼ 1.25 M 범위의 구아니딘 농도내에서 관찰되었다. 재폴딩된 BMP-2 에 상응하는 희미한 밴드가 1.25 ∼ 1.5 M 범위의 구아니딘 농도에서 발생되는 것이 관찰되었다. BMP-2의 재폴딩은 7.5 ∼ 9.5 범위의 pH 범위내 구아니딘에서 발생하였으며, pH 8.5에서 보다 우수하였고, pH 9.5에서 재폴딩이 최적화되었다. 비록 약간의 재폴딩이 실온 (약 23℃)에서 관찰되었지만, BMP-2의 재폴딩은 4℃에서 쳐적화되었다.
실시예 6
아르기닌/염화나트륨에서 이. 콜리 BMP-2 의 재폴딩
1% 아세트산내 또는 0.1% TFA 3 ∼ 40% 아세토니트릴을 포함하는 역상 버퍼내 BMP-2 단백질을 고속 진공기를 이용하여 건조시키거나 또는 아세토니트릴을 제거하여 부피를 감소시키고, 0.01% TFA 4 ㎕ 로 재용해시키고, 5 ∼ 10 분 동안 완전히 용해되도록 하였다. 사용된 단백질 농도는 희석된 상태에서 최종 단백질농도가 10 ∼ 100 ㎍/ml 이 되도록 하는 그러한 값이다.
폴딩버퍼는, 적절한 pH로 적정된 100 mM 버퍼, 5mM EDTA, 그리고 바람직한 농도의 염을 포함하고 있다.
아르기닌에서 이. 콜리 생성 BMP-2의 재폴딩을 실시예 4에서 진술한 바와같이 트리신- SDS - PAGE를 이용하여 환원 및 비환원 조건하에서 분석하였다.
실질적인 밴드가, BMP-2를 재폴딩하는데 사용된 모든 아르기닌 농도에서 관찰되었다 ; 그러나, BMP-2의 가장 높은 수율은, 0.6 ∼0.8 M 아르기닌 및 0 ∼ 0.25 M 염화나트륨을 사용하여 획득하였다. 여러형태의 염을 BMP-2 재폴딩을 강화하는 능력에 대해서 테스트하였다 : NaCl, MgCl2, MgSO4, Na2SO4. 이들중에서 NaCl 및 MgCl2가 최적량의 재폴딩 BMP-2를 생산하였고, 그리고 MgSO4는 중간정도양의 재폴딩 BMP-2를 생산하였다. 아르기닌에서 BMP-2를 재폴딩하기 위한 최적 pH 범위는 pH 9.5 ∼ 10 사이다. 또한 재폴딩은 pH 8.5 에서도 일어났다. 비록 약간의 재폴딩이 실온 (약 23℃)에서 관찰되었지만 아르기닌에서 BMP-2 재폴딩은 4℃에서 최적화되었다.
실시예 7
유기 알콜을 이용한 BMP-2 의 재폴딩
전술한 바와같이 제조되는 1% 아세트산내 변성되고, 단량체인 BMP-2 (및 BMP-6)를 에펜도프 튜브에 넣고, 건조 상태로 동결 건조시켰다.
상기 팰럿을 0.01% 트리플루오르 아세트산 20㎕ 에 재용해시켰다. 그 다음에, 50 mM Tris (pH 8.5), 5mM EDTA, 1.0 M NaCl, 2mM 환원 글루티티온, 1mM 산화 글루타티온, 그리고 10 ∼ 20 % 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올을 포함하는 버퍼 500 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 3일 동안 실온에서 보관한 후에, 16% 노벡스 트리신 겔상에서 SDS-PAGE 에 의한 이합체 형성을 평가하였다. 적으나 식별할 수 있는 양의 BMP-2 이합체를 실버로 염색한 후에 검출하였다. 동일한 겔상에서의 BMP 6/6 단일 이합체 또는 BMP-2/6 이형 이합체에 대한 아무런 증거도 없다.
실시예 8
이합체 BMP-2의 정제
요소 재폴딩 BMP-2 단백질을 HPLC C4 분석 칼럼 (Vydac 214 TP54)상에 주입하고, 10% B 버퍼 (A 버퍼 = 0.1% TFA, B 버퍼 = 95% 아세토니트릴, 0.1% TFA) 로 평형시켰으며, 유속은 1ml/분이었다. 15 분후에, 10% ∼ 50% 사이의 B 버퍼 선형농도 구배가 이합체 BMP-2 단백질이 용출되는 시간 동안인 40 분 이상 적용되었다.
단백질은 280 nm 의 흡광도로 추적했다. BMP-2 이합체 분획피크(45분 ∼ 48분 사이에 용출)를 한데 모아서, 16% 트리신 - SDS - PAGE 로 분석하였고, 그리고 실시예 9 및 10 에 기재된 분석법으로 생물학적 활성에 대해 테스트하였다.
실시예 9
W-20 알칼리 포스파타제 분석의 실험계획
200 ㎕ 의 배지 (10% 가열 불활화된 소태아 혈청, 2mM 글루타민을 포함하는 DME)가 있는 웰 (Well) 당 10,000 세포의 농도로 W - 20 - 17 세포를 96 웰 조직배양 플레이트내에 도포한다. 37℃에서 95% 공기, 5% 이산화 탄소 배양기내에, 세포를 밤새동안 인큐베이트 한다.
200 ㎕ 의 배지를 다중채널 피페터 (pipettor)로 각각의 웰로부터 제거하고, 10% 가열 불활화 소태아혈청, 2mM 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DME 에서 분출된 같은 양의 테스트샘플로 치환한다.
테스트 샘플 및 표준배지가, W - 20 - 17 표식세포를 가지고 24 시간 배양하는 시기에 사용된다. 24시간후에, 플레이트를 37℃ 배양기로부터 제거해낸 다음, 세포로부터 테스트 배지를 제거한다.
상기 W - 20 - 17 세포층을, 웰당 칼슘/마그네슘 결핍 인산염 버퍼염수 200㎕ 로 3 회 세척하고, 이러한 세척액을 폐기한다.
유리증류수 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 그 다음에 분석 플레이트를 신속한 동결을 위해 드라이아이스/에탄올 동결조에 배치한다. 일단 동결되면, 분석 플레이트를 드라이아이스/에탄올 동결조로부터 제거하고, 37℃에서 녹인다. 총 3 회의 동결 - 녹임 절차를 위해, 이러한 과정을 2 회 이상 반복한다. 일단 완결되면, 막결합 알칼리 포스파타제는 측정에 이용할 수 있다.
50㎕ 의 분석혼합액 (50 mM 글리신, 0.05 % 트리톤 X-100, 4mM MgCl2, 5mM p-니트로페놀 인산염, pH=10.3)을 각각의 분석 웰에 첨가하고, 그 다음 상기 분석 플레이트를 1 분당 60 진동을 하는 교반 욕조내에, 37℃에서 30 분 동안 배양한다.
30 분 배양의 끝 무렵에, 반응은 각각의 웰에 0.2 n NaOH 100㎕ 를 첨가함으로써 중단시키고, 분석 플레이트를 아이스상에 배치한다.
각 웰에 대한 분광광도계의 흡광도를 405 nm 의 파장에서 파악한다. 그 다음, 이러한 값을 통상의 표준값과 비교하여, 각 샘플에서의 알칼리 포스파타제 활성을 평가한다. 예를들어, 알고있는 p-니트로페놀 염산염의 양을 이용하여, 흡광도값을 계산해낸다. 이러한 것이 표 1 에 나타나있다.
BMP-2 의 알고있는 양에 대한 흡광도 값을 결정할 수 있으며, 표 2 에 나타낸 바와같이 단위 시간당 분열된 p -니트로페놀 인산염의 μ몰로 전환될 수 있다.
그 다음, 이러한 값은 BMP 이형이합체의 알고 있는 양에 대한 활성과 BMP-2 단일 이합체를 비교하는데 사용된다.
실시예 10
Rosen - 변형 Sampath - Reddi 분석
앞서의 Sampath - Reddi 절차 중 에탄올 침전 단계가, 물에 대하여 분석될 분획을 투석 (조성물이 용액인 경우)또는 디아필터링 (조성물에 현탁액인 경우)하는 것으로 치환된다. 그 다음, 상기 용액 또는 현탁액을 0.1% TFA 로 다시 용해시키고, 그 결과로 얻어지는 용액에 20 mg 의 래트세포 간질을 첨가한다. 본 발명의 단백질로 처리되지 않은 모의 래트 세포간질 샘플이 대조구로 쓰인다. 이러한 물질을 동결시키고, 녹이고, 그리고 결과고 생성나는 분말을 #5 겔라틴 캡슐에 봉입한다. 이러한 캡슐은, 21 ∼ 49 일 자란 수컷 롱 에반스 래트의 복강 흉부 부위에 피하로 주입된다. 이러한 주입물을 7 ∼ 14일 후에 제거한다. 각 주입물의 절반은 알칼리 포스파타제 분석 ["A. H. Reddi, etal.,Proc. Natl. Acad. Sci., 69; 1601 (1972) " 참조] 에 이용된다.
각 주입물의 나머지 절반은 고정되고, 조직학적인 분석을 위해 처리된다. 글리콜메타크릴레이트 구역 1㎛를 봉코사 (Von Kossa)및 산 퍼스킨 (acid fuschin)으로 염색하여, 각각의 주입물에 존재하는 유도된 골 및 연골의 형성된 양을 기록한다. +1부터 +5는, 새로운 골 및/또는 연골-세포 및 간질에 의해 채워진 주입물의 각기 조직학적 구역면적을 나타낸다. +5의 기록은, 50% 이상의 주입물이 주입물에서의 단백질의 직접적인 결과로 생성되는 새로운 골 및 또는 연골인 것을 나타낸다. +4, +3, +2 및 +1의 기록은, 각기 40%, 30%, 20%, 및 10% 이상의 주입물이 새로운 연골 및/또는 골을 포함한다는 것을 나타낸다.

Claims (17)

  1. 319 내지 321 의 3 누클레오티드(triplet)가 아스파르트산을 코오딩하는 3 누클레오티드로 치환된 것을 제외하고는, 서열 ID 번호 : 3 에 나타난 바와같은 BMP-4를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  2. 166 내지 168 의 3 누클레오티드가 히스티딘을 코오딩하는 3 누클레오티드로 치환된 것을 제외하고는, 서열 ID번호 : 5에 나타난 바와같은 BMP-5를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  3. 166 내지 168 의 3 누클레오티드가 히스티딘을 코오딩하는 3 누클레오티드로 치환된 것을 제외하고는, 서열 ID번호 : 7 에 나타난 바와같은 BMP-6를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  4. 187 내지 189의 3 누클레오티드가 히스티딘을 코오딩하는 3 누클레오티드로 치환된 것을 제외하고는, 서열 ID 번호 : 9에 나타난 바와같은 BMP-7를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  5. 187 내지 189 의 3 누클레오티드가 히스티딘을 코오딩하는 3 누클레오티드로치환된 것을 제외하고는, 서열 ID번호 : 11에 나타난 바와같은 BMP-8를 코오딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  6. 아미노산 107 잔기인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 서열 ID 번호 : 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 BMP-4.
  7. 아미노산 56 잔기인 알라닌이 히스티딘으로 치환된 서열 ID 번호 : 6 의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 BMP-5.
  8. 아미노산 56 잔기인 알라닌이 히스티딘으로 치환된 서열 ID 번호 : 8 의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 BMP-6.
  9. 아미노산 63 잔기인 알라닌이 히스티딘으로 치환된 서열 ID 번호: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로하는 돌연변이체 BMP-7.
  10. 아미노산 63 잔기인 세린이 히스티딘으로 치환된 서열 ID 번호 : 12 의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 BMP-8.
  11. BMP-2및 제 6항에 따른 돌연변이체 BMP를 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 이형 이합체.
  12. BMP-2 및 제 7항에 따른 돌연변이체 BMP 를 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 이형 이합체.
  13. BMP-2및 제 8항에 따른 돌연변이체 BMP를 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 이형 이합체.
  14. BMP-2 및 제 9항에 따른 돌연변이체 BMP를 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 이형 이합체.
  15. BMP-2및 제 10항에 따른 돌연변이체 BMP를 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 이형 이합체.
  16. 증진된 재폴딩 특성을 갖는 골 발육 촉진성 단백질(BMP) 의 돌연변이체를 수득하는 방법으로 :
    a) 재폴딩이 잘되는 것으로 밝혀진 BMP 의 아미노산 서열(BMP+)과 재폴딩이 잘되지 않는 BMP의 아미노산 서열 (BMP-)의 비교 ;
    b) (a) 단계에서의 비교를 통해 상호 관계가 있는 아미노산 위치에서의 차이를 결정 ;
    c) 변형 BMP-단백질을 형성하기 위해, BMP+의 상호 관계가 있는 아미노산과차이가 있는 하나의 아미노산이 BMP+ 의 상호 관계가 있는 아미노산으로 치환되도록 BMP-의 아미노산서열 변경 ;
    d) 재폴딩 능력에 대한 BMP- 단백질의 테스트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항의 방법으로 생성된 증진된 재폴딩 특성을 갖는 골 발육 촉진성 단백질 (BMP)의 돌연변이체.
KR1019960703011A 1993-12-07 1994-11-15 골발육촉진성단백질의돌연변이체 KR100361058B1 (ko)

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