KR20180080335A - 내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180080335A
KR20180080335A KR1020187018035A KR20187018035A KR20180080335A KR 20180080335 A KR20180080335 A KR 20180080335A KR 1020187018035 A KR1020187018035 A KR 1020187018035A KR 20187018035 A KR20187018035 A KR 20187018035A KR 20180080335 A KR20180080335 A KR 20180080335A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fgf2
lys
gly
leu
ala
Prior art date
Application number
KR1020187018035A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102650035B1 (ko
Inventor
페트르 드보르작
파벨 크레이치
루카스 발렉
리비아 에이셀레오바
자네타 코네츠나
파벨 드보르작
다비트 베드나르
얀 브레조브스키
에바 세베스토바
라드카 할로웁코바
베로니카 스테판코바
파벨 바나체크
즈비네크 프로코프
지리 담보르스키
미하엘라 보사코바
Original Assignee
마자리코바 우니베지타
에난티스 에스.알.오.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마자리코바 우니베지타, 에난티스 에스.알.오. filed Critical 마자리코바 우니베지타
Publication of KR20180080335A publication Critical patent/KR20180080335A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102650035B1 publication Critical patent/KR102650035B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

본 발명은, FGF2 활성을 가지며; 서열번호 2 (FGF2 wt) 또는 이의 기능성 단편과 85% 이상의 서열 동일성을 가지며; 하나 이상의 아미노산 치환 R31L을 포함하는, 단리된 내열성 폴리펩타이드, 및 세포 생물학 연구, 재생 의학 및 관련된 의학적 용도 또는 코스메틱에서의 이의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포 및 유도된 만능성 줄기 세포를 비롯한 인간 만능성 줄기 세포를 배양하는데 적합한 대상 FGF2를 포함하는 배양 배지를 개시한다.

Description

내열성 FGF2 폴리펩타이드 및 그 용도
본 발명은 야생형과 비교해 개선된 열적 안정성을 가진 조작된 섬유모세포 성장인자 2 (FGF2, bFGF) 및 세포 생물학 연구, 재생 의학 및 관련 의학적 응용 또는 코스메틱에서의 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 배아 줄기 세포 및 유도된 만능성 줄기 세포를 모두 포함하는 인간 만능성 줄기 세포를 배양하는데 적합한 FGF2를 포함하는 배양 배지에 관한 것이다.
섬유모세포 성장인자 2 (FGF2, 또한, 염기성 FGG, bFGF라고도 함)는 다양한 세포 타입에서 증식, 분화, 이동 및 생존의 다면발현성 조절인자 (pleiotropic regulator)로서, 세포를 만능성 상태로 유지하는데 일조하기 때문에 인간 만능성 줄기 세포 (PSC) 배양용 배지의 필수 성분이다. 만능성은, 무한 자기-재생 및 인간 신체의 모든 세포 타입으로의 분화를 수행하는 세포의 능력을 의미한다. 이러한 특성은 배아발생 연구, 약물 개발 및 세포성 치료에 있어 세포의 가치를 높인다. 의약적 용도를 포괄하는 FGF2의 다른 중요한 생물학적 활성으로는, 혈관신생 촉진, 상처 치유 촉진, 연골형성 또는 골형성의 촉진 및 신경발생의 촉진 등이 있다.
그러나, 야생형 FGF2의 낮은 안정성과 짧은 반감기는, PSC 배양 등의, 몇가지 용도에 적합하지 않다. 야생형 분자의 반감기는 인간 PSC를 배양하는데 전형적으로 사용되는 조건에서 24시간 미만이므로, 자주 보충되어야 하며, 이는 산업계에서 비용 측면에서 문제가 된다 (Lotz, et al. 2013, PLoS One 8: e56289). 포유류 줄기 세포 또는 전구 세포를 FGF2의 지속적인 농도 하에 배양하는 방법이 특허 문헌 US 8,481,308에 제시되었다. 그러나, 계속적인 FGF2 분해로 인해, 줄기 세포는 FGF2의 농도 변동에 노출되는데, 이는 만능성에 필연적인 적절한 신호전달을 급속하게 저하시키는데 기여할 수 있다. 단백질의 비-폴딩된 형태 또는 응집된 형태가 잠재적으로 독성이고 면역원성일 수 있기 때문에, 단백질의 열역학적 안정성은 치료학적인 용도에서는 특히 중요하다.
전통적으로, 열과 산으로 인한 변성으로부터 FGF2를 보호하고, 또한 반감기를 연장시키는 헤파린을 첨가함으로써, FGF2를 안정시킨다. 그러나, 헤파린은 체내 비만세포에 의해 생산되므로, FGF2에 의해 생체내에서 조절되는 대부분의 세포/조직에서 이의 사용은 생리학적으로 적절하지 않다. 또한, 헤파린의 항-응고 특성과 알레르기 유발 위험성으로 인해, 의학적 및 코스메틱 목적으로 상기한 조성물을 사용하는 것은 적절하지 않다. 따라서, 헤파린을 사용하지 않고도 높은 안정성과 긴 기능성 반감기를 가진 적절한 FGF2 조성물을 수득할 수 있는, 새로운 개선된 방법이 당해 기술 분야에서 계속적으로 요구되고 있다.
특허 문헌 WO2013/082196은, FGF2의 성장인자 활성을 완전히 유지하면서 안정성을 확보하기 위해, 헤파린을 모방한 설포네이트 폴리머 (예, 폴리(스티렌 설포네이트)) 또는 코폴리머 (예, 폴리(스티렌 설포네이트-co-폴리(폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트)와 FGF2의 접합체를 개시하고 있다. 일부 물질을 첨가하여 FGF를 안정화하는 방법은 US 7,754,686 (FGF 산화를 방지하기 위해 환원제 첨가), US 5,202,311 (슈크로스 옥타설페이트 첨가), US 5,189,148 (수-불용성 하이드록시프로필 셀룰로스 첨가), EP0345660 (글루칸 설페이트 첨가) 등과 같은 몇몇 문헌들에 기술되어 있다. 그러나, 이들 조제물의 문제는, 헤파린이 첨가된 FGF2 제형의 경우에서와 같이, 의학적 목적 및 데이 케어 목적으로는 적합하지 않은, 잠재적으로 유해한 화합물이 존재한다는 것이다.
단백질 조작은 첨가제를 사용하지 않고 단백질을 안정화하는 매우 효과적인 해법을 제시해준다. 이에 따라, 동일한 서브패밀리에 속하는 FGF1 및 FGF2의 돌연변이들이 강화된 안정성 및/또는 기능을 가진 것으로 개시되어 있다. FGF1의 생명공학적 용도는 주로 높은 선천적인 불안정성으로 인해 FGF2에 비해 훨씬 더 제한적이다.
미국 특허 출원번호 2008/038287은 N-말단의 절단, 선택적으로는 N-말단 아미노산의 치환을 통해 달성된 개선된 수용체 특이성을 가진 FGF2 또는 FGF4 폴리펩타이드의 설계, 제조 및 용도에 관한 것이다. 그러나, 이 문헌은 N-말단 잔기에서의 돌연변이 또는 절단이 FGF의 내열성에 영향을 줄 수 있다는 것에 대해서는 교시하는 바가 없고, 이를 뒷받침하지도 않는다.
미국 특허 출원번호 2012/0225479는 내열성이 증가된 조작된 인간 FGF2 돌연변이 및 이를 이용한 배아 줄기 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 출원인은, FGF2와 Zakrzewska 등 (Zakrzewska M, 2005 J Mol Biol)에 의해 발표된 안정화된 FGF1 돌연변이 간의 단순 아미노산 서열 정렬을 통해 확인된, 야생형 FGF2 서열의 Q65I, N111G 및 C96S 치환을 이용하였다. 이 특허 문헌에 기술된 돌연변이는 일정 수준의 안정화를 나타내지만, 생물학적 활성을 고온에서 장기간 유지하진 못한다.
미국 특허 출원번호 2013/0236959는 특이적인 내열성 FGF2 K128N 돌연변이를 개시하고 있다. K128은, 야생형 FGF2에서 헤파린 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG) 결합에 주로 기여하는, 아미노산이다. 즉, 이 위치의 아미노산 치환은 HSPG에 대한 FGF2 결합력을 떨어뜨려, HSPG에의 FGF2 결합이 FGF 수용체 활성화에 중요한 기능적 요소들 중 하나이므로, FGF2의 특이적인 생물 활성에 부정적으로 작용할 수 있다. FGF 신호전달의 전체적인 기전에는 헤파린 또는 HSPG가 참여하며, 이들은 FGF의 올리고머 형성과 티로신 키나제 수용체 (FGFR)에의 FGF 결합을 촉진하는 공동-수용체로 작용함으로써, FGFR 올리고머 형성 및 신호전달을 유발한다. 헤파린/HSPG 결합 도메인에서의 치환은 또한 미국 특허 출원번호 2013/0157359에도 기술되어 있다. 이 출원은 3개 및 4개의 아미노산 치환을 도입함으로써 강화된 내열성을 가진 2종의 FGF1 변이체의 용도에 관한 것이다. 헤파린과 무관한 FGF1의 안정화는 HSPG 결합에 중요한 K112 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성되었다.
미국 특허 8,461,111은 코어 패키징 돌연변이 도입에 의해 개선된 기능성 반감기를 가진 조작된 FGF1에 관한 것이다.
미국 특허 8,119,776은 12번 및 134번 잔기를 치환함으로써 증가된 내열성과 유사분열촉진력을 가진 조작된 FGF1에 관한 것이다.
본 발명의 과제는 배양 비용을 현저하게 감소시켜, 배양된 세포의 품질을 개선하고 필요한 조작을 줄일 수 있는, 내열성을 가진 FGF2를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 재생 의학 및 관련 의학적 용도 또는 코스메틱에 사용될 수 있을 것이다.
당해 기술 분야에서 전술한 문제점들은, FGF 활성을 가지고 있으며 서열번호 2의 서열과 85%의 서열 동일성을 가진 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 구성되는, 단리된 내열성 폴리펩타이드를 제공하는 본 발명에 의해, 해소된다. 동시에, FGF2 폴리펩타이드는 R31L 또는 H59F로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환; 또는 적어도 R31L과 H59F의 조합을 포함한다. 이는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 적어도 R31L 또는 H59F 치환; 또는 적어도 R31L과 H59F의 조합을 항상 가지는 것을 의미한다.
유익하게는, 본 발명에 따른 대상 FGF-2 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 장기간 고온에서 안정적이며, 변화없는 생물 활성을 나타낸다 (예, 도 11 참조).
본 발명에 따른 내열성 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편은, 야생형 FGF2와 비교해 특히 더 안정적이라는 점에서 특히 유익하다. 이러한 안정성은 FGF2에 내재된 것이며; 헤파린과 같은 부가적인 화합물은 첨가되지 않아야 한다. FGF2의 생물 활성에 필수적인 아미노산 위치들은 심지어 모두 치환 또는 절단되지 않는다. 본 발명의 대상 FGF2 돌연변이 및 이의 단편은 임상 뿐만 아니라 연구 실무에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 내열성 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편은 FGF2 활성을 가지며, 야생형 FGF2 폴리펩타이드와 비교해, 1-20℃, 바람직하게는 8-20℃, 더 바람직하게는 14-20℃ 정도로 증가된 용융 온도를 가진다. 13개의 단일-점 돌연변이들을 구축하여, 발현 벡터 pET28b에 클로닝한 후 정제 (SDS-PAGE 분석으로 판단시 순도 ≥ 95%)하고, 용융 온도를 규명하였다.
부가적인 측면에서, 본 발명은, 서열번호 2 또는 그 단편과 85% 이상의 서열 동일성을 가지며; 적어도 아미노산 치환 R31L을 가진, FGF2 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예는, 적어도 아미노산 치환 R31L을 포함하는 서열번호 2 또는 그 단편을 가진 내열성 FGF2 폴리펩타이드를 개시한다.
더 바람직하게는, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26 또는 서열번호 28로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 더 바람직한 구현예는, FGF2 폴리펩타이드에서 필수 치환이 R31L일 경우, R31W, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환 2개 이상, 또는 5개 이상, 또는 8개 이상, 또는 10개 이상을 더 포함하는, 내열성 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편을 개시한다.
본 발명의 더 바람직한 구현예는, FGF2 폴리펩타이드에서 필수 치환이 H59F일 경우, R31W, R31L, V52T, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환 2개 이상, 또는 5개 이상, 또는 8개 이상, 또는 10개 이상을 더 포함하는, 내열성 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편을 개시한다.
본 발명의 더 바람직한 구현예는, FGF2 폴리펩타이드에서 필수 치환이 R31L 및 H59F의 조합일 경우, R31W, V52T, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H, T121PP로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환 1개 이상, 또는 4개 이상, 또는 7개 이상, 또는 9개 이상을 더 포함하는, 내열성 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편을 개시한다.
본 발명의 더 바람직한 구현예는, (a) 3개의 아미노산 치환 R31L, V52T, H59F, 가장 바람직하게는 서열번호 30을 가진 폴리펩타이드, 또는 (b) 6개의 아미노산 치환 R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, 가장 바람직하게는 서열번호 32를 가진 폴리펩타이드, 또는 (c) 9개의 아미노산 치환 K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H, S109E, 가장 바람직하게는 서열번호 34를 가진 폴리펩타이드, 또는 (d) 9개의 아미노산 치환 R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P, 가장 바람직하게는 서열번호 36을 가진 폴리펩타이드, 및 (e) 11개의 아미노산 치환 K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P, 가장 바람직하게는 서열번호 38을 가진 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드를 개시한다.
또한, 후술한 돌연변이 단백질 (mutein)은 본 발명의 범위의 일부로서 간주되어야 한다.
본 발명에 따른, FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편, 또는 이의 돌연변이 단백질의 생물학적 활성은, 0.1 내지 5 ng/mL, 바람직하게는 0.5 내지 3 ng/mL의 범위에서 NIH/3T3 세포의 증식에 대한 EC50으로 정량적으로 표현될 수 있다. FGF2의 생물 활성은 기존에 개시된 바와 같이 배양된 섬유모세포의 증식 분석에 의해 평가될 수 있다 (Dubey, et al. 2007 J Mol Biol).
제2 측면에서, 본 발명은, 재생 의학 (예, 상처 및 궤양의 치유, 골절 치유 및 치주 조직 재생)에 사용될 수 있으며, 다른 의학적 용도 (예, 암 치료, 심혈관 질환의 치료 및 정서 장애의 치료) 또는 코스메틱 (예, 모발 자극, 콜라겐 합성 지지 및 항-노화 치료제)에 사용될 수 있는, 본 발명에 따른 내열성 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 유효량의 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편을 배양 배지의 1.0 ng/㎕ 내지 100 ng/㎕ 범위로 포함하는, 인간 만능성 줄기 세포를 미-분화된 상태로 배양하는데 적합한 배양 배지를 제공한다. 바람직하게는, 본원의 배양 배지는, 아미노산 치환 (a) R31L, V52T, H59F를 가지는 폴리펩타이드, 가장 바람직하게는 서열번호 30을 가진 폴리펩타이드, 또는 (b) R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E를 가지는 폴리펩타이드, 가장 바람직하게는 서열번호 32를 가진 폴리펩타이드, 또는 (c) K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H, S109E를 가지는 폴리펩타이드, 가장 바람직하게는 서열번호 34를 가진 폴리펩타이드, 또는 (d) R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P를 가지는 폴리펩타이드, 가장 바람직하게는 서열번호 36을 가진 폴리펩타이드, 및 (e) K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P를 가지는 폴리펩타이드, 가장 바람직하게는 서열번호 38을 가진 폴리펩타이드를 포함하는, 본 발명에 따른 대상 FGF2 폴리펩타이드 또는 그 단편을 포함한다.
본 발명의 이러한 특성과 그외 특성, 과제 및 효과는 후술한 설명들에서 보다 잘 이해될 것이다. 본원에서, 본원의 일부를 구성하는 첨부된 도면을 참조하며, 이는 예로 도시된 것일 뿐 본 발명의 구현예를 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 후술한 상세한 설명에 대한 고려가 주어지는 경우에 더 잘 이해될 것이며, 전술한 점 이외의 측면들 및 효과가 명확해질 것이다. 이러한 상세한 설명은 아래 도면을 참조한다.
도 1은 야생형 FGF2의 폴리펩타이드 (서열번호 2)이다.
도 2는 pET28b 벡터에 상류 서열을 가진 야생형 Fgf2의 뉴클레오티드 서열이다. 개시 코돈은 회색으로 표시되고, His-tag는 두꺼운 선으로 밑줄 표시되고, 트롬빈 절단 인지 부위는 검정색 음영으로 표시되며, pET28b 발현 벡터에 클로닝하기 위한 제한효소 부위 NdeI 및 XhoI은 실선으로 밑줄 표시된다. 야생형 Fgf2 코딩 서열은 ATG로 개시되고, 정지 코돈은 TAG이다.
도 3은 단일 점 FGF2 돌연변이 (R31W, R31L, V52T, H59F, C78Y, N80G, L92Y, C96Y, S109E, R118W, T121K, V125L)의 발현 후 SDS-PAGE 및 정제를 도시한 것이다. 단백질 마커: 116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 kDa. 6x His 테그와 트롬빈 절단부를 가진 재조합 FGF2 돌연변이는 약 19.1 kDa의 Mw을 가진다.
도 4는 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 측정된 개별 단일-점 FGF2 돌연변이 (R31W, R31L, V52T, H59F, C78Y, N80G, L92Y, C96Y, S109E, R118W, T121K, V125L)의 내열성을 비교 도시한 것이다. 돌연변이 조합을 구축하는데 선택된 돌연변이는 회색으로 강조 표시된다.
도 5는 정제된 FGF2 CS1 및 CS2 돌연변이의 SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1, 단백질 마커 (116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 kDa); 레인 2, 분자량 19.1 kDa의 6x His tag 및 트롬빈 절단부를 가진 정제된 FGF2 CS1.
도 6은 야생형 FGF2의 내열성을 FGF2 CS1 및 FGF2 CS2 돌연변이와 비교 도시한 것이다. 용융 온도 (T m)는 DSC를 이용해 결정되었다.
도 7은 36.5℃ 및 41.5℃에서 2일간 인큐베이션한 후 야생형 FGF2, FGF2 CS1 및 FGF2 CS2의 RCS 세포 증식 저해력을 도시한 것이다. RCS 세포는 96웰 플레이트에 접종하였다. 데이타는 웰 6개의 평균과 지정된 표준편차로 표시된다.
도 8은 FGF2 CS2가 인간 PSC를 미-분화된 상태로 유지함을 보여주는 것이다. 인간 PSC는, ESC (CCTL14) 및 iPSC (AM13) 둘다, 피더 층을 이용하여 콜로니 (A)로서 또는 마트리겔 상의 단일 층 (B)으로서 증식시켰다. 외인성 FGF2를 제거하면 현저한 증식 지연이 유발되었지만, 야생형 FGF2 및 FGF CS2 둘다 콜로니 (A) 및 단일층 (B)을 미-분화된 상태로 생장시킬 수 있었다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 9는 FGF2 CS2가 인간 PSC의 만능성 마커 발현을 유지시킴을 보여주는 것이다. 인간 PSC, ESC (CCTL14) 및 iPSC (AM13) 둘다 피더 층을 이용하여 콜로니 (A)로서 또는 마트리겔 상의 단일 층 (B)으로서 증식시켰다. 테스트한 각 조건에서 5회 계대 배양한 후, 세포를 만능성 마커 Oct4 및 Nanog에 대해 면역염색하였다. 음성 대조군은 일차 항체 첨가없이 인큐베이션하였다. 야생형 FGF2 및 FGF2 CS2는 Oct4 및 Nanog의 발현을 동일하게 유지시켰다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 10은, FGF2 CS2가 인간 ESC의 증식을 유지시킨다는 것을 보여주는 것이다. (A) 인간 ESC (CCTL14)를 테스트한 FGF2 각각에서 증식시켰으며, 4일 연속하여 세포수를 계수하였다. 2가지 실험의 대표적인 결과를 도시한다. 각 데이타 포인트는 웰 3개의 평균 ± SEM을 표시한다. (B, C) 인간 ESC (CCTL14)의 피더-프리 단일층을 각 테스트 FGF2에 5회 계대 배양 동안 적응시켰다. 그런 후, 세포를 접종하여 3일간 계수하고, 상대적인 세포 카운트에 대한 그래프를 작성하였다 (B; n=2). 다른 예로, 세포를 접종하고 6일 뒤 크리스탈 바이올렛으로 대조염색하였으며, 그 결과를 상대적인 광학 밀도에 대해 그래프를 작성하였다 (C; n=3). 막대는 평균을 나타내며, 에러 막대는 SEM을 나타낸다. 스튜던트의 t-검정, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.
도 11은 37℃에서 지속적으로 인큐베이션하는 동안 FGF2 CS2의 생물학적 활성 유지 능력을 도시한 것이다. 외인성 FGF2 첨가없이 준비한 마우스 배아 섬유모세포로 컨디셔닝화된 배지 (CM)에 10 ng/mL FGF2를 보충하여, 37℃에서 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 2d, 3d, 4d 또는 5d 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, FGF2-고갈된 인간 ESC (CCTL14)에 2시간 동안 예비-열 인큐베이션한 FGF2가 함유된 CM을 처리하고, 인산화된 ERK1/2에 대해 면역블롯팅하였다. 전체 ERK1/2 수준을 로딩 대조군으로 사용하였다. 야생형 FGF2의 생물 활성은 예비-열 인큐베이션 시간에 따라 감소되었지만, 열-안정화된 FGF2 CS2는 37℃에서 5일 후에도 충분한 생물학적 활성을 유지하였다. 4번의 실험의 대표적인 결과들을 도시한다.
도 12는, FGF2 CS2가 매일 배지를 교체하지 않고도 만능성 인간 ESC를 유지시킬 수 있음을, 보여주는 것이다. 인간 ESC (CCTL14) 콜로니를 5회 계대 배양 동안 열-안정화된 FGF2 CS2의 존재 하에 표준 (4 ng/mL) 또는 감소된 (1 ng/mL) FGF2 농도에서 배양하였다. 배지는 콜로니가 분할되었을 때만, 즉 3일-4일마다 교체하였다. 인간 ESC 콜로니는, FGF2의 낮은 농도에서도, 정상 형태 (A) 및 만능성 마커 발현 (Oct4, B) 둘다를 유지하였다.
도 13은, 컨디셔닝화된 배지 (CM)의 반복적인 보충이 FGF2 CS2를 이용한 경우 필요없다는 것을 보여준다. FGF2의 장기간 안정성을 조사하기 위해, 피더 세포에 의한 컨디셔닝화한 이후에 부가적인 보충없이 CM을 준비하였다. 피더-프리 인간 PSC, ESC (CCTL14) 및 iPSC (AM13) 둘다, 각 테스트한 FGF2로 5회 계대 배양으로 증식시켰으며, 만능성 마커 (A)의 발현과 증식 (B)을 모니터링하였다. Oct4의 발현은 양쪽 FGF2에서 높게 유지되었다 (A). 스케일 바, 100 ㎛. FGF2 CS2는 야생형 FGF2와 비교해 증식을 뒷받침하는데 보다 우수한 능력을 나타내었다 (B). 막대는 평균을 표시하고, 에러 막대는 SEM을 나타낸다. 스튜던트의 t-검정, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.
도 14는 컨디셔닝화된 배지 (CM)의 준비 방법을 도시한 것이다. 표준 CM의 제조시, 완전 인간 PSC 배지를 유사분열이 불활성화된 마우스 배아 섬유모세포 (mEF)에 의해 연속적인 5-7일간 컨디셔닝화한 다음 분해로 인한 성장인자 농도를 회복시키기 위해 10 ng/mL FGF2를 첨가하였다 (CM I). 대부분의 실험에서, FGF2가 결핍된 인간 PSC 배지에서 CM을 준비하였으며, 최종 산물에만 바람직한 FGF2 10 ng/mL을 보충하였다 (CM II). 다른 예로, FGF2의 장기 내열성을 평가하기 위해, CM은 FGF 10 ng/mL이 함유된 배지에서 준비하고, 이후 보충하지 않았다 (CM III).
도 15는 라이브러리 FGF2-S152X에서 기원한 조 추출물 (CE)에서 돌연변이된 FGF2 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 스크리닝한 산출 데이타의 일 예를 도시한 것이다. X 축의 코딩은 오리지날 마이크로타이터 플레이트의 웰에 대응한다. 금방 녹인 CE 또는 41.5℃에서 예비 배양한 CE 중의 FGF2를 병렬식 마이크로타이터 플레이트에 최종 농도 20 ng.mL-1로 증식시킨 랫 연골 세포에 첨가하였으며, 연골 세포의 증식 저해를 세포의 광학 밀도를 측정함으로써 대조군을 함유한 샘플과 비교하였다. 대조군: NEG, 음성 대조군 (빈 플라스미드); R31L, 양성 대조군 (열적 안정성이 개선된 단일 점 돌연변이를 가진 플라스미드; WT, 백그라운드 대조군 (야생형 FGF2를 가진 플라스미드). 백그라운드 대조군에 비해 보다 통계학적으로 유의하게 증식 정지를 나타내는 오리지날 클론 H5의 샘플을 양성 히트로서 선택하였다.
도 16은 MagneHisTM 정제 시스템에 의해 정제한 후 포화 돌연변이유발 라이브러리 (saturation mutagenesis library)에서 확인된 FGF2 돌연변이의 샘플로 SDS-PAGE한 결과이다. M, 단백질 마커 (116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 kDa). 6x His 테그와 트롬빈 절단부를 가진 재조합 FGF2 돌연변이의 약 19.1 kDa 밴드를 프래임으로 표시한다.
도 17은 정제된 FGF2 CS3, CS4 및 CS5 돌연변이의 SDS-PAGE 결과이다. 단백질 마커: 116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 kDa. 6x His 테그와 트롬빈 절단부를 가진 재조합 FGF2 돌연변이는 약 19.1 kDa의 Mw를 가진다.
도 18은 FGF2 CS4 재조합 단백질에 의해 유도된 NIH/3T3 세포의 증식을 도시한 것이다.
정의
본원에 사용되는 일부 용어들의 정의가 아래에 제공된다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적인 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다.
본원에서, 용어 '내열성'은 단백질의 용어 '열적 안정성'과 동의어이며, 열역학적 및 동역학적 안정성을 망라한다. 열역학적 안정성은 단백질의 폴딩된 (네이티브) 상태와 비-폴딩된 상태 간의 평형에 대한 것이며, 이들 2가지 단백질 상태 간의 깁스 자유 에너지 차이로서 정의된다.
본원에서, FGF2 단백질의 용어 '용융 온도' (T m)는 단백질의 50%가 폴딩되고, 단백질의 50%가 비-폴딩되는 온도는 지칭한다. 용융 온도는 열역학적 안정성의 직접적인 척도이다.
본원에서, FGF2 단백질의 용어 '반감기'는 지정된 공정 조건에서 FGF2 단백질의 생물 활성이 절반으로 감소되는데 소요되는 시간을 의미한다. 예를 들어, 기능성 반감기는 세포의 생장, 증식 및/또는 생존 시간에 따른 FGF2 단백질의 생물 활성을 토대로 할 수 있다. 반감기는 비-기능성 단백질 형태 (비-폴딩된 상태, 비가역적으로-변성된 단백질)로부터 네이티브 상태를 분리시키는 에너지 장벽과 관련있는 카이네틱 안정성의 직접적인 척도이다.
본원에서, 용어 '야생형'은 종의 구성원들에서 가장 공통적인 아미노산 서열을 가진 네이티브 FGF2를 의미한다. 본원에서, 야생형 FGF2는 아미노산 155개 길이의 (서열번호 2) 18 kDa 단백질인 인간 FGF2이다.
본원에서, 용어 'FGF2 폴리펩타이드'는 서열번호 2와 85% 이상의 서열 동일성을 가지거나 또는 바람직하게는 서열번호 2를 가지며, R31L 또는 H59F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환; 또는 적어도 2종의 치환 R31L 및 H59F의 조합을 포함하며, 야생형 FGF2 단백질과 비교해 1℃ 이상, 바람직하게는 8℃ 이상, 더 바람직하게는 14℃ 이상 증가된 T m을 가진, FGF2 활성을 소유한 폴리펩타이드를 지칭한다. T m은 원편광 이색성 분광법 (circular dichroism spectroscopy), 시차 주사 열량측정법 및 형광 열 쉬프트 분석 (fluorescent thermal shift assay)과 같이 용융 온도를 측정하는데 적합한 임의의 방법을 통해 측정할 수 있다.
본원에서, 용어 '3-포인트 FGF2 돌연변이' 또는 "FGF2 CS1"은 다음과 같은 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2를 가지는 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 지칭한다: R31L, V52T, H59F. 바람직하게는, 서열번호 30을 가진 폴리펩타이드이다.
본원에서, 용어 '6-포인트 FGF2 돌연변이' 또는 "FGF2 CS2"는 다음과 같은 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2를 가지는 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 지칭한다: R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E. 바람직하게는, 서열번호 32를 가진 폴리펩타이드이다.
본원에서, 용어 '9-포인트 FGF2 돌연변이' 또는 "FGF2 CS3"는 다음과 같은 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2를 가지는 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 지칭한다: K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H, S109E. 바람직하게는, 서열번호 34를 가진 폴리펩타이드이다.
본원에서, 용어 '9-포인트 FGF2 돌연변이' 또는 "FGF2 CS4"는 다음과 같은 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2를 가지는 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 지칭한다: R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P. 바람직하게는, 서열번호 36을 가진 폴리펩타이드이다.
본원에서, 용어 '11-포인트 FGF2 돌연변이' 또는 "FGF2 CS5"는 다음과 같은 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2를 가지는 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 지칭한다: K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E, T121P. 바람직하게는, 서열번호 38을 가진 폴리펩타이드이다.
본원에서, 용어 'FGF2 폴리펩타이드'는 'FGF2 돌연변이'와 동의어이며, 야생형 서열 FGF2 서열번호 2와 비교해 본 발명에 따른 임의의 치환을 나타내는 하나 이상의 여러가지 아미노산 서열을 가진 변형된 폴리펩타이드 서열을 의미한다.
본원에서, 용어 '폴리펩타이드'는 '단백질'과 동의어이다.
본원에서, 용어 "FGF2 활성"은 용어 "FGF2의 생물 활성"과 동의어이다. 이는 본 발명에 따른 FGF2 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 이의 돌연변이 단백질의 생물 활성을 의미한다. 이는 본 발명에 따른 대상 FGF2 단백질의 세포 결합성 영역과 헤파린 결합 세그먼트를 유지한다. 이는, 신호를 세포 내부로 전달하여, 비-처리된 대조군 세포와 비교해 생장, 증식 또는 생존을 촉발하는데 필수적인, 세포 표면에 존재하는 하나 이상의 FGF 수용체 (FGFR)에 결합할 수 있다. 상기한 세포는, FGF 단백질에 반응하거나 또는 하나 이상의 FGFR을 발현하는 것으로 당해 기술 분야에 공지된, 예를 들어, 간엽 기원의 세포, 일반적으로 섬유모세포, 신경모세포, 신경교 세포 및 그외 신경 기원의 세포, 평활근 세포, 내피 세포 등일 수 있다. FGFR은 세포외 도메인을 포함하나 막관통 및 키나제 도메인은 결핍된 가용성 버전 (soluble version) 등의 수용체의 다양한 이소타입들을 포함한다. 생물 활성은 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 세포 증식 및/또는 기질의 인산화에 의해 측정할 수 있다.
본원에서, 용어 '단편'은 FGF2 활성을 가진 본 발명에 따른 FGF2 폴리펩타이드의 기능성 단편을 지칭한다. 또한, 서열번호 2의 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 가진 FGF2 폴리펩타이드의 기능성 단편을 지칭한다. FGF2 폴리펩타이드의 단편은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 치환을 적어도 가진다. 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 바람직하다. 단편은 온전한 폴리펩타이드 서열 및 구조의 일부로만 구성되는 폴리펩타이드로 의도되며, 변이체의 C-말단 결손 또는 N-말단 결손이 존재할 수 있다. 이러한 기능성 단편은 본 발명에 따른 대상 FGF2 단백질의 세포 결합 영역과 헤파린 결합 세그먼트를 보유한다. 본 발명에 따른 대상 FGF2 단백질의 단편은 바람직한 특성을 보유하여, 이의 T m은 야생형 FGF2와 비교해 1℃ 이상, 바람직하게는 8℃ 이상, 더 바람직하게는 14℃ 이상 증가되며, 또한 세포 표면에 존재하는 하나 이상의 FGF 수용체에 결합하여, 비-처리된 대조군 세포와 비교해 생장, 증식 또는 생존을 촉발할 수 있다.
본원에서, 용어 '돌연변이 단백질 (mutein)'은 본 발명에 따른 FGF2 단백질의 기능성 돌연변이 단백질 또는 이의 단편을 지칭한다. 또한, 본 발명에 따른 임의의 치환을 가지며, 서열번호 2의 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드의 기능성 돌연변이 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 이 용어는 본 발명에 따른 FGF2 단백질에 대한 전술한 아미노산의 가능한 치환들 중 임의의 것을 가지며, 서열번호 2의 서열의 잔기들 중 85% 이상을 가진, 돌연변이된 형태를 의미한다. 이러한 기능성 돌연변이 단백질은 참조 서열의 FGF2의 생물 활성을 유지한다. 바람직하게는, 돌연변이는, 하나의 아미노산이 생물학적으로 유사한 다른 아미노산으로 치환되는, L-아미노산을 이용한 치환이다. 보존적인 치환의 예로는 소수성 잔기의 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하전 또는 극성 잔기의 다른 하전 또는 극성 잔기로의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 치환은 생물학적 활성과 관련없는 FGF2 N-말단에 도입된다.
본원에서, 용어 '서열 동일성'은 동일한 아미노산 잔기가 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 FGF2 단백질에서 발견되는 것을 의미한다. FGF2 단백질의 아미노산 서열의 명시된 연속 세그먼트를 정렬하여 기준 분자에 해당되는 특정 아미노산 서열과 비교하였을 때, FGF2 단백질이 기준으로서 사용된다. 서열 동일성의 %는, 양쪽 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 측정함으로써 일치된 위치의 수를 산정하고, 이를 기준 분자와 비교하는 세그먼트의 전체 위치 개수로 나누고, 이에 100을 곱하여, 서열 동일성의 %를 산출함으로써, 계산한다. 서열 정렬 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 본원에 사용되는 기준 서열은 본 발명에 따른 특정 대응되는 인간 FGF2 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 마우스, 랫, 토끼, 영장류, 돼지, 개, 소, 말 및 인간 등의 포유류 종의 경우, FGF2는 고도로 보존되어 있으며, 광범위한 종들에서 85% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는 서열 동일성은 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 또는 100%이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명에 따른 FGF2 단백질의 전장에서 나머지 15% 이하의 아미노산은 예를 들어 FGF2 종의 다른 소스를 이용하거나 또는 당해 기술 분야에 일반적으로 공지된 적합한 비-FGF 펩타이드 서열 또는 테그의 부가로 인해, 가변적일 수 있음을, 이해할 것이다. 야생형 FGF2에 대해 85% 이상의 동일성을 가진 본 발명의 구현예에 따른 FGF2 단백질은, FGF 패밀리의 다른 멤버들은 일반적으로 매우 낮은 서열 동일성을 가지므로, 비슷한 FGF2 이외의 다른 단백질을 포함할 가능성은 낮다.
본원에서, 용어 '유효량'은 적어도 5번의 계대 배양 동안에 미-분화된 상태로 만능성 줄기 세포를 유지시키는데 필요한 양을 의미한다.
인간 배아 줄기 세포 및 유도된 만능성 줄기 세포 둘다를 포함하는, 본원에서, 용어 '인간 만능성 줄기 세포'는, 동일한 자신의 후대와 인간 신체의 실제 모든 세포 타입을 생성할 수 있게 하는 만능성을 형성하는 능력 - 자가-재생력 (self-renewal capacity) - 을 특징으로 한다.
본원에서, 용어 '줄기 세포를 만능성 상태로 유지시킨다'는 것은 실제 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미-분화된 상태로 세포를 유지시키는 것을 의미한다. 이러한 만능성 상태는 FGF2가 가장 중요한 성장인자인 성장인자들의 줄기성(stemness)-지지 칵테일에 의존한다. FGF2는 여러가지 방식으로 자가-재생을 지원한다: 미토겐-활성화된 단백질 키나제 경로를 직접 활성화하고, 형질전환 성장인자 β 1 및 액티빈 신호전달을 간접적으로 촉매한다 (Greber, et al. 2008, Stem Cells 25, 455-464). FGF2는, 세포 부착 및 생존 기능을 통해, 인간 PSC의 만능성에 복합적으로 기여한다 (Eisellova, et al. 2009, Stem Cells 27, 1847-1857).
상세한 설명
FGF 단백질의 불안정성을 해결하기 위한 가장 가능성있는 방식은 돌연변이를 통해 단백질 특성을 바꾸는 것이다. 아미노산 서열을 바꿈으로써, FGF 단백질은 더 높은 열적 안정성, 연장된 반감기 및 단백질성 분해에 대한 내성 증가를 가질 수 있다. 이러한 특성을 최적화하기 위한 단백질의 돌연변이 유발은 인간 치료학적 용도에서도 실행가능하다. 단백질의 몇가지 돌연변이 형태들이 인간 약제로서의 용도로서 FDA로부터 승인된 바 있다.
본원은 단백질 조작에 의해 안정화된 본 발명에 따른 FGF2 폴리펩타이드를 제공한다. 안정화 돌연변이는 생물정보 분석 및 컴퓨터를 이용한 단백질 설계를 통해 합리적으로 예측된다. 진화적 분석을 통한 정보를 힘-필드 연산 (force-field calculation)과 조합한 하이브리드 방법을 스마트 필터링 (smart-filtering) 및 전문가 판단 (expert judgement)으로 보강한다. 이런 방식은 안정성 치환에 대한 매우 신뢰성있는 인 실리코 (in silico) 예측을 제공해준다. 이에 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 돌연변이를 제조하거나 또는 새로운 증식 정지 분석 (novel growth arrest assay)을 통해 대규모 포화 라이브러리 (saturation library)로부터 스크리닝한다. 최종적인 돌연변이는 컴퓨터 분석 (computational analysis)을 통해 재조합하고, 유전자 합성 또는 돌연변이 유발을 통해 제조한다.
일반적으로, FGF2의 코딩 유전자를 클로닝한 다음 형질전환된 유기체, 바람직하게는 미생물에서 발현시킨다. 숙주 유기체는 발현 조건에서 FGF2를 생산하도록 외래 유전자를 발현한다. 또한, 합성 재조합 FGF2는 진핵 생물, 예를 들어, 효모 또는 인간 세포에서 만들어질 수 있다. FGF2는 재조합 생산 방법에 따라 146개 아미노산 형태, 153-155 아미노산 형태 또는 이의 혼합 형태일 수 있다 (미국 특허 5,143,829 참조).
용융 온도는 열역학적 안정성의 직접적인 척도이다. 융용 온도를 측정하기 위해 사용되는 기법의 예로는 원편광 이색성 (CD) 분광법, 시차 주사 열량측정법 (DSC) 및 형광 열 쉬프트 분석 (TSA)이 있다. CD 분광법은 단백질의 2차 구조와 배좌 (conformational) 변화를 모니터링하는데 적합한 표지-프리 방법 (label-free method)이다. DSC는 열적 비-폴딩시 단백질의 열 용량이 어떻게 달라지는 지를 관찰하는 열 분석 기법이다. TSA는 단백질 응집을 검출하는 형광 단백질-결합 프로브를 사용해 단백질의 3차 구조의 열적 안정성을 측정하는, 고성능 방법이다. 이들 기법들이 단백질을 비-폴딩시키는 여러가지 작용을 모니터링하더라도, 기준 야생형 FGF2와 본 발명에 따른 FGF2 폴리펩타이드 간의 T m 차이로서 계산된 상대적인 수치는 0.5℃ 미만의 편차로 비슷할 수 있다.
본원에 제시된 설명은, 야생형 FGF2에서의 일부 변화가 인간 세포 배양시 야생형 단백질 보다 높은 열적 안정성과 긴 반감기를 가진 FGF2 돌연변이를 구축함을 최초로 입증해준다.
본원에 기술된 치환을 삽입하기 위해 사용되는 본 발명에 따른 FGF2 단백질은, 본원에 지정된 기준을 충족하는 한, 즉, 야생형 FGF2의 바람직한 생물 활성을 보유하면서 열-안정화되는 한, 예를 들어, 마우스, 랫, 토끼, 영장류, 돼지, 개, 소, 말 및 인간 등의 임의의 포유류에서 유래될 수 있다. 바람직하게는, 대상 FGF2 단백질은 인간 소스로부터 유래된다. 그러나, 비교의 기준으로 사용되는 서열번호 2의 인간 FGF2 단백질의 아미노산 서열에 대해 85% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가진, 포유류 FGF2에 대한 모든 생물학적으로 활성인 변이체들이, 본 발명에서 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명에 따른 안정적인 FGF2 폴리펩타이드는, 검출, 정제, 특정 조직 또는 세포에의 테깅, 개선된 안정성, 연장된 활성, 개선된 발현 등을 용이하게 수행하기 위해 사용될 수 있는, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 부가적인 FGF 펩타이드 이외의 서열 또는 테그를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 조작된 대상 FGF2의 특징 규명, 단백질에서의 치환 효과 입증, 인간 PSC 배양에서 단백질의 이용 방법, 및 인간 PSC를 미분화된 상태로 배양하는데 적합한 본원에 기술된 하나 이상의 내열성 FGF2 단백질을 포함하는 배지를 제공한다. 본원에 제공된 실시예들에서 사용되는 인간 배아 줄기 세포 (ESC)는 의사에 의한 사전동의 하에 수득된 배반포기 배아로부터 유래되었다. 29-41회 계대의 특징이 잘 규명된 인간 ESC 세포주 (Adewumi, et al. 2007, Nat Biotechnol 25, 803-816) CCTL14 (Centre of Cell Therapy Line)를 사용하였다. 인간 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC)에서와 같이, 야마나카의 칵테일 (Yamanaka's cocktail) 및 센다이 바이러스 형질감염 (Sendai virus transfection)에 의한 피부 섬유모세포의 리프로그래밍을 이용하여 유래된 AM13 세포주는 34-41회 계대 상태를 사용하였다 (Kruta et al. 2014, Stem Cells and Development 23, 2443-2454).
본원에 기술된 기법 및 공정들은 일반적으로 통례적인 방법에 따라 수행되며, 이는 본원 전체에 제시된다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명 및 분자 생물학, 생화학, 분석 화학 및 세포 배양에서의 실험 절차들은 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 바와 동일하다.
본 발명의 다른 측면, 과제 및 효과들이 설명 및 청구항들로부터 명확해질 것이다.
실시예
아래 실시예들은 본 발명의 구현예들을 예시하기 위해 제공된다. 주어진 실시예들은 단지 예시하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 개시된 내용와 비슷하거나 또는 동등한 방법 및 물질들이 본 발명을 테스트하는데 사용될 수 있지만, 적절한 방법과 물질은 아래에 기술된다.
실시예 1.
에너지 기반 방식 (energy-based approach)에 의한 FGF2의 단일 점 돌연변이의 안정화 효과 예측
2.20Å 이상의 해상도를 가진 입수가능한 FGF2 구조를 RCSB Protein Data Bank (Berman et al., (2000). Nucleic Acids Res. 28, 235-242)에서 다운로딩하였다. 이 구조는 리간드와 물 분자를 제거함으로써 분석을 위해 준비하였다. 하나의 체인은 멀티플 체인 구조일 경우에 선택하였다. 1번 위치에서 시작하도록 구조들 모두 번호를 다시 매겼다. 단백질 측쇄들을 최소화하고 점수를 매겨, 최소화를 바르게 통과하였는 지를 결정하였다. 가능한 모든 단일-점 돌연변이들의 안정성 효과를 힘-필드 연산 (force-field calculation)을 이용해 추정하였다. ΔΔG 자유 에너지를 수집하고, 사용된 전체 구조에 대해 평균을 산출하고, 특정 위치에서 20종의 돌연변이 전체에 대해 평균을 구하였다. 진화적인 보존 (evolutionary conservation)은 상동적인 서열의 계통 발생 분석을 이용해 추정하였다. 추가적인 분석을 위해 ΔΔG < -1.0 kcal/mol인 돌연변이와 < 8인 보존을 선택하였다. 기능성 영역, 예를 들어, 헤파린 결합 잔기들에 대한 영향이 제한적인 최상의 위치들을 확인하였다. 9개의 단일-점 돌연변이를 실험 구축 및 특정화를 위해 선택하였다: R31W, R31L, H59F, C78Y, L92Y, C96Y, R118W, T121K 및 V125L (표 1). 이들 돌연변이의 넘버링은 야생형 인간 FGF2의 서열에 따른다 (하기 서열번호 2).
표 1. 자유 에너지 예측, 보존 분석 및 육안 검사에 따라 선택된 안정화 돌연변이들.
잔기 위치 돌연변이 ΔΔG [kcal/ mol ] 보존 기능적인 역할
R 31 L -3.6 7 -
R 31 W -4.0 7 -
H 59 F -2.6 3 FGF-2 이량체화
C 78 Y -1.5 3 -
L 92 Y -2.3 7 -
C 96 Y -3.0 3 자가-조합
R 118 W -1.6 3 -
T 121 K -1.5 7 -
V 125 L -1.7 7 -
ΔΔG: 돌연변이에 따른 깁스 자유 에너지 변화
실시예 2. 진화적 방식에 의한 FGF2에서 단일-점 돌연변이들의 안정화 효과 예측
FGF2와 관련 단백질의 멀티플 서열 정렬 (multiple sequence alignment)을 구축하였다. FGF2 단백질 서열을 NCBI의 nr 데이타베이스에 대한 PSI-BLAST (Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402) 검색의 쿼리로서 사용하였다. 3번 반복 후 수집된 서열을 90% 상동성 역치에서 CD-HIT에 의해 클러스터링을 수행하였다 (Li & Godzik, (2006). Bioinformatics 22, 1658-1659). 서열 500개 이상으로 구성된 수득한 데이타세트를 디폴트 파라미터를 사용하여 P-값 역치를 다양화하면서 CLANS를 사용해 클러스터링을 수행하였다 (Frickey & Lupas, (2004). Bioinformatics. 20, 3702-3704). P 값 10-30에서 FGF2와 함께 클러스트링된 서열들을 추출하고, MUSCLE 프로그램 (Edgar, (2004). BMC Bioinformatics. 5, 113)에서 정렬하였다. 서열 238개를 포함하는 최종 정렬을 심플 컨센서스 방법 (simple consensus approach)을 이용해 백-투-컨센서스 분석 (back-to-consensus analysis)의 입력값으로 사용하였다. 이 분석은 컨센서스 컷-오프 0.5를 사용해 수행하였으며, 이는 주어진 잔기가 컨센서스 잔기로서 할당되기 위해 전체 분석 서열의 50% 이상에서 해당 위치에 존재하여야 함을 의미한다. FGF2 단백질에서 가능한 전체 단일-점 돌연변이들의 안정성 효과들은 자유 에너지 계산으로 추정하였다. 이들 2가지 방법에서 추정되는 평균 ΔΔG ≤ 1 kcal/mol을 가진 돌연변이만 FGF2 안정화를 위한 핫-스팟으로 인 것으로 간주하였다. 기능적으로 중요한 FGF2 부위들은 생물학적 기능에 잠재적으로 유해한 돌연변이로서 제외시켰다. 백-투-컨센서스 분석의 결과는 표 2에 요약 개시한다. 넘버링은 야생형 인간 FGF2의 서열 (서열번호 2)에 따른다. 예측된 높은 ΔΔG 값을 토대로 돌연변이 10개는 제외되었으며, 헤파린 결합에 기능적으로 중요한 위치들에서의 돌연변이 3개는 설계에서 제외시켰다. 마지막으로, 3개의 단일-점 돌연변이들이 모든 기준을 통과하였으며, 이를 실험 구축 및 특정화를 위해 선택하였다: V52T, N80G 및 S109E.
표 2: 50% 컨센서스 컷-오프를 이용한 FGF2에서 확인된 백-투-컨센서스 돌연변이들. 실험 구축을 위해 선택된 돌연변이는 회색으로 강조 표시된다.
잔기 위치 Freq Res_TOP Freq _TOP ΔΔG [kcal/mol] 기능적인 역할
P 22 0.10 L 0.59 - -
K 27 0.11 R 0.52 - 인터페이스
R 42 0.22 Q 0.53 3.04 -
V 52 0.13 T 0.53 -0.70 -
Q 63 0.14 E 0.61 1.37 인터페이스, FGF2 이량체화
E 67 0.11 V 0.71 -0.39 인터페이스, FGF2 이량체화
A 79 0.14 S 0.58 1.22 -
N 80 0.18 G 0.56 -0.03 -
K 86 0.06 N 0.71 1.67 자가-조합
A 93 0.27 G 0.53 2.22 -
S 109 0.07 E 0.69 0.51 -
K 128 0.15 N 0.51 1.22 헤파린 결합, 자가 조합
R 129 0.14 K 0.58 -0.20 헤파린 결합, 자가 조합, 인터페이스
K 138 0.36 R 0.53 0.62 헤파린 결합
L 147 0.2 H 0.68 1.10 -
M 151 0.13 R 0.55 1.92 인터페이스
빈도: 멀티플 서열 정렬의 소정의 위치에서 주어진 FGF-2 잔기의 빈도; RES_Top: 멀티플 서열 정렬의 소정의 위치에서 가장 보존된 잔기; Freq_TOP: 멀티플 서열 정렬의 소정의 위치에서 가장 보존된 잔기의 빈도; ΔΔG: 돌연변이에 따른 깁스 자유 에너지 변화.
실시예 3: FGF2의 단일-점 돌연변이 12종 구축 및 친화성 크로마토그래피에 의한 상동성 정제
돌연변이 FGF2 R31W, R31L, V52T, H59F, C78Y, N80G, L92Y, C96Y, S109E, R118W, T121K 및 V125L을 상업적으로 합성하여, 유도성 T7 프로모터 하류에 위치한 pET28b-His-트롬빈의 NdeI 및 XhoI 부위에 서브클로닝하였다. 제조되는 구조체들을 Escherichia coli Dh5α 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 세포를 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 아가 플레이트에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양하였다. 플라스미드를 분리하고, 상업적인 서열분석을 통해 뉴클레오티드 서열을 검증하였다. E. coli BL21(DE3) 세포를 발현 벡터로 형질전환하고, 카나마이신이 첨가된 아가 플레이트에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 한개의 콜로니를 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 LB 배지 10 mL에 접종하고, 세포를 밤새 37℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 배양물을 사용해 카나마이신이 첨가된 LB 배지 200 mL에 접종하였다. 세포를 37℃에서 배양하였다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 최종 농도 0.25 mM로 사용해 발현을 유도하였다. 그런 후, 세포를 20℃에서 밤새 배양하였다. 배양 완료 후, 원심분리에 의해 생중량 (biomass)을 회수하고, 이를 완충제 (20 mM 다이-포타슘 하이드로겐포스페이트 및 포타슘 다이하이드로겐포스페이트, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸)로 헹구었다. 현탁물내 세포를 초음파처리하여 파괴하고, 세포 용해물을 원심분리하였다. 한 단계 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용해 조 추출물로부터 단백질을 정제하였다. 피크 분획내 단백질의 존재를 15% 폴리아크릴아미드 겔에서의 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 500-750 mM NaCl이 함유된 완충제에서 투석하여 단백질의 석출을 최소화하였다. 친화성 크로마토그래피에 의한 FGF2 돌연변이 정제로 SDS-PAGE 분석으로 판단하였을 때 90% 이상의 순도를 가진 균질한 단백질들을 수득하였다 (도 3). 정제된 FGF2 돌연변이들의 순도는 15 내지 90 mg.L-1 범위였다.
실시예 4: 시차 주사 열량측정법에 의한 단일-점 FGF2 돌연변이들의 내열성 측정
에너지에 기반한 방식과 진화에 기반한 방식으로 예측된 단일-점 FGF 돌연변이들의 내열성을 시차 주사 열량측정법 (DSC) 분석에 의해 측정하였다. 500-750 mM 소듐 클로라이드가 첨가된 50 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.5) 중의 1.0 mg/mL 단백질 용액의 열적 비-폴딩 (thermal unfolding)을 VP-캐필러리 DSC 시스템을 이용한 열 용량을 모니터링함으로써 추적하였다. 이 방법은 20℃에서 80℃까지 1℃/분의 가열 속도로 승온시키는 조건에서 수행하였다. 열 용량 곡선이 최고치에 도달하는 온도를 T m으로 결정하였다. 그 결과는 표 4 및 도 4에 나타낸다.
표 4: 시차 주사 열량측정법에 의해 결정된 FGF2 돌연변이들의 내열성. 3-포인트 및 6-포인트 돌연변이들을 조합 구축하기 위해 선택된 돌연변이들은 회색으로 강조 표시된다 (실시예 5 참조).
돌연변이 T m (℃) 1 델타 T m (℃) 예측 방법
야생형 FGF2 54 - -
R31W 56 2 에너지 기반
R31L 59 5 에너지 기반
V52T 57 3 진화 기반
H59F 58 4 에너지 기반
C78Y 55 1 에너지 기반
N80G 54 0 진화 기반
L92Y 56 2 에너지 기반
C96Y 56 2 에너지 기반
S109E 56 2 진화 기반
R118W 54 0 에너지 기반
T121K 54 0 에너지 기반
V125L 50 -4 에너지 기반
T m: 용융 온도; ΔT m: 돌연변이시 융용 온도의 변화; 1 3번의 독립적인 실험들의 평균이다 (표준편차는 10% 미만임).
본 실시예는, 본원의 인 실리코 (in- silico) 예측 방법이 FGF2의 안정화 돌연변이를 예측하는데 유용하다는 것을, 입증해준다. T m을 2℃ 이상 높이는 돌연변이들을, 자유 에너지 계산 결과를 적용하여, 3-포인트 (R31L, V52T 및 H59F) 및 6-포인트 (R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y 및 S109E) 돌연변이들 FGF CS1 및 FGF2 CS2로 각각 조합하였다 (실시예 5 참조).
실시예 5: 3 -포인트 FGF2 CS1 및 6-포인트 FGF2 CS2 돌연변이들의 구축, 정제 및 내열성 분석
FGF2의 멀티플-포인트 돌연변이를 상업적으로 합성하고, 유도성 T7 프로모터 하류에 위치한 pET28b-His-트롬빈의 NdeI 및 XhoI 부위에 서브클로닝하였다 (돌연변이된 뉴클레오티드 서열과 폴리펩타이드 서열은 아래 서열번호 29-32에 표시됨). 제조되는 구조체들을 Escherichia coli Dh5α 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 세포를 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 아가 플레이트에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양하였다. 플라스미드를 분리하고, 상업적인 서열분석을 통해 뉴클레오티드 서열을 검증하였다. E. coli BL21(DE3) 세포를 발현 벡터로 형질전환하고, 카나마이신이 첨가된 아가 플레이트에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 한개의 콜로니를 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 LB 배지 10 mL에 접종하고, 세포를 밤새 37℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 배양물을 사용해 카나마이신이 첨가된 LB 배지 200 mL에 접종하였다. 세포를 37℃에서 배양하였다. IPTG를 최종 농도 0.25 mM로 사용해 발현을 유도하였다. 그런 후, 세포를 20℃에서 밤새 배양하였다. 배양 완료 후, 원심분리에 의해 생중량을 회수하고, 이를 완충제 (20 mM 다이-포타슘 하이드로겐포스페이트 및 포타슘 다이하이드로겐포스페이트, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸)로 헹구었다. 현탁물내 세포를 초음파처리하여 파괴하고, 세포 용해물을 원심분리하였다. 한 단계 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용해 조 추출물로부터 단백질을 정제하였다. 피크 분획내 단백질의 존재를 15% 폴리아크릴아미드 겔에서의 SDS-PAGE에 의해 확인하였다 (도 5). 750 mM NaCl이 함유된 완충제에서 투석하여 단백질의 석출을 최소화하였다. 2종의 돌연변이들의 수율은 배양물에서 약 20 mg/L이었다. DSC를 이용해 단백질 열적 안정성을 규명하였다. FGF2 돌연변이를 DSC 실험을 위해 1.0 mg.mL-1로 희석하였다. DSC 데이타 수집은 20-100℃의 온도 범위에서 수행하였다. T m은 베이스라인의 매뉴얼 세팅 후 가우스 곡선 (Gaussian curve)의 최고치로서 평가하였다. FGF2 CS1 및 CS2 돌연변이들은 각각 T m 62.8℃ 및 68.0℃를 나타내었다 (도 6).
실시예 6: 랫 연골육종 증식-정지 분석을 이용한 3-포인트 및 6-포인트 FGF2 돌연변이들의 내열성 측정
랫 연골 육종 (Rat chondorsarcoma (RCS)) 세포는 최소 FGF 농도에 반응하는 불멸화된 표현형의 안정적인 세포주로서, 강력한 증식 정지는 현저한 형태 변화 및 세포외 매트릭스 변성을 동반한다. FGF 수용체 (FGFR)는 이 세포주에서 세포 증식의 저해 인자로서 기능한다. 세포 증식을 저해하기 위해, FGF 돌연변이는 FGFR 신호 전달을 특이적으로 유도하여야 하며, 이로써 유도된 증식 정지의 농도 의존성에 의해 나타나는 FGF 활성을 측정할 수 있다. RCS 분석의 주된 장점은 독성 화학제가 없고, 위-양성 히트가 없다는 것이다 (Krejci, et al., 2007 Invest New Drugs, 25: 391-395). 고-성능 증식 정지 실험은 96웰 플레이트에서 수행하였으며, 세포 함량은 심플 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하였다. 돌연변이된 FGF2가 약 40 ng/mL 농도로 첨가된 또는 첨가되지 않은 배지를 48시간 동안 36.5℃ 및 41.5℃에서 인큐베이션하고, 이 기간 동안 12시간 마다 혼합하였다. FGF2 돌연변이의 변성을 평가하기 위해, 예비 인큐베이션한 배지를 신선한 대조군으로서 돌연변이된 FGF2와 혼합하였다. 처리 하루 전날 RCS 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 세포 농도 250개씩 접종하였다. 세포에, 각 FGF2 돌연변이에 대해 예비 인큐베이션한 FGF2와 신선한 대조군을 최종 농도 20 ng/mL로 둘다 4일간 처리하였다. 세포를 PBS로 헹구고, 4% 파라포름알데하이드로 고정한 다음 다시 헹구고, 0.025% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 염색하였다. 염색된 세포를 증류수로 3번 헹구었다. 세포로부터 색을 33% 아세트산에 용해시켰다. 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. RCS 증식-정지 분석의 결과는 도 7에 나타낸다. 이 실험으로, 6-포인트 FGF2 CS2 돌연변이는 RCS 세포 증식을 저해하는 저해력이 심지어 41.5℃에서 2일 배양한 이후에도 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 반면, 야생형 FGF2의 생물 활성은 36.5℃에서 배양한 후 이미 감소하였다.
실시예 7: 열-안정화된 6-포인트 FGF2 CS2는 인간 만능성 줄기 세포의 미-분화성 증식을 유지시킨다
미-분화된 인간 만능성 줄기 세포 (PSC)의 장기간 증식을 지원하는 열-안정화된 FGF2 CS2 돌연변이의 능력을 평가하기 위해, 2가지 배양 시스템을 사용하였다: (i) 마우스 배아 섬유모세포 (mEF) 피더 층의 존재 하에 콜로니 증식, 및 (ii) MatrigelTM hESC-qualified Matric (BD Biosciences) 상에서의 피더-프리 단일층 증식 (feeder-free monolayer growth). 피더-의존적인 조건에서, 배지는 15% KnockOut Serum Replacement, 1% MEM 비-필수 아미노산, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 100μM β-머캅토에탄올 및 4 ng/mL 야생형 FGF2 또는 FGF2 CS2 돌연변이가 첨가된 DMEM/F12 (1:1)로 구성되었다. 피더-프리 단일층 시스템의 경우, 인간 PSC 증식을 위해 mEF-컨디셔닝화된 배지가 필요하다. 이를 위해, 배양 배지에는 피더 세포에 의해 컨디셔닝화 후 테스트 FGF2 (10 ng/mL)를 첨가하였다 (CM II, 도 14). 인간 PSC를 각 테스트 조건에서 5회 계대 배양으로 배양하고, 세포의 형태와 만능성 마커 Oct4 및 Nanog의 발현을 모니터링하였다. FGF2가 첨가되지 않은 배양 배지에서 유지시킨 인간 PSC는 수개의 분화된 콜로니가 형성되었는데, 이는 인간 PSC의 미-분화된 상태를 유지하는데 FGF2의 역할이 중요하다는 것을 의미한다. 테스트한 2종의 FGF의 존재 하에 배양하였을 때, 인간 PSC는 전형적인 형태 - 피더 세포와 함께 배양하였을 때 타이트하게 밀집된 콜로니와 2가지 배양 시스템에서 세포질 대비 핵의 비율이 높음 - 를 나타내었다 (도 8). 야생형 FGF2와 6-포인트 FGF 돌연변이 간에 세포 형태적 차이는 관찰되지 않았다. 보다 구체적으로 인간 PSC의 만능성 상태를 조사하기 위해, 만능성 마커 Oct4 및 Nanog의 발현을 면역조직화학적으로 조사하였다. 테스트한 임의 조건들에서 Oct4 또는 Nanog의 발현 양 또는 패턴에서 차이는 관찰되지 않았다 (도 9).
실시예 8: 열-안정화된 6-포인트 FGF2 CS2는 인간 만능성 줄기 세포의 증식을 자극한다.
증식 속도를 측정하기 위해, 2가지 방식을 이용하였다. 일차로, 피더-프리 인간 ESC의 수를 접종 후 연속 4일간 계수하였다. 테스트한 2종의 FGF2 모두 비슷한 효율로 인간 ESC의 증식을 유지시켰다 (도 10A). FGF2의 장기간의 유지력을 조사하기 위해, 피더-프리 인간 ESC를 5회 계대 배양으로 테스트 FGF2 각각에 적응시켰다. 그런 후, 직접 세포 카운트 (도 10B) 또는 크리스탈 바이올렛 카운터 염색된 세포의 광학 밀도 (도 10C)를 이용해, 증식을 측정하였다. 이들 분석에서, 6-포인트 FGF2 CS2 돌연변이는 야생형 FGF2 보다 인간 ESC의 증식을 지지하는 효과가 더 우수하였다. 이 데이타는 단기 증식 및 장기 증식시, 열-안정화된 FGF2 CS2의 증식 촉진 효과를 명확하게 보여준다.
실시예 9: 열-안정화된 6-포인트 FGF2 CS2는 37℃에서 장기간 인큐베이션하 는 동안 생물학적 활성을 유지한다
FGF-수용체 및 ERK1/2 등의 이의 하류 작동 인자 (downstream effector)들은 FGF2 처리시 활성화되어, 인간 PSC의 만능성에 기여한다 (Dvorak, et al. 2005, Stem Cells 25, 1200-1211; Eiselleova, et al. 2009, Stem Cell 27, 1847-1857). FGF2의 생물학적 활성이 37℃에서 줄어들기 때문에, ERK1/2 인산화가 감소하며, 인간 PSC는 쉽게 분화 촉진된다. 야생형 FGF2 및 FGF2 CS2 돌연변이의 열적 안정성을 테스트하기 위해, FGF2 첨가 없이 준비한 CM에 원하는 FGF2를 10 ng/mL로 첨가하여, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 2d, 3d, 4d 또는 5d 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 후, FGF2-고갈된 인간 ESC에 예비-열 인큐베이션한 FGF2가 함유된 CM을 2시간 처리하고, 인산화된 ERK1/2에 대한 웨스턴 블롯을 실시하였다. 야생형 FGF2의 생물 활성은 예비-열 인큐베이션 시간에 따라 감소하였지만, 열-안정화된 FGF2 CS2 돌연변이는 심지어 37℃에서 5일간 인큐베이션한 후에도 충분한 생물 활성을 유지하였다 (도 11).
실시예 10: 배양 배지의 매일 교체는 열-안정화된 FGF2 CS2에 필요하지 않다
야생형 FGF2의 불안정성으로 인해, 인간 PSC의 만능성을 유지하는데 배양 배지를 매일 교체하는 것이 필수적이다. 이에, 열-안정화된 FGF2 CS2 돌연변이의 사용이 이러한 조건을 우회할 수 있는 지를 테스트하였다. 이를 위해, 인간 ESC를 FGF2 돌연변이를 표준 4 ng/mL 또는 감소된 1 ng/mL으로 함유한 배지 중에 피더 세포 상에 접종하고, 배지 교체없이 이후 3-4일간 콜로니를 배양하였다. 도 12에 나타낸 결과는, 열-안정화된 FGF2 CS2 돌연변이가 인간 ESC의 미-분화된 형태를 유지시킬 뿐만 아니라 심지어 농도 1 ng/mL에서도 만능성 마커 Oct4의 발현을 유지시키며, 배지를 매일 교체할 필요가 없다는 것을, 입증해준다.
실시예 11: 열-안정화된 FGF2 CS2를 이용하는 경우 컨디셔닝화된 배지를 반복적으로 보충할 필요가 없다
야생형 FGF2는 CM 증식시 불활성화 및 분해되기 때문에, 피더 세포에 의한 컨디셔닝화 전 및 이후에 배양 배지에 FGF2가 보충되어야 한다. 이에, 열-안정화된 6-포인트 FGF2 돌연변이가, 피더 세포에 의해 컨디셔닝화된 이후에 배지의 추가적인 보충없이도, 인간 PSC의 미-분화된 증식을 유지할 수 있는 지를 조사하였다 (CM III, 도 14). 피더-프리 인간 PSC를 야생형 FGF2 및 FGF2 돌연변이 양쪽에서 5회 계대 배양으로 증식시켰으며, 만능성 마커의 발현과 증식을 모니터링하였다. 6-포인트 FGF2 돌연변이는 만능성 마커의 발현에는 영향을 주지 않으면서 (도 13A), 야생형 FGF2와 비교해 우수한 증식 유지 능력을 나타낸다 (도 13B).
실시예 12: 포화 돌연변이 유발에 의한 안정적인 FGF2 돌연변이 예측 및 구축
추가적인 안정화 돌연변이를 밝혀줄 수 있는 포화 돌연변이 유발을 위한 위치들은 힘-필드 연산을 이용해 제안되었다. 돌연변이는 깁스 자유 에너지에서 예측된 변화 (ΔΔG)에 따라 3개의 그룹으로 나누었다. ΔΔG < -1.0 kcal/mol인 돌연변이는 안정성인 것으로, 1.0 < ΔΔG < -1.0인 돌연변이는 중성인 것으로, ΔΔG > 1.0인 돌연변이는 불안정성인 것으로 분류하였다. 안정화성 돌연변이 수가 제일 많고 불안정성 돌연변이의 수가 적은 위치 11곳을 포화 돌연변이 유발을 위해 선택하였다 (표 5).
표 5: 에너지 기반 방식에 의해 예측된 FGF2 선택 위치에서의 안정화 돌연변이 및 불안정화 돌연변이.
위치 힘-필드 1 힘-필드 2
안정성 치환 개수 불안정성 치환 개수 안정성 치환 개수 불안정성 치환 개수
K30 8 5 0 6
E54 6 3 0 0
E67 5 2 0 1
C78 15 0 3 0
R90 4 2 0 5
S94 5 4 2 1
C96 17 0 0 0
E108 9 2 0 5
N113 13 2 5 4
T121 4 2 2 0
S152 5 2 0 1
FGF2의 전체 11개의 단일-점 포화 돌연변이 유발 라이브러리를 유전자 합성에 의해 제조하였다. 6x His 테그와 트롬빈 절단 제한효소 부위가 포함된 N-말단 서열에 용합된 야생형 Fgf2 cDNA (도 2)를 pET28b 베겉에 서브클로닝하여 돌연변이 유발의 주형으로서 사용하였다. 라이브러리는 뉴클레오티드 서열에서 변성된 코돈에 해당되는 위치에 오직 20개의 단백질성 아미노산만 허용하는 "Fixed Oligo" 기법을 이용해 구축하였다. 라이브러리는 동결건조된 플라스미드 DNA로서 전달되었다. DNA 펠릿을 멸균수에 최종 농도 250 ng/㎕로 용해하였다. 각 라이브러리에서 1 ㎕를 취하여 신선하게 준비한 E. coli XJb (DE3) 오토라이시스 세포 100 ㎕에 전기충경으로 도입하였다. 세포를 카나마이신이 최종 농도 50 ㎍/mL로 첨가된 LB 아가 플레이트 11개에 각각 접종하여, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 11개의 각 LB 아가 플레이트에서 콜로니 하나를 취하여 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 LB 배지 250 ㎕이 수용된 1 mL 96 딥-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 플레이트를 고습 챔버 안에서 200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 발현은 카나마이신, IPTG 및 L-아라비노스가 각각 최종 농도 50 ㎍.mL -1, 0.25 mM 및 3 mM로 첨가된 신선한 LB 배지를 첨가함으로서 유도하였다. 플레이트를 20℃에서 교반하면서 밤새 인큐베이션하였다. 22시간 후, 플레이트를 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿이 존재하는 전체 마이크로타이터 플레이트를 -70℃에서 냉동시켰다. 그런 후, 라이시스 완충제 (20 mM 소듐 포스페이트 완충제, 150 mM NaCl, pH 7.0) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 30℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 수득한 세포 용해물에서 세포 파편을 제거하고, 브래드포드 방법으로 각 플레이트에서 용해성 단백질의 총량을 측정하였다. 전체 용해성 단백질에 대한 %로서 FGF2의 함량을 SDS-PAGE 및 밀도측정기로 측정하였다. 각 라이브러리에서 선택된 조 추출물내 전체 용해성 단백질의 농도는 0.2 내지 0.3 mg.mL-1 범위였다. 조 추출물내 FGF의 함량은 전체 용해성 단백질의 5% 내지 7% 범위였다.
각각의 FGF2 돌연변이가 포함된 세포 용해물의 생물 활성을 RSC를 이용한 증식 정지 분석으로 측정하였다. FGF2 돌연변이와 대조군이 함유된 조추출물이 수용된 마이크로타이터 플레이트를 실온에서 해동시켜, 41.5℃에서 48시간 예비 배양하였다. 예비 배양한 조 추출물을, 새로운 마이크로타이터 플레이트에서 증식시킨 연골 세포에 최종 농도 20 ng.mL-1로 첨가하고, 연골 세포의 증식 저해를 세포의 광학 밀도를 측정함으로써 대조군 함유 샘플과 비교하였다 (도 15). 보다 안정적인 FGF2 돌연변이가 첨가된 조 추출물에 존재하였으며, 보다 명백한 증거는 증식 저해였다. 증식 저해는 또한 승온된 온도에서 예비 배양하지 않은 샘플에서도 측정되었다. 야생형 FGF2가 함유된 샘플과 비교해 더 현저한 증식 저해를 야기하는 샘플을 양성 히트로 간주하였다. 각 양성 히트에서, 전술한 전체 스크리닝 절차를 반복 수행하였다. 돌연변이된 Fgf2 유전자들은 생거 방법으로 서열을 분석하였다. 수득한 서열들은 야생형 FGF2의 서열과 정렬시켜 삽입된 돌연변이를 검증하였다 (표 6).
표 6. FGF2의 포화 돌연변이 유발 라이브러리 11종의 스크리닝 결과에 대한 개괄.
라이브러리 검증된 히트 수 서열분석으로 검증된 돌연변이
K30X 2 K30I, K30R
E54X 2 E54D, E54A
E67X 5 E67F, E67V, E67I, E67H, E67W
C78X 1 C78M
R90X 1 R90K
S94X 7 S94V, S94N, S94M, S94R, S94L, S94T, S94I
C96X 3 C96Q, C96R, C96N
E108X 2 E108V, E108H
N113X 0 -
T121X 7 T121C, T121F, T121P, T121A, T121H, T121R, T121Q,
S152X 2 S152Q, S152R
E. coli BL21(DE3) 세포를 발현 벡터 pET28b-His-트롬빈::fgf2x (x = 32종의 FGF2 돌연변이)로 형질전환하여, 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니 하나를 카나마이신이 첨가된 LB 배지 10 mL에 접종하여, 세포를 밤새 37℃에서 배양하였다. IPTG를 최종 농도 0.25 mM로 첨가하여 발현을 유도하였다. 그런 후, 세포를 20℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 생중량을 원심분리하고, 세포 펠릿을 -70℃에서 냉동시켰다. 펠릿을 해동시켜, FastBreak™ 세포 라이시스 시약 1X에 재현탁하였다. 세포분해된 세포를 실온에서 교반 플랫폼 상에서 10-20분간 인큐베이션하였다. 세포 펠릿에 MagneHis™ Ni-입자를 첨가하였다. MagneHis™ Ni-입자에 대한 결합성을 향상시키기 위해, 박테리아 배양물에 500 mM NaCl을 첨가하였다 (0.03 g NaCl/세포분해물 1.0 mL). 파괴된 박테리아 세포가 든 튜브를 실온에서 2분간 인큐베이션한 다음 자기 스탠드에 약 30초간 배치하여, MagneHis™ Ni-입자를 포획하였다. 상층액을 조심스럽게 분리하였다. 결합되지 않은 세포 단백질을 세척하기 위해, 500 mM NaCl이 첨가된 MagneHis™ 결합/세척 완충제를 첨가하였다. 상층액을 조심스럽게 분리하였다. 세척 단계를 2번 반복하였다. 결합된 단백질의 용출은 500 mM NaCl이 첨가된 MagneHis™ 용출 완충제 105 ㎕를 첨가하여 수행하였다. 용출 혼합물을 실온에서 2분간 인큐베이션한 다음 약 30초간 적절한 자기 스탠드에 튜브를 배치하여 정제된 단백질이 함유된 상층물을 분리하였다. 모든 FGF2 돌연변이의 존재는 15% 폴리아크릴아미드 겔에서의 SDS-PAGE에 의해 검증하였다 (도 16). 정제된 FGF2 돌연변이의 수율은 10 내지 100 mg.L-1이었으며, FGF2 돌연변이 대부분이 야생형 FGF2와 비슷하거나 또는 더 높은 수준으로 발현되었다.
열 쉬프트 분석 (thermal shift assay)을 타겟 단백질의 열적 안정성을 측정하는데 이용하였다. 측정은 96-마이크로타이터 플레이트에서 수행하였다. 각 웰은 Sypro Orange dye (물에 40x로 희석됨) 2 ㎕을 포함하며, FGF2 돌연변이의 적절한 부피를 하기 식으로 계산하였다:
VFGF2var = (CFGF2var * Vdv) / Cdc
VFGF2var = (CFGF2var * 1) / 2.5
상기 식에서, VFGF2var은 FGF2 돌연변이의 부피이고, CFGF2var은 FGF2 돌연변이의 농도이고, Cdc는 지정된 농도 2.5 mg.mL-1이고, Vdv는 1 ㎕로 지정된다. 용출 완충제를 마지막에 첨가하여, 웰내 총 부피는 25 ㎕이었다. 열-변성 분석을, 출발 온도 25℃에서 1℃ 최종 온도 95℃까지 승온시키면서, 실시간 PCR 시스템에서 수행하였다. T m 값을 볼츠만-유래 방법 (Boltzmann-derived method)으로 구하였으며, T m 값은 형광 용융 곡선 플롯의 변곡점 (inflection point)으로서 취하였다 (표 7).
표 7: 열 쉬프트 분석에 의해 측정한 포화 돌연변이 유발을 통해 입수한 FGF2 돌연변이들의 내열성. 열 쉬프트 분석에 의해 측정된 야생형 FGF2의 T m은 51℃였다. 추가적인 컴퓨터 분석을 위해 선택한 아미노산 치환 (실시예 13 참조)은 회색으로 강조 표시된다.
FGF2 돌연변이 T m (℃) T m (℃) FGF2 돌연변이 T m (℃) T m (℃)
K30I 55 +4 S94T 51 0
K30R n.d. - S94I 53 +2
E54D 53 +2 C96Q 52 +1
E54A n.d. - C96R 51 0
E67F 52 +1 C96N 53 +2
E67V 52 +1 E108V 49 -2
E67I 52 +1 E108H 53 +2
E67H n.d. - T121C 50 -1
E67W 52 +1 T121F 49 -2
C78M 51 0 T121P 54 +3
R90K 48 -3 T121A 51 0
S94V 51 0 T121H 50 -1
S94N 50 -1 T121R 50 -1
S94M 50 -1 T121Q 52 +1
S94R 48 -3 S152Q 49 -2
S94L 51 0 S152R 49 -2
T m: 용융 온도; ΔT m: 돌연변이시 용융 온도의 변화; n.d., 단백질 폴딩 불량으로 인해 측정 안됨.
실시예 13: 포화 돌연변이 유발로부터 수득한 단일 점 돌연변이들의 조합
길항 효과없이 조합가능한 돌연변이들을 확인하고 고도로 안정적인 FGF2의 멀티-사이트 돌연변이를 설계하기 위해, 힘-필드 연산을 이용하였다. 라이브러리 스크리닝에서 구한 하기 돌연변이 (실시예 12 참조)들을 추가적인 분석을 위해 선택하였다: K30I, E54D, S94I, C96N, E108H 및 T121P. 이들 돌연변이를 기존의 FGF2 CS2 돌연변이들 (R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y 및 S109E)과 조합하였다. 2-포인트 돌연변이들의 조합들을 모두 인 실리코로 구축하여, 각 돌연변이의 가산 효과 (additivity)를 예측하였다. 예측된 ΔΔG 와 각 단일-점 돌연변이들의 총합 간의 차이가 > 1 kcal.mol-1인 2-포인트 돌연변이를 길항성으로 간주하였다. 따라서, 추가적인 특정화를 위해 서로 다른 3개의 멀티플 포인트 돌연변이들을 설계하였다. 3종의 돌연변이들 모두 기준에 설계된 FGF2 CS2에 기초하였다. FGF2 CS3 돌연변이 (R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D 및 E108H)는 열 쉬프트 분석에서 최대 안정화 효과를 가진 부가적인 돌연변이 3종을 포함하였다. 단백질 기능을 보존하기 위해 FGF2 CS4 (R31L, V52T, H59F, L92Y, S109E, E54D, S94I, C96N 및 T121P)를 설계하였다. FGF2와 FGFR1 또는 FGFR2 수용체 간의 인터페이스 또는 이량체화에 중요한 위치들을 타겟팅하는 돌연변이는 모두 버리고, 실험적으로 검증된 우수한 안정화 효과로 인해 돌연변이 C96Y를 C96N으로 치환하였다. 단백질의 내열성 효과를 극대화하기 위해 FGF2 CS5 돌연변이 (R31L, V52T, H59F, L92Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H 및 T121P)를 선택하였으며, 이들 돌연변이 모두 열 쉬프트 분석에서 FGF2를 안정화하는 것으로 확인되었다 (실시예 12).
실시예 14: FGF2 CS3, CS4 및 CS5 돌연변이의 구축, 정제 및 내열성 분석
FGF2의 멀티플-점 돌연변이를 상업적으로 합성하여, 유도성 T7 프로모터 하류에 위치한 pET28b-His-트롬빈의 NdeI 및 XhoI 부위에 서브클로닝하였다 (돌연변이된 뉴클레오티드 서열과 폴리펩타이드 서열은 아래 서열번호 33-38에 표시됨). 제조되는 구조체들을 E. coli Dh5α 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 세포를 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 아가 플레이트에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양하였다. 플라스미드를 분리하고, 상업적인 서열분석을 통해 뉴클레오티드 서열을 검증하였다. E. coli BL21(DE3) 세포를 발현 벡터로 형질전환하고, 카나마이신이 첨가된 아가 플레이트에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 한개의 콜로니를 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 첨가된 LB 배지 10 mL에 접종하고, 세포를 밤새 37℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 배양물을 사용해 카나마이신이 첨가된 LB 배지 200 mL에 접종하였다. 세포를 37℃에서 배양하였다. IPTG를 최종 농도 0.25 mM로 사용해 발현을 유도하였다. 그런 후, 세포를 20℃에서 밤새 배양하였다. 배양 완료 후, 원심분리에 의해 생중량을 회수하고, 이를 완충제 (20 mM 포타슘 포스페이트 완충제, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸)로 헹구었다. 현탁물내 세포를 초음파처리하여 파괴하고, 세포 용해물을 원심분리하였다. 한 단계 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용해 조 추출물로부터 단백질을 정제하였다. 피크 분획내 단백질의 존재를 15% 폴리아크릴아미드 겔에서의 SDS-PAGE에 의해 확인하였다 (도 17). 750 mM NaCl이 함유된 완충제에서 투석하여 단백질의 석출을 최소화하였다. 돌연변이들의 수율은 배양물에서 5-10 mg/L이었다. DSC를 이용해 단백질 열적 안정성을 규명하였다. FGF2 돌연변이를 DSC 실험을 위해 1.0 mg.mL-1로 희석하였다. 데이타 수집은 20-90℃의 온도 범위에서 1℃/분의 속도로 수행하였다. FGF2 CS3, FGF2 CS4 및 FGF2 CS5 돌연변이들은 각각 T m 72.6℃, 72.2℃ 및 72.7℃를 나타내었다.
실시예 15: 열-안정화된 FGF2 CS4에 의한 NIH/3T3 세포 증식
NIH/3T3 세포를 세포 40,000개/cm2의 밀도로 웰 당 배지 190 ㎕ 중에 접종하였다 (DMEM 31966, Gibco® + P/S + 10% 갓 태어난 송아지의 혈청). 24시간 후, 고갈로 인해 배지를 교체하였다 (DMEM 31966, Gibco® + P/S + 0.5% 갓 태어난 송아지의 혈청). 16시간 후, 세포를 멸균수에 희석하고, FGF2 CS4를 최종 농도 0.01 - 20 ng/mL로 첨가하여 처리한 다음 세포를 37℃에서 추가로 48시간 배양하였다. 세포의 증식을 CyQuant® 형광 분석으로 측정하였다 (도 18). 실험은 동일한 세트 3세트로 수행하였다. FGF2 CS4에 대한 EC50, 즉, 최고 반응의 절반 수준을 달성하는 FGF2 CS4 농도는, NIH/3T3 세포의 증식 분석에서 측정한 바에 따라, 0.6-1.1 ng/mL이다.
SEQUENCE LISTING <110> MASARYKOVA UNIVERZITA ENANTIS s.r.o. <120> Thermostable FGF2 polypeptide, use thereof. <130> D3876-PCT/Ma <150> EP15196802.1 <151> 27.11.2015 <160> 38 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 3 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:4 <400> 3 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag tggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 4 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 R31W <400> 4 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Trp Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 5 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:6 <400> 5 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag ctgctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 6 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aminoacid sequence of FGF-2 R31L <400> 6 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Leu Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 7 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:8 <400> 7 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac gggacccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 8 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 V52T <400> 8 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Thr Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 9 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:10 <400> 9 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctttcatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 10 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 H59F <400> 10 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro Phe Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 11 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:12 <400> 11 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttatatgctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 12 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 L92Y <400> 12 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 13 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:14 <400> 13 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatatgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 14 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 C96Y <400> 14 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Tyr 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 15 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:16 <400> 15 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaagaaaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 16 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 S109E <400> 16 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 17 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:18 <400> 17 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccatc cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 18 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 K30I <400> 18 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Ile Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 19 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:20 <400> 19 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg acaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 20 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 E54D <400> 20 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Asp Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 21 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:22 <400> 21 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggcta tcaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 22 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 S94I <400> 22 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ile Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 23 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:24 <400> 23 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaaaacgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 24 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 C96N <400> 24 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Asn 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 25 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:26 <400> 25 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt gcactctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 26 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 E108H <400> 26 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu His Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 27 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:28 <400> 27 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 cccagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 28 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 T121P <400> 28 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 29 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:30 <400> 29 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag ctgctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac gggacccggg agaagagcga ccctttcatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 30 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 CS1 <400> 30 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Leu Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Thr Arg Glu Lys Ser Asp Pro Phe Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 31 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:32 <400> 31 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag ctgctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac gggacccggg agaagagcga ccctttcatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttatatgctt ctaaatatgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaagaaaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 32 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 CS2 <400> 32 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Leu Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Thr Arg Glu Lys Ser Asp Pro Phe Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Lys Tyr 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 33 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:34 <400> 33 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccatc ctgctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac gggacccggg acaagagcga ccctttcatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttatatgctt ctaaatatgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt gcacgaaaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 34 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 CS3 <400> 34 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Ile Leu Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Thr Arg Asp Lys Ser Asp Pro Phe Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Lys Tyr 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu His Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 35 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO:36 <400> 35 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag ctgctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac gggacccggg acaagagcga ccctttcatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttatatgcta tcaaaaacgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaagaaaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 cccagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 36 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 CS4 <400> 36 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Leu Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Thr Arg Asp Lys Ser Asp Pro Phe Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Tyr Ala Ile Lys Asn 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 37 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence shown for SEQ ID NO: 38 <400> 37 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccatc ctgctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac gggacccggg acaagagcga ccctttcatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttatatgcta tcaaaaacgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt gcacgaaaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 cccagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctag 468 <210> 38 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of FGF-2 CS5 <400> 38 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Ile Leu Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Thr Arg Asp Lys Ser Asp Pro Phe Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Tyr Ala Ile Lys Asn 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu His Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155

Claims (15)

  1. 내열성 폴리펩타이드 (thermostable polypeptide)로서,
    FGF2 활성을 가지며,
    서열번호 2 또는 이의 단편과 85% 이상의 서열 동일성을 가지며,
    적어도 아미노산 치환 R31L을 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 서열번호 2 또는 이의 단편을 가지며, 적어도 아미노산 치환 R31L을 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H 및 T121P로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 아미노산 치환 R31L, V52T 및 H59F를 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H 및 T121P로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 아미노산 치환 R31L, V52T, H59F, L92Y, C96Y 및 S109E를 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H 및 T121P로 이루어진 군으로부터 선택되는 8개 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 아미노산 치환 K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, C96Y, E108H 및 S109E를 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 아미노산 치환 R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E 및 T121P를 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    V52T, H59F, L92Y, C96Y, S109E, K30I, E54D, S94I, C96N, E108H 및 T121P로 이루어진 군으로부터 선택되는 10개 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 아미노산 치환 K30I, R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, E108H, S109E 및 T121P를 포함하는, 내열성 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    재생 의학 및 기타 의학적 용도로 사용하기 위한 것인, 내열성 폴리펩타이드.
  13. 코스메틱 (cosmetics)에서의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 내열성 폴리펩타이드의 용도.
  14. 인간 만능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cell)를 미-분화된 상태 (undifferentiated state)로 배양하는데 적합한 배양 배지로서,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 내열성 폴리펩타이드를 배양 배지 중에 1.0 ng/㎕ 내지 100 ng/㎕ 범위의 유효량으로 포함하는, 배양 배지.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 제4항, 제6항, 제8항, 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 아미노산 치환을 포함하는, 배양 배지.
KR1020187018035A 2015-11-27 2016-10-03 내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 KR102650035B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15196802 2015-11-27
EP15196802.1 2015-11-27
PCT/EP2016/073567 WO2017089016A1 (en) 2015-11-27 2016-10-03 Thermostable fgf2 polypeptide, use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180080335A true KR20180080335A (ko) 2018-07-11
KR102650035B1 KR102650035B1 (ko) 2024-03-20

Family

ID=54754475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187018035A KR102650035B1 (ko) 2015-11-27 2016-10-03 내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11746135B2 (ko)
EP (1) EP3380508B1 (ko)
JP (1) JP7131772B2 (ko)
KR (1) KR102650035B1 (ko)
CN (1) CN108779158A (ko)
AU (1) AU2016359722B2 (ko)
BR (1) BR112018010676A2 (ko)
CA (1) CA3006388C (ko)
ES (1) ES2824479T3 (ko)
LT (1) LT3380508T (ko)
PL (1) PL3380508T3 (ko)
SG (1) SG11201804402WA (ko)
WO (1) WO2017089016A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210064042A (ko) * 2019-11-25 2021-06-02 한국해양과학기술원 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112190531B (zh) * 2019-06-19 2022-11-01 湖北医药学院 抗细胞衰老制剂及其制备方法和应用、细胞及其构建方法
JP2022548776A (ja) * 2019-09-19 2022-11-21 ノースウェスタン ユニバーシティ ヒト人工多能性幹細胞のための費用効果の高い培地およびプロトコル
EP4067374A4 (en) * 2019-11-25 2024-03-06 Korea Institute Of Ocean Science And Tech FGF2 POLYPEPTIDE WITH IMPROVED TEMPERATURE STABILITY AND PROTEASE RESISTANCE AND USE THEREOF
CZ309550B6 (cs) * 2021-06-15 2023-04-05 Enantis s.r.o Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití
GB2616475A (en) * 2022-03-11 2023-09-13 Multus Biotechnology Ltd Engineered fibroblast growth factor variants
WO2024110932A1 (en) * 2022-11-25 2024-05-30 Btl Healthcare Technologies A.S. The fgf-2 polypeptides with improved stability, the process for preparing the fgf-2 polypeptides and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110053841A1 (en) * 2006-09-28 2011-03-03 Avner Yayon N-terminal fgf variants having increased receptor selectivity and uses thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU614137B2 (en) 1988-06-06 1991-08-22 Takeda Chemical Industries Ltd. Stabilized fgf composition and production thereof
US5202311A (en) 1988-08-19 1993-04-13 Children's Medical Center Corporation Stabilized fgf composition
CA2020654A1 (en) 1989-07-07 1991-01-08 Yohko Akiyama Stabilized fgf composition and production thereof
US5143829A (en) 1990-03-29 1992-09-01 California Biotechnology Inc. High level expression of basic fibroblast growth factor having a homogeneous n-terminus
EP0730651B1 (en) * 1993-09-24 2005-07-06 Wyeth Holdings Corporation Surface loop structural analogues of fibroblast growth factors
KR20000075739A (ko) * 1997-02-26 2000-12-26 시블렉스 코포레이션 리더 서열이 없는 단백질 수송의 억제제
WO2002017956A2 (en) 2000-08-31 2002-03-07 Chiron Corporation Stabilized fgf formulations containing reducing agents
AT410798B (de) 2001-01-26 2003-07-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen
EP1444995A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) FGF-2 derived proteins for the preparation of biomaterials or medical devices such as stents
US7816140B2 (en) * 2005-06-14 2010-10-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Composition and methods for osteogenic gene therapy
US20070212332A1 (en) * 2005-08-11 2007-09-13 Department Of Veterans Affairs Methods for accelerating bone repair
US7659379B1 (en) 2007-05-24 2010-02-09 Florida State University Research Foundation, Inc. Mutants of human fibroblast growth factor having increased stability and/or mitogenic potency
US8461111B2 (en) 2009-05-20 2013-06-11 Florida State University Research Foundation Fibroblast growth factor mutants having improved functional half-life and methods of their use
EP2333074A1 (en) * 2009-12-14 2011-06-15 Robert Steinfeld Substances and methods for the treatment of lysosmal storage diseases
EP4202040A1 (en) 2010-07-01 2023-06-28 Regenerative Research Foundation Methods for culturing undifferentiated cells using sustained release compositions
US9169309B2 (en) * 2011-03-01 2015-10-27 Humanzyme Inc. Thermostable variants of fibroblast growth factors
US9925270B2 (en) 2011-11-28 2018-03-27 The Regents Of The University Of California bFGF-polymer conjugates, methods for making the same and applications thereof
US8772460B2 (en) 2011-12-16 2014-07-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Thermostable FGF-2 mutant having enhanced stability
US9023644B2 (en) 2011-12-16 2015-05-05 Wisconsin Alumni Research Foundation FGF having enhanced stability
US9474785B2 (en) * 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
EP2930181B1 (en) * 2014-04-07 2017-10-11 Miltenyi Biotec GmbH Fibroblast growth factor muteins with increased activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110053841A1 (en) * 2006-09-28 2011-03-03 Avner Yayon N-terminal fgf variants having increased receptor selectivity and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210064042A (ko) * 2019-11-25 2021-06-02 한국해양과학기술원 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도

Also Published As

Publication number Publication date
ES2824479T3 (es) 2021-05-12
EP3380508B1 (en) 2020-07-22
WO2017089016A1 (en) 2017-06-01
CA3006388C (en) 2023-05-09
CA3006388A1 (en) 2017-06-01
CN108779158A (zh) 2018-11-09
BR112018010676A2 (pt) 2019-04-09
EP3380508A1 (en) 2018-10-03
US11746135B2 (en) 2023-09-05
SG11201804402WA (en) 2018-06-28
US20200270320A1 (en) 2020-08-27
PL3380508T3 (pl) 2021-07-12
LT3380508T (lt) 2020-11-10
JP7131772B2 (ja) 2022-09-06
JP2019500414A (ja) 2019-01-10
AU2016359722B2 (en) 2020-09-17
KR102650035B1 (ko) 2024-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102650035B1 (ko) 내열성 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도
KR100205078B1 (ko) 염기성 섬유 아세포 성장인자 및 이의 생산방법
AU2016359722A1 (en) Thermostable FGF2 polypeptide, use thereof
EP3052519B1 (en) Protoxin-ii variants and methods of use
US6800286B1 (en) Chimeric fibroblast growth factor proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof
KR20160102039A (ko) 인간 fgfr2b 세포외 도메인 및 이의 코딩을 위한 핵산
JP2017522052A (ja) ヒトＦＧＦＲ２ｃ細胞外ドメイン１４６−３５６とそれをコードする遺伝子及びそれらの応用
WO2012038953A2 (en) Fgf-18 truncated variants having increased receptor specificity and uses thereof
CN102898514B (zh) 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途
KR101040168B1 (ko) 신규의 ｋｇｆ2-fｎ10 융합 단백질 및 그의 피부재생 촉진 용도
CN104039820B (zh) 用于诱导软骨形成的gdf‑5突变体
CN114805534B (zh) 人成纤维细胞生长因子突变体及其编码基因、制备方法与应用
Song et al. High-efficiency production of bioactive recombinant human fibroblast growth factor 18 in Escherichia coli and its effects on hair follicle growth
KR20100085041A (ko) Ｓｄｆ-1계 글리코스아미노글리칸 길항제 및 그 사용 방법
Foley et al. The CRIPTO/FRL‐1/CRYPTIC (CFC) domain of human Cripto: Functional and structural insights through disulfide structure analysis
EP4183796A1 (en) Thermostable fgf10 polypeptide or fragment thereof use thereof
CN108640998A (zh) Fgf1-fgf21嵌合蛋白及其治疗糖尿病的应用
JPH08310966A (ja) 繊維芽細胞成長因子キメラ蛋白質を含有する医薬組成物
CZ309550B6 (cs) Termostabilní polypeptid na bázi FGF18 a jeho použití
EP2198027A1 (en) Short polypeptide mediated conformational changes promoting enhancement of enzymatic activity
Liu et al. Computer-assisted engineering of stable human leukemia inhibitory factor
CN114437201A (zh) FGFR2c胞外段类似物及其编码基因和应用
KR20190005240A (ko) Tgf-베타 슈퍼패밀리의 ab6 패밀리 디자이너 리간드를 포함하는 골 및 연골 질환 치료용 조성물 및 그의 이용
Chiu Study of Structural Relationship Between Human Ribosomal Proteins P1 and P2
MXPA00009879A (en) Therapeutic agent for ngf

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant