ES2824479T3 - Polipéptido FGF2 termoestable, utilización del mismo - Google Patents
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Abstract
Polipéptido termoestable que posee actividad de FGF2 y que tiene, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y que comprende, como mínimo, una sustitución de aminoácidos R31L.
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptido FGF2 termoestable, utilización del mismo
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2, bFGF) modificado genéticamente que tiene estabilidad térmica mejorada en comparación con el de tipo salvaje y a la utilización del mismo en la investigación de biología celular, medicina regenerativa y aplicaciones médicas relacionadas o productos cosméticos. La presente invención se refiere además a un medio de cultivo que comprende FGF2 adecuado para cultivar células madre pluripotentes humanas que implican tanto células madre embrionarias humanas como células madre pluripotentes inducidas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2, del inglés Fibroblast Growth Factor, también conocido como FGF básico, bFGF) es un regulador pleiotrópico de la proliferación, la diferenciación, la migración y la supervivencia en una variedad de tipos de células y es un componente esencial de los medios para las células madre pluripotentes humanas (PSC, de Pluripotent Stem Cell) dado que ayuda a mantener las células en estado pluripotente. La pluripotencia es la capacidad de las células para experimentar una autorrenovación indefinida y diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo humano. Esta propiedad hace que las células sean valiosas para estudiar la embriogénesis, para el descubrimiento de fármacos y para las terapias basadas en células. Entre otras actividades biológicas importantes de FGF2 que cubren la utilización médica se incluyen la promoción de la angiogénesis, la promoción de la cicatrización de heridas, la promoción de la condrogénesis u osteogénesis y la promoción de la neurogénesis.
Sin embargo, la baja estabilidad y la corta semivida de los FGF2 de tipo salvaje no es práctica para diversas aplicaciones, entre las que se incluye el cultivo de PSC. La semivida de la molécula de tipo salvaje es de menos de 24 horas en las condiciones utilizadas normalmente para cultivar PSC humanas, lo que hace necesario reemplazos frecuentes, lo cual es motivo de preocupación en la industria desde una perspectiva de costes (Lotz, et al. 2013, PLoS One 8: e56289). En la Patente US8,481,308 se da a conocer un procedimiento para cultivar células madre o progenitoras de mamífero en presencia de una concentración sostenida de FGF2. Además, debido a la degradación continua de los FGF2, las células madre están expuestas a la fluctuación de su concentración, lo que puede contribuir a una rápida disminución de la señalización adecuada, que es esencial para la pluripotencia. La estabilidad termodinámica de una proteína es de particular importancia en aplicaciones terapéuticas, dado que las formas desplegadas o agregadas de una proteína pueden ser potencialmente tóxicas e inmunogénicas.
Tradicionalmente, el FGF2 se estabiliza mediante la adición de heparina, que protege el FGF2 de la desnaturalización mediante calor y ácido, y también prolonga su semivida. Sin embargo, la heparina la producen los mastocitos en el cuerpo, por lo que su utilización no es fisiológica en la mayoría de las células/tejidos regulados por el FGF2 in vivo. Además, debido a las propiedades anticoagulantes de la heparina y los riesgos de inducir reacciones alérgicas, no es adecuado utilizar estas preparaciones con fines médicos y cosméticos. Por lo tanto, continúa la necesidad en la técnica de procedimientos nuevos y mejorados que permitan obtener una composición de FGF2 asequible que tenga una mayor estabilidad y una semivida funcional más larga sin necesidad de heparina. La Patente WO2013/082196 describe conjugados de polímeros de sulfonato miméticos de heparina (tales como poli(sulfonato de estireno)) o copolímeros (tales como poli(sulfonato de estireno-co-poli(metacrilato de polietilenglicol) y FGF2, a efectos de estabilizar FGF2 conservando toda su actividad de factor de crecimiento. La estabilización de los FGF mediante la adición de algunos agentes está descrita en diversos documentos de patente, tales como la Patente US7,754,686 (adición de un agente reductor para inhibir las oxidaciones de FGF), la Patente US5,202,311 (adición de octasulfato de sacarosa), la Patente US5,189,148 (adición de hidroxipropilcelulosa insoluble en agua) y la Patente EP0345660 (adición de sulfato de glucano). Sin embargo, la desventaja de estas preparaciones es, como en el caso del FGF2 formulado con heparina, la presencia de compuestos potencialmente nocivos que no son adecuados para fines médicos y de cuidado diario.
La ingeniería de proteínas ofrece una solución de gran alcance para estabilizar proteínas sin aditivos. Por consiguiente, se describen mutantes de FGF1 y FGF2 que pertenecen a la misma subfamilia que tienen una estabilidad y/o función mejoradas. Las aplicaciones biotecnológicas de FGF1 son aún más limitadas en comparación con FGF2, principalmente debido a su alta inestabilidad intrínseca.
La Patente US2008/038287 se refiere al diseño, a la fabricación y a la utilización de polipéptidos FGF2 o FGF4 que tienen una especificidad de receptor mejorada que se consigue mediante el truncamiento del extremo N-terminal y, opcionalmente, la sustitución de aminoácidos del extremo N-terminal. Sin embargo, no se da a conocer ni sostiene que la mutación o el truncamiento en los residuos N-terminales afecten a la termoestabilidad de los FGF.
La Patente US2012/0225479 se refiere a mutantes de FGF2 humano modificados genéticamente con
termoestabilidad aumentada y al procedimiento de utilización de los mismos en el cultivo de células madre embrionarias. Los autores utilizaron las sustituciones Q65I, N111G y C96S de la secuencia de FGF2 salvaje, identificadas por alineación simple de secuencias de aminoácidos entre FGF2 y el mutante de FGF1 estabilizado, informado por Zakrzewska et al. (Zakrzewska M, 2005 J Mol Biol). Los mutantes descritos muestran un cierto nivel de estabilización, pero sin mantener su actividad biológica durante más tiempo a temperaturas más elevadas.
La Patente US2013/0236959 describe un mutante termoestable específico de FGF2 K128N. K128 es un aminoácido que, en el caso del FGF2 de tipo salvaje, contribuye significativamente a la unión de heparina y proteoglicano de heparán sulfato (HSPG, de Heparan Sulfate ProteoGlycan). De este modo, la sustitución de aminoácidos en esta posición disminuye la capacidad de FGF2 para unirse a HSPG, lo que puede afectar negativamente a la actividad biológica específica de FGF2, dado que la unión de FGF2 a HSPG es uno de los componentes funcionales críticos en la activación del receptor de FGF. El mecanismo general de señalización de FGF implica heparina o HSPG, que actúan como correceptores para facilitar la oligomerización de FGF y la unión de FGF a sus receptores de tirosina quinasa (FGFR, de Fibroblast Growth Factor Receptor), lo que conduce a la oligomerización y señalización de FGFR. También se describe una sustitución en el dominio de unión de heparina/HSPG en la Patente US2013/0157359. Esta solicitud se refiere a la utilización de dos variantes de FGF1 que tienen termoestabilidad mejorada mediante la introducción de tres y cuatro sustituciones de aminoácidos. La estabilización de FGF1 independiente de la heparina se consiguió mediante la mutación de un residuo K112 que es importante para la unión de HSPG.
La Patente US8,461,111 se refiere a FGF1 modificado genéticamente que tiene una semivida funcional mejorada mediante la introducción de mutaciones de empaquetamiento de núcleo.
La Patente US8,119,776 se refiere a FGF1 modificado genéticamente que tiene termoestabilidad y potencia mitógena aumentadas mediante la sustitución de los residuos 12 y 134.
El estado general de la técnica anterior se ha dado a conocer en las Patentes US6083706, WO95/08630, WO2004/069298, EP2333074, US2010/221232, US2007/212332, WO2013/184962, WO2012/158244, EP2930181, WO2013/090919 y en el documento de M. Buchtova et al: “Instability restricts signaling of multiple fibroblast growth factors”, CMLS Cellular and molecular life sciences., Vol. 72, no.12, (2015).
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
Es un objetivo de la presente invención dar a conocer FGF2 con una termoestabilidad que reduciría significativamente el coste de los cultivos, podría conducir a la mejora de la calidad de las células cultivadas y a una manipulación menos exigente. Además, se podría utilizar en medicina regenerativa y aplicaciones médicas relacionadas o productos cosméticos.
Los inconvenientes que son resultado de las soluciones del estado de la técnica son superados por la presente invención, que presenta un polipéptido aislado termoestable que posee actividad de FGF2 y consiste en el polipéptido FGF2 que tiene el 85 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2. Al mismo tiempo, el polipéptido FGF2 comprende, como mínimo, una sustitución de aminoácidos seleccionada entre R31L o H59F; o, como mínimo, una combinación de dos sustituciones R31L y H59F. Esto significa que el polipéptido, según la presente invención, presenta siempre, como mínimo, una sustitución R31L o H59F; o, como mínimo, la combinación de dos sustituciones R31L y H59F.
De manera ventajosa, los polipéptidos de FGF-2 objetivo o fragmentos de los mismos, según la presente invención, muestran una actividad biológica estable y sin cambios a temperatura elevada durante un tiempo prolongado (por ejemplo, véase la figura 11).
Los polipéptidos FGF2 termoestables o los fragmentos de los mismos, según la presente invención, se benefician especialmente del hecho de que son notablemente más estables, en comparación con el FGF2 de tipo salvaje. Esta estabilidad es inherente al FGF2; no se tienen que añadir compuestos adicionales, tales como la heparina. Además, ninguna de las posiciones de aminoácidos que son esenciales para la actividad biológica de FGF2 están sustituidas o truncadas. Los mutantes de FGF2 objetivo, así como los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar tanto en prácticas clínicas como de investigación.
Los polipéptidos FGF2 termoestables o los fragmentos de los mismos, según la presente invención, poseen actividad de FGF2 y una temperatura de fusión aumentada de 1 a 20 °C, preferentemente, de 8 a 20 °C, más preferentemente, de 14 a 20 °C, en comparación con el polipéptido FGF2 de tipo salvaje. Se construyeron todos y cada uno de los 13 mutantes de un solo punto, se subclonaron en el vector de expresión pET28b, se purificaron (pureza > 95 % según se juzga mediante análisis de SDS-PAGE) y, posteriormente, se caracterizaron mediante su temperatura de fusión.
En un aspecto adicional, la presente invención da a conocer el polipéptido FGF2 que tiene, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y que comprende, como mínimo, la sustitución de aminoácidos R31L.
Las realizaciones preferentes de la presente invención dan a conocer los polipéptidos FGF2 termoestables, que tienen la SEQ ID NO: 2, que comprenden, como mínimo, la sustitución de aminoácidos R31L.
Los polipéptidos más preferentes son los que comprenden las secuencias seleccionadas entre la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID. NO: 16, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 28.
Las realizaciones más preferentes de la presente invención dan a conocer el polipéptido FGF2 termoestable o el fragmento del mismo que comprende además, como mínimo, dos o, como mínimo, cinco o, como mínimo, ocho o, como mínimo, diez sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre un grupo que consiste en V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P, en el caso de que la sustitución esencial en el polipéptido FGF2 sea R31L.
Las realizaciones más preferentes de la presente invención dan a conocer el polipéptido FGF2 termoestable o el fragmento del mismo que comprende además, como mínimo, dos o, como mínimo, cinco o, como mínimo, ocho o, como mínimo, diez sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre un grupo que consiste en R31W, R31L, V52T, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P, en el caso de que la sustitución esencial en el polipéptido FGF2 sea H59F.
Las realizaciones más preferentes de la presente invención dan a conocer el polipéptido FGF2 termoestable o el fragmento del mismo que comprende además, como mínimo, una o, como mínimo, cuatro o, como mínimo, siete o, como mínimo, nueve sustituciones de aminoácidos seleccionados entre un grupo que consiste en V52T, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P en el caso de que las sustituciones esenciales en el polipéptido FGF2 sean la combinación de sustituciones R31L y H59F.
Las realizaciones más preferentes de la presente invención dan a conocer el polipéptido que comprende: (a) tres sustituciones de aminoácidos R31L, V52T, H59F, el más preferente es el polipéptido que tiene la sEq ID NO: 30, o (b) seis sustituciones de aminoácidos R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 32, o (c) nueve sustituciones de aminoácidos K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H, S109E, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 34, o (d) nueve sustituciones de aminoácidos R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 36, y (e) once sustituciones de aminoácidos K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 38.
Se deben considerar también como una parte del alcance de la presente invención las muteínas, tal como las que se describen a continuación.
La actividad biológica de los polipéptidos FGF2, o fragmentos de los mismos, o las muteínas de los mismos, según la presente invención, se puede expresar cuantitativamente mediante la EC50 para la proliferación de células NIH/3T3 en el intervalo de 0,1 a 5 ng/ml, preferentemente de 0,5 a 3 ng/ml. La actividad biológica de FGF2 se puede evaluar mediante un ensayo de proliferación de fibroblastos en cultivo, tal como se ha descrito anteriormente (Dubey, et al. 2007 J Mol Biol).
En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer el polipéptido FGF2 termoestable o el fragmento del mismo, según la presente invención, que se puede utilizar en medicina regenerativa (tal como, por ejemplo, la curación de heridas y úlceras, la consolidación de fracturas y la regeneración del tejido periodontal), y en otras aplicaciones médicas (tales como, por ejemplo, el tratamiento del cáncer, la terapia de enfermedades cardiovasculares y el tratamiento de trastornos del estado de ánimo) o en productos cosméticos (tal como, por ejemplo, la estimulación del cabello, el apoyo a la síntesis de colágeno y el tratamiento antienvejecimiento).
En un tercer aspecto, la presente invención da a conocer un medio de cultivo adecuado para cultivar células madre pluripotentes humanas en un estado indiferenciado, que comprende una cantidad eficaz del polipéptido FGF2 termoestable o el fragmento del mismo, según la presente invención, en el intervalo de 1,0 ng/ml a 100 ng/ml de medio de cultivo. Preferentemente, el medio de cultivo objetivo comprende el polipéptido FGF2 objetivo o el fragmento del mismo, según la presente invención, que comprende las sustituciones de aminoácidos (a) R31L, V52T, H59F, el más preferente es el polipéptido que tiene la sEq ID NO: 30, o (b) R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 32, o (c) K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H , S109E, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 34, o (d) R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P, el más preferente es el polipéptido que tiene la SeQ ID NO: 36, y (e) K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P, el más preferente es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 38.
Estas y otras características, objetivos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción. En la descripción, se hace referencia a los dibujos adjuntos, que forman parte de la misma y en los que se muestran, a modo de ilustración y no de limitación, realizaciones de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
A continuación se proporciona la definición de ciertos términos, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que el entendido de manera común por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término 'termoestabilidad' es sinónimo de la expresión 'estabilidad térmica' de la proteína y abarca las estabilidades termodinámica y cinética. La estabilidad termodinámica está relacionada con el equilibrio entre el estado plegado (nativo) y desplegado de la proteína y se define como la diferencia en la energía libre de Gibbs entre estos dos estados proteicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'temperatura de fusión' (Tm) de la proteína FGF2 se refiere a la temperatura a la que el 50 % de la proteína está plegada y el 50 % de la proteína está desplegada. La temperatura de fusión es una medida directa de la estabilidad termodinámica.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término 'semivida' de la proteína FGF2 se refiere a la cantidad de tiempo en el que la función biológica de la proteína FGF2 se reduce a la mitad en condiciones de proceso definidas. Por ejemplo, la semivida funcional se puede basar en la actividad biológica de la proteína FGF2 a lo largo del tiempo para inducir el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de las células. La semivida es una medida directa de la estabilidad cinética, que está relacionada con una barrera energética que separa el estado nativo de las formas proteicas no funcionales (estados desplegados, proteína desnaturalizada irreversiblemente). Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'de tipo salvaje' se refiere al FGF2 nativo que tiene la secuencia de aminoácidos más común de entre los miembros de una especie. En la presente memoria descriptiva, el FGF2 de tipo salvaje es el FGF2 humano, que es una proteína de 18 kDa con una longitud de 155 aminoácidos (SEQ ID NO: 2).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'polipéptido FGF2' se refiere a un polipéptido que posee actividad de fGF2 que tiene, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 o, preferentemente, que tiene la SEQ ID NO: 2, y que comprende, como mínimo, una sustitución de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en R31L o H59F; o, como mínimo, la combinación de dos sustituciones R31L y H59F, con una Tm que aumenta en, como mínimo, 1 °C, preferentemente en, como mínimo, 8 °C, más preferentemente en, como mínimo, 14 °C en comparación con la proteína FGF2 de tipo salvaje. La Tm se puede medir mediante cualquier procedimiento adecuado para la determinación de la temperatura de fusión, tal como espectroscopía de dicroísmo circular, calorimetría diferencial de barrido y ensayo de desplazamiento térmico fluorescente.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'mutante de FGF2 de 3 puntos' o “FGF2 CS1” se refiere a un polipéptido FGF2 que tiene la SEQ Id NO: 2 o el fragmento del mismo que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: R31L, V52T, H59F. Preferentemente, es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 30. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'mutante de FGF2 de 6 puntos' o “FGF2 CS2” se refiere a un polipéptido FGF2 que tiene la SEQ Id NO: 2 o el fragmento del mismo que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E. Preferentemente, es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 32.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'mutante de FGF2 de 9 puntos' o “FGF2 CS3” se refiere a un polipéptido FGF2 que tiene la SEQ Id NO: 2 o el fragmento del mismo que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H, S109E. Preferentemente, es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 34.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'mutante de FGF2 de 9 puntos' o “FGF2 CS4” se refiere a un polipéptido FGF2 que tiene la SEQ Id NO: 2 o el fragmento del mismo que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P. Preferentemente, es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 36.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'mutante de FGF2 de 11 puntos' o “FGF2 CS5” se refiere a un polipéptido FGF2 que tiene la SEQ ID NO: 2 o el fragmento del mismo que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P. Preferentemente, es el polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 38.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'polipéptido FGF2' es sinónimo de 'mutante de
FGF2' y se refiere a una secuencia de polipéptido modificada que tiene, como mínimo, una secuencia de aminoácidos diferente que presenta cualquiera de las sustituciones, según la presente invención, en comparación con la secuencia SEQ ID nO: 2 del FGF2 de tipo salvaje.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término 'polipéptido' es sinónimo de 'proteína'.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “actividad del FGF2” es sinónimo de la expresión “actividad biológica de FGF2”. Se refiere a la actividad biológica de polipéptidos FGF2, o fragmentos de los mismos, o muteínas de los mismos, según la presente invención. Conservan las porciones de unión a células y los segmentos de unión a heparina de la proteína FGF2 objetivo según la presente invención. Son capaces de unirse, como mínimo, a un receptor de FGF (FGFR) presente en la superficie de una célula, que es necesario para transducir la señal al interior de la célula y para desencadenar el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de las células cultivadas en relación con las células de control no tratadas. Dichas células pueden incluir, por ejemplo, células de origen mesenquimatoso en general, fibroblastos, neuroblastos, células gliales y otras células de origen nervioso, células de músculo liso, células endoteliales, etc., conocidas en la técnica por expresar uno o más FGFR o por responder a las proteínas FGF. El FGFR incluye diversos isotipos del receptor, entre los que se incluyen versiones solubles que comprenden el dominio extracelular y que carecen de los dominios transmembrana y quinasa. La actividad biológica se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo, proliferación celular y/o fosforilación de sustrato.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término 'fragmento' se refiere a fragmentos funcionales del polipéptido FGF2, según la presente invención, que poseen actividad de FGF2. Además, se refiere a fragmentos funcionales del polipéptido FGF2 que tienen, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2. El fragmento de polipéptido FGF2 también presenta, como mínimo, una o más sustituciones según la presente invención. Lo preferente es, como mínimo, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia. El fragmento pretende ser un polipéptido que consiste en solamente una parte de la secuencia y estructura del polipéptido intacto, y puede haber una deleción C-terminal o una deleción N-terminal de la variante. Estos fragmentos funcionales conservan las porciones de unión a células y los segmentos de unión a heparina de la proteína FGF2 objetivo según la presente invención. Los fragmentos de la proteína FGF2 objetivo, según la presente invención, conservan las propiedades deseadas, por lo que su Tm aumenta en, como mínimo, 1 °C, preferentemente en, como mínimo, 8 °C, más preferentemente en, como mínimo, 14 °C en comparación con el FGF2 de tipo salvaje, así como también pueden unirse a, como mínimo, un receptor de FGF presente en la superficie de una célula y desencadenar el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de las células cultivadas en relación con las células de control no tratadas.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término 'muteína' se refiere a muteínas funcionales de la proteína FGF2 o fragmentos de la misma, según la presente invención. Además, se refiere a muteínas funcionales de un polipéptido que tiene, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2 mostrando cualquiera de las sustituciones según la presente invención. Lo preferente es, como mínimo, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia. Esto significa que sus formas mutadas conservan cualquiera de las posibles sustituciones de aminoácidos, tales como las que se han descrito anteriormente para la proteína FGF2, según la presente invención, y, como mínimo, el 85 % o más de los residuos de la secuencia SEQ ID NO: 2. Dicha muteína funcional conserva la actividad biológica del FGF2 de esta secuencia de referencia. Preferentemente, las mutaciones son sustituciones que utilizan L-aminoácidos, en las que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido biológicamente similar. Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras se incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo por otro, o la sustitución de un residuo cargado o polar por otro. Preferentemente, las sustituciones se introducen en el extremo N-terminal de FGF2, que no está asociado con la actividad biológica.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'identidad de secuencia' implica que, dentro de la proteína FGF2, se encuentran los mismos residuos de aminoácidos, según la presente invención, tal como se ha definido anteriormente. La proteína FGF2 sirve como referencia cuando un segmento contiguo especificado de la secuencia de aminoácidos de la proteína FGF2 se alinea y se compara con la secuencia de aminoácidos de la molécula de referencia correspondiente particular. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en el segmento que se compara con la molécula de referencia y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los procedimientos de alineación de secuencias son bien conocidos en la técnica. La secuencia de referencia utilizada en la presente memoria descriptiva se refiere a una proteína FGF2 humana correspondiente particular, según la presente invención. En especies de mamíferos tales como, por ejemplo, ratón, rata, conejo, primate, cerdo, perro, vaca, caballo y ser humano, el FGF2 está altamente conservado y muestra, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia en una amplia gama de especies. Lo preferente es, como mínimo, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia. Una persona experta en la materia entenderá que el 15 % o menos restante de aminoácidos a lo largo de la proteína FGF2, según la presente invención, es variable debido a, por ejemplo, la utilización de diferentes fuentes de especies de FGF2 o la adición de un péptido, una secuencia o una etiqueta distintas de FGF adecuados conocidos generalmente en la
técnica, etc. Es poco probable que una proteína FGF2, según las realizaciones de la presente invención, que tiene, como mínimo, el 85 % de identidad con la FGF2 de tipo salvaje incluya proteínas distintas de las que se asemejan a FGF2, ya que otros miembros de la familia de FGF tienen generalmente una identidad de secuencia mucho menor. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'cantidad eficaz' implica la cantidad necesaria para mantener las células madre pluripotentes con una morfología indiferenciada durante, como mínimo, 5 pases. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'células madre pluripotentes humanas', que implican tanto células madre embrionarias humanas como células madre pluripotentes inducidas, se caracterizan por su capacidad de autorrenovación (capacidad para formar su propia progenie idéntica) y pluripotencia que les permite generar prácticamente todos los tipos de células del cuerpo humano.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión 'mantenimiento de células madre en estado pluripotente' se refiere a mantener las células en estado indiferenciado con capacidad de diferenciarse en prácticamente todos los tipos de células. El estado pluripotente depende del cóctel de factores de crecimiento que sostiene la pluripotencialidad (stemness), en el que FGF2 es de gran importancia. El FGF2 sostiene la autorrenovación de diversas maneras: activa directamente la ruta de la proteína quinasa activada por mitógenos e promueve indirectamente la señalización del factor de crecimiento transformante beta 1 y de la activina (Greber, et al. 2008, Stem Cells 25, 455-464). A través de su papel en la adhesión y la supervivencia celular, el FGF2 contribuye de manera compleja a la pluripotencia de las PSC humanas (Eisellova, et al. 2009, Stem Cells 27, 1847-1857). Descripción
El enfoque más atractivo para superar la inestabilidad de las proteínas FGF es modificar las propiedades de la proteína mediante mutagénesis. Al cambiar su secuencia de aminoácidos, una proteína FGF puede tener mayor estabilidad térmica, una mayor semivida, así como una mayor resistencia a la degradación proteolítica. La mutación de proteínas para optimizar sus propiedades es viable incluso para aplicaciones terapéuticas en seres humanos. La FDA ha aprobado diversas formas mutantes de proteínas para su utilización como productos farmacéuticos humanos.
La presente divulgación da a conocer polipéptidos FGF2, según la presente invención, estabilizados mediante ingeniería de proteínas. Las mutaciones estabilizantes se predicen racionalmente mediante análisis bioinformático y diseño computacional de proteínas. El procedimiento híbrido que combina la información del análisis evolutivo y los cálculos de campo de fuerza se enriquece con el filtrado inteligente y el juicio de expertos. Este enfoque conduce a predicciones in silico muy fiables de sustituciones estabilizantes. En consecuencia, los mutantes se preparan mediante mutagénesis dirigida lateralmente o se seleccionan a partir de grandes bibliotecas de saturación mediante un novedoso ensayo de detención del crecimiento. Los mutantes finales se recombinan mediante análisis computacional y se preparan mediante síntesis genética o mutagénesis.
En general, el gen que codifica para FGF2 se clona y, a continuación, se expresa en organismos transformados, preferentemente, un microorganismo. El organismo huésped expresa el gen exógeno para producir FGF2 en condiciones de expresión. El FGF2 recombinante sintético también se puede preparar en eucariotas, tal como en células de levadura o humanas. Cuando el FGF2 puede ser la forma de 146 aminoácidos, la forma de 153-155 aminoácidos o una mezcla de las mismas, dependiendo del procedimiento de producción recombinante (véase la Patente US5,143,829).
La temperatura de fusión es una medida directa de la estabilidad termodinámica. Entre los ejemplos de técnicas utilizadas para medir la temperatura de fusión están la espectroscopía de dicroísmo circular (CD, de Circular Dichroism), la calorimetría diferencial de barrido (DSC, de Differential Scanning Calorimetry) y el ensayo de desplazamiento térmico fluorescente (TSA, de Thermal Shift Assay). La espectroscopía de CD es un procedimiento sin etiquetas adecuado para controlar la estructura secundaria y los cambios conformacionales de las proteínas. La DSC es una técnica de análisis térmico que analiza cómo cambia la capacidad calorífica de una proteína durante el desplegamiento térmico. El TSA es un procedimiento de alta resolución que mide la estabilidad térmica de la estructura terciaria de la proteína utilizando una sonda fluorescente de unión a proteínas que detecta la agregación de proteínas. Aunque estas técnicas controlan los diferentes efectos que acompañan al despliegue de la proteína, los valores relativos calculados como la diferencia en Tm entre el FGF2 de tipo salvaje de referencia y un polipéptido FGF2, según la presente invención, son comparables con una variación inferior a 0,5 °C.
La divulgación presentada en la presente memoria descriptiva demuestra, por primera vez, que ciertos cambios en el FGF2 de tipo salvaje tienen como resultado mutantes de FGF2 que tienen una mayor estabilidad térmica y una semivida más prolongada en el cultivo de células humanas que la proteína de tipo salvaje.
La proteína FGF2, según la presente invención, utilizada para la inserción de las sustituciones descritas en la presente memoria descriptiva, puede ser de cualquier fuente de mamífero tal como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, primates, cerdos, perros, vacas, caballos y seres humanos, siempre que cumpla el criterio especificado en la presente memoria descriptiva, es decir, siempre que se estabilice térmicamente al tiempo que conserva la
actividad biológica deseada del FGF2 de tipo salvaje. Preferentemente, la proteína FGF2 objetivo se deriva de una fuente humana. Sin embargo, en la presente invención se puede utilizar cualquier variante biológicamente activa de FGF2 de mamífero que tenga, como mínimo, el 85 % y, más preferentemente, aproximadamente el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la proteína FGF2 humana de la SEQ ID NO: 2, que sirve como base para la comparación.
Según alguna realización, un polipéptido FGF2 estable, según la presente invención descrito en la presente memoria descriptiva, puede incluir además cualquier secuencia o etiqueta peptídica distinta de FGF adicional conocida generalmente en la técnica, que se puede utilizar para facilitar su detección, purificación, etiquetado hacia un tejido o una célula particular, solubilidad mejorada, actividad sostenida, expresión mejorada, etc.
La presente divulgación da a conocer también una caracterización del FGF2 objetivo modificado genéticamente, una demostración de los efectos de las sustituciones en las proteínas, los procedimientos para la utilización de las proteínas en el cultivo de PSC humanas y un medio que contiene, como mínimo, una proteína FGF2 termoestable descrita en la presente memoria descriptiva, adecuado para cultivar PSC humanas en un estado indiferenciado. Las células madre embrionarias humanas (ESC, de Embryonic Stem Cells) utilizadas en los ejemplos proporcionados en la presente memoria descriptiva se derivaron de embriones en etapa de blastocisto obtenidos con el consentimiento informado de los donantes. Se utilizó una línea de ESC humanas bien caracterizada (Adewumi, et al. 2007, Nat Biotechnol 25, 803-816), CCTL14 (Center of Cell Therapy Line), en los pases 29-41. En cuanto a las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC, de induced Pluripotent Stem Cells), se utilizó la línea AM13 derivada mediante la reprogramación de fibroblastos cutáneos mediante el cóctel de Yamanaka y la transfección del virus Sendai en los pases 34-41 (Krutá, et al. 2014, Stem Cells and Development 23, 2443-2454).
Las técnicas y los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva se realizan generalmente según los procedimientos convencionales que se proporcionan a lo largo de la presente memoria descriptiva. En general, la nomenclatura utilizada en la presente memoria descriptiva y los procedimientos de laboratorio en biología molecular, bioquímica, química analítica y cultivo celular son los bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica.
Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La presente invención se entenderá mejor y los aspectos y las ventajas distintos de los expuestos anteriormente serán evidentes cuando se tenga en cuenta la siguiente descripción detallada de la misma. Dicha descripción detallada hace referencia a los siguientes dibujos, en los que:
FIGURA 1. es el polipéptido FGF2 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2).
FIGURA 2. es la secuencia de nucleótidos de Fgf2 de tipo salvaje con secuencias en el sentido 5’ en el vector pET28b. El codón de inicio está en gris, la etiqueta de His está subrayada por una línea gruesa, el sitio de reconocimiento de escisión de trombina está en negro y los sitios de restricción NdeI y XhoI para la clonación en el vector de expresión pET28b están subrayados por una línea en negrita. La secuencia codificante de Fgf2 de tipo salvaje comienza con ATG y el codón de terminación es TAG.
FIGURA 3. muestra los geles de SDS-PAGE después de la expresión y purificación de mutantes de FGF2 de un solo punto (R31W, R31L, V52T, H59F, C78Y, N80G, L92Y, C96Y, S109E, R118W, T121K, V125L). Marcador de proteína: 116, 66,2, 45, 35, 25, 18,4, 14,4 kDa. Los mutantes recombinantes de FGF2 con etiqueta de 6xHis y sitio de escisión de trombina tienen un Pm de aproximadamente 19,1 kDa.
FIGURA 4. muestra la comparación de la termoestabilidad de mutantes de FGF2 individuales de un solo punto (R31W, R31L, V52T, H59F, C78Y, N80G, L92Y, C96Y, S109E, R118W, T121K, V125L) medida mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las mutaciones seleccionadas para la construcción de mutantes combinados se resaltan en gris.
FIGURA 5. es el SDS-PAGE de los mutantes FGF2 CS1 y CS2 purificados. Carril 1, marcador de proteína (116, 66,2, 45, 35, 25, 18,4, 14,4 kDa); carril 2, FGF2 CS1 purificado con etiqueta de 6x His y sitio de escisión de trombina de peso molecular 19,1 kDa, y carril 3, FGF2 CS2 purificado con etiqueta de 6x His y sitio de escisión de trombina de peso molecular 19,1 kDa.
FIGURA 6. muestra la comparación de la termoestabilidad del FGF2 de tipo salvaje con los mutantes FGF2 CS1 y FGF2 CS2. La temperatura de fusión (Tm) se determinó utilizando DSC.
FIGURA 7. muestra la capacidad de FGF2 de tipo salvaje, FGF2 CS1 y FGF2 CS2 para inhibir la proliferación de células RCS después de dos días de incubación a 36,5 y 41,5 °C. Se sembraron células RCS en placas de 96 pocillos. Los datos representan el promedio de seis pocillos con la desviación estándar indicada.
FIGURA 8. demuestra que FGF2 CS2 mantiene una morfología indiferenciada de las PSC humanas. Las PSC humanas, tanto ESC (CCTL14) como iPSC (AM13), se propagaron como colonias con la capa alimentadora (A) o como monocapas en Matrigel (B). Aunque la retirada del FGF2 exógeno provocó un retraso significativo del crecimiento, tanto el FGF2 de tipo salvaje como el FGF2 CS2 fueron capaces de dar lugar a colonias (A) y monocapas (B) con morfología indiferenciada. Barras de escala, 100 mm.
FIGURA 9. demuestra que FGF2 CS2 mantiene la expresión del marcador de pluripotencia de las PSC humanas.
Las PSC humanas, tanto ESC (CCTL14) como iPSC (AM13), se propagaron como colonias con la capa alimentadora (A) o como monocapas en Matrigel (B). Después de cinco pases en cada una de las condiciones ensayadas, las células se sometieron a inmunotinción con los marcadores de pluripotencia Oct4 y Nanog. Los controles negativos se incubaron sin anticuerpos primarios. FGF2 de tipo salvaje y FGF2 CS2 sostuvieron igualmente la expresión de Oct4 y Nanog. Barras de escala, 100 mm.
FIGURA 10. demuestra que fGF2 CS2 sostienen la proliferación de ESC humanas. (A) Se propagaron ESC humanas (CCTL14) en cada uno de los FGF2 analizados y se contaron los números de células durante cuatro días consecutivos. Se muestra el resultado representativo de dos experimentos. Cada punto de datos muestra la media ± EEM de tres pocillos. (B, C) Se adaptaron monocapas sin alimentador de ESC humanas (CCTL14) a cada uno de los FGF2 ensayados durante cinco pases. A continuación, se contaron las células tres días después de la siembra en placa y se representaron gráficamente como recuentos celulares relativos (B; n = 2). Alternativamente, las células se tiñeron por contraste con cristal violeta seis días después de la siembra en placa y los resultados se representaron gráficamente como densidades ópticas relativas (C; n = 3). Las columnas muestran las medias, las barras de error muestran el EEM. Prueba de la t de Student, ***p <0,001, **p <0,01, *p <0,05.
FIGURA 11. muestra la capacidad de FGF2 CS2 de mantener su actividad biológica durante una incubación prolongada a 37 °C. Se complementó el medio acondicionado (CM, de Conditioned Médium) con fibroblastos embrionarios de ratón preparado sin FGF2 exógeno con 10 ng/ml de FGF2 y se incubó a 37 °C durante 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 2 d, 3 d, 4 d o 5 d. A continuación, las ESC humanas (CCTL14) privadas de FGF2 se trataron con CM que contenía FGF2 incubado previamente con calor durante dos horas y se sometieron a inmunotransferencia para ERK1/2 fosforilado. Los niveles totales de ERK1/2 se utilizaron como controles de carga. Mientras que la actividad biológica del FGF2 de tipo salvaje disminuyó con el tiempo de incubación previa con calor, el FGF2 CS2 termoestabilizado conservó la actividad biológica completa incluso después de cinco días a 37 °C. Se muestran los resultados representativos de cuatro experimentos diferentes.
FIGURA 12. demuestra que FGF2 CS2 mantiene a las ESC humanas pluripotentes sin necesidad de un cambio de medio diario. Se hicieron crecer colonias de ESC humanas (CCTL14) en presencia de FGF2 CS2 termoestabilizado durante 5 pases, ya sea en concentración estándar (4 ng/ml) o disminuida (1 ng/ml) de FGF2. El medio se cambió solo cuando se dividieron las colonias, es decir, cada 3° a 4° día. Las colonias de ESC humanas conservaron tanto la morfología normal (A) como la expresión del marcador de pluripotencia (Oct4, B), incluso en la concentración reducida de FGF2.
FIGURA 13. demuestra que no se requiere la complementación repetida del medio acondicionado (CM) con FGF2 CS2. Para ensayar la estabilidad a largo plazo de FGF2, se preparó CM sin complementación adicional después de haber sido acondicionado mediante células alimentadoras. Se propagaron PSC humanas sin alimentador, tanto ESC (CCTL14) como iPSC (AM13), durante cinco pases con cada uno de los FGF2 ensayados, y se controló la expresión de los marcadores de pluripotencia (A) y la proliferación (B). La expresión de Oct4 permanece elevada con ambos FGF2 (A). Barras de escala, 100 mm. FGF2 CS2 muestra una capacidad superior para soportar la proliferación en comparación con el FGF2 de tipo salvaje (B). Las columnas muestran las medias, las barras de error muestran el EEM. Prueba de la t de Student, ***p <0,001, **p <0,01, *p <0,05.
FIGURA 14. muestra la preparación de medio acondicionado (CM). Para la preparación de CM estándar, se acondicionó el medio de PSC humanas completo con fibroblastos embrionarios de ratón (mEF) mitóticamente inactivados durante 5-7 días consecutivos y, a continuación, se complementó con 10 ng/ml de FGF2 para restaurar la concentración del factor de crecimiento debido a su degradación (CM I). Para la mayoría de los experimentos, el CM se preparó a partir de medio de PSC humanas que carecía de FGF2, y solamente el producto final se complementó con 10 ng/ml del FGF2 deseado (CM II). Alternativamente, para ensayar la termoestabilidad a largo plazo del FGF2, el CM se prepara a partir de un medio que contiene 10 ng/ml de FGF2 sin complementación posterior (CM III).
FIGURA 15. es un ejemplo de datos de salida del cribado de la actividad biológica de polipéptidos FGF2 mutados en extractos en bruto (Ce, de crude extract) que se originan a partir de la biblioteca FGF2-S152X. La codificación en el eje X corresponde a los pocillos de la placa de microtitulación original. Se añadió FGF2 en CE recién fundidos o CE incubados previamente a 41,5 °C a los condrocitos de rata cultivados en placas de microtitulación paralelas hasta la concentración final de 20 ng-ml-1 y se comparó la inhibición del crecimiento de condrocitos con las muestras que contenían controles midiendo la densidad óptica de las células. Controles: NEG, control negativo (plásmido vacío); R31L, control positivo (plásmido con mutante de un solo punto con estabilidad térmica mejorada); WT, control de referencia (plásmido con FGF2 de tipo salvaje). Se seleccionó como acierto positivo una muestra del clon H5 original que muestra una detención del crecimiento estadísticamente más significativa que el control de referencia.
FIGURA 16. es el SDS-PAGE con muestras de mutantes de FGF2 identificados en bibliotecas de mutagénesis de saturación después de la purificación mediante el sistema de purificación MagneHis® M, marcador de proteína (116, 66.2, 45, 35, 25, 18,4, 14,4 kDa). Las bandas de aproximadamente 19,1 kDa de mutantes recombinantes de FGF2 con etiqueta de 6x His y sitio de escisión de trombina están marcadas por el recuadro.
FIGURA 17. es el SDS-PAGE de los mutantes FGF2 CS3, CS4 y Cs5 purificados. Marcador de proteínas: 116, 66.2, 45, 35, 25, 18,4, 14,4 kDa. Los mutantes recombinantes de fGF2 con etiqueta de 6x His y sitio de escisión de trombina tienen un Pm de aproximadamente 19,1 kDa.
FIGURA 18. proliferación de células NIH/3T3 inducida por la proteína recombinante FGF2 CS4.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar las realizaciones de la presente invención. Los ejemplos
dados son únicamente de naturaleza ilustrativa y no pretenden constituir limitación. Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria descriptiva en los ensayos de la presente invención, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados.
EJEMPLO 1. Predicción del efecto estabilizante de mutaciones de un solo punto en FGF2 mediante un enfoque basado en energía
Se descargaron estructuras disponibles de FGF2 con resolución superior a 2,20 Á del RCSB Protein Data Bank (Berman et al., (2000). Nucleic Acids Res. 28, 235-242.). Las estructuras se prepararon para análisis eliminando ligandos y moléculas de agua. Se eligió una cadena en el caso de estructura de cadena múltiple. Todas las estructuras se volvieron a numerar para que comenzaran desde la posición 1. Las cadenas laterales de proteínas se minimizaron y calificaron para determinar si la minimización pasó correctamente. Los efectos de estabilidad de todas las posibles mutaciones de un solo punto se estimaron utilizando los cálculos del campo de fuerza. Se recogieron y promediaron las energías libres DDG sobre todas las estructuras utilizadas y posteriormente se promediaron las 20 mutaciones en una posición particular. Se estimó la conservación evolutiva mediante análisis filogenético de secuencias homólogas. Se seleccionaron para análisis adicionales las mutaciones con DDG < -1,0 kcal/mol y conservación < 8. Se identificaron las mejores posiciones con sólo una influencia limitada sobre las regiones funcionales, por ejemplo, residuos de unión a heparina. Se seleccionaron nueve sustituciones de un solo punto para la construcción y caracterización experimental: R31W, R31L, H59F, C78Y, L92Y, C96Y, R118W, T121K y V125L (tabla 1). La numeración de estos mutantes corresponde a la secuencia de FGF2 humano de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2 a continuación).
Tabla 1. Las mutaciones estabilizantes seleccionadas de acuerdo con la predicción de la energía libre, análisis de conservación e ins ección visual.
EJEMPLO 2. Predicción del efecto estabilizante de mutaciones de un solo punto en FGF2 mediante un enfoque basado en la evolución
Se construyó la alineación de secuencias múltiples de FGF2 con proteínas relacionadas. Se utilizó la secuencia de la proteína FGF2 como una consulta para la búsqueda de PSI-BLAST (Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402) contra la base de datos nr de NCBI. Se agruparon secuencias recogidas después de 3 iteraciones mediante Cd-HIT (Li & Godzik, (2006). Bioinformatics 22, 1658-1659) con un umbral de identidad del 90 %. Se agrupó el conjunto de datos resultante de más de 500 secuencias con CLANS (Frickey & Lupas, (2004). Bioinformatics. 20, 3702-3704) utilizando parámetros predeterminados- 30y umbrales de valor de P variables. Se extrajeron las secuencias agrupadas junto con FGF2 al valor de P de 10-30 y se alinearon con el programa MUSCLE (Edgar, (2004). BMC Bioinformatics. 5, 113.). La alineación final, que comprendía 238 secuencias, se utilizó como entrada para el análisis de vuelta al consenso utilizando el enfoque de consenso simple. El análisis se realizó utilizando el límite de consenso de 0,5, lo que significa que un residuo dado debe estar presente en una posición dad en, como mínimo, el 50 % de todas las secuencias analizadas para ser asignado como residuo de consenso. Se estimaron los efectos de estabilidad de todas las posibles mutaciones de un solo punto en la proteína FGF2 mediante cálculos de energía libre. Solo las mutaciones con un promedio predicho de DdG < 1 kcal/mol por ambos procedimientos se consideraron puntos críticos para la estabilización de FGF2. Se excluyeron los sitios funcionalmente importantes de FGF2, tales como mutaciones perjudiciales potencialmente para la función biológica. Los resultados del análisis de vuelta al consenso se resumen en la tabla 2. La numeración corresponde a la secuencia de FGF2 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2 a continuación). Se excluyeron diez mutaciones basándose en el elevado valor de DDG predicho y se descartaron tres mutaciones del diseño por su ubicación en posiciones importantes funcionalmente para la unión de heparina. Finalmente, tres mutaciones de un solo punto pasaron todos los criterios y se
seleccionaron para la construcción y caracterización experimental: V52T, N80G y S109E.
Tabla 2. Mutaciones de vuelta al consenso identificadas en FGF2 utilizando el límite de consenso del 50 %. Las mutaciones seleccionadas para las construcciones experimentales se resaltan en gris
Frec: frecuencia de un residuo de FGF-2 dado en una posición dada de la alineación de secuencia múltiple; RES_Top: el residuo más conservado en una posición dada de la alineación de secuencia múltiple; Freq_TOP: frecuencia del residuo más conservado en una posición dada de la alineación de secuencia múltiple; DDG: cambio en la energía libre de Gibbs tras la mutación.
EJEMPLO 3: Construcción de doce mutantes de un solo punto de FGF2 y su purificación hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad
Los mutantes FGF2 R31W, R31L, V52T, H59F, C78Y, N80G, L92Y, C96Y, S109E, R118W, T121K y V125L se sintetizaron comercialmente y se subclonaron en los sitios Ndel y Xhol del promotor T7 pET28b-His-trombina inducible en el sentido 3’. Las construcciones resultantes se transformaron en células competentes de Escherichia coli Dh5a. Se sembraron las células en placas de agar con kanamicina (50 mg-ml-1) y se hicieron crecer durante toda la noche a 37 °C. Los plásmidos se aislaron y las secuencias de nucleótidos se confirmaron mediante secuenciación comercial. Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) con vectores de expresión, se sembraron en placas de agar con kanamicina y se hicieron crecer durante toda la noche a 37 °C. Se utilizaron colonias individuales para inocular 10 ml de medio LB con kanamicina (50 mg-ml-1) y se hicieron crecer las células durante toda la noche a
37 °C. Se utilizó un cultivo de una noche para inocular 200 ml de medio LB con kanamicina. Las células se cultivaron a 37 °C. La expresión se indujo con isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,25 mM. A continuación, las células se cultivaron durante toda la noche a 20 °C. Al final del cultivo, la biomasa se recogió por centrifugación y se lavó con tampón (hidrogenofosfato de dipotasio y dihidrogenofosfato de potasio 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM). Se rompieron las células en suspensión mediante sonicación y se centrifugó el lisado celular. Se purificaron las proteínas a partir de extractos brutos utilizando cromatografía de afinidad de níquel de una sola etapa. La presencia de proteínas en las fracciones máximas se demostró mediante SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 15 %. La precipitación de proteínas se minimizó mediante diálisis contra tampón que contenía NaCl 500-750 mM. La purificación de mutantes de FGF2 mediante cromatografía de afinidad tuvo como resultado proteínas homogéneas con una pureza superior al 90 %, según se juzga mediante análisis de SDS PAGE (figura 3). Los rendimientos de mutantes de FGF2 purificados variaron de 15 a 90 mg-l-1.
EJEMPLO 4: Determinación de la termoestabilidad de mutantes de FGF2 de un solo punto mediante calorimetría diferencial de barrido
Se determinó la termoestabilidad de FGF2 de un solo punto, predicha por enfoques basados en energía y evolución, mediante ensayo de calorimetría diferencial de barrido (DSC). Se siguió el desplegamiento térmico de soluciones de proteína de 1,0 mg/ml en tampón fosfato 50 mM (pH 7,5) con cloruro de sodio 500-750 mM monitorizando la capacidad calorífica utilizando el sistema de DSC capilar VP. Las medicinas se realizaron a temperaturas desde 20 hasta 80 °C a una velocidad de calentamiento de 1 °C/min. La Tm se determinó como la temperatura a la que la curva de capacidad calorífica alcanzó el valor máximo. Los resultados se muestran en la tabla 4 y la figura 4.
Tabla 4. Termoestabilidad de mutantes de FGF2 determinada mediante calorimetría diferencial de barrido. Las mutaciones seleccionadas para la construcción de mutantes de 3 y 6 puntos combinados se resaltan en gris (véase el ejemplo 5).
Tm\ Temperatura de fusión; DTm: Cambio em la temperatura de fusión tras la mutación; ^ e presenta el promedio de tres experimentos independientes (las desviaciones estándar fueron menos del 10 %).
Este ejemplo demuestra que los procedimientos de predicción in-silico de la presente descripción son útiles para la predicción de la estabilización de las mutaciones en FGF2. Las mutaciones que mejoran la Tm en, como mínimo, 2 °C se combinaron utilizando cálculos de energía libre en mutantes de 3 puntos (R31L, V52T y H59F) y de 6 puntos (R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y y S109E) FGF CS1 y FGF2 CS2, respectivamente (véase el ejemplo 5).
EJEMPLO 5: Construcción, purificación y análisis de termoestabilidad de mutantes FGF2 CS1 de 3 puntos y FGF2 CS2 de 6 puntos
Se sintetizaron comercialmente mutantes de FGF2 de múltiples puntos y se subclonaron en los sitios Ndel y Xhol de promotor T7 inducible pET28b-His-trombina en el sentido 3’ (las secuencias de nucleótidos mutadas y de
polipéptidos se muestran en las SEQ ID NO: 29 a SEQ ID NO: 32, a continuación). Las construcciones resultantes se transformaron en células competentes de E. coli Dh5a. Las células se sembraron en placas de agar con kanamicina (50 mg-ml-1) y se hicieron crecer durante toda la noche a 37 °C. Los plásmidos se aislaron y las secuencias de nucleótidos se confirmaron mediante secuenciación comercial. Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) con vectores de expresión, se sembraron en placas de agar con kanamicina y se hicieron crecer durante toda la noche a 37 °C. Se utilizaron colonias individuales para inocular 10 ml de medio LB con kanamicina (50 mg-ml'1) y las células se hicieron crecer durante toda la noche a 37 °C. Se utilizó un cultivo de una noche para inocular 200 ml de medio LB con kanamicina. Las células se cultivaron a 37 °C. La expresión se indujo con IPTG hasta una concentración final de 0,25 mM. A continuación, se cultivaron las células durante toda la noche a 20 °C. Al final del cultivo, se recogió la biomasa mediante centrifugación y se lavó con tampón (hidrogenofosfato de dipotasio y dihidrogenofosfato de potasio 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM). Se rompieron las células en suspensión mediante sonicación y se centrifugó el lisado celular. Se purificaron las proteínas a partir de extractos brutos utilizando cromatografía de afinidad de níquel de una sola etapa. La presencia de proteínas en las fracciones máximas se demostró mediante SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 15 % (figura 5). La precipitación de proteínas se minimizó mediante diálisis contra tampón que contenía NaCl 750 mM. Los rendimientos de ambos mutantes fueron de, aproximadamente, 20 mg/l de cultivo. Se utilizó DSC para caracterizar la estabilidad térmica de la proteína. Los mutantes de FGF2 se diluyeron a 1,0 mg-ml-1 para los experimentos de DSC. La recopilación de datos de DSC se realizó en un intervalo de temperatura de 20 °C a 100 °C. Se evaluó la Tm como la parte superior de la curva de Gauss después del ajuste manual de la línea base. Los mutantes de FGF2 CS1 y CS2 presentaron Tm de 62,8 y 68,0 °C, respectivamente (figura 6).
EJEMPLO 6: Determinación de la termoestabilidad de mutantes de FGF2 de 3 y 6 puntos utilizando un ensayo de detención del crecimiento de condrosarcoma de rata
Las células de condrosarcoma de rata (RCS, de rat chondorsacoma) son una línea celular inmortalizada fenotípicamente estable que responde a concentraciones diminutas de FGF con una potente detención del crecimiento acompañada de cambios morfológicos marcados y degradación de la matriz extracelular. El receptor de FGF (FGFR) funciona como inhibidor de la proliferación celular en esta línea celular. Para inhibir la proliferación celular, los mutantes de FGF tienen que inducir específicamente la transducción de señales de fGfR, lo que permite medir la actividad de FGF reflejada por la dependencia de la concentración de la detención inducida del crecimiento. La principal ventaja del ensayo de RCS es la exclusión de productos químicos tóxicos y falsos positivos (Krejcí, et al., 2007 Invest New Drugs, 25: 391-395.). El experimento de detención del crecimiento de alto rendimiento se realizó en un formato de placa de 96 pocillos con el contenido celular determinado por tinción simple con cristal violeta. Se incubaron los medios con o sin FGF2 mutado en una concentración aproximada de 40 ng/ml a 36,5 y 41,5 °C durante 48 horas y se mezclaron cada 12 horas dentro de este período. Para evaluar la degradación de los mutantes de FGF2, se mezcló medio preincubado con FGF2 mutado como control reciente. Se sembraron células RCS en una concentración de 250 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, un día antes del tratamiento. Las células se trataron tanto con FGF2 preincubado como con control fresco para cada mutante de FGF2 a una concentración final de 20 ng/ml durante 4 días. Las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se lavaron de nuevo y se tiñeron con cristal violeta al 0,025 % durante 1 hora. Las células coloreadas se lavaron 3 veces con agua destilada. El color de las células se disolvió en ácido acético al 33 %. La absorbancia se midió a 570 nm. Los resultados del ensayo de detención del crecimiento de RCS se muestran en la figura 7. Este ejemplo demuestra que la capacidad del mutante FGF2 CS2 de 6 puntos para inhibir la proliferación de células RCS no se ve afectada incluso después de dos días de incubación a 41,5 °C. Por el contrario, la actividad biológica del FGF2 de tipo salvaje ya se reduce después de la incubación a 36,5 °C.
EJEMPLO 7: El FGF2 CS2 de 6 puntos termoestabilizado sostiene el crecimiento indiferenciado de células madre pluripotentes humanas
Para evaluar la capacidad del mutante FGF2 CS2 termoestabilizado de sostener a largo plazo propagación de células madre pluripotentes indiferenciadas humanas (PSC), se utilizaron dos sistemas de cultivo: (i) el crecimiento de colonias en presencia de una capa de alimentación de fibroblastos embrionarios de ratón (mEF) y (ii) el crecimiento de monocapa libre de alimentación en Matrigel® hESC-Qualified Matric (BD Biosciences). En condiciones dependientes del alimentador, el medio consistió en DMEM/F12 (1:1) complementado con el 15 % de reemplazo de suero desactivado, aminoácidos no esenciales MEM al 1 %, penicilina-estreptomicina al 0,5 %, p-mercaptoetanol 100 mM y 4 ng/ml del mutante FGF2 CS2 o el FGF2 de tipo salvaje. En el sistema de monocapa sin alimentador, el medio acondicionado con mEF es necesario para el crecimiento de las PSC humanas. Para esto, el medio de cultivo se complementó con los FGF2 ensayados (10 ng/ml) solo después de haber sido acondicionado mediante células alimentadoras (CM II, figura 14). Se hicieron crecer PSC humanas en cada una de las condiciones ensayadas durante cinco pases, y se monitorizó la morfología de las células, así como la expresión de los marcadores de pluripotencia Oct4 y Nanog. Las PSC humanas mantenidas en el medio de cultivo sin FGF2 dieron lugar a pequeñas colonias diferenciadas que indican un papel importante de FGF2 en el mantenimiento del estado indiferenciado de las PSC humanas. Cuando se hicieron crecer en presencia de ambos FGF2 ensayados, las PSC humanas mostraron una morfología típica: colonias muy compactas cuando se hicieron crecer con células alimentadoras y una alta proporción de núcleo respecto a citoplasma en ambos sistemas de cultivo (figura 8). No se observaron diferencias entre el FGF2 de tipo salvaje y el mutante de FGF2 de 6 puntos con respecto a la morfología
celular. Para examinar el estado de pluripotencia de las PSC humanas con más detalle, se ensayó inmunocitoquímicamente la expresión de los marcadores de pluripotencia Oct4 y Nanog. No se observaron diferencias en las cantidades o patrones de expresión de Oct4 o Nanog en ninguna de las condiciones ensayadas (figura 9).
EJEMPLO 8: FGF2 CS2 de 6 puntos termoestabilizado estimula la proliferación de células madre pluripotentes humanas
Para determinar la tasa de proliferación, se utilizaron dos enfoques. En primer lugar, se contó el número de ESC humanas sin alimentador durante cuatro días consecutivos después de la siembra en placa. Ambos FGF2 ensayados sostuvieron el crecimiento de ESC humanas con una eficiencia similar (Figura 10A). Para ensayar la capacidad de sostenimiento a largo plazo de FGF2, se adaptaron ESC humanas sin alimentador a cada uno de los fGF2 ensayados durante cinco pases. A continuación, se utilizó el recuento directo de células (Figura 10B) o la densidad óptica de las células teñidas con contador de cristal violeta (figura 10C) para medir la proliferación. En estos ensayos, el mutante FGF2 CS2 de 6 puntos sostuvo la proliferación de ESC humanas mejor que el FGF2 de tipo salvaje. Los datos demuestran un claro efecto pro-proliferativo del FGF2 CS2 termoestabilizado, tanto durante la propagación prolongada como a corto plazo.
EJEMPLO 9: El FGF2 CS2 de 6 puntos termoestabilizado mantiene su actividad biológica durante una incubación prolongada a 37 °C
Los receptores FGF y sus efectores en el sentido de 3’, entre los que se incluye el ERK1/2 se activan tras el tratamiento con FGF2, contribuyendo a la pluripotencia de las PSC humanas (Dvorak, et al 2005, Stem Cells 25, 1200-1211; Eiselleova, et al 2009., Stem Cell 27, 1847-1857). A medida que la actividad biológica de FGF2 disminuye a 37 °C, la fosforilación de ERK1/2 disminuye y las PSC humanas se preparan fácilmente para la diferenciación. Para ensayar la estabilidad térmica de FGF2 de tipo salvaje y el mutante de FGF2 CS2, se complementó CM preparado sin FGF2 con 10 ng/ml del FGF2 deseado y se incubó a 37 °C durante 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 2 d, 3 d, 4 d o 5 d. A continuación, las ESC humanas privadas de FGF2 se trataron con CM que contenía FGF2 preincubado con calor durante dos horas y se sometieron a inmunotransferencia de tipo Western para la ERK1/2 fosforilada. Mientras que la actividad biológica del FGF2 de tipo salvaje disminuyó con el tiempo de preincubación por calor, el mutante CS2 de FGF2 termoestabilizado retuvo la actividad biológica completa incluso después de cinco días a 37 °C (figura 11).
EJEMPLO 10: No se requiere cambio diario del medio de cultivo con FGF2 CS2 termoestabilizado Debido a la inestabilidad del FGF2 de tipo salvaje, es inevitable cada día el cambio del medio de cultivo para mantener la pluripotencia de las PSC humanas. Por lo tanto, se ensayó si la utilización del mutante de FGF2 CS2 termoestabilizado evitaría este requisito. Para esto, se sembraron eSc humanas en células alimentadoras en el medio que contenía mutante FGF2 4 ng/ml convencional o reducido a 1 ng/ml, y las colonias se hicieron crecer durante los siguientes 3-4 días sin cambiar el medio. Los resultados mostrados en la figura 12 demuestran que el mutante de FGF2 CS2 termoestabilizado mantiene una morfología indiferenciada de las ESC humanas, así como la expresión del marcador de pluripotencia Oct4 incluso a una concentración de 1 ng/ml, y que no era necesario un cambio diario del medio.
EJEMPLO 11: No se requiere la complementación repetida del medio acondicionado con FGF2 CS2 termoestabilizado
Debido a que el FGF2 de tipo salvaje se inactiva y se degrada durante la preparación del CM, es necesario que el medio de cultivo esté complementado por FGF2 antes y después del acondicionamiento mediante las células alimentadoras. Por lo tanto, se ensayó la capacidad del mutante FGF2 de 6 puntos termoestabilizado de mantener el crecimiento indiferenciado de PSC humanas sin complementación adicional de medio después de haber sido acondicionado mediante células alimentadoras (CM III, figura 14). Se propagaron PSC humanas sin alimentador durante cinco pases con mutantes de FGF2 y de tipo salvaje, y se controló la expresión de marcadores de pluripotencia y la proliferación. Aunque la expresión de marcadores de pluripotencia no se ve afectada (figura 13A), el mutante fGF2 de 6 puntos muestra una capacidad superior para soportar la proliferación en comparación con el FGF2 de tipo salvaje (figura 13B).
EJEMPLO 12: Predicción y construcción de mutantes estables de FGF2 mediante mutagénesis por saturación
Se propusieron las posiciones para la mutagénesis por saturación que deben revelar mutaciones estabilizantes adicionales utilizando cálculos de campo de fuerza. Las mutaciones se dividieron en tres grupos según el cambio previsto en la energía libre de Gibbs (DDG). Las mutaciones con DDG < -1,0 kcal/mol se clasificaron como estabilizantes, 1,0 < DDG < -1,0 como neutrales y DDG > 1,0 como desestabilizantes. Se seleccionaron once posiciones (K30, E54, E67, C78, R90, S94, C96, E108, N113, T121 y S152) con el mayor número de mutaciones estabilizantes y bajo número de desestabilizantes para la mutagénesis de saturación (tabla 5).
Tabla 5. Mutaciones estabilizantes y desestabilizantes en las posiciones seleccionadas de FGF2 predichas ____________________________ mediante enfoque basado en energía____________________________ Campo de fuerza 1 Campo de fuerza 2
Posición Número de sustituciones Número de sustituciones Número de sustituciones Número de sustituciones estabilizantes desestabilizantes estabilizantes desestabilizantes
K30 8 5 0 6
E54 6 3 0 0
E67 5 2 0 1
C78 15 0 3 0
R90 4 2 0 5
S94 5 4 2 1
C96 17 0 0 0
E108 9 2 0 5
N113 13 2 5 4
T121 4 2 2 0
S152 5 2 0 1
Las 11 bibliotecas de mutagénesis de saturación de sitio único de FGF2 se prepararon por síntesis génica. Se utilizó como plantilla para la mutagénesis el ADNc de Fgf2 de tipo salvaje (figura 2) fusionado a la secuencia N-terminal que contenía los etiqueta de 6x His y el sitio de reconocimiento de escisión de trombina subclonado en el vector pET28b. Las bibliotecas se construyeron utilizando la tecnología “Fixed Oligo” que permite que sólo se presenten 20 aminoácidos proteinogénicos en la posición correspondiente al codón degenerado en la secuencia de nucleótidos. Las bibliotecas se entregaron como ADN plasmídico liofilizado. Los sedimentos de ADN se disolvieron en agua estéril hasta la concentración final de 250 ng-ml-1. Se sometió a electroporación un volumen de 1 ml de cada biblioteca en 100 ml de células de autólisis de E. coliXJb (DE3) recién preparadas. Las células se extendieron sobre 11 placas de agar LB individuales con kanamicina a una concentración final de 50 mg-ml-1 y se incubaron durante toda la noche a 37 °C. Se utilizaron colonias individuales de cada una de las 11 placas de agar LB para la inoculación de pocillos individuales en placas de 96 pocillos profundos de 1 ml que contenían 250 ml de medio LB con kanamicina (50 mg-ml-1). Las placas se incubaron durante toda la noche a 37 °C con agitación de 200 rpm en una cámara de alta humedad. Se indujo la expresión mediante la adición de medio LB reciente con kanamicina, IPTG y L-arabinosa hasta la concentración final de 50 mg-ml-1, 0,25 mM y 3 mM, respectivamente. Las placas se incubaron durante toda la noche a 20 °C con agitación. Después de 22 horas, se centrifugaron las placas y se drenó el sobrenadante. Se congelaron las placas de microtitulación completas con los sedimentos celulares a -70 °C. A continuación, se añadieron 100 ml de tampón de lisis (tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 20 min a 30 °C. Se eliminaron los restos celulares de los lisados celulares resultantes y se determinó la proteína soluble total para cada placa utilizando el procedimiento de Bradford. Se determinó el contenido de FGF2 en % de la proteína soluble total mediante SDS-PAGE y densitometría. Las concentraciones de proteína soluble total en muestras seleccionadas de extractos brutos en bibliotecas individuales oscilaron entre 0,2 y 0,3 mg-ml-1. El contenido de FGF2 en los extractos brutos osciló entre el 5 % y el 7 % de la proteína soluble total.
La actividad biológica de los lisados de células que contenían mutantes FGF2 individuales se determinó mediante el ensayo de la detención del crecimiento utilizando RSC. Se fundieron placas de microtitulación con extractos brutos que contenían el mutante de FGF2 y controles a temperatura ambiente y se preincubaron a 41,5 °C durante 48 h. Se añadieron extractos brutos preincubados a los condrocitos cultivados en placas de microtitulación recién preparadas hasta la concentración final de 20 ng-ml-1 y se comparó la inhibición del crecimiento de condrocitos con las muestras que contenían controles midiendo la densidad óptica de las células (figura 15). Cuanto más estable era el mutante de FGF2 que estaba presente en el extracto bruto añadido, más evidente era la inhibición del crecimiento. La inhibición del crecimiento se determinó también para muestras no preincubadas a temperatura elevada. Las muestras que provocaron una inhibición del crecimiento más significativa que las muestras que contenían FGF2 de tipo salvaje se consideraron como aciertos positivos. Para cada uno de los aciertos positivos, se repitió el procedimiento de selección completo, tal como se ha descrito anteriormente. Los genes Fgf2 mutados se secuenciaron mediante el procedimiento de Sanger. Las secuencias resultantes se alinearon con la secuencia de FGF2 de tipo salvaje para verificar la mutación insertada (tabla 6).
Tabla 6. Resumen del resultado del cribado de 11 bibliotecas de mutagénesis de saturación de FGF2 Biblioteca Aciertos confirmados Mutaciones verificadas mediante secuenciación
K 30 X 2 K 30 I, K 30 R
E 54 X 2 E 54 D ,E 54 A
E 67 X 5 E 67 F , E 67 V , E 67 I, E 67 H , E 67 W
C 78 X 1 C 78 M
R 90 X 1 R 90 K
S 94 X 7 S 94 V , S 94 N , S 94 M , S 94 R , S 94 L , S 94 T , S 94 I
C 96 X 3 C 96 Q , C 96 R , C 96N
E 108 X 2 E 108 V , E 108 H
N 113 X 0 -T 121 X 7 T 121 C , T 121 F , T 121 P , T 121 A , T 121 H , T 121 R ,
T 121 Q .
S 152 X 2 S 152 Q , S 152 R
Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) con los vectores de expresión pET28b-his-trombina::fgf2x (x = 32 mutantes FGF2 diferentes), en placas de agar con kanamicina (50 mg-ml-1) y se cultivaron toda la noche a 37 °C. Se utilizaron colonias individuales para inocular 10 ml de medio LB con kanamicina y las células se cultivaron durante toda la noche a 37 °C. La expresión se indujo con IPTG hasta una concentración final de 0,25 mM. A continuación, las células se cultivaron durante toda la noche a 20 °C. Al final del cultivo, se centrifugó la biomasa y el sedimento celular se congeló a -70 °C. Se descongeló el sedimento y se resuspendió en FastBreak® Cell Lysis Reagent 1X. Las células lisadas se incubaron durante 10-20 minutos a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. Se añadieron partículas de Ni MagneHis® al sedimento celular. Para mejorar la unión a las partículas de Ni MagneHis®, se añadió NaCl 500 mM al volumen de cultivo bacteriano (0,03 g de NaCl por 1,0 ml de lisado). Los tubos que contenían células bacterianas rotas se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente y a continuación se colocaron en el soporte magnético durante, aproximadamente, 30 segundos para capturar las partículas de Ni MagneHis®. Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante. Para eliminar las proteínas de las células no unidas, se añadió tampón de unión/lavado MagneHis® con NaCl 500 mM. El sobrenadante se eliminó cuidadosamente. La etapa de lavado se repitió 2 veces. La elución de las proteínas unidas se realizó añadiendo 105 ml de tampón de elución MagneHis® que contenía NaCl 500 mM. Las mezclas de elución se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente y después se colocaron los tubos en el soporte magnético apropiado durante, aproximadamente, 30 segundos para eliminar el sobrenadante que contenía la proteína purificada. Se confirmó la presencia de todos los mutantes de FGF2 mediante SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 15 % (figura 16). El rendimiento del mutante de FGF2 purificado varía de 10 a 100 mg-l-1, mientras que la mayoría de los mutantes del FGF2 se expresan a un nivel similar o superior al del FGF2 de tipo salvaje.
Se utilizó el ensayo de desplazamiento térmico para la medición de la estabilidad térmica de las proteínas diana. La medición se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Cada pocillo estaba compuesto por 2 ml de colorante Sypro Orange (40x diluido en agua) y un volumen apropiado de mutante FGF2 calculado utilizando las siguientes ecuaciones:
VFGF2var = (CFGF2var * Vdv)/Cdc
VFGF2var = (CFGF2var * 1) / 2,5
en las que VFGF2var es el volumen del mutante FGF2, CFGF2var es la concentración del mutante FGF2, Cdc es la concentración definida de 2,5 mg-ml-1 y Vdv se define como 1 ml. Se añadió en último lugar el tampón de elución, de modo que el volumen total en el pocillo fue de 25 ml. Se llevó a cabo un ensayo de desnaturalización térmica en un sistema de PCR en tiempo real con una temperatura inicial de 25 °C aumentando en incrementos de 1 °C hasta una temperatura final de 95 °C. Se generaron los valores de Tm mediante el procedimiento derivado de Boltzmann, en el que los valores de Tm se toman del punto de inflexión del gráfico de la curva de fusión de fluorescencia (tabla 7).
Tabla 7. Termoestabilidad de mutantes de FGF2 de mutagénesis de saturación determinada mediante ensayo de desplazamiento térmico. La Tm del FGF2 de tipo salvaje determinado por ensayo de desplazamiento térmico fue de 51 °C. Se resaltan en gris las sustituciones de aminoácidos seleccionadas para posteriores análisis computacionales véase el eem lo 13.
Tm: temperatura de fusión; DTm: cambio en la temperatura de fusión tras la mutación; n.d., no determinado debido al plegamiento insatisfactorio de las proteínas
EJEMPLO 13: Combinación de mutantes de un solo punto a partir de mutagénesis de saturación
Se utilizaron cálculos de campo de fuerza para la determinación de mutaciones combinables sin efecto antagonista y para el diseño de mutantes de FGF2 de múltiples sitios altamente estables. Se seleccionaron las siguientes mutaciones del cribado de la biblioteca (véase el ejemplo 12) para un análisis adicional: K30I, E54D, S94I, C96N, E108H y T121P. Estas mutaciones se combinaron con mutaciones existentes del mutante FGF2 CS2 (R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y y S109E). Todas las combinaciones de mutantes de doble punto se construyeron in silico para predecir la aditividad de las mutaciones individuales. Los mutantes de doble pu-n1to con la diferencia entre el DDG predicho y la suma de las mutaciones de un solo punto individuales > 1 kcal-mol'1 se consideraron antagonistas. En consecuencia, se diseñaron tres mutantes de múltiples puntos diferentes para una caracterización adicional. Los tres mutantes se basaron en el FGF2 CS2 previamente diseñado. El mutante FGF2 CS3 (R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D y E108H) contenía tres mutaciones adicionales con los efectos estabilizantes más elevados en el ensayo de desplazamiento térmico. FGF2 CS4 (R31L, V52T, H59F, L92Y, S109E, E54D, S94I, C96N y T121P) fue diseñado con el objetivo de preservar una función proteica. Se descartaron todas las mutaciones dirigidas a la interfase entre FGF2 y FGFR1 o receptores FGFR2 o posiciones importantes para la dimerización, mientras que se intercambió la mutación C96Y por C96N, debido a un mejor efecto estabilizante verificado experimentalmente. El mutante FGF2 CS5 (R31L, V52T, H59F, L92Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H y T121P) se seleccionó para maximizar el efecto de termoestabilidad de la proteína, que contenía todas las mutaciones que estabilizan el FGF2 en el ensayo de desplazamiento térmico (ejemplo 12).
EJEMPLO 14: Construcción, purificación y análisis de termoestabilidad de mutantes FGF2 CS3, CS4 y CS5
Se sintetizaron comercialmente mutantes de FGF2 de múltiples puntos y se subclonaron en los sitios Ndel y Xhol del promotor T7 inducible pET28b-His-trombina en el sentido 3’ (las secuencias de nucleótidos mutada y de polipéptidos se muestran en las s Eq ID NO: 33 a SEQ ID NO: 38). Las construcciones resultantes se transformaron en células competentes de E. coli Dh5a. Las células se sembraron en placas de agar con kanamicina (50 mg-ml-1) y se cultivaron durante toda la noche a 37 °C. Los plásmidos se aislaron y las secuencias de nucleótidos se confirmaron mediante secuenciación comercial. Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) con vectores de expresión, se sembraron en placas de agar con kanamicina y se cultivaron durante toda la noche a 37 °C. Se utilizaron colonias individuales para inocular 10 ml de medio LB con kanamicina (50 mg-ml-1) y las células se cultivaron durante toda la noche a 37 °C. Se utilizó un cultivo de una noche para inocular 200 ml de medio LB con kanamicina. Las células se cultivaron a 37 °C. Se indujo la expresión con IPTG hasta una concentración final de 0,25 mM. A continuación, las células se cultivaron durante toda la noche a 20 °C. Al final del cultivo, la biomasa se recogió por centrifugación y se lavó con tampón (tampón fosfato de potasio 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM). Las células en suspensión se rompieron mediante sonicación y se centrifugó el lisado celular. Las proteínas se purificaron a partir
Claims (15)
1. Polipéptido termoestable que posee actividad de FGF2 y que tiene, como mínimo, el 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y que comprende, como mínimo, una sustitución de aminoácidos R31L.
2. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene la SEQ ID NO: 2 y comprende, como mínimo, la sustitución de aminoácidos R31L.
3. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además, como mínimo, dos sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre un grupo que consiste en V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P.
4. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 3, en el que el polipéptido comprende las sustituciones de aminoácidos R31L, V52T y H59F.
5. Polipéptido termoestable, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además, como mínimo, cinco sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre un grupo que consiste en V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P.
6. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 5, en el que el polipéptido comprende las sustituciones de aminoácidos R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E.
7. Polipéptido termoestable, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, como mínimo, ocho sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre un grupo que consiste en V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P.
8. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido comprende las sustituciones de aminoácidos K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H, S109E.
9. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido comprende las sustituciones de aminoácidos R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P.
10. Polipéptido termoestable, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además, como mínimo, diez sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre un grupo que consiste en V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P.
11. Polipéptido termoestable, según la reivindicación 10, en el que el polipéptido comprende las sustituciones de aminoácidos K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P.
12. Polipéptido termoestable, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su utilización en medicina regenerativa y otras aplicaciones médicas.
13. Utilización del polipéptido termoestable, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para productos cosméticos.
14. Medio de cultivo adecuado para cultivar células madre pluripotentes humanas en un estado indiferenciado, que comprende una cantidad eficaz del polipéptido termoestable, definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el intervalo de 1,0 ng/ml a 100 ng/ml de medio de cultivo.
15. Medio de cultivo, según la reivindicación 14, en el que el polipéptido comprende las sustituciones de aminoácidos definidas según cualquiera de las reivindicaciones 4, 6, 8, 9 y 11.
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