CN114437201A

CN114437201A - FGFR2c胞外段类似物及其编码基因和应用

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Publication number: CN114437201A
Application number: CN202011233292.5A
Authority: CN
Inventors: 汪炬
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明公开了一种FGFR2c胞外段类似物及其编码基因和应用，所述FGFR2c胞外段类似物的其多肽组成为：(1)野生型wsFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)S252W突变型msFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或是与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有80％同源性的序列。本发明重新构建的FGFR2c胞外段类似物，能够更好的与膜上受体FGFR2结合的多肽，有利于加Fc段真核表达，该多肽具有很好的抑制肺纤维化的作用。

Description

FGFR2c胞外段类似物及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的，本发明涉及FGFR2c胞外段类似物及其编码基因和应用。

背景技术

肺纤维化是多种慢性肺疾病的终末阶段，其特征为肺部纤维化，最终肺功能丧失而致死，严重危害人类生命健康。近年来，国际上针对PDGF、VEGF、FGFR、IL-13、IL-4Rα、CTGF以及LOXL2等IPF治疗靶点的治疗药物也相继进入临床试验，但到目前为止大部分药物仅仅是延缓其进程，能够逆转肺纤维化进程的药物出现，仅仅是延缓很少其进程，因而研发新的更加安全有效的肺纤维化治疗药物迫在眉睫非常有必要。

在肺纤维化进程中，某些FGF家族成员如FGF-2等，通过促进成纤维细胞再生和增殖发挥促纤维化的作用。成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors FGFs)是一组同源的肝素结合多肽，其家族包含23个成员。FGFs有广泛的生物学活性，例如在胚胎发育中调控细胞增殖、迁移和分化，有证据表明致纤维化的细胞因子TGF–β通过分泌大量的FGF2而起作用，抑制FGF2的活性可有效的抑制纤维化的产生。目前已鉴定了人的23种FGFs和不同基因编码的5种FGF受体(Fgfrs)。不同的FGF家族成员发挥着不同的生物学作用，主要表现为调节细胞的增殖，细胞的存活，细胞的分化和细胞的迁移等。在肺纤维化进程中，某些FGF家族成员如FGF-2等，通过促进成纤维细胞再生和增殖发挥促纤维化的作用。

人FGFRs胞外区域包括三个免疫球蛋白结构域，分别为D1、D2、D3免疫球蛋白样区域。D2和D3区域为FGFs配体特异结合区域。

我们努力寻找能够更好抑制FGF信号的FGFR胞外段分子，并采用半衰期更长的大分子给药更方便患者，有望达到较好的治疗肺纤维化的目的。本申请的发明人曾经提供FGFR2IIIc胞外段在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化药物中的应用(CN200810198967.X)，专利号为ZL201410347938.0《FGFR2c胞外段类似物及其编码基因与应用》中，提供了一种FGFR2c胞外段序列为(149-360)氨基酸，其稳定性较之前发表的胞外段序列(147-366)以及(151-377)以及(150-366)均更加稳定，但在实际应用中偶然发现，上述多肽的稳定性都有待提高。

目前已鉴定了人的23种FGFs和不同基因编码的5种FGF受体(Fgfrs)。不同的FGF家族成员发挥着不同的生物学作用，主要表现为调节细胞的增殖，细胞的存活，细胞的分化和细胞的迁移等。人FGFRs胞外区域包括三个免疫球蛋白结构域，分别为D1、D2、D3免疫球蛋白样区域。D2和D3区域为FGFs配体特异结合区域。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种新的FGFR2c胞外段类似物，使其蛋白与FGF-2配体结合力更强，并且有利于加Fc段真核表达，形成半衰期更长的大分子蛋白。

实现上述目的的技术方案如下。

FGFR2c胞外段类似物，其多肽组成为：(1)野生型wsFGFR2c：氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；(2)S252W突变型msFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或是与SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有80％同源性的序列。

本发明的另一目的在于提供所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因。

FGFR2c胞外段类似物的编码基因，其序列组成为：(1)野生型wsFGFR2c如SEQ IDNO.3所示；或因遗传密码的简并性而SEQ ID NO.3不同的序列，该序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)编码S252W突变型msFGFR2c的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示；或因遗传密码的简并性而与(SEQ ID NO.4的序列，该序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的在于提供所述的FGFR2c胞外段类似物在抑制肺纤维化中的应用。

本发明的另一目的在于提供所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因在抑制肺纤维化中的应用。

一种表达重组载体，含有所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因；

所述的表达重组载体优选为将所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因克隆至表达载体得到，或是将所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因和其他基因重组，再克隆至表达载体得到；

所述的表达载体包括原核表达载体和真核表达载体；优选为pET3c载体、pCDNA3.1载体、pIRESneo3载体、pPICZαA载体或pFastBac载体pET30a；

所述的其他基因优选为编码免疫球蛋白表位标记序列的基因或编码Fc区的基因。

一种转基因细胞株，是将上述表达重组载体转染到宿主细胞中得到；

所述的宿主细胞优选为CHO细胞、大肠杆菌、昆虫细胞和酵母细胞中的任一种。

一种融合蛋白，含有上述FGFR2c胞外段类似物的氨基酸序列；

所述的融合蛋白优选为免疫球蛋白表位标记序列或Fc区与上述FGFR2c胞外段类似物连接得到。

上述任一项多肽或上述任一项核苷酸序列用于抑制EGF信号通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

上述表达重组载体、上述宿主细胞和上述融合蛋白中的任一项用于抑制EGF信号通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

一种用于抑制肺纤维化的药物，其活性成分包括上述任一项FGFR2c胞外段类似、所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因、所述表达重组载体、所述转基因细胞株。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明在于利用发明人经过积累的经验和大量研发找到的新的FGFR2c胞外段类似物或其药用组合物阻断如FGF信号通路，阻止其激活，从而抑制肺纤维化及其他以FGFR2c为靶点的疾病。

本发明通过重新构建FGFR2c胞外段类似物，找到一种较FGFR2c胞外149-360片段能够更好的与膜上受体FGFR2结合的多肽，有利于加Fc段真核表达，该多肽具有很好的抑制肺纤维化的作用，能够实现一周给药一次。

附图说明

图1为实施例1中野生型(149-360)、S252W突变型(149-360)、野生型(149-382)、S252W突变型(149-382)FGFR2c胞外段类似物的SDS-PAGE图。

图2为实施例2中野生型(149-360)、S252W突变型(149-360)、野生型(149-382)、S252W突变型(149-382)FGFR2c胞外段类似物的western blotting鉴定图。

图3为实施例3中sFGFR2c胞外段与外源过表达FGFR膜上受体的293细胞的结合能力的流式细胞图。

图4为实施例4中突变型真核表达的FGFR2c对大鼠博来霉素诱导的肺纤维化动物实验结果图。

具体实施方式

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)；PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))；Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。

本发明所述的野生型可溶性FGFR(wild type soluble FGFR，wsFGFR)以及突变型FGFR(mutant soluble FGFR，msFGFR)wsFGFR2c-域突变型msFGFR2c-Fc的构成如下。

野生型wsFGFR2c-Fc：氨基酸序列如下所示；或是与野生型wsFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的野生型wsFGFR2c-Fc的氨基酸序列，如下所示：

1)胞外段序列：SEQ ID NO.1

NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL PKQQAPGREK EITAS PDYLE IA

(2)S252W突变型msFGFR2c-Fc：氨基酸序列如下所示；或是与S252W突变型msFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的S252W突变型msFGFR2c-Fc的氨基酸序列，包括如下所示：

1)胞外段序列：SEQ ID NO.2

NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERWPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL PKQQAPGREK EITAS PDYLE IA

所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因，选自如下核苷酸序列：

(1)①编码野生型wsFGFR2c的核苷酸序列，如下所示；或

②因遗传密码的简并性而与(1)①的核苷酸序列不同的序列；或

③与(1)①或(1)②的核苷酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的编码野生型wsFGFR2c的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3

AATAAACGTGCGCCGTACTGGACCAACACCGAAAAAATGGAAAAACGTCTGCACGCGGTTCCGGCGGCGAACACCGTTAAATTCCGTTGCCCGGCGGGCGGTAACCCGATGCCGACCATGCGTTGGCTGAAAAACGGCAAAGAATTCAAACAGGAACACCGTATCGGTGGTTACAAAGTTCGTAACCAGCACTGGAGCCTGATCATGGAAAGCGTTGTTCCGAGCGATAAAGGCAACTACACCTGCGTTGTTGAAAACGAATACGGTAGCATCAACCACACCTACCACCTGGATGTTGTTGAACGTAGCCCGCACCGTCCGATCCTGCAGGCTGGCCTGCCGGCGAACGCGAGCACCGTTGTTGGCGGTGATGTTGAATTCGTTTGCAAAGTTTACTCTGATGCGCAGCCGCACATCCAGTGGATCAAACACGTTGAGAAAAACGGTTCTAAATACGGCCCGGATGGTCTGCCGTACCTGAAAGTTCTGAAAGCGGCGGGTGTTAACACCACCGATAAAGAAATCGAAGTTCTGTACATCCGTAACGTTACCTTCGAAGATGCGGGTGAATACACCTGCCTGGCGGGTAACAGCATCGGCATCTCTTTCCACAGCGCGTGGCTGACCGTTCTGCCGAAACAGCAGGCGCCGGGCCGTGAAAAAGAAATCACCGCGAGCCCGGATTACCTGGAAATCGCG

(2)①编码S252W突变型msFGFR2c的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示；或

②因遗传密码的简并性而与(2)①的核苷酸序列不同的序列；或

③与(2)①或(2)②的核苷酸序列至少有80％同源性的序列；

所述的编码S252W突变型msFGFR2c的核苷酸序列为：SEQ ID NO.4

AACAAACGTGCGCCGTACTGGACCAACACCGAAAAAATGGAAAAACGTCTGCACGCGGTTCCGGCGGCGAACACCGTTAAATTCCGTTGCCCGGCGGGCGGTAACCCGATGCCGACCATGCGTTGGCTGAAAAACGGTAAAGAATTTAAACAGGAACACCGTATCGGCGGCTACAAAGTTCGTAACCAGCACTGGAGCCTGATCATGGAAAGCGTGGTTCCGTCTGATAAAGGTAACTACACCTGCGTTGTTGAAAACGAATACGGTAGCATCAACCACACCTACCACCTGGATGTTGTTGAACGTTCTCCGCACCGTCCGATCCTGCAGGCGGGTCTGCCGGCGAACGCGAGCACCGTTGTTGGCGGTGATGTTGAGTTCGTTTGCAAAGTTTACAGCGATGCGCAGCCGCACATCCAGTGGATCAAACACGTTGAGAAAAACGGTTCTAAATACGGTCCGGATGGCCTGCCGTACCTGAAAGTTCTGAAAGCGGCGGGTGTTAACACCACCGATAAAGAAATCGAAGTTCTGTACATCCGTAACGTTACCTTCGAAGATGCGGGCGAATACACCTGCCTGGCGGGTAACAGCATCGGCATCTCTTTCCACAGCGCGTGGCTGACCGTTCTGCCGAAACAGCAGGCGCCGGGTCGTGAAAAAGAAATCACCGCGTCTCCGGATTACCTGGAAATCGCG。

实施例1：野生型及突变型FGFR2c胞外段类似物多肽基因在大肠杆菌中的表达原核表达第149-382个氨基酸FGFR2c胞外段

1、以双酶切和连接反应构建重组质粒以及FGFR2c胞外段的表达和鉴定

人工合成野生型及突变型FGFR2c胞外段(149-382氨基酸)的DNA序列(SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4)，两端加引物：

F：CGCATATGAATAAACGTGCGCCGT(SEQ ID NO.5)；划横线为NdeⅠ酶切位点；

R：ATGGATCCCGCGATTTCCAGGTAA(SEQ ID NO.6)；划横线为BamH I酶切位点。

利用限制性核酸内切酶酶切位点NdeΙ和BamH I将FGFR2c胞外段基因插入到原核表达载体pET30a中，并通过全质粒酶切法和目的基因测序确认重组表达载体FGFR2c/pET30a的准确性；接下来，重组表达载体通过物理法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，利用IPTG诱导目的蛋白FGFR2c胞外段在37℃、25℃和16℃下试表达，并通过SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定分析表达产物。

2、FGFR2c胞外段多肽的收集与纯化：

(1)获得IPTG诱导后的菌体，接着4℃、6000rpm离心30min收集菌体沉淀。

(2)按菌体：破碎缓冲液＝1g：(8～10)ml的比例，超声破碎菌体，破碎完成后4℃、18000rpm离心60min，收集破碎的上清。破碎条件是：工作3s，停5s，破碎时间为18min，振幅为65％，破碎缓冲液为：0.15M NaCl、25mM磷酸钠缓冲液(PB，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠搭配得到)、2mM EDTA，pH＝7.5。

(3)在一些原核表达的菌中，FGFR2c胞外段类似物蛋白以包涵体形式表达，则通过包涵体清洗以及变复性技术来获得活性形式的FGFR2c胞外段类似物蛋白(具体方法可参考专利ZL200710029286.6实施例1)。

(4)通过Western Blot进行检测，一抗为Bek抗体(c-17)(santa CruzBiotechnology)，二抗为兔二抗(cat NO.AS006,Asbio)。结果如图2所示，表明FGFR2c胞外段类似物能被FGFR抗体特异性识别。

实施例2：野生型及突变型FGFR2c胞外段类似物多肽基因加Fc段在CHO细胞中的表达

真核表达野生型及突变型FGFR2c胞外段(149-382氨基酸)加Fc段融合蛋白

1、Fc段基因的获取

(1)引物设计：

F9-Fc：

5’-CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTG-3’SEQ ID NO.7；

F8-Fc：

5’-AAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC-3’SEQ ID NO.8；

F7-Fc：

5’-TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTG-3’SEQ ID NO.9；

F6-Fc：

5’-TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCAGCAAG-3’SEQ ID NO.10；

R6-Fc：

5’-CAGGGACACCTGGTTCTTGGTCATTTCCTCTCGAGAGGGTGGCAGGGTGTACACCTGGGGTTCCCTGGGCTGGCCCTTGGCCTTGCTGATGGTTTTCTC-3’SEQ ID NO.11；

R7-Fc：

5’-TCTTGTAGTTGTTCTCGGGCTGGCCGTTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGGTAGAAGCCCTTCACCAGGCAGGTCAGGGACACCTGGTTCTT-3’SEQ ID NO.12；

R8-Fc:

5’-CCCTGCTGCCATCTGCTCTTGTCCACGGTCAGCTTGCTGTACAGGAAGAAGCTGCCGTCGCTGTCCAGCACTGGGGGGGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCGG-3’SEQ ID NO.13；

R9-Fc:

5’-CTTGCCGGGGGACAGGCTCAGGCTCTTCTGGGTGTAGTGGTTGTGCAGGGCCTCGTGCATCACGCTGCAGCTGAACACGTTGCCCTGCTGCCATCTGCTC-3’SEQ ID NO.14。

(2)经4步PCR获得Fc段目的基因，第一步是以F6-Fc和R6-Fc为引物进行PCR，1％浓度的琼脂糖电泳，切胶回收(TIANGEN，DP209)；第二步以F7-Fc和R7-Fc为引物，第一步PCR产物为模板，进行PCR，然后切胶回收；第三步以F8-Fc和R8-Fc为引物，第二步PCR产物为模板，进行PCR，然后切胶回收；第四步以F9-Fc和R9-Fc为引物，第三步PCR产物为模板，进行PCR，然后切胶回收；

PCR反应体系：

2、通过PCR和重叠PCR分别扩增获得FGFR2c胞外段、Fc和FGFR2c-L-Fc(FGFR2c胞外段序列加linker序列和FC段序列)目的基因。

以pET30-FGFR2c质粒段基因为模板，F10-FGFR2c和R10-FGFR2c为引物，PCR得到FGFR2c模板片段；以Fc段基因为模板，F11-Fc和R11-Fc为引物，PCR得到Fc段模板片段。

(1)引物设计如下：均为5’-3’

F10-FGFR2c：ATATACTAGT ATG GATGACGACGACAAG AACAAGAGAGCACCATAC；划横线为SpeI酶切位点；

R10-FGFR2c：CGACCCACCACCGCCGGAGCCACCGCCACCCAGAACTGTCAACCATGC SEQ IDNO.15；

F11-Fc：GGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCCCAAGAGCTGCGACAAG SEQ ID NO.16；

R11-Fc：ATATGAATTCTCATTACTTGCCGGGGGACAGG SEQ ID NO.17；划横线为EcoR I酶切位点；

(2)PCR反应体系和反应条件如下：

PCR反应体系

反应条件为：96℃5min；94℃15s、60℃15s、72℃5s，31个循环；72℃10min。

(3)按照实施例1中PCR产物切胶回收的方法回收FGFR2c和Fc段DNA：

重叠PCR反应体系：

反应条件为：96℃5min；94℃15s、60℃15s、72℃5s，5个循环；72℃10min。

(4)上述5个循环完成后加F10-FGFR2c和R11-Fc引物各3μL，再进行30个循环，PCR产物切胶回收的方法按照实施例1，得到FGFR2c-L-Fc基因。

3、pCDNA3.1-FGFR2c(149-382)片段、pCDNA3.1-FGFR2c-S252W(149-382)片段分别转染293细胞。

(1)按照去内毒素质粒小提试剂盒的方法(购买于OMEGA公司)抽提质粒，得到pCDNA3.1-FGFR2c、pCDNA3.1-FGFR2c-S252W质粒；

(2)选用DHFR突变CHO-K1细胞株(一种广泛用于基因工程生产的细胞株)

为宿主细胞，以添加了胎牛血清(FBS，终浓度为10％v/v)的DMEM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱培养细胞生长至融合；

(3)转染24h前，用质量体积比0.25％的胰酶消化对数期生长的293T细胞，用无双抗的DMEM培养基吹打细胞成悬液，铺于六孔板中，每孔2×10⁵个，使其在转染时完全贴壁，且细胞密度达到50％-60％；

(4)使用电穿孔的方法将表达载体稳定转染至CHO-K1细胞中。通过间接法ELISA和SDS-PAGE筛选出了表达量高的细胞株。经过亚克隆的筛选过程进一步提高了细胞株的稳定表达量。

4、FGFR2c胞外段类似物蛋白质的纯化与鉴定：

4℃、18000rpm离心30min收集培养液上清，蛋白质纯化步骤为：

使用protein A亲和层析柱，用双蒸水冲洗柱子3个柱体积后用亲和层析平衡液平衡柱子，流速为5ml/min，平衡至少3个柱体积后将步骤(2)得到的上清上样，上样完成后继续用亲和层析平衡液冲洗3个柱体积，换成使用柠檬酸洗脱缓冲液对Protein A柱进行梯度洗脱，对目标洗脱液进行收集，并使用10％的1M Tris-HCl进行中和。

使用肝素亲和层析柱进行进一步纯化，高盐洗脱液进行洗脱，在波长为280nm处收集单一的洗脱峰，得到野生型wsFGFR2c多肽和S252W突变型msFGFR2c多肽，-70℃保存，用于后续试验。

亲和层析平衡液：25mM HEPES、0.15M NaCl，pH＝7.5；

肝素洗脱液：25mM HEPES、1.5M NaCl，pH＝7.5；

流速为5ml/min。

通过SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定。结果表明FGFR2c-FC胞外段类似物融合蛋白能被FGFR抗体特异性识别。参见图1和图2。

SDS-PAGE结果参见图1，图1从左到右各泳道依次为野生型(149-360)、S252W突变型(149-360)、野生型(149-382)、S252W突变型(149-382)FGFR2c胞外段类似物的SDS-PAGE图。

图2为野生型(149-360)、S252W突变型(149-360)、野生型(149-382)、S252W突变型(149-382)FGFR2c胞外段类似物的western blotting鉴定图。从左到右依次是野生型(149-360)、S252W突变型(149-360)、野生型(149-382)、S252W突变型(149-382)FGFR2c胞外段类似物。

实施例3 FGFR2c胞外段(149-382)能够更好地结合配体FGF-2

发明人之前申请并授权的专利《201410347938.0:FGFR2c胞外段类似物及其编码基因与应用》FGFR2c胞外段序列为(149-360)氨基酸，稳定性较之前发表的胞外段序列(147-366)以及(151-377)以及(150-366)均更加稳定，现又设计了新的序列(149-382)，与(149-360)的胞外段相比,增加的(360-382)段主要为亲水性氨基酸,根据文献(M.Mohammadi et al./Cytokine&Growth Factor Reviews,16(2005):107–137),FGFR2c亚型受体与配体结合的特异性主要来自D3环大量的氢键，因而一个亲水的环境是更加合适的，能够更好地结合FGF-2配体。而从382到胞外段C端大部分均为疏水性氨基酸，则不利于受体与配体的结合，并对融合蛋白的linker以及Fc段的添加产生位阻。

(1)合成全长的FGFR2IIIc基因，通过PCR方法在基因两端加上酶切位点及HA标签。

引物序列为：

F：5’-ATATGGATCCGCCGCCACCATGGTCAGCTGGGGTCGTTTCAT-3’SEQ ID NO.18；

R：

5’-GCGCAAGCTTTCACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTATGTTTTAACACTGCCGTT-3’

SEQ ID NO.19；包括酶切位点BamH1，HindIII，下游引物包含HA序列。BamH I andHind III限制酶内切位点已加入到引物末端，PCR反应条件见前。切胶回收后的PCR产物及载体pCDNA3.1(-)通过限制性内切酶BamH1，HindIII双酶切，Omega公司DNA纯化试剂盒纯化后，通过T4DNA连接酶连接过夜。转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，通过BamH1，HindIII双酶切鉴定得到阳性克隆，进行序列测定。测定结果，msFGFR2与wsFGFR2的核苷酸序列如SED IDNO.4和SED ID NO.3。

(2)乙醇沉淀

①抽提测序成功的菌体质粒，加0.1体积的NaAC(醋酸钠)，2倍体积的无水乙醇，充分混匀，这两种溶液均为预冷溶液；

②-20℃，放置20min；

③4℃，16000rpm，离心15min；

④4℃的75％乙醇洗2遍；

⑤50μl无菌3dH₂O溶解，溶解前确保乙醇充分挥发。

⑥紫外分光光度计检测质粒浓度，并做好记录，-20℃保存。

(3)生物素标记msFGFR2与wsFGFR2

用生物素标记试剂盒(DSB-X^TM Biotin Protein Labeling Kit，Invitrogen公司)标记msFGFR2与wsFGFR2，用于激光共聚焦和免疫共沉淀。标记后的msFGFR2与wsFGFR2简称msFGFR2-Biotin与wsFGFR2-Biotin。

(4)293T细胞的培养

293T细胞培养于含10﹪胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基中，37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱培养。细胞用0.25﹪牛胰蛋白酶进行消化、传代，取对数生长期的细胞进行实验。

(5)将pCDNA3.1(-)-FGFR2IIIc-HA质粒瞬时转染293T细胞

转染前一天，向6孔板中每孔加入293T细胞2×10⁵个，使其在转染时完全贴壁，且细胞密度达50～60％。lipofectamine^TM 2000脂质体转染具体流程如下：

(5.1)lipofectamine^TM 2000的稀释：按六孔板每孔5μl lipofectamine^TM 2000加到250UL opti-MEM培养基的比例稀释，静置5min；

(5.2)待转染质粒的稀释：按六孔板每孔4μg待转染质粒加到250μlopti-MEM培养基的比例稀释；

(5.3)等体积混合以上两种稀释液，静置20min，每孔加500μl混合液；

(5.4)每孔补加1.5mlopti-MEM培养基；

(5.5)37℃，5％CO₂培养箱培养4-6h后换成10％FBS DMEM培养基；

(6)流式细胞仪检测(6.1)转染24小时后，更换为含0.5％胎牛血清的DMEM饥饿培养24小时。

(6.2)诱导细胞：用FGF2，msFGFR2-Biotin，wsFGFR2-Biotin诱导细胞。分以下几组：对照组，FGF2+ msFGFR2-Biotin组,FGF2+ wsFGFR2-Biotin组,msFGFR2-Biotin组，wsFGFR2-Biotin组。诱导条件为37℃，2小时，FGF2，msFGFR2-Biotin，wsFGFR2-Biotin浓度为2μg/ml、10μg/ml。

(6.3)收集细胞，用和生物素特异结合的荧光染料(Streptavidin,Alexa Fluor488 conjugate)标记细胞，室温30min。流式细胞仪进行检测带绿色荧光的细胞的百分数。

请参见图3，结果表明：通过流式细胞仪检测S252W突变型(149-382)FGFR2c与膜上受体的结合力比S252W突变型(149-360)FGFR2c更强，而两种突变型胞外段较野生型结合力强。其中，msFGFR2c指S252W突变型胞外段，wsFGFR2c指野生型胞外段。

实施例4

博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型动物实验证明msFGFR2c有良好的抑制肺纤维化的作用。

1.分组：

2.实验方案

(1)采用160-200g的Wistar大鼠雄鼠；

(2)用3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹腔注射0.1ml/100g；

(3)采用气管滴注法用一次性注射器一次性从气管注入200ul的博来霉素或生理盐水。博来霉素剂量为5mg/kg，建立肺纤维化模型；

(4)取仰卧位固定于手术板上，用酒精消毒，颈部正中切口，逐层剥离，暴露气管，经气管软骨环间隙项心端刺入，回抽无空气阻力后，向气管注入200ul的博来霉素或生理盐水。手术板取直立位，匀速旋转，让药液在肺内均匀分布，缝合，将大鼠放入笼中。

(5)造模3天后的给药方式以及剂量：

S252W突变型(149-360)FGFR2c给药组腹腔注射100μl,剂量100ug/每只/每天。

S252W突变型(149-382)FGFR2c给药组腹腔注射100μl,剂量100ug/每只/每天。

S252W野生型分别给药组腹腔注射100μl，剂量100ug/每只/每三天。对照组为腹腔注射100μl生理盐水。

(6)观察检测：massion染色。

结果请参见图4，结果显示，S252W突变型(149-382)FGFR2c对肺纤维化以及I型胶原的表达的抑制作用比S252W突变型(149-360)FGFR2c更强，而两种突变型胞外段较两种野生型FGFR2c胞外段抑制肺纤维化的作用强。

除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。所有的数字标识，例如pH、温度、时间和浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 汪炬

<120> FGFR2c胞外段类似物及其编码基因和应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg

1 5 10 15

Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala

20 25 30

Gly Gly Asn Pro Met Pro Thr Met Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu

35 40 45

Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Asn Gln His

50 55 60

Trp Ser Leu Ile Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr

65 70 75 80

Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr His

85 90 95

Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly

100 105 110

Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly Asp Val Glu Phe Val

115 120 125

Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys His

130 135 140

Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu

165 170 175

Val Leu Tyr Ile Arg Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr

180 185 190

Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Ile Ser Phe His Ser Ala Trp Leu

195 200 205

Thr Val Leu Pro Lys Gln Gln Ala Pro Gly Arg Glu Lys Glu Ile Thr

210 215 220

Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala

225 230

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg

1 5 10 15

Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala

20 25 30

Gly Gly Asn Pro Met Pro Thr Met Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu

35 40 45

Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Asn Gln His

50 55 60

Trp Ser Leu Ile Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr

65 70 75 80

Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr His

85 90 95

Leu Asp Val Val Glu Arg Trp Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly

100 105 110

Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly Asp Val Glu Phe Val

115 120 125

Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys His

130 135 140

Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu

165 170 175

Val Leu Tyr Ile Arg Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr

180 185 190

Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Ile Ser Phe His Ser Ala Trp Leu

195 200 205

Thr Val Leu Pro Lys Gln Gln Ala Pro Gly Arg Glu Lys Glu Ile Thr

210 215 220

Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala

225 230

<210> 3

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aataaacgtg cgccgtactg gaccaacacc gaaaaaatgg aaaaacgtct gcacgcggtt 60

ccggcggcga acaccgttaa attccgttgc ccggcgggcg gtaacccgat gccgaccatg 120

cgttggctga aaaacggcaa agaattcaaa caggaacacc gtatcggtgg ttacaaagtt 180

cgtaaccagc actggagcct gatcatggaa agcgttgttc cgagcgataa aggcaactac 240

acctgcgttg ttgaaaacga atacggtagc atcaaccaca cctaccacct ggatgttgtt 300

gaacgtagcc cgcaccgtcc gatcctgcag gctggcctgc cggcgaacgc gagcaccgtt 360

gttggcggtg atgttgaatt cgtttgcaaa gtttactctg atgcgcagcc gcacatccag 420

tggatcaaac acgttgagaa aaacggttct aaatacggcc cggatggtct gccgtacctg 480

aaagttctga aagcggcggg tgttaacacc accgataaag aaatcgaagt tctgtacatc 540

cgtaacgtta ccttcgaaga tgcgggtgaa tacacctgcc tggcgggtaa cagcatcggc 600

atctctttcc acagcgcgtg gctgaccgtt ctgccgaaac agcaggcgcc gggccgtgaa 660

aaagaaatca ccgcgagccc ggattacctg gaaatcgcg 699

<210> 4

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacaaacgtg cgccgtactg gaccaacacc gaaaaaatgg aaaaacgtct gcacgcggtt 60

ccggcggcga acaccgttaa attccgttgc ccggcgggcg gtaacccgat gccgaccatg 120

cgttggctga aaaacggtaa agaatttaaa caggaacacc gtatcggcgg ctacaaagtt 180

cgtaaccagc actggagcct gatcatggaa agcgtggttc cgtctgataa aggtaactac 240

acctgcgttg ttgaaaacga atacggtagc atcaaccaca cctaccacct ggatgttgtt 300

gaacgttctc cgcaccgtcc gatcctgcag gcgggtctgc cggcgaacgc gagcaccgtt 360

gttggcggtg atgttgagtt cgtttgcaaa gtttacagcg atgcgcagcc gcacatccag 420

tggatcaaac acgttgagaa aaacggttct aaatacggtc cggatggcct gccgtacctg 480

aaagttctga aagcggcggg tgttaacacc accgataaag aaatcgaagt tctgtacatc 540

cgtaacgtta ccttcgaaga tgcgggcgaa tacacctgcc tggcgggtaa cagcatcggc 600

atctctttcc acagcgcgtg gctgaccgtt ctgccgaaac agcaggcgcc gggtcgtgaa 660

aaagaaatca ccgcgtctcc ggattacctg gaaatcgcg 699

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcatatgaa taaacgtgcg ccgt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggatcccg cgatttccag gtaa 24

<210> 7

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgtc ctgctccaga actcctgggc 60

ggacccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctg 105

<210> 8

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagcccaagg acaccctgat gatcagcagg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 60

gtgagccacg aggacccaca ggtcaagttc aactggtacg tggac 105

<210> 9

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcaactggt acgtggacgg cgtgcaggtg cacaacgcca agaccaagcc ccgggagcag 60

cagtacaact ccacctacag agtggtgtcc gtgctgaccg tgctg 105

<210> 10

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccgtgctga ccgtgctgca ccagaactgg ctggacggca aagagtacaa gtgcaaggtc 60

tccaacaagg ccctgccagc ccccatcgag aaaaccatca gcaag 105

<210> 11

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagggacacc tggttcttgg tcatttcctc tcgagagggt ggcagggtgt acacctgggg 60

ttccctgggc tggcccttgg ccttgctgat ggttttctc 99

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcttgtagtt gttctcgggc tggccgttgc tctcccactc cacggcgatg tcgctggggt 60

agaagccctt caccaggcag gtcagggaca cctggttctt 100

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccctgctgcc atctgctctt gtccacggtc agcttgctgt acaggaagaa gctgccgtcg 60

ctgtccagca ctgggggggt ggtcttgtag ttgttctcgg 100

<210> 14

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttgccgggg gacaggctca ggctcttctg ggtgtagtgg ttgtgcaggg cctcgtgcat 60

cacgctgcag ctgaacacgt tgccctgctg ccatctgctc 100

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgacccacca ccgccggagc caccgccacc cagaactgtc aaccatgc 48

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct cccaagagct gcgacaag 48

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atatgaattc tcattacttg ccgggggaca gg 32

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atatggatcc gccgccacca tggtcagctg gggtcgtttc at 42

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgcaagctt tcacgcatag tcaggaacat cgtatgggta tgttttaaca ctgccgtt 58

Claims

1.FGFR2c胞外段类似物，其特征在于，其多肽组成为：(1)野生型wsFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)S252W突变型msFGFR2c：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或是(3)与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有80％同源性的序列。

2.FGFR2c胞外段类似物的编码基因，其特征在于，其序列组成为：(1)野生型wsFGFR2c如SEQ ID NO.3所示；或因遗传密码的简并性而SEQ ID NO.3不同的序列，该序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)编码S252W突变型msFGFR2c的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示；或因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.4的序列，该序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的FGFR2c胞外段类似物在抑制肺纤维化中的应用。

4.权利要求2所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因在抑制肺纤维化中的应用。

5.一种表达重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因。

6.根据权利要求5所述的表达重组载体，其特征在于，所述的表达重组载体为将权利要求2所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因克隆至表达载体得到，或是将权利要求2所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因和其他基因重组，再克隆至表达载体得到。

7.根据权利要求6所述的表达重组载体，其特征在于，所述的表达载体pET30a。

8.一种转基因细胞株，其特征在于，是将权利要求5-7任一项所述表达重组载体转染到宿主细胞中得到。

9.根据权利要求8所述的转基因细胞株，其特征在于，所述的宿主细胞优选为CHO细胞。

10.一种用于抑制肺纤维化的药物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述FGFR2c胞外段类似物、权利要求2所述FGFR2c胞外段类似物的编码基因、权利要求5-7任一项所述表达重组载体、或权利要求8或9所述转基因细胞株。