NO317800B1 - Rekombinante DNA-molekyler som koder for benmorfogene proteiner og rensede sammensetninger og fremgangsmater derav. - Google Patents
Rekombinante DNA-molekyler som koder for benmorfogene proteiner og rensede sammensetninger og fremgangsmater derav. Download PDFInfo
- Publication number
- NO317800B1 NO317800B1 NO19962303A NO962303A NO317800B1 NO 317800 B1 NO317800 B1 NO 317800B1 NO 19962303 A NO19962303 A NO 19962303A NO 962303 A NO962303 A NO 962303A NO 317800 B1 NO317800 B1 NO 317800B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bmp
- amino acid
- seq
- refolding
- replaced
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 29
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 11
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title description 30
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 title description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 82
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 54
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 claims description 27
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 claims description 27
- 102100022545 Bone morphogenetic protein 8B Human genes 0.000 claims description 26
- 101000899368 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 8B Proteins 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 26
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 claims 2
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 claims 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 106
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 104
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 46
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 25
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 17
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 17
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 16
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 13
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 4
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 3-(3-chloroaminopropyl)dimethylamino-l-propanesulfonate Chemical compound 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000899388 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000899390 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 6 Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 2
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150114167 ampC gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101150061927 BMP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 101100174784 Bacillus subtilis (strain 168) ganR gene Proteins 0.000 description 1
- 101150072730 Bmp6 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100040892 Growth/differentiation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710113100 Membrane-bound alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100165560 Mus musculus Bmp7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101710151715 Protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- WZRZTHMJPHPAMU-UHFFFAOYSA-L disodium;(3e)-3-[(4-amino-3-sulfonatophenyl)-(4-amino-3-sulfophenyl)methylidene]-6-imino-5-methylcyclohexa-1,4-diene-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C(=N)C(C)=CC1=C(C=1C=C(C(N)=CC=1)S([O-])(=O)=O)C1=CC=C(N)C(S(O)(=O)=O)=C1 WZRZTHMJPHPAMU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 101150043267 lacR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013289 male long evans rat Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N octylphenoxy polyethoxyethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002943 spectrophotometric absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører mutanter av benmorfogene proteiner. Disse mutantene er nyttige spesielt for anvendelse for å forbedre fremgangsmåte for fremstilling av biologiske aktive dimere rekombinante benmorfogene proteiner produsert i uoppløselig form fra bakterielle cellekulturer.
En antall proteiner som blir referert til innenfor fagområdet som benmorfogene proteiner (BMP) er nylig blitt identifisert og har evne til å indusere ben eller bruskdannelse når implantert i pattedyr. For eksempel beskriver Wang et al. i US-PS 5.013.649, inkorporert heri som referanse, DNA-sekvenser kodende for bovine og humane benmorfogene proteiner 2A (nå benmorfogent protein-2) og 2B (nå benmorfogent protein 4); tilsvarende proteiner som blir kodet av disse DNA-sekvensene, og fremgangsmåter for rekombinant produksjon av BMP-2A (nå BMP-2) og BMP-2B (nå BMP-4) proteiner. Wozney et al., i US-PS 5.106.748, inkorporert heri som referanse, beskriver DNA og aminosyresekvensene til bovint og humant benmorfogent protein-5 (BMP-5), sammen med fremgangsmåter for rekombinant produksjon av BMP-5 proteinene. I US-PS 5.187.076, inkorporert heri som referanse, Wozney et al. beskriver DNA-sekvenser, aminosyresek-venser og fremgangsmåter for rekombinant produksjon av human og bovin benmorfogent protein-6 (BMP-6). DNA og aminosyresekvensene som koder for benmorfogent protein-7 (BMP-7), noen ganger referert til som OP-1) og fremgangsmåter for rekombinant produksjon av BMP-7 er beskrevet i Rosen et al., US-PS 5.141.905, inkorporert heri som referanse. DNA-sekvenser som koder for BMP-8 er beskrevet i PCT publikasjon W091/18098. DNA-sekvenser kodende for BMP-9 er beskrevet i PCT publikasjon WO93/00432. Disse referansene er inkorporert heri som referanse. Disse proteinene an-tas å ha bred medisinsk anvendelse for behandling av ben- og bruskskader og forstyrrel-ser hos pattedyr. For å oppfylle det ventede medisinske behovet for disse benmorfogene proteinene vil det være nødvendig med store mengder av biologisk aktivt protein.
Rekombinant produksjon av benmorfogene proteiner er mulig både i eukaryote og prokaryote cellekultursystemer. En vanlig forekomst i rekombinant produksjon av heterologe proteiner i prokaryote celler, så som bakterier, er dannelsen av uoppløselige intracellulære presipitater, kjent som inklusjonslegemer. Idet bakteriene generelt har evne til å transkribere og translatere DNA-sekvenser som koder for heterologe proteiner korrekt, kan disse prokaryote cellene ikke folde noen heterologe proteiner tilstrekkelig korrekt til å muliggjøre deres produksjon i en oppløselig form. Dette er spesielt tilfelle når det gjel-der prokaryot ekspresjon av proteiner med eukaryot opprinnelse, så som benmorfogene proteiner. Dannelse av ukorrekt foldede, heterologe proteiner har til en viss grad begren-set den kommersielle anvendelsen av bakteriell fermentasjon for å produsere rekombinante pattedyrproteiner. Når produsert i bakterier, blir rekombinante, benmorfogene proteiner ofte likeledes funnet i inklusjonslegemer i en aggregert, biologisk uaktiv form.
Flere fremgangsmåter for oppnåelse av korrekt foldede heterologe proteiner fra bakterielle inklusjonslegemer er kjent. Disse fremgangsmåtene involverer generelt oppløsning av proteinet fra inklusjonslegemene, deretter fullstendig denaturering av proteinet ved
anvendelse av et kaotropt middel. Når cysteinresidiene er til stede i den primære aminosyresekvensen til proteinet er det ofte nødvendig å oppnå refolding i et miljø som mulig-gjør korrekt dannelse av disulfidbindinger (et redokssystem). Generelle fremgangsmåter for refolding er beskrevet i Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990).
EP 0433225 beskriver en fremgangsmåte for refolding av transformerende vekstfaktor B (TGF-B)-lignende proteiner som anvender, i tillegg til et kaotropt middel og et redokssystem, et solubiliseirngsmiddel i form av en detergent. EP 0433225 angir at fremgangsmåter beskrevet deri generelt kan anvendes for refolding av "TGF-6-lignende proteiner", basert på homologigraden mellom medlemmene av TGF-B familien. Foreliggende opp-finnere har imidlertid funnet at fremgangsmåter beskrevet i EP 0433225 produserer uønskede lave utbytter av korrekt foldet, biologisk aktiv dimerisk protein når anvendt på bakterielt produsert BMP-4, BMP-5, BMP-6 eller BMP-7 av ukjent grunn.
Det er uventet blitt oppdaget at til tross for at noen benmorfogene proteiner ikke tilveiebringer korrekt foldet, biologisk aktiv dimerisk protein når produsert bakterielt, så som BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 eller BMP-8 kan visse mutante former av disse proteinene tilveiebringe slike proteiner. Det er videre blitt oppdaget, også uventet, at visse mutante former av benmorfogene proteiner også kan tilveiebringe korrekt foldede, biologisk aktive heterodimerer, så som heterodimerene til BMP-2/5 og BMP-2/6, i store mengder, mens de native formene av disse proteinene produserer uønskede lave utbytter av korrekt foldede, biologiske aktive heterodimerer, og disse utbyttene er forbedret ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen.
I en utførelsesform omfatter oppfinnelsen mutante former av BMP-4 som er nyttige i bakterielle produksjonsprosesser for å tilveiebringe korrekt foldede, biologiske aktive former av BMP-4.
I en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen mutante former av BMP-5, BMP-6, BMP-7 og BMP-8 som er nyttige for bakterielle produksjonsprosesser for å tilveiebringe korrekt foldede, biologiske aktive former av heterodimerer av BMP-2/5, BMP-2/6, BMP-2/7 og BMP-2/8.
I en ytterligere utførelsesform omfatter oppfinnelsen DNA-molekyler som omfatter DNA-sekvenser kodende for ovennevnte mutante former av benmorfogene proteiner.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en fremgangsmåte for oppnåelse av andre mutanter av benmorfogene proteiner med forbedrede refoldingsegenskaper, og mutante proteiner som dermed oppnås.
KORT BESKRIVELSE AV SEKVENSENE
SEQ ID NO: 1 er nukleotidsekvensen som koder for BMP-2.
SEQ ID NO: 2 er aminosyresekvensen for BMP-2.
SEQ ID NO: 3 er nukleotidsekvensen som koder for BMP-4.
SEQ ID NO: 4 er aminosyresekvensen for BMP-4.
SEQ ID NO: 5 er nukleotidsekvensen som koder for BMP-5.
SEQ ID NO: 6 er aminosyresekvensen for BMP-5.
SEQ ID NO: 7 er nukleotidsekvensen som koder for BMP-6.
SEQ ID NO: 8 er aminosyresekvensen for BMP-6.
SEQ ID NO: 9 er nukleotidsekvensen som koder for BMP-7.
SEQ ID NO: 10 er aminosyresekvensen for BMP-7.
SEQ ID NO: 11 er nukleotidsekvensen som koder for BMP-8.
SEQ ID NO: 12 er aminosyresekvensen for BMP-8.
BESKRIVELSE AV FIGUREN
Figur 1 er en sammenligning av sekvensene til BMP-2,4,5, 6,7 og 8.
I henhold til foreliggende oppfinnelse kan mutante former av rekombinant benmorfogent protein-4 (BMP-4) (SEQ ID NO: 3 og 4); BMP-5 (SEQ ID NO: 5 og 6); BMP-6 (SEQ ID NO: 7 og 8); BMP-7 (SEQ ID NO: 9 og 10); og BMP-8 (SEQ ID NO: 11 og 12) anvendes for å produsere store mengder av BMP homodimerer eller heterodimerer fra bakterier og refoldet til biologiske aktive dimeriske molekyler.
DNA-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter DNA-molekyler som omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-4 med unntagelse av at nukleotidtripletten koder for glutaminsyre ved residie 107 (dvs. mikleotidene 319 til 321 ifølge SEQ ID NO: 3) er erstattet (for eksempel, ved mutasjon eller syntetisk) av en nukleotidtriplett som koder for en asparaginsyre ved residie 107.
En utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter DNA-molekyler som omfatter en nukleotidsekvens kodende for BMP-5, BMP-6 eller BMP-7, med unntagelse av at nukleotidtripletten kodende for alanin ved residie 56 til BMP-5 eller BMP-6 (dvs. mikleotidene 166 til 168) av SEQ ID NO: 5 eller 7), eller residie 63 til BMP-7 (dvs. nukleotidene 187 til 189 ifølge SEQ ID NO: 9), blir erstattet (for eksempel ved mutasjon eller syntetisk) av en nukleotidtriplett som koder for et histidin.
En annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter DNA-molekyler som omfatter en nukleotidsekvens kodende for BMP-8, med unntagelse av at nukleotidtripletten som koder for serin i residie 63 til BMP-8 (dvs. nukleotidene 187 til 189 ifølge SEQ ID NO: 11) er erstattet (for eksempel ved mutasjon eller syntetisk) med en nukleotidtriplett som koder for en histidin.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre rensede sammensetninger av proteinet som omfatter aminosyresekvensen til BMP-4, med unntagelse av at aminosyren glutaminsyre ved residie 107 er erstattet med en asparaginsyre. Dette modifiserte BMP-4 proteinet kan refereres til ved nomenklaturen BMP-4(A107Asp).
I en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse rensede sammensetninger av protein som omfatter aminosyresekvensene til BMP-5, BMP-6 eller BMP-7, med unntagelse av at aminosyren alanin i residie 56 til BMP-5 eller BMP-6, eller residie 63 til BMP-7, er erstattet med et histidin. Dette modifiserte BMP-5 proteinet kan refereres til, for eksempel, ved nomenklaturen BMP-5(A56His). I en annen utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse rensede sammensetninger av proteinet som omfatter aminosyresekvensene til BMP-8, med unntagelse av at aminosyren serin ved residie 63 til BMP-8, er erstattet med en histidin. Modifisert BMP-8 proteinkan refereres til for eksempel ved nomenklatur BMP-8(A63His).
Som anvendt heri angir betegnelsen "korrelerende" følgende. Det er kjent at BMP-2 omfatter en dimer av polypeptidkjeder som hver kan ha 114 aminosyrer i lengde. Likeledes omfatter BMP-4 en dimer av polypeptidkjeder som hver kan være 116 aminosyrer i lengde. BMP-5 og BMP-6 omfatter hver dimerer av polypeptidkjeder, og hver kan være 172 aminosyrer i lengde. BMP-7 omfatter en dimer av polypeptidkjeder som hver kan inneholde 139 aminosyrer i lengde. BMP-8 omfatter en dimer av polypeptidkjeder som hver kan ha en lengde på 139 aminosyrer. Det er videre kjent at aminosyrene til BMP-2 fra leucin i residie 19 (korrelerende med residie 21 til BMP-4) til og med arginin i residie 114 er meget homolog med BMP-4 fra leucin ved residie 21 til arginin i residie 116). Det er likeledes kjent at aminosyrene til BMP-2 fra leucin 19 til BMP-2 til og med arginin 114 til BMP-2 er meget homologe med aminosyrene leucin 36 til og med histidin 132 til BMP-5 og BMP-6 og aminosyrene leucin 43 til og med histidin 139 til BMP-7, og til leucin 43 til histidin 139 av BMP-8. Leucin ved residie 19 til BMP-2 sies å være korrelerende med residie 21 til BMP^4, og med residiene 36 til BMP-5 og BMP-6, og med residie 43 til BMP-7, og med residie 43 til BMP-8. Asparaginsyren ved residie 105 til BMP-2 sies å være korrelerende med glutaminsyre i residie 107 til BMP-4, og histidin i residie 39 til BMP-2 sies å være korrelerende med alanin i residiene 56 til BMP-5 og BMP-6 og alanin i residie 63 til BMP-7, og serin i residie 63 til BMP-8. 112 aminosyresekvensen til TGF-6 kan også bli anvendt som et referansepunkt for define-ring av korrelerende aminosyrer.
Ut fra en granskning av figur 1 kan det sees at BMP-2 og BMP-4 er meget homologe, begynnende ved første cystein (residie 14 til BMP-2; korrelerende residie 16 til BMP-4). Det er bare åtte korrelerende residier som er forskjellige. Disse er henholdsvis residiene 15,39,46, 3,95,96 og 105 til BMP-2. Søkerne har oppdaget at fremgangsmåtene beskrevet i EP 0433225, som er effektive for refolding av BMP-2 i akseptable mengder, produserer uønskede lave utbytter av korrekt foldet, biologisk aktivt dimerisk protein når anvendt på bakterielt produsert BMP-4. Søkerne har konstruert molekyler hvor de første 4 (N-terminale) av disse residiene ligner BMP-2 residie, mens de siste fire (C-terminale) av disse residiene ligner det korrelerende BMP-4 residie (betegnet "BMP-2/BMP-4"). Det er også blitt konstruert heri molekyler hvor de N-terminale fire residiene ligner BMP-4, mens de C-terminale 4 av disse residiene lignet det korrelerende BMP-4-residiet (betegnet "BMP-4/BMP-2). Som beskrevet i eksempel 2 har søkerne oppdaget at idet BMP-4/BMP-2 ble refoldet i store mengder skjedde ikke det samme med BMP-2/BMP-4.
Foreliggende oppfinnelse innbefatter DNA-molekyler som omfatter en DNA-sekvens kodende for BMP-4, hvor minst nukleotidsekvensen kodende for aminosyren glutaminsyre i residie 107 blir erstattet med den korrelerende nukleotidsekvensen til BMP-2 som koder for asparaginsyre. Det er i tillegg blitt betraktet at andre nukleotidsekvenser av BMP-4 kan bli erstattet med den korrelative nukleotidsekvensen til BMP-2 dersom glu-taminsyreresidiet i 107 er erstattet med det korrelative asparaginsyreresidiet til BMP-2. Et slikt DNA-molekyl kan være kimært, dvs. deler av BMP-2 kodende sekvens og BMP-4 kodende sekvens kan bli ligert sammen ved hjelp av fremgangsmåter kjent for fagfolk innenfor dette området. Alternativt kan dette DNA-molekylet bli konstruert syntetisk eller ved mutasjoner, så som ved hjelp av kjemiske metoder. DNA-molekylet når det blir dannet kan bli dimerisert ved hjelp av fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet, enten med seg selv (homodimer) eller med et annet medlem av BMP familien (heterodimer).
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre DNA-molekyler som omfatter en DNA-sekvens kodende for BMP-5, MP-6, BMP-7 eller BMP-8 hvor nukleotidsekvensen kodende for aminosyren alanin i residie 56 til BMP-5 eller BMP-6, eller residie 63 til BMP-7 eller BMP-8, er erstattet med en korrelative nukleotidsekvensen til BMP-2.1 tillegg er det blitt betraktet at andre nukleotidsekvenser til BMP-5, BMP-6, BMP-7 eller BMP-8 kan bli erstattet med den korrelative nukleotidsekvensen til BMP-2, dersom alanin residiet ved 56 (63 til BMP-7), eller serinresidiet ved 63 til BMP-8, blir erstattet med det korrelative histidinresidiet til BMP-2. Et slikt DNA-molekyl kan være kimært, dvs. deler av BMP-2 kodende sekvens og BMP-5, BMP-6, BMP-7 eller BMP-8 kodende sekvens kan bli ligert sammen ved hjelp av fremgangsmåter kjent for fagfolk innenfor dette området. Alternativt kan dette DNA-molekylet bli konstruert syntetisk eller ved mutasjoner, så som ved hjelp av kjemiske metoder. DNA-molekylet kan når det er blitt dannet, dimeri-seres ved hjelp av fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet.
Foreliggende oppfinnelse muliggjør videre fremgangsmåter for oppnåelse av andre mutanter av benmorfogene proteiner (BMP) med forbedrede refoldingsegenskaper. Fremgangsmåten omfatter først sammenligning av aminosyresekvensen til en BMP som refolder bra (BMP<+>) ved anvendelse av refoldingsmetodene beskrevet heri, med aminosyresekvensen til en BMP som ikke refolder bra ved anvendelse av slike fremgangsmåter (BMP-), og forskjellene til korrelative aminosyreposisjoner blir bestemt. Deretter blir aminosyresekvensen til BMP" endret slik at en eller flere aminosyrer som er forskjellige fra de til korrelative aminosyrer til BMP<+> blir erstattet med de korrelative aminosyrene til BMP*". Slike modifiserte aminosyrer kan bli dannet ved å danne en eller flere nukleo-tidmutasjoner eller substitusjoner i DNA-sekvensen kodende for aminosyresekvensen for BMP" slik at DNA-sekvensen vil uttrykke et modifisert BMP" protein. Modifisert BMP" protein blir deretter testet for dets evne til å refolde. Denne fremgangsmåten kan bli gjentatt for hver aminosyreposisjon hvor sekvensen til BMP<+> og BMP" er forskjellig for å identifisere de aminosyreresidiene som er kritiske for forskjeller i refolding. Flere forandringer i aminosyresekvensen til BMP" kan bli dannet for å erstatte aminosyreresi-dier med den korrelative aminosyren fra BMP<+> for å ytterligere forbedre refoldingen av modifisert BMP" protein.
Fremgangsmåter for mutagenese av proteiner og nukleinsyrer er kjente, se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1990). Det er videre kjent at det kan eksi-stere mer enn en nukleotidtriplett som koder for et gitt aminosyreresidie. Et histidinre-sidie kan for eksempel kodes av enten CAT eller CAC, og et asparaginsyreresidie kan kodes av enten GAT eller GAC. Se Lehninger, Biochemistry, (Worth Publishers, N.Y.,
N.Y.).
En hvilken som helst bakteriell art kan anvendes for å danne rekombinant BMP for refolding i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Bacillus subtilis blir fortrinnsvis anvendt for å produsere inklusjonslegemer inneholdende BMP. Pseudomonas blir fortrinnsvis anvendt for å produsere inklusjonslegemer inneholdende BMP for refolding i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Det er mest foretrukket at Escherichia coli blir anvendt for å produsere inklusjonslegemer inneholdende BMP for refolding i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En hvilken som helst stamme av E. coli kan bli anvendt for å produsere BMP for refolding i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dersom stammen har evne til å uttrykke heterologe proteiner. En foretrukket stamme, E.coli stamme Gl724 (A.T.C.C., aksesjonsnr 55151) kan bli anvendt for å produsere BMP for refolding i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Mutante former av BMP ifølge oppfinnelsen kan bli produsert i bakterier ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Det kan være nødvendig å modifisere N-terminale sekvenser til de mutante formene av BMP for å optimalisere bakteriell ekspresjon. På grunn av at spaltning av bindingen mellom formyl-metionin og glutamin ikke er effektivt i E. coli er den N-terminale enden til nativt modent BMP-2 protein (Met-gln-ala-lys) modifisert ved delesjon av glutaminresidiet for å tilveiebringe en N-terminal ende som er mer egnet for BMP-2 produksjon i Exoli (Met-ala-lys-his). Andre bakterielle arter kan trenge analoge modifikasjoner for å optimalisere utbyttet av mutanten BMP oppnådd derfra. Slike modifikasjoner hører inn under det som er kjent for fagfolk innenfor dette området.
Modifisert eller umodifisert nukleotidsekvens til SEQ ID NO:3 som koder for BMP-4; SEQ ID NO: 5; som koder for BMP-5; SEQ ID NO: 7, som koder for BMP-6; SEQ ID NO: 9, som koder for BMP-7, eller SEQ ID NO: 11, som koder for BMP-8 kan bli satt inn i et plasmid egnet for transformasjon og ekspresjon av disse heterologe proteinene i bakterier. Et hvilket som helst bakterielt ekspresjonsplasmid kan bli anvendt dersom det har evne til å lede ekspresjonen av et heterologt protein så som BMP i bakteriene som blir valgt. Akseptable arter av bakterier innbefatter B.subtilis, arter av Pseudomonas og E. coli. Egnede ekspresjonsplasmider for hver av disse artene er kjent innenfor fagområdet. For produksjon av BMP i bakterier er en egnet vektor beskrevet i Taniguchi et al., PNAS:USA, 77:5230-5233 (1980).
Bakterielt ekspresjonsplasmid kan bli transformert inn i en kompetent bakteriell celle ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Transformanter blir selektert for vekst på medium inneholdende et hensiktsmessig medikament når medikamentresistens blir anvendt som selektivt trykk, eller for vekst på medium som mangler et hensiktsmessig næ-ringsmiddel når auxotrofi blir anvendt som selektivt trykk. Ekspresjon av heterologt protein kan optimaliseres ved anvendelse av kjente metoder. BMP som dermed blir oppnådd vil være til stede i uoppløselige, refraktile inklusjonslegemer som kan finnes i pelleter av ødelagte og sentrifugerte celler.
Inklusjonslegemene som dermed blir oppnådd blir deretter solubilisert ved anvendelse av en denaturant eller ved surgjøring med eddiksyre eller trifluoreddiksyre. Dersom det blir oppløst ved anvendelse av en denaturant blir et reduksjonsmiddel så som B-merkaptoetanol eller ditiotreitol tilsatt med denaturanten. Dersom proteinet blir oppløst ved sur-gjøring må det reduseres før surgjøringen. Oppløst heterologt protein kan bli ytterligere renset ved anvendelse av kjente kromatografiske metoder så som størrelseseksklusjons-kromatografi, eller byttekromatografi, eller revers fase høy ytelse væskekromatografi.
Oppløsningen inneholdende BMP blir deretter redusert i volum eller vakuumtørket for å fjerne kromatografibuffer, og på ny løst opp i medium (egnet medium innbefatter 50 mM tris, 1,0 M NaCl, 2% 3-(3-chloIamidopropyl)dimetylammonio-l-propansulfat (CHAPS), 5 mM EDTA, 2 mM glutation (redusert) 1 mM glutation (oksidert); ved pH på omtrent 8,5; og andre medier som kan være egnede for gjenoppløsning innbefatter al-ternative refoldingsbuffere som er beskrevet andre steder i beskrivelsen (for eksempel guanidin, urea, arginin)] for å tilveiebringe en konsentrasjon på 1 til 100 ug/ml protein. Høyere konsentrasjoner av proteinet kan bli refoldet i henhold til oppfinnelsen, for eksempel opp til omtrent 1 mg/ml, men presipitater eller aggregater er til stede over pro-teinkonsentrasjoner på 100 ug/ml og utbytte av aktiv BMP homodimer eller heterodimer kan reduseres tilsvarende.
For produksjon av heterodimerer blir ovennevnte prosedyre utført ved anvendelse av like mengder av to plasmider, hver inneholdende en kodende sekvens for et bestemt BMP (for eksempel pALBP2, kodende for BMP-2 og pALBPX kodende for BMP-X, hvor X er 5, 6,7 eller 8). Plasmidene blir dyrket separat, og resulterende inklusjonslegemer blir solubilisert og refoldet i henhold til fremgangsmåtene beskrevet heri. Refoldede proteinmonomerer blir blandet sammen i ekvivalente forhold og behandlet som beskrevet i paragrafen ovenfor. For heterodimerer anvender mediene CHAPS som refoldings-buffer. Resulterende dimeriske proteiner blir observert å innbefatte homodimerer av BMP-2, samt heterodimerer av BMP-2/X. Disse formene kan bli separert fra hverandre ved hjelp av prosedyrer kjent innenfor fagområdet. Produksjon av heterodimerer av BMP er grundig beskrevet i WO93/09229, og beskrivelsen er inkorporert heri som referanse.
For å refolde proteinene kan følgende betingelser og medier bli anvendt: 50 mM tris, 1,0 M NaCl, 2% 3-(3-chlolamidopropyl)dimetylammonio-l-propansulfat (CHAPS), 5mM EDTA, 2 mM glutation (redusert) 1 mM glutation (oksidert); ved pH på omtrent 8,5. Med mindre modifikasjoner kan andre detergenter, inkludert ikke-ioniske, for eksempel digitonin, eller zwitterioniske detergenter, så som, 3-(3-chlolaminopropyl)dimetylam-minio-l-propansulfonat (CHAPS) eller N-oktylglukosid, bli anvendt i foreliggende oppfinnelse. Fagfolk innenfor dette området ved at ovennevnte tilstander og medier kan bli variert, for eksempel, som beskrevet nedenfor. Slike variasjoner og modifikasjoner hø-rer inn under oppfinnelsen.
På grunn av at BMP er disulfidbundede dimerer i deres aktive tilstand er det nyttig å innbefatte et redokssystem som muliggjør dannelsen av tiol/disulfidbindinger i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Flere slike redokssystemer er kjente. For eksempel de oksiderte og reduserte formene av glutation, ditiotreitol, B-merkaptoetanol, B-merkapto-metanol, cystein og cystamin kan bli anvendt som redokssystemer i et forhold mellom reduksjonsmiddel og oksideringsmiddel på omtrent 1:10 til omtrent 2:1. Når glutationre-dokssystemet blir anvendt er forholdet mellom redusert glutation og oksydert glutation fortrinnsvis 0,5 til 5; mer foretrukket er 1 til 1; og mest foretrukket er 2 til 1 av redusert form til oksidert form.
Med ytterligere modifikasjoner kan andre refoldingsmidler, så som urea, guanidin, arginin og andre midler for refolding, bli anvendt for å produsere korrekt refoldede proteiner med mutantene ifølge foreliggende oppfinnelse. Kaotrope midler blir generelt anvendt ved konsentrasjoner i området 1 til 9 M. Når urea er refoldingsmidlet er det fortrinnsvis til stede ved konsentrasjoner i området på omtrent 0,IM til omtrent 3M, mer foretrukket er omtrent 0,5M til 2,5M, eller omtrent 1,0M til omtrent 2,0M.
Når guanidinhydroklorid blir anvendt som refoldingsmiddel blir det fortrinnsvis innled-ningsvis tilsatt ved høye konsentrasjoner, for eksempel, 7-8M, og deretter blir konsentrasjonen av guanidin redusert for å redusere refoldingen. Reduksjon av guanidinkonsentrasjonen kan oppstå spontant, som ved fortynning, eller gradvis, som ved dialysering. Guanidinkonsentrasjonen blir fortrinnsvis redusert til en sluttkonsentrasjon som er mindre enn omtrent 1,5 M, eller mer foretrukket mindre enn omtrent IM. Når guanidinkonsentrasjonen reduseres gradvis kan guanidin bli fullstendig fjernet fra refoldet protein. Fortynning av et guanidin skjer fortrinnsvis ved hjelp av dialysering.
Når arginin anvendes som refoldingsmiddel er det fortrinnsvis til stede i konsentrasjoner på omtrent 0,4M til omtrent 1,5M, mer foretrukket er omtrent 0.6M til omtrent 1.25M, eller omtrent 0,6M til omtrent 1,0M.
I tillegg til refoldingsmiddelet kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvende en saltdel. Når detergenter, så som CHAPS, blir anvendt er saltdelen fortrinnsvis NaCl, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på omtrent 0,5M til omtrent 2,0M, fortrinnsvis omtrent 1.0M. Når urea er refoldingsmiddelet er saltdelen fortrinnsvis natriumklorid, fortrinnsvis ved en konsentrasjon på omtrent 0,25 M til omtrent 2M. Det er mer foretrukket at natriumklorid er til stede i en konsentrasjon i området på området på omtrent 0.5M til omtrent 1,5M når urea er refoldingsmiddelet. Det er mest foretrukket når urea er refoldingsmiddelet at natriumklorid er til stede ved en konsentrasjon i området på omtrent
0,75 M til omtrent 1,25 M. Når guanidin blir anvendt som refoldingsmiddel må natrium-kloridkonsentrasjonen bli øket når konsentrasjonen av guanidin øker. For refolding i 0,2 M guanidin er området til NaCl konsentrasjonen som er optimal 0,25 til 0,5 M, mens for refolding i 1,0 M guanidin 1,0 til 2,0 M NaCl er nødvendig for optimal refolding.
pH til refoldingsreaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse når urea er refoldingsmiddelet utgjør fortrinnsvis fra omtrent 7,5 til omtrent 11; mer foretrukket er fra omtrent 8,5 til omtrent 10,5. Når detergenter så som CHAPS blir anvendt som refoldingsmiddel er foretrukket pH omtrent 8,5. Når guanidin blir anvendt som refoldingsmiddel er pH fortrinnsvis fra omtrent 7,5 til omtrent 9,5; mer foretrukket er omtrent 8,5; og mest foretrukket omtrent 9,5. Når arginin blir anvendt som refoldingsmiddel er pH fortrinnsvis fra omtrent 8 til omtrent 10; mer foretrukket er fra omtrent 8,5 til omtrent 10; og mest foretrukket er fra omtrent 9,5 til omtrent 10.
Det er foretrukket at refoldingsreaksjonen ifølge oppfinnelsen blir utført ved et tempera-turområde fra omtrent 4°C til omtrent 23°C. Det er mer foretrukket at refoldingsreaksjonen utføres ved 4°C. Refoldingsreaksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse blir kjørt fullstendig, fortrinnsvis i omtrent 16 timer.
Grad av refolding av benmorfogene proteiner oppnådd blir registrert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidelektroforese (SDS-PAGE) under ikke-reduserende og reduserende betingelser. BMP-4 homodimer vil fremkomme som et bånd ved omtrent 30 kD under ikke-reduserte betingelser på en 16% SDS-polyakrylamidgel; og BMP-4 monomeren fremkommer som et bånd ved omtrent 13 kD under reduserte betingelser. BMP-2/5 heterodimeren vil fremkomme som et bånd på omtrent 35 kD under ikke-reduserte betingelser på en 16% SDS-polyakrylamidgel; BMP-2 monomeren fremkommer som et bånd på omtrent 13 kD under reduserte betingelser; og BMP-5 monomeren fremkommer som et bånd ved omtrent 15 kD under reduserte betingelser. BMP-2/6 heterodimeren vil fremkomme som et bånd på omtrent 35 kD under ikke-reduserte betingelser på en 16% SDS-polyakrylamidgel; BMP-2 monomeren fremkommer som et bånd på omtrent 13 kD under reduserte betingelser; og BMP-6 monomeren fremkommer som et bånd på omtrent 15 kD under reduserte betingelser. BMP-2/7 heterodimeren vil fremkomme som et bånd ved omtrent 35 kD under ikke-reduserte betingelser på en 15% SDS-polyakrylamidgel; BMP-2 monomeren fremkommer som et bånd på omtrent 13 kD under reduserte betingelser; og BMP-7 monomeren fremkommer som et bånd på omtrent 15 kD under reduserte betingelser.
In vitro biologisk aktivitet til refoldede benmorfogene proteiner blir registrert ifølge W-20 analysen som vist i eksempel 9. Anvendelse av W-20-17 benmargsstromaceller som en indikatorcellelinje er basert på omdanningen av disse cellene til osteoblast-lignende celler etter behandling med BMP [R.S.Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research 5(2):305 (1990); og R.S. Thies et al., Endocrinology 130:1318-1324 (1992)]. W-20-17 cellene er en klonal benmargsstromacellelinje oppnådd fra voksne mus fra for-skere i laboratoriet til Dr.D.Nathan. Children's Hospital, Boston, MA. Behandling av W-20-17 celler med BMP resulterer i (1) øket alkalisk fosfatase produksjon, (2) induksjon av parathyroid hormon stimulert cAMP og (3) induksjon av osteocalcin syntesen til cellene. Idet (1) og (2) representerer karaktertrekk assosisert med osteoblastfenotypene er evnen til å syntetisere osteocalcin en fenotypisk egenskap som bare fremkommer fra modne osteoblaster. Frem til nå har omdanning av W-20-17 stromaceller til osteoblast-lignende celler bare blitt observert ved behandling med benmorfogene proteiner. In vivo biologisk aktivitet til refoldede benmorfogene proteiner blir registrert ifølge en modifisert versjon av rottebendannelsesanalysen beskrevet i Sampath and Reddi, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:6595 (1983) heri betegnet Rosen-modifisert Sampath-Reddi-analyse, som angitt i eksempel 10.
Foreliggende oppfinnelse omfatter et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-4 som vist i SEQ ID NO: 3, hvor nukleotidtripletten ved 319 til 321 er blitt erstattet med en triplett kodende for asparaginsyre.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-5 som vist i SEQ ID NO: 5, hvor nukleotidtripletten ved 166 til 168 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
Videre omfatter oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-6 som vist i SEQ ID NO: 7, hvor nukleotidtripletten ved 166 til 168 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
Videre omfatter oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-7 som vist i SEQ ID NO: 9 hvor nukleotidtripletten ved 187 til 189 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens kodende for BMP-8 som vist i SEQ ID NO: 11, hvor nukleotidtripletten ved 187 til 189 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en renset sammensetning av en mutant BMP-4, kjennetegnet ved at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 4, hvori glutaminsyren ved aminosyreresidiet 107 er blitt erstattet med asparagin.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en renset sammensetning av en mutant BMP-5, kjennetegnet ved at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 6, hvori alanin ved aminosyreresidiet 56 er blitt erstattet med histidin.
Videre omfatter foreliggende oppfinnesle en renset sammensetning av en mutant BMP-6, kjennetegnet ved at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 8, hvori alanin ved aminosyreresidiet 56 er blitt erstattet med histidin.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en renset sammensetning av en mutant BMP-7, kjennetegnet ved at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 10, hvori alanin ved aminosyreresidiet 63 er blitt erstattet med histidin.
Oppfinnelsen omfatter videre en renset sammensetning av en mutant BMP-8, kjennetegnet ved at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 12, hvori serin ved aminosyreresidiet 63 er blitt erstattet med histidin.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en renset sammensetning av BMP heterodimer, kjennetegnet ved at den omfatter minst én mutant ifølge det ovenstående.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en renset sammensetning av BMP heterodimer, kjennetegnet ved at den omfatter minst en mutant BMP ifølge det ovennevnte.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en renset sammensetning av BMP heterodimer, kjennetegnet ved at den omfatter minst én BMP mutant ifølge det ovenstående.
Den foreliggende oppfinnelsen omfatter videre en renset sammensetning av BMP heterodimer, kjennetegnet ved at den omfatter minst en mutant BMP ifølge det ovennevnte.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en renset sammensetning av BMP heterodimer, kjennetegnet at den omfatter minst en mutant BMP ifølge det ovenstående.
Endelig omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av benmorfogenetiske proteiner (BMP), kjennetegnet ved at nevnte proteiner kodes av DNA-molekylene ifølge det ovennevnte.
Eksempel 1
Refolding av BMP- 4 ved anvendelse av CHAPS systemet
1,0 g celler lagret ved -80°C blir målt. Oppløsningen (3,4 ml 100 mM TRIS, 10 mM EDTA, pH 8,5) blir tilsatt. Oppløsningen blir vortex-behandlet helt til cellene er suspen-
dert. 40 ul 100 mM PMSF i isopropanol blir tilsatt. Cellene blir lysert ved 1000 psi i en French press-celle. Inklusjonslegemene sentrifugeres ved 4°C i 20 minutter i en
Eppendorf mikrofuge for å danne pelleter. Supernatantene dekanteres. Til én pellet (av 4 totalt) blir 1,0 ml avgasset 8,0 M guanidinhydroklorid, 0.5M tris, 5 mM EDTA, pH 8,5, inneholdende 250 mm DTT tilsatt. Pelleten blir oppløst og argon blir blåst over væsken i 30 sekunder. Deretter blir oppløsningen inkubert ved 37°C i 1 time. Uoppløselige ma-terialer blir pelletert i 2-3 minutter i en Eppendorf sentrifuge ved 23°C. 0,5-1,0 ml av supernatanten blir injisert på en Supelco 2 cm "guard cartridge" (LC-304), og eluert med en acetonitirlgradient i 0,1% TFA fra 1-70% over 35 minutter. BMP-4 eluerer mellom 30 og 32 minutter. Fraksjoner blir slått sammen og proteinkonsentrasjonen blir bestemt ved A280 mot 0,1% TFA ved anvendelse av teoretisk ekstinksjonskoeffisient basert på aminosyreinnholdet.
Et tilstrekkelig volum av BMP-4 blandingen blir lyoFilisert for å tilveiebringe 10 ug protein. 5 ul glassdestillert vann blir tilsatt for på ny å oppløse resten og deretter blir 100 ul av refoldet blanding (TRIS, salt, CHAPS, osv.) tilsatt. Oppløsningen blir forsiktig blandet og lagret ved 23°C i 1-4 dager. Dimerdannelsen blir vurdert ved å kjøre en alikvot på en Novex 16% tricin gel ved 125 volt i 2,5 timer, etterfulgt av Coomassie blå farging og avfarging.
Eksempel 2
Refolding av andre BMP dimerer
Ut fra en granskning av figur 1 kan det sees at BMP-2 og BMP-4 er meget homologe, og begynner ved første cystein (residie 14 til BMP-2; korrelativt residie 16 til BMP-4). Det er bare åtte korrelative residier som er forskjellige. Disse er henholdsvis ved residiene
15,39,46, 73,95,96 og 105 til BMP-2. Søkerne har oppdaget at BMP-4 som beskrives i EP 0433225, som er effektive for refolding av BMP-2 i akseptable mengder, produserer uønskede lave utbytter av korrekt foldet, biologisk aktivt dimerisk protein når anvendt på bakterielt produsert BMP-4. Søkerne har konstruerte molekyler hvor de første fire (N-terminale) av residiene lignet BMP-2-residiet, mens de siste fire (C-terminale) av disse residiene lignet det korrelative BMP-4-residiet (betegnet "BMP-2/BMP-4"). Søkerne har også konstruert molekyler hvor de N-terminalt fire av disse residiene etterlignet BMP-4, mens de C-terminalt fire av disse residiene etterlignet det korrelative BMP-4-residiet (betegnet "BMP-4/BMP-2"). Disse molekylene ble opparbeidet som beskrevet for villtype BMP-4 ovenfor. Delene ble kjørt med hensiktsmessige kontrollpro-
teiner (for eksempel BMP-4 mutantene ved siden av villtype BMP-4; BMP-2 og villtype BMP-5 blandet sammen som en kontroll for BMP-2 og BMP5(A56His).
Villtype BMP-4 ble ikke godt refoldet. Mens BMP-4/BMP-2 ble refoldet i stort utbytte; men BMP-2/BMP-4 ble ikke refoldet. BMP-4(A107Asp) homodimeren refolder i store mengder i forhold til villtype BMP-4.
BMP-2/BMP-5 heterodimer refolder ikke godt. BMP2/BMP5(A39HIS) heterodimer refolder i store mengder i forhold til BMP-2/BMP-5.
BMP-2/BMP-6 heterodimer refolder ikke godt. BMP2/BMP6(A39ffis) heterodimer refolder i stor mengde i forhold til BMP-2/BMP-6.
Eksempel 3
Ekspresjon av BMP i E. coli
Et ekspresjonsplasmid pALBP2-782 inneholdende følgende prinsipielle trekk ble konstruert for produksjon av BMP-2 i E. coli. Nukleotidene 1-2060 inneholder DNA-sekvenser som kommer fra plasmid pUC-18 [Norrander et al., Gene 26:101-106 (1983)] inkludert sekvenser inneholdende genet for 6-laktamase som tilveiebringer motstand mot antibiotika ampicillin i verts E. coli stammene, og et colEl-oppnådd replikasjonsorigo. Nukleotidene 2061-2221 inneholder DNA 5 sekvenser for hoved- venstre promoter (pL) til bakteriofag X [Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982)], inkludert tre operator-sekvenser OlI, 0\ 2 og Ol3. Operatorene er bindingsseter for Xcl reseptorproteinet, og intracellulære nivåer kontrollerer mengden av transkripsjonsinitiering fra pL. Nukleotidene 2222-2723 inneholder en sterkt ribosombindende sekvens inkludert en sekvens avledet fra nukleotidene 35566 til 35472 og 38137 til 38361 fra bakteriofag lambda som beskrevet i Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982). Nukleotidene 2724-3133 inneholder en DNA-sekvens kodende for modent BMP-2 protein med ytterligere 62 nuk-leotider av 3'-utranslatert sekvens. Nukleotidene 3150-3218 tilveiebringer en "linker" DNA-sekvens som inneholder restriksjons-endonukleaseseter. Nukleotidene 3150-3218 tilveiebringer en transkripsjonstermineringssekvens basert på den til E.coli asp A-genet [Takagi et al., Nucl. Acids Res. 13:2063-2074 (1985)]. Nukleotidene 3219-3623 er DNA-sekvenser avledet fra pUC18.
Ved anvendelse av restriksjonsendonukleaser og prosedyrer kjent innenfor fagområdet kan man lett erstatte med den kodende sekvensen for BMP-2 innbefattet i pALBP2-781 med den kodende sekvensen for et annet BMP som man ønsker å produsere i E.coli. Med denne substitusjonen i pALB2-781-plasmidet kan følgende eksempler anvendes for å uttrykke og refolde hvilke som helst av BMP ifølge foreliggende oppfinnelse. Plasmid pALBP2-781 ble transformert inn i E. coli vertsstammen G1724 (F.lacR lacp<L8>j ampC::Xx;I<+>) ved hjelp av prosedyren til Dagert og Ehrlich, Gene 6:23 (1979). G1274 (ATCC aksesjonsnr 55151) inneholdende en kopi av villtype Xcl repressorgenet stabilt integrert inn i kromosomet ved ampC lokuset, hvor det er blitt plassert under transkrip-sjonen kontroll av salmonella typhimurium trrj promoter/operatorsekvenser. IGI724, blir ACI proteinet bare dannet i løpet av vekst i tryptofanfritt medium, så som minimalt medium eller et minimalt medium supplert med casaminosyrer så som IMC, beskrevet ovenfor. Tilførsel av tryptofan til en kultur av GF724 vil undertrykke trp_ promoteren og stenge av syntesen av tcI, som gradvis forårsaker induksjon og transkripsjon fra pL promoterne dersom de er til stede i cellen.
Transformantene ble selektert på 1,5% vekt/volum agarskåler inneholdende IMC-medium, som består av M9 medium [Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold
Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] supplert med 1 mM MgSC>4,0,5% vekt/- volum casaminosyrer og 100 ug/ml ampicillin og GI724 transformert med pALBP2-781 ble dyrket ved 37°C til en A550 på 0,5 i IMC medium inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Tryptofan ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 ug/ml og kulturen inkubert i ytterligere 4 timer på ampicillin-inneholdende medium. I løpet av denne tiden ak-kumulerer BMP-protein til omtrent 10% av totalt celleprotein, alle i "inklusjonslegeme"-fraksjonen.
Ni gram av frosne cellepelleter oppnådd fra E. coli transformanter som beskrevet ovenfor ble tint i 30 ml TE8.3(100:10) buffer (100 mM tris-HCl pH 8,3,10 mM Na2EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF[. Cellene ble lysert ved å bli ført tre ganger gjennom en Microfluidizer<TM> [modell nr MCF 100 T], Lysatet ble fortynnet til omtrent 120 ml med TE8.3 100:10 buffer. En pellet av inklusjonslegemematerialet ble oppnådd ved sentrifugering ved 15.000 x g. Supernatanten ble dekantert og inklusjonslegeme materialet ble suspendert i 50 ml TE8.3(100:10) som også inneholdt 1% Triton-XlOO. Re-suspenderte inklusjonslegemer ble sentrifugert i 10 minutter ved 15.000 x g og supernatanten ble dekantert. Pelleten ble suspendert i TE8.3(20:1) buffer (20 mM tris-HCl pH
8.3, 1 mM Na2EDTA, 1 mM PMSF) som også inneholdt 1% ditiotreitol [DTT], Etter at suspensjonen var homogenisert i en Wheaton glasshomogenisator ble den surgjort til pH
2,5 med iseddiksyre og deretter sentrifugert i 25 minutter ved 15000 x g. Supernatanten fra denne sentrifugeringen ble samlet og kromatografert over en Sepharose S-IOO<TM >størrelseseksklusjonskolonne (83 cm x 2,6 cm; = 440 ml sjikt) i 20 ml geler. Sepharose S_1<qqTM> kolonnen ble kjørt med en mobil fase bestående av 1% eddiksyre ved en strømningsrate på 1,4 ml/min. Fraksjoner tilsvarende BMP-2 monomer ble detektert ved absorbanse ved 280 nm, og ved anvendelse av en datamaskin ble ekstinksjonskoeffisien-ten beregnet til 18200M~lcm~l og molekyl vekten (12777 dal ton). Dette størrelses-eksklusjonskolonnematerialet ble slått sammen og anvendt som utgangsmateriale for refoldingsreaksjoner.
Alternativt ble cellene lysert som ovenfor, men opprinnelig pellet av inklusjonslegemematerialet ble løst opp i 8 M guanidin-HCl, TE8.5 (100:10) buffer (100 mM tris-HCl pH 8,5, 10 mM Na2EDTA som inneholdt 100 mM DTT, og inkubert ved 37°C i 1 time. Dette materialet ble sentrifugert ved 12.000 x g i 15 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble injisert inn i C4 analytisk RP-HPLC (revers fase-høy ytelse væske kromato-grafi) -kolonne (Vydac 214TP54) ekvilibrert til 1% B buffer (A buffer - 0,1% trifluoreddiksyre, B buffer = 95% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre [TFA], med en strømnings-rate på 1 ml/min. Etter 5 minutter ble en lineær gradient fra 1% til 70% B buffer (fortynnet inn i A buffer) kjørt over 35 minutter og i løpet av denne tiden eluerer proteinet. Proteinet ble registrert ved absorbanse ved 280 nm. Topp BMP-2 fraksjonene (som eluerte mellom 25 og 35 minutter) ble slått sammen. Konsentrasjonen ble bestemt ved absorbanse ved 280 nm og anvendelse av data beregnet ekstinksjonskoeffisient og molekylvekt som angitt ovenfor. Dette RP-HPLC C4 kolonne blandede materialet ble også anvendt som utgangsmateriale for refoldingsreaksjoner.
Eksempel 4
Refolding av E. coli produsert BMP- 2 i urea/ NaCl
BMP-2 protein i 1% eddiksyre eller i revers fase buffer inneholdende 0,1% TFA, 30-40% acetonitril ble tørket eller redusert i volum ved anvendelse av speed vakuum, gjen-oppløst med få mikroliter 0,01% TFA og oppløst fullstendig i 5 til 10 minutter. En buffer inneholdende 7M til 8M urea, 100 mM 2-(N-cykloheksylamino)-etansulfonsyre [CHES] pH 9,5, 5 mM EDTA ble tilsatt til BMP-2 i TFA og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur (RT, omtrent 23°C) før fortynning. Proteinkonsentrasjonene som ble anvendt var slik at slutt BMP-2 konsentrasjonen i fortynnet tilstand var 10 til 100 ug/ml. De endelige tilstandene til foldingsbufferen inneholdt 100 mM CHES, 5 mM EDTA, og ønsket konsentrasjon av salt for urea konsentrasjonen ble anvendt. Flere områder av urea, NaCl, pH og redoks betingelser ble testet for å optimalisere BMP-2 refoldingsbe-tingelser.
Refolding av E. coli produsert BMP-2 i urea/NaCl ble analysert under reduserende og ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av 16% tricin-natriumdodecylsulfat poly-akrylamid elektroforese (SDS-PAGE).
Refoldingen ble registrert som positiv når BMP-2 fremkom som en dimer med hensiktsmessig molekylvekt under ikke-reduserende betingelser og som en monomer med hensiktsmessig molekylvekt under reduserende betingelser. Utbytte av refoldet BMP-2 ble bestemt ved skanning av bånd på coomassie blå eller sølvfargede geler. Biologisk aktivitet til refoldet BMP-2 dimer ble testet ved anvendelse av analyser ifølge eksemplene 9 og 10 nedenfor.
Refolding av E.coli produserte BMP-2 i urea og NaCl oppsto optimalt i områder på 1,0 til 2,0 M urea og 0,75 til 1,25 M NaCl. SDS-PAGE båndene med middels intensitet ble observert innenfor konsentrasjonsområder på 0,5 til 1,0 M og 2,0 til 2,5 M urea og 0,5 til 0,75 M og 1,25 til 1,5 M NaCl. Svake bånd som tilsvarer refoldet BMP-2 ble observert i konsentrasjoner i områder på 0,1 til 0,5 og 2,5 til 3 M urea og 0,25 til 0,5 og 1,5 til 2 M NaCl. Refolding av BMP-2 oppsto innenfor pH området på 7,5 til 11, med bedre refolding i pH området 8,5 til 10,5 og optimal refolding i pH området 9 til 10.
Eksempel 5
Refolding av E. coli produserte BMP- 2 i guanidin/ NaCl
BMP-2 protein i 1% eddiksyre eller i revers fase buffer av 0,1% TFA, 30-40% acetonitril ble tørket eller redusert i volum for å fjerne acetonitril ved anvendelse av speedvakuum, på ny oppløst med 4 ui 0,01% TFA og oppløst fullstendig i 5 til 10 minutter. En oppløsning inneholdende 8 M til 8,5 M guanidin HC1 (guanidin), 100 mM CHES, pH 9,5,5 mM EDTA ble tilsatt til BMP-2 i TFA og inkubert i 20-30 minutter ved romtemperatur før fortynning. Proteinkonsentrasjonene som ble anvendt var slik at den endelige proteinkonsentrasjonen i fortynnet tilstand var 10 til 100 (ig/ml.
Guamdin/BMP-oppløsningen ble fortynnet inn i avkjølt foldebuffer (på is) med hensiktsmessig mengde NaCl og med 50-100 mM CHES pH 9,5, 5 mM EDTA, 2 mM redusert glutation (GSH), 1 mM oksidert glutation (GSSG). Prøvene ble boblet med argon (15 sekunder) mens de står på is og inkubert ved 4°C.
Refolding av E.coli produsert BMP-2 i guanidin ble analysert under reduserende og ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av tricin-SDS-PAGE som beskrevet ovenfor i eksempel 4.
Refolding av E.coli produsert BMP-2 i guanidin oppsto optimalt i områder på 0,18 til 1,0 M guanidin. SDS-PAGE båndene med middels intensitet ble observert innenfor konsentrasjonsområder på 0 til 0,18 M og 1,0 til 1,25 M guanidin. Svake bånd tilsvarende refoldet BMP-2 ble observert å oppsto ved konsentrasjoner i området 1,25 til 1,5 M guanidin. Refolding av BMP-2 oppsto i guanidin innenfor pH området 7,5 til 9,5, med bedre refolding ved pH 8,5 og optimal refolding ved pH 9,5. Refolding av BMP-2 var optimal ved 4°C til tross for at en viss refolding ble observert ved romtemperatur (omtrent 23°).
Eksempel 6
Refolding av E. coli BMP- 2 i areinin/ NaCl
BMP-2 protein i 1% eddiksyre eller i reversfase buffer bestående av 0,1% TFA, 3-40% acetonitril ble tørket eller redusert i volum for å fjerne acetonitril ved anvendelse av et speedvakuum, på ny oppløst med 4 (il 0,01% TFA og oppløst fullstendig i 5 til 10 minutter. Proteinkonsentrasjonene som ble anvendt var slik at den endelige proteinkonsentrasjonen i foldebufferen var 10 til 100 ug/ml. Foldebufferen inneholdt 100 mM buffer titrert til hensiktsmessig pH 5 mM EDTA og ønsket konsentrasjon av salt. Refolding av E. coli produsert BMP-2 i arginin ble analysert under reduserende og ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av Tricin-SDS-PAGE som beskrevet ovenfor i eksempel 4. Vesentlige bånd ble observert ved alle konsentrasjonene av arginin anvendt for å refolde BMP-2, men det største utbyttet av BMP-2 ble oppnådd ved anvendelse av 0,6 til 0,8 M arginin og fra 0 til 0,25 M NaCl. Flere salttyper ble testet for evnen til å forsterke BMP-2 refoldingen: NaCl, MgCl2, MgSC>4, Na2SC>4. Av disse ga NaCl og MgCl2 optimale mengder av refoldet BMP-2 og MgSC«4 ga middels mengder av refoldet BMP-2. Optimalt pH-område for refolding av BMP-2 i arginin er pH 9,5 til 10. Refolding oppsto også ved pH 8,5. Refolding av BMP-2 i arginin var optimalt ved 4°C til tross for at en viss refolding ble observert ved romtemperatur (omtrent 23°).
Eksempel 7
Refoldin<g> av BMP- 2 ved anvendelse av organiske alkoholer
Denaturert, monomerisk BMP-2 (og BMP-6) i 1% eddiksyre, preparert som tidligere beskrevet, ble tilsatt til et Eppendorf-rør og lyofilisert til tørrhet. Pelletene ble gjenoppløst i 20 ul 0,01% trifluoreddiksyre. 500 ul buffer ble deretter tilsatt, inneholdende 50 mM tris (pH 8,5), 5 mM EDTA, 1,0 M NaCl, 2 mM redusert glutation, 1 mM oksidert glutation og 10-20% metanol, etanol eller isopropanol. Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 3 dager, vurdert for dimerdannelse ved SDS-PAGE på en 16% Novex tricin gel. En liten, men viss mengde av BMP-2 dimer ble detektert etter farging med sølv. Det var ikke noe bevis for BMP-2/6 heterodimer av BMP6/6 homodimer på de samme gelene.
Eksempel 8
Rensing av dimerisk BMP- 2
Urea refoldet BMP-2 protein ble injisert på en HPLC C4 analytisk kolonne (Vydac 214TP54) ekvilibrert til 10% B buffer (A buffer = 0,1% TFA, B buffer = 95% acetonitril, 0,1% TFA), med en strømningsrate på 1 ml/min. Etter 15 minutter ble en lineær gradient fra 10% til 50% B buffer påført over 40 minutter og i løpet av denne tiden eluerte dimerisk BMP-2 protein. Proteinet ble registrert ved absorbanse ved 280 nm. Topp BMP-2 dimerfraksjoner (som eluerer mellom 45 og 48 minutter) ble slått sammen, analysert ved 16% tricin-SDS-PAGE og testet for biologisk aktivitet i analyser beskrevet i eksemplene 9 og 10.
Eksempel 9
W- 20 alkalisk fosfatase analyse protokoll
W-20-17 cellene ble sådd ut i 96 brønners vevskulturskåler ved en tetthet på 10.000 celler pr brønn i 200 ul medium (DME med 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum, 2 mM glutamin). Cellene ble tilkoblet over natt i en 95% luft, 5% CO2 inkubator ved 37°C.
200 ul medium blir fjernet fra hver brønn med en multikanal pipette og erstattet med et likt volum testprøve levert i DME med 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum, 2 mM glutamin og 1% penicillin-streptomycin.
Testprøvene og standardene ble gitt en 24 timer lang inkubasjonsperiode med W-20-17 indikatorcellene. Etter 24 timer blir skålene fjernet fra 37°C inkubatoren og testmediet blir fjernet fra cellene.
W-20-17 cellelagene ble vasket tre ganger med 200 |xl pr brønn kalsium/magnesium fri fosfatbufret saltvann og disse vaskeløsningene blir fjernet. 50 (il glassdestillert vann blir tilsatt til hver brønn og analyseskålene blir deretter plassert på et tørris-/etanolbad for hurtig frysing. Når frossen blir analyseplatene fjernet fra tørris-/etanolbadet og tint ved 37°C. Dette trinnet blir gjentatt to ytterligere ganger i totalt 3 fryse-tine prosedyrer. Når fullført er membranbundet alkalisk fosfatase tilgjen-gelig for måling. 50 (il analyseblanding (50 mM glycin, 0,05% Triton X-100,4 mM MgCl2,5 mM p-nitrofenolfosfat, pH = 10,3) blir tilsatt til hver analysebrønn og analyseskålene blir deretter inkubert i 30 minutter ved 37°C i et ristevannbad ved 60 oscillasjoner pr minutt.
Etter 30 minutters inkubasjon blir reaksjonen stoppet ved tilsetning av 100 (il 0,2 n NaOH til hver brønn og plassering av analyseplatene på is.
Spektrofotometrisk absorbanse for hver brønn blir avlest ved en bølgelengde på 405 na-nometere. Disse verdiene blir deretter sammenlignet med kjente standarder for å gi et estimat på alkalisk fosfataseaktivitet i hver prøve. For eksempel ved anvendelse av kjente mengder p-nitrofenolfosfat blir absorbanseverdiene dannet. Dette er vist i tabell I. Absorbanseverdier for kjente mengder BMP-2 kan bestemmes og omdannes til umol p-nitrofenolfosfat spaltet pr enhetstid som vist i tabell IL Disse verdiene blir deretter anvendt for å sammenligne aktivitetene til kjente mengder BMP heterodimerer med BMP-2 homodimer.
Eksempel 10
Rosen- modifisert Sampath- Reddi analyse
Etanolpresipiteringstrinnet ifølge Sampath-Reddi prosedyren angitt ovenfor blir erstattet med dialysering (dersom sammensetningen er en oppløsning) eller diafiltrering (dersom sammensetningen er en suspensjon) av fraksjonen som skal bh analysert mot vann. Oppløsningen eller suspensjonen blir deretter på ny oppløst i 0,1% TFA, og den resulterende oppløsningen blir tilsatt til 20 mg rottematrise. En "narre rotte" matriseprøve som ikke er blitt behandlet med proteinet virker som en kontroll. Dette materialet blir frosset og lyofilisert og resulterende pulvere innesluttet i nr 5 gelatinkapsler. Kapslene blir implantert subkutant i abdominal torax område til 21-49 dager hann Long Evans rotter. Implantatene blir fjernet etter 7-14 dager. Halvparten av hvert implantat blir anvendt for alkalisk fosfataseanalyser (se A.H. Reddi, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 69:1601 (1972)].
Den andre halvparten av hvert implantat blir fiksert og behandlet for histologiske analyser. En iim glykol metakrylatdel blir farget med Von Kossa og sur fuschin for å regi-strere mengden av indusert ben og bruskdannelse til stede i hvert implantat. Angivelsene +1 til og med +5 representerer området for hvert histologisk snitt av et implantat som er okkupert av nye ben og/eller bruskceller og matriser. En registrering på +5 indikerer at mer enn 50% av implantatet er nytt ben og/eller brusk produsert som et direkte resultat av proteinet i implantatet. En registrering på 44, +3, +2 og +1 indikerer at mer enn 40%, 30%, 20% og 10% ab implantatet inneholder nytt brusk og/eller ben.
Claims (16)
1.
Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-4 som vist i SEQ ID NO: 3, hvor nukleotidtripletten ved 319 til 321 er blitt erstattet med en triplett kodende for asparaginsyre.
2.
Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-5 som vist i SEQ ID NO: 5, hvor nukleotidtripletten ved 166 til 168 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
3.
Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-6 som vist i SEQ ID NO: 7, hvor nukleotidtripletten ved 166 til 168 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
4.
Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-7 som vist i SEQ ID NO: 9 hvor nukleotidtripletten ved 187 til 189 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
5.
Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for BMP-8 som vist i SEQ ID NO: 11, hvor nukleotidtripletten ved 187 til 189 er blitt erstattet med en triplett kodende for histidin.
6.
Renset sammensetning av en mutant BMP-4, karakterisert v e d at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 4, hvori glutaminsyren ved aminosyreresidiet 107 er blitt erstattet med asparagin.
7.
Renset sammensetning av en mutant BMP-5, karakterisert v e d at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 6, hvori alanin ved aminosyreresidiet 56 er blitt erstattet med histidin.
8.
Renset sammensetning av en mutant BMP-6, karakterisert v e d at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ TD NO: 8, hvori alanin ved aminosyreresidiet 56 er blitt erstattet med histidin.
9.
Renset sammensetning av en mutant BMP-7, karakterisert v e d at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 10, hvori alanin ved aminosyreresidiet 63 er blitt erstattet med histidin.
10.
Renset sammensetning av en mutant BMP-8, karakterisert v e d at den omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 12, hvori serin ved aminosyreresidiet 63 er blitt erstattet med histidin.
11.
Renset sammensetning av BMP heterodimer, karakterisert v e d at den omfatter minst en mutant ifølge krav 6.
12.
Renset sammensetning av BMP heterodimer, karakterisert v e d at den omfatter minst en mutant BMP ifølge krav 7.
13.
Renset sammensetning av BMP heterodimer, karakterisert v e d at den omfatter minst en BMP mutant ifølge krav8.
14.
Renset sammensetning av BMP heterodimer, karakterisert v e d at den omfatter minst en mutant BMP ifølge krav 9.
15.
Renset sammensetning av BMP heterodimer, karakterisert v e d at den omfatter minst en mutant BMP ifølge krav 10.
16.
Fremgangsmåte for fremstilling av benmorfogenetiske proteiner (BMP), karakterisert ved at nevnte proteiner kodes av DNA-molekylene ifølge krav 1-5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/163,877 US5399677A (en) | 1993-12-07 | 1993-12-07 | Mutants of bone morphogenetic proteins |
| PCT/US1994/013181 WO1995016034A1 (en) | 1993-12-07 | 1994-11-15 | Mutants of bone morphogenetic proteins |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO962303D0 NO962303D0 (no) | 1996-06-04 |
| NO962303L NO962303L (no) | 1996-06-04 |
| NO317800B1 true NO317800B1 (no) | 2004-12-13 |
Family
ID=22591964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19962303A NO317800B1 (no) | 1993-12-07 | 1996-06-04 | Rekombinante DNA-molekyler som koder for benmorfogene proteiner og rensede sammensetninger og fremgangsmater derav. |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5399677A (no) |
| EP (1) | EP0733108B1 (no) |
| JP (1) | JP3704350B2 (no) |
| KR (1) | KR100361058B1 (no) |
| AT (1) | ATE200515T1 (no) |
| AU (1) | AU682238B2 (no) |
| CA (1) | CA2176943C (no) |
| DE (1) | DE69427093T2 (no) |
| DK (1) | DK0733108T3 (no) |
| ES (1) | ES2157313T3 (no) |
| FI (1) | FI118428B (no) |
| GR (1) | GR3035769T3 (no) |
| NO (1) | NO317800B1 (no) |
| OA (1) | OA10294A (no) |
| PT (1) | PT733108E (no) |
| WO (1) | WO1995016034A1 (no) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6150328A (en) * | 1986-07-01 | 2000-11-21 | Genetics Institute, Inc. | BMP products |
| US20080139474A1 (en) * | 1991-11-04 | 2008-06-12 | David Israel | Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use |
| KR100259827B1 (ko) | 1991-11-04 | 2000-06-15 | 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저 | 재조합 골형태 형성 단백질 헤테로다이머, 그 조성물 및 사용방법 |
| US6291206B1 (en) * | 1993-09-17 | 2001-09-18 | Genetics Institute, Inc. | BMP receptor proteins |
| AU689184B2 (en) * | 1993-12-07 | 1998-03-26 | Genetics Institute, Llc | BMP-12, BMP-13 and tendon-inducing compositions thereof |
| US5942496A (en) | 1994-02-18 | 1999-08-24 | The Regent Of The University Of Michigan | Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells |
| US6551618B2 (en) | 1994-03-15 | 2003-04-22 | University Of Birmingham | Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival |
| US7235527B2 (en) | 1995-04-19 | 2007-06-26 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologieschen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Protein and process for producing the same |
| US6040431A (en) * | 1995-06-07 | 2000-03-21 | Stryker Corporation | Single chain analogs of the TGF-β superfamily (morphons) |
| US6048964A (en) * | 1995-12-12 | 2000-04-11 | Stryker Corporation | Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors |
| US7026292B1 (en) | 1995-12-12 | 2006-04-11 | Stryker Corporation | Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors |
| US5869041A (en) * | 1996-01-12 | 1999-02-09 | The Miriam Hospital | Delivery of bioactive compounds to an organism |
| US20040019185A1 (en) * | 1996-12-25 | 2004-01-29 | Hidetoshi Andou | Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor |
| US7811793B2 (en) * | 1996-12-25 | 2010-10-12 | Biopharma Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor |
| ZA9711580B (en) * | 1996-12-25 | 1999-09-23 | Hoechst Marion Roussel Ltd | Process for the production of purified dimeric bone morphogenetic factors. |
| US20020052026A1 (en) * | 1997-10-08 | 2002-05-02 | Steven M. Vicik | Methods of refolding proteins |
| US6391311B1 (en) | 1998-03-17 | 2002-05-21 | Genentech, Inc. | Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1 |
| EP2050762A3 (en) | 1998-03-10 | 2009-07-08 | Genentech, Inc. | Human cornichon-like protein and nucleic acids encoding it |
| AU758353B2 (en) * | 1998-03-17 | 2003-03-20 | Genentech Inc. | Polypeptides homologous to VEGF and BMP1 |
| US6677432B1 (en) | 1998-10-07 | 2004-01-13 | Stryker Corporation | Mutations of the C-terminal portion of TGF-β superfamily proteins |
| JP3762222B2 (ja) | 1998-10-07 | 2006-04-05 | ストライカー・コーポレーション | 改変型ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質 |
| US6846906B1 (en) | 1998-10-07 | 2005-01-25 | Stryker Corporation | Modified proteins of the TGF-β superfamily, including morphogenic proteins |
| US6727224B1 (en) * | 1999-02-01 | 2004-04-27 | Genetics Institute, Llc. | Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage |
| DE19906096A1 (de) | 1999-02-13 | 2000-08-17 | Walter Sebald | Protein mit einem Heparin-bindenden Epitop |
| DE19944626A1 (de) * | 1999-09-17 | 2001-03-22 | Knoell Hans Forschung Ev | Verfahren zur Herstellung von dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteinen |
| CA2386408A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Formulations of hyaluronic acid for delivery of osteogenic proteins |
| US7740841B1 (en) | 2000-01-28 | 2010-06-22 | Sunnybrook Health Science Center | Therapeutic method for reducing angiogenesis |
| US20030104977A1 (en) * | 2000-03-31 | 2003-06-05 | Ugo Ripamonti | Methods for inducing angiogenesis using morphogenic proteins and stimulatory factors |
| DE10026713A1 (de) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Walter Sebald | Mutein einer Kette eines Proteins aus der Superfamilie des Wachstumsfaktors TGF-beta |
| US20030082233A1 (en) * | 2000-12-01 | 2003-05-01 | Lyons Karen M. | Method and composition for modulating bone growth |
| EP1399023B1 (en) * | 2001-06-01 | 2008-04-30 | Wyeth | COMPOSITIONS FOR SYSTEMIC ADMINISTRATION OF SEQUENCES ENCODING BONE MORPHOGENETIC PROTEINS& x9; |
| TWI267378B (en) * | 2001-06-08 | 2006-12-01 | Wyeth Corp | Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins |
| FI117667B (fi) * | 2001-07-05 | 2007-01-15 | Univ Zuerich | Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä |
| MXPA04011337A (es) * | 2002-05-17 | 2005-07-01 | Wyeth Corp | Portadores de acido hialuronico solidos y susceptibles de ser inyectados para la liberacion de proteinas osteogenicas. |
| US20040023322A1 (en) * | 2002-08-01 | 2004-02-05 | Goodheart Clyde R. | Method of producing non-recombinant BMP-2 and use thereof |
| CA2531969C (en) * | 2003-07-09 | 2011-04-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Protein-refolding material |
| PL1675608T3 (pl) * | 2003-09-12 | 2007-11-30 | Wyeth Corp | Stałe fosforanowo wapniowe pałeczki do wstrzyknięć dla dostarczania białek osteogennych |
| WO2005037232A2 (en) | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods and compositions for modulating adipocyte function |
| US20070066525A1 (en) * | 2004-02-04 | 2007-03-22 | Lee John C | Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins |
| CA2566333A1 (en) * | 2004-05-19 | 2005-12-01 | Wyeth | Modulation of immunoglobulin production and atopic disorders |
| CA2574848A1 (en) * | 2004-08-05 | 2006-12-21 | Wyeth | Antagonizing interleukin-21 receptor activity |
| EP2322553A3 (en) * | 2005-02-14 | 2011-11-16 | Wyeth LLC | Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor |
| CN101160528A (zh) * | 2005-02-14 | 2008-04-09 | 惠氏公司 | Il17-f在诊断和治疗气道炎症中的用途 |
| JP2008534607A (ja) * | 2005-03-30 | 2008-08-28 | ワイス | Ｂｍｐを投与することによって毛髪の成長を刺激するための方法 |
| GT200600148A (es) | 2005-04-14 | 2006-11-22 | Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis | |
| EP1885751B1 (en) | 2005-05-27 | 2011-11-16 | BBS - Bioactive Bone Substitutes Oy | Bone morphogenetic protein 6 containing a heparin binding site and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof |
| WO2006125866A1 (en) | 2005-05-27 | 2006-11-30 | Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oy | Bone morphogenetic protein 3 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof |
| ATE520711T1 (de) | 2005-05-27 | 2011-09-15 | Bbs Bioactive Bone Substitutes Oy | Knochenmorphogenetisches protein 4 und osteogene vorrichtungen und pharmazeutische produkte, die dieses enthalten |
| WO2006130690A2 (en) | 2005-06-01 | 2006-12-07 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods and compositions for inducing brown adipogenesis |
| GB0604938D0 (en) | 2006-03-11 | 2006-04-19 | Renovo Ltd | Proteins, nucleic acids and medicaments |
| GB0604966D0 (en) | 2006-03-11 | 2006-04-19 | Renovo Ltd | Medicaments and proteins |
| GB0604964D0 (en) | 2006-03-11 | 2006-04-19 | Renovo Ltd | Protein folding |
| JP2009538140A (ja) * | 2006-05-25 | 2009-11-05 | ワイス | 血管疾患および炎症性疾患でのシステインプロテアーゼレグマインの発現 |
| SI2078071T1 (sl) * | 2006-11-08 | 2015-05-29 | Wyeth Llc | Racionalno zasnovana gojišča za celično kulturo |
| AU2007339280B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-12-05 | Stryker Corporation | Sustained-release formulations comprising crystals, macromolecular gels, and particulate suspensions of biologic agents |
| CL2008000883A1 (es) * | 2007-03-28 | 2008-10-03 | Wyeth6 3 | Metodo de deteccion de compuestos capaces de antagonizar la senalizacion de il-17f/il-17a; compuesto identificado por dicho metodo; uso de una cantidad de un antagonista de senalizacion de il-17f/il-17a, composicion farmaceutica que comprende dicho a |
| TW200902708A (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-16 | Wyeth Corp | Methods of protein production using anti-senescence compounds |
| EP2019117A1 (en) * | 2007-07-27 | 2009-01-28 | BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH | Optimized purification process of recombinant growth factor protein |
| EP2188371B1 (en) * | 2007-08-09 | 2017-12-20 | Wyeth LLC | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| EP2350130B1 (en) * | 2008-10-31 | 2018-10-03 | Wyeth LLC | Purification of acidic proteins using ceramic hydroxyapatite chromatography |
| US20100204123A1 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-12 | Mary Elizabeth Pecquet Goad | Peripheral Administration of Proteins Including TGF-beta Superfamily Members for Treatment of Systemic Disorders and Disease |
| CA2752160A1 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Stryker Corporation | Compositions and methods for minimally-invasive systemic delivery of proteins including tgf-.beta. superfamily members |
| WO2010110974A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Stryker Corporation | Methods and compositions for tissue engineering |
| US20110224138A1 (en) | 2009-09-09 | 2011-09-15 | Julie Krop | Methods for treating pain induced by injuries and diseases of an articular joint |
| EP2352750B1 (en) | 2009-09-17 | 2012-06-13 | Stryker Corporation | Buffers for controlling the ph of bone morphogenetic proteins |
| CN102822197A (zh) | 2009-12-22 | 2012-12-12 | 史赛克公司 | 具有降低的免疫原性的bmp-7变体 |
| CN109415425A (zh) * | 2016-05-31 | 2019-03-01 | 财团法人牧岩生命科学研究所 | TGF-β超家族的AB6家族设计配体 |
| US20190135884A1 (en) * | 2016-05-31 | 2019-05-09 | Mogam Institute For Biomedical Research | Composition comprising an ab6 family designer ligand of tgf-beta superfamily for treating bone and cartilage disease and use thereof |
| US20190135885A1 (en) * | 2016-05-31 | 2019-05-09 | Mogam Institute For Biomedical Research | Composition comprising an ab6 family designer ligand of tgf-beta superfamily for treating liver disease and use thereof |
| EP4126919A1 (en) * | 2020-03-24 | 2023-02-08 | Bio-Techne Corporation | Methods of using a tgf beta knockout cell line and compositions resulting therefrom |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR79124B (no) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| US5013649A (en) * | 1986-07-01 | 1991-05-07 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding osteoinductive products |
| ZA874681B (en) * | 1986-07-01 | 1988-04-27 | Genetics Inst | Novel osteoinductive factors |
| US5106748A (en) * | 1986-07-01 | 1992-04-21 | Genetics Institute, Inc. | Dna sequences encoding 5 proteins |
| US5187076A (en) * | 1986-07-01 | 1993-02-16 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding BMP-6 proteins |
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| JPH06500991A (ja) * | 1990-05-16 | 1994-01-27 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | 骨および軟骨誘導蛋白質 |
| DK0575555T3 (da) * | 1991-03-11 | 2001-11-05 | Curis Inc | Proteininduceret morfogenese |
| DK0592562T3 (da) * | 1991-06-25 | 1999-08-30 | Genetics Inst | BMP-9-præparater |
| KR100259827B1 (ko) * | 1991-11-04 | 2000-06-15 | 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저 | 재조합 골형태 형성 단백질 헤테로다이머, 그 조성물 및 사용방법 |
-
1993
- 1993-12-07 US US08/163,877 patent/US5399677A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-11-15 EP EP95903116A patent/EP0733108B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 AT AT95903116T patent/ATE200515T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-11-15 ES ES95903116T patent/ES2157313T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 DE DE69427093T patent/DE69427093T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 KR KR1019960703011A patent/KR100361058B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-11-15 PT PT95903116T patent/PT733108E/pt unknown
- 1994-11-15 CA CA002176943A patent/CA2176943C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-15 JP JP51619695A patent/JP3704350B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-15 AU AU12093/95A patent/AU682238B2/en not_active Ceased
- 1994-11-15 DK DK95903116T patent/DK0733108T3/da active
- 1994-11-15 WO PCT/US1994/013181 patent/WO1995016034A1/en active IP Right Grant
- 1994-12-21 US US08/360,914 patent/US5756308A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-04 NO NO19962303A patent/NO317800B1/no unknown
- 1996-06-06 FI FI962349A patent/FI118428B/fi active IP Right Grant
- 1996-06-07 OA OA60839A patent/OA10294A/en unknown
- 1996-10-31 US US08/741,589 patent/US5804416A/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-04-20 GR GR20010400618T patent/GR3035769T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO962303D0 (no) | 1996-06-04 |
| PT733108E (pt) | 2001-08-30 |
| FI962349A (fi) | 1996-07-16 |
| GR3035769T3 (en) | 2001-07-31 |
| EP0733108A1 (en) | 1996-09-25 |
| JPH09506259A (ja) | 1997-06-24 |
| US5804416A (en) | 1998-09-08 |
| AU682238B2 (en) | 1997-09-25 |
| OA10294A (en) | 1997-10-07 |
| US5399677A (en) | 1995-03-21 |
| AU1209395A (en) | 1995-06-27 |
| JP3704350B2 (ja) | 2005-10-12 |
| US5756308A (en) | 1998-05-26 |
| WO1995016034A1 (en) | 1995-06-15 |
| CA2176943C (en) | 2007-04-03 |
| DE69427093D1 (de) | 2001-05-17 |
| ATE200515T1 (de) | 2001-04-15 |
| KR100361058B1 (ko) | 2003-04-10 |
| DK0733108T3 (da) | 2001-06-18 |
| FI962349A0 (fi) | 1996-06-06 |
| DE69427093T2 (de) | 2001-11-15 |
| FI118428B (fi) | 2007-11-15 |
| EP0733108B1 (en) | 2001-04-11 |
| NO962303L (no) | 1996-06-04 |
| CA2176943A1 (en) | 1995-06-15 |
| ES2157313T3 (es) | 2001-08-16 |
| KR960706558A (ko) | 1996-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO317800B1 (no) | Rekombinante DNA-molekyler som koder for benmorfogene proteiner og rensede sammensetninger og fremgangsmater derav. | |
| EP1021528B1 (en) | Methods of refolding proteins by use of zwitterionic low molecular weight agents | |
| NO317801B1 (no) | DNA-molekyl, kimaert DNA-molekyl eller vektor som koder for BMP12 eller BMP12-relaterte proteiner, og vertceller, fremgangsmater, proteiner, sammensetninger og anvendelse derav. | |
| NO300329B1 (no) | Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner | |
| NO317730B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av dimerisk, biologisk aktivt TGF-beta-lignende protein | |
| US7354901B2 (en) | Production of recombinant BMP-2 | |
| NO300067B1 (no) | Fremgangsmåte for å tilveiebringe renset, biologisk aktiv CSF-1 dimer | |
| AU690311B2 (en) | Novel process for the production of biologically active dimeric protein | |
| Sharma et al. | Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli | |
| US7947821B2 (en) | Optimized DNA sequences encoding recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2), preparation method and the uses thereof | |
| EP0496833A1 (en) | BIOSYNTHETIC CONSTRUCTS OF TGF-$g(b) | |
| Andrades et al. | Production of a recombinant human basic fibroblast growth factor with a collagen binding domain | |
| MXPA00003436A (es) | Metodo para el repliegue de proteinas mediante el uso de agentes zwitterionicos de bajo peso molecular | |
| Yoon et al. | Overproduction of recombinant human bone morphogenetic protein-7 in Chinese hamster ovary cells | |
| CA2574929C (en) | Bone morphogenetic protein (bmp)-17 and bmp-18 and compositions | |
| CZ2021303A3 (cs) | Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití | |
| JPH09262093A (ja) | 蛋白質の活性化方法 |