CN101095957A - 一种包含成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc类似物基因的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc类似物基因的药物组合物，该类似物基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列在第252位由丝氨酸突变成色氨酸和/或第253位由脯氨酸突变为精氨酸；更具体地说，该药物组合物所包含成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc类似物基因是以被包括在非病毒重组表达载体或重组病毒表达颗粒中的形式提供的。本发明还涉及了该药物组合物的制备方法，以及该药物组合物在诱导细胞分化、凋亡、抑制增殖和作为基因治疗药物在抗肿瘤方面的应用。

Description

一种包含成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc类似物基因的药物组合物

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种包含成纤维细胞生长因子受体2 IIIc(FGFR2IIIc)类似物的基因的药物组合物。

背景技术

1.FGFR2IIIc及其突变类似物简介

FGF及FGFRs在胚胎发育、组织生长中扮演着极其重要的角色，对细胞的增殖，迁移，分化有关键作用，具有广泛的生物学效应。在组织发生过程中，FGF信号通过识别靶细胞膜上的FGFR，使FGFR二聚化，进而激活受体膜内区的酪氨酸激酶，导致细胞内一系列的生物学变化，引起相关细胞行为的改变。迄今为止，已经发现70余种FGFR突变可以引起人类10余种长骨或颅骨的遗传病，在这些突变中，FGFR2占了很大部分。

FGFR2是FGFRs(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFR)家族4个成员中的一员，由于前体mRNA的选择性剪接，由不同的外显子拼接而成膜外第3个Ig区，故产生了不同的亚型(第7与第8外显子为b型，第7与第9外显子为c型)。故通常又分为FGFR2IIIb或Fgr和FGFR2IIIc或Bek。FGFR2IIIb与FGF-1、3、7、10和22结合，主要在上皮组织表达；而FGFR2IIIc与FGF-1、2、4、6、9、17和18结合，主要在间充质组织表达。有报道称当FGFR2胞外段发生点突变(S252W)时，促使FGF7和10激活FGF R2IIIc和FGF2、6、9激活FGFR2IIIb，导致表达这些配体细胞自分泌信号激活。

从1993年发现了第一例颅缝早闭综合征(Craniosynostosis，CS)，到目前已发现多种人类的CS征大部分与FGFR2的胞外段点突变有关，包括Boston、Cronzon(颅面骨性接合)，Pfeiffer(扁头和趾指早开)，Apert(尖头并指)、Jackson-Weiss等综合征。而Apert综合征是目前为止发现的最严重的一种，为膜内骨形成紊乱，属染色体显性遗传，经统计，在160多例不相关的患者中，大多数是FGFR2IIIc的Pro253Arg(35％)和Ser252Trp(65％)的突变。

2.FGFR2与抗肿瘤药物开发

目前市场上抗肿瘤药物分为：1、细胞毒类药物：(1)作用于DNA结构的药物：(2)影响核酸合成的药物；(3)作用于核酸转录的药物；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物(5)其他细胞毒药如门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成。2、激素类：如抗雌激素、抗雄激素、RH-LH激动剂/拮抗剂；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤，如干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽类；4、单克隆抗体；5、其他如细胞分化诱导剂如维甲类，细胞凋亡诱导剂，新生血管生成抑制剂等。

针对FGFs与FGFRs进行抗肿瘤药物的开发是一个重要的方向。FGFs通过与特异性受体FGFRs的结合在肿瘤细胞的发生、发展和转移过程中起了关键的作用，而且其与血管内皮细胞生长因子VEGF对肿瘤组织的血管生成高度相关，对肿瘤的增殖和转移起了关键的作用。目前有若干相关药物被开发，如抑制二者结合的短肽(专利WO2006/135263)或有机化合物(专利WO2007/019884)，表达FGFRs的膜外段作为拮抗剂(专利WO2007/014123)等等。其作用都是抑制FGFs与FGFRs的结合能达到抑制肿瘤生长增殖的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含成纤维细胞生长因子受体IIIc类似物的基因的药物组合物，该药物组合物包括的FGFR2IIIc类似物基因与序列表SeqID No.1所示核苷酸序列有90％以上的同源性。更具体地说，本发明提供了一种包含FGFR2IIIc类似物的基因的非病毒重组表达载体或重组病毒颗粒作为活性成分的药物组合物。

为了完成上述的目的，本发明首先提供了编码FGFR2IIIc类似物的基因的核苷酸序列，该DNA序列对于诱导细胞分化、凋亡、抑制细胞增殖，特别是诱导肿瘤细胞分化凋亡或抑制增殖上显示出活性。

按照本发明所述的组合物，其包含的FGFR2IIIc类似物的基因DNA序列的方式可以是以在动物细胞中表达的质粒载体中插入该类似物基因，或以通过逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体作为载体通过包装细胞组装成含有该类似物的基因的重组病毒颗粒等存在。

本发明的另一个目的是提供了制备本药物组合物的方法，该方法包括：

(1)获得含有如权利要求1所述的FGFR2IIIc类似基因的核苷酸序列片段；

(2)对该核苷酸片段进行适当的修饰或突变；

(3)对(1)或(2)所得的核苷酸核苷酸两端加入适当的限制性内切酶位点序列；

(4)将(3)所述的序列片段克隆入适当的表达载体中形成重组表达载体；

(5)对(4)获得的重组病毒载体进一步转化包装细胞获得重组病毒颗粒，并扩增纯化；或对(4)所获得的非病毒重组表达载体进行扩增纯化；

(6)对(5)所获得的纯化产物添加适当的溶液进一步制备成药物组合物。

本发明的再一个目的是公开了该药物组合物在促进诱导细胞分化凋亡、抑制细胞增殖上的应用，以及作为基因治疗药物在抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞分化凋亡上的应用。应用的方式是采用该药物组合物直接转染或者转导一种细胞诱导该细胞分化；或者直接转染或者转导局部的肿瘤组织细胞，以便连续和局部地诱导该肿瘤组织细胞分化凋亡、抑制其增殖。

在本文中，所使用的术语“FGFR2IIIc类似物”不限于天然的野生型蛋白多肽，其包括适用于本发明目的的具有诱导细胞分化凋亡、抑制细胞增殖的所有的FGFR2IIIc个别的或者部分的氨基酸突变，而且该类似物也不限定于人源的蛋白；相应地，术语“FGFR2IIIc类似物的基因”也不限定于天然的DNA，如果能够合适地用于本发明的目的话，可以包括任何形式的能够保持所述活性的核苷酸水平的合适的修饰和突变，以及包括融合序列标签的加入，无论其是否通过基因工程或者化学方法获得的。

以下对本发明进行详细的描述：

本发明的药物组合物的特征是包含FGFR2IIIc类似物的基因作为该组合物的活性成分。按照本发明，该FGFR2IIIc类似物的基因可以是衍生自人类、鼠、猕猴、猪、兔或者牛的FGFR2IIIc的DNA，优选的是来源于人类或鼠类的cDNA，更优选的是来源于人源的FGFR2IIIc的cDNA。

在本发明优选的实施例中，其人源的FGFR2IIIc的cDNA来自人的胎盘组织。因此，具体地，本发明首先提供了编码人FGFR2IIIc类似物的基因的核苷酸序列SEQ IDNo.1，以及该核苷酸序列所编码的氨基酸序列SEQ ID No.2。其特征是以起始密码子所编码的甲硫氨酸为起点的第252个氨基酸为丝氨酸(Ser，S)或色氨酸(Trp，W)，和/或第253个氨基酸为脯氨酸(Pro，P)或精氨酸(Arg，R)。

由于密码子的简并性，本发明所述的FGFR2IIIc类似物基因的核苷酸片段与如SEQID No.1所示的核苷酸序列有90％以上的同源性，优选的是有95％以上的同源性，最优的是有98％以上的同源性，以上说述的核苷酸序列均编码如Seq ID No.2所示的氨基酸序列。

在本发明的药物组合物中包含的非病毒重组表达载体包含如上所述的任何FGFR2IIIc类似物基因的核苷酸序列，使用的载体可以是插入该基因后能够在所转染的细胞或组织中表达FGFR2IIIc类似物蛋白。优选的是能够在动物细胞或组织内表达的非病毒表达载体，更优选的是能在动物细胞或组织内瞬时表达的非病毒表达载体。

在本发明的药物组合物中包含的重组病毒颗粒也包含如上所述的任何FGFR2IIIc类似物基因的核苷酸序列，可以是逆转录病毒颗粒、腺病毒颗粒、腺相关病毒颗粒和单纯疱疹病毒颗粒，优选的是属于逆转录病毒的慢病毒颗粒、腺病毒颗粒，更优选的是能够用于基因治疗用的慢病毒颗粒、腺病毒颗粒。

如上所述的任何FGFR2IIIc类似物的基因，可以在其上游或者下游含有融合序列，该融合序列可以是但不仅限于His标签、Myc标签、Flag标签或Fc序列，其目的是为了在应用药物组合物进行基因治疗或者诱导细胞时，作为一个检测和/或纯化相应目的蛋白的标记物，或者延长表达蛋白在细胞内的半衰期。

本发明的另一个目的是提供了制备本药物组合物的方法，该方法包括：

(1)获得含有如权利要求1所述的FGFR2IIIc类似基因的核苷酸序列片段；

(2)对该核苷酸片段进行适当的修饰或突变；

(3)对(1)或(2)所得的核苷酸核苷酸两端加入适当的限制性内切酶位点序列；

(4)将(3)所述的序列片段克隆入适当的表达载体中形成重组表达载体；

(5)对(4)获得的重组病毒载体进一步转化包装细胞获得重组病毒颗粒，并扩增

纯化；或对(4)所获得的非病毒重组表达载体进行扩增纯化；

(6)对(5)所获得的纯化产物添加适当的溶液进一步制备成药物组合物。

各种野生型的FGFR2IIIc的氨基酸序列和核苷酸序列信息在多个网站上可以检索得到：如蛋白组分析系统蛋白质组服务器网站 www.expasy.org；美国国立卫生研究院网站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等。根据网站提供的信息，可以采用《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等[美]，黄培堂译，科学出版社，2002版)所提供的方法获得各种FGFR2IIIc野生型的核苷酸序列。

在本发明优选的实施例中，提供了获得人源FGFR2IIIc类似物基因的方法。一般地说，首先，从人胎盘组织或人源细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，构建cDNA文库：然后以提取的mRNA为模板，通过反转录酶合成cDNA，得到相应的双链cDNA。其次，设计适当的引物，采用PCR扩增方法从cDNA文库中获得目的序列，获得大小为2463bp的核苷酸片段。然后，对所获得的核苷酸片段进行测序的鉴定。然后，以测序证实序列正确的FGFR2IIIc野生型核苷酸片段为模板，采用重叠PCR法(见附图1)对目的碱基进行突变，然后将所获得的PCR产物进一步测序鉴定，以获得的序列正确的FGFR2IIIc类似物的基因，并以突变碱基所造成的氨基酸突变命名，例如由于碱基突变造成FGFR2mc第252个氨基酸由丝氨酸突变为色氨酸，则该类似物命名为FGFR2IIIc-S252W，同样方法和命名获得FGFR2IIIc-P253R、FGFR2IIIc-S252W+P253R类似物等。

测序的工作可以交由特定的提供测序服务的生物技术公司进行。通常可以将所获得的PCR产物直接交给相关公司进行测序，但常规的做法是将所获得的PCR产物克隆入适当的载体进行测序鉴定。载体可以是常用于测序的T载体，如本发明实施例中所采用的美国Promega公司的pGEM-T easy载体。

对如上所获得的FGFR2IIIc野生型、FGFR2IIIc-S252W、FGFR2IIIc-P253R、FGFR2IIIc-S252W+P253R核苷酸序列片段可以根据下一步的开发应用进行适当的修饰，如加入融合序列His标签、或Myc、或Flag、或Fc等；也可以将其克隆入在N端或C端含有所述融合序列的表达载体中，优选的是使融合序列位于类似物基因的C端。加入融合序列的目的是为了在应用该组合物时能够进行方便检测，使之能够与内源的核苷酸序列或氨基酸序列区别开；或为了延长其半衰期，使之能够更好地被开发应用。在本发明优选的一个实施例中，采用的融合标签是Myc序列。

对该FGFR2IIIc类似物核苷酸片段进行适当的修饰还包括根据不同组织细胞的密码子偏好性在不改变氨基酸序列的情况下对密码子的偏好进行修改，从而提高该核苷酸片段在被表达时的翻译效率。因此，在不改变氨基酸序列的情况下，与本发明所述的FGFR2IIIc类似物核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列都属于本发明要求保护的范围，优选的是95％以上同源性的序列，更优选的是98％以上同源性的序列。

将上述所得的FGFR2IIIc类似物的核苷酸序列片段克隆入适当的表达载体中形成重组表达载体是本领域技术人员常用的方法，可参考《分子克隆实验指南》。也可参照本发明优选的实施例中采用的方法。

重组表达载体的扩增纯化也为本领域技术人员熟知的技术方法，方法可见《分子克隆实验指南》，或采用生物技术公司出品的质粒抽提试剂盒，优选的是采用去内毒素的质粒抽提方法或质粒抽提试剂盒；也可参照本发明优选的实施例中采用的方法。

重组病毒颗粒的扩增纯化可根据所获得病毒颗粒的滴度，可采用离心法或葡聚糖凝胶层析法进行浓缩纯化，纯化的具体方法可见《蛋白质与蛋白质组学实验指南(翻译版)》([澳]理查德著，化学工业出版，2006年出版)。

对所获得的非病毒重组表达载体或重组病毒颗粒的纯化产物，加入适当的溶液作为保护剂或稳定剂以进一步制备成本发明所述的药物组合物。该溶液包括通常用于注射的无菌的任何液体，例如，可以是包括蒸馏水、氯化钠溶液、氯化钠和无机盐的混合物以及它们的类似的混合溶液；或者诸如甘露醇、乳糖、右旋糖苷和葡萄糖或氨基酸的混合液，如甘氨酸和精氨酸，有机酸溶液或者盐溶液和葡萄糖溶液的混合物，以及它们的类似的混合溶液。该注射液可以通过加入渗透压调节剂、pH控制剂、植物油例如芝麻油、豆油、卵磷脂，或者表面活性剂例如非离子型表面活性剂，以常规的方式加入该非病毒重组表达载体或重组病毒颗粒中而制成溶液、混悬剂或者胶体溶液的形式制备成药物组合物。该药物组合物也可以以粉末或者冻干的形式制备并且然后在使用前溶解成溶液的形式。

如上所说的添加的溶液，优选的是能保存重组表达载体或重组病毒颗粒的溶剂，如灭菌的三蒸水或各种缓冲液，最优的是该溶剂同时对细胞和组织有等渗性，如生理盐水、PBS、TBS溶液或细胞培养液如DMEM等。

综上所述，本发明所述的药物组合物是由包含编码FGFR2IIIc类似物基因的非病毒重组表达载体或重组病毒颗粒与用于诱导细胞分化或基因治疗的无菌溶液混合而成。

按照本发明提供的一个优选的实施例，该药物组合物是以非病毒重组表达载体和蒸馏水的组合形式直接制备而成的；按照本发明提供的另一个优选的实施例，该药物组合物采用的是含有FGFR2IIIc类似物蛋白的DNA的慢病毒颗粒与DMEM细胞培养溶液进一步组合而成的。

本发明另一个目的是公开了该药物组合物在诱导细胞分化、凋亡、抑制细胞增殖和作为基因治疗的药物在抗肿瘤方面的应用。

该药物组合物可以采用非病毒重组表达载体直接转染细胞的方式，或采用重组病毒颗粒直接感染细胞的方式进行应用，作为诱导剂达到诱导细胞分化或凋亡的目的，在细胞学研究上有重要的意义和作用。所应用的细胞包括来源于人类、鼠、猕猴、猪、兔或着牛的各种细胞，优选的是来源于人或鼠的各种肿瘤细胞、转化细胞株、胚胎干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞等，最优选的是来源于人或鼠的各种胚胎间充质干细胞、成体间充质干细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成软骨细胞、成骨细胞。按照本发明提供的一个优选的实施例，诱导研究对象采用的是来源于小鼠的间充质干细胞和来源于人的成骨细胞、骨肉瘤细胞和前列腺癌细胞。

该药物组合物可以采用基因治疗的方式，将该FGFR2IIIc类似物基因导入到肿瘤细胞内，使其表达FGFR2IIIc类似物，该FGFR2IIIc类似物可以抑制肿瘤细胞的增殖和生长，促进肿瘤细胞的分化或凋亡，从而达到抗肿瘤或治疗肿瘤的目的。所涉及的肿瘤或肿瘤细胞，包括各种实体瘤或其癌细胞，可以是但不仅限于骨肉瘤、前列腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、淋巴瘤、结肠癌、视网膜母细胞癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、肾癌、肉瘤、头颈癌等各种肿瘤及其肿瘤细胞。其中优选的作用较好的是能够向成骨分化方向转化的肿瘤，如骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌或鼻咽癌等。按照本发明提供的一个优选的实施例，利用了无胸腺无移植排斥能力的裸鼠构建的动物模型产生的人骨肉瘤，作为本发明药物组合物的基因治疗的对象。

综上所述，该药物组合物的活性成分是FGFR2IIIc类似物基因的核苷酸序列，而非蛋白类药物，在基因水平直接进行作用，在抗肿瘤药物的开发上属于一种基因治疗药物；可用于诱导细胞分化、凋亡，特别是诱导肿瘤细胞分化、凋亡和抑制其增殖，应用领域广泛，因此不仅可以作为细胞分化凋亡诱导剂，而且可以作为抗肿瘤的基因治疗药物；另外，在制备工艺上无需蛋白质的变复性，相对简单、快捷；因此，有较强的工业产业化前景。

附图说明

图1：重叠PCR方法示意图：其中F1和R1为第一对引物，F2和R2为第二对引物，R1和F1在相应的位点进行了碱基的突变，第一轮PCR反应相应地产生了两条在目的位点产生突变并相互重叠的PCR扩增产物，第二轮PCR反应以第一轮产生的两条核苷酸序列为模板，采用F1和R2为扩增引物，可产生完整的在目的位点产生突变的PCR目的产物。

图2：在FGF-2诱导下对Saos-2各重组骨肉瘤细胞株的MTT法检测：1、0ng/mlFGF-2；2、0.128ng/ml FGF-2；3、0.64ng/ml FGF-2；4、3.2ng/ml FGF-2；5、16ng/ml FGF-2；6、80ng/ml FGF-2；7、400ng/ml FGF-2；8、2000ng/ml FGF-2。

图3：在FGF-2诱导下Saos-2各重组骨肉瘤细胞株的成骨矿化晚期指标钙结节茜素红染色：a.Mock组：为转化任何FGFR2IIIc类似物基因的空白对照组；b.转化并过表达FGFR2IIIc野生性基因组；c.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W基因组；d.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W+P253R基因组。

图4：在FGF-2诱导下PC3各重组前列腺癌细胞株的成骨矿化晚期指标钙结节茜素红染色：a.Mock组：为转化任何FGFR2IIIc类似物基因的空白对照组；b.转化并过表达FGFR2IIIc野生性基因组；c.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W基因组；d.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W+P253R基因组。

图5：在FGF-2诱导下C3H10T1/2各重组间充质干细胞株的成骨矿化晚期指标钙结节茜素红染色：a.Mock组：为转化任何FGFR2IIIc类似物基因的空白对照组；b.转化并过表达FGFR2IIIc野生性基因组；c.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W基因组；d.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W+P253R基因组。

图6：在FGF-2诱导下HBOF1.19各重组成骨细胞株的成骨矿化晚期指标钙结节茜素红染色：a.Mock组：为转化任何FGFR2IIIc类似物基因的空白对照组；b.转化并过表达FGFR2IIIc野生性基因组；c.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W基因组；d.转化并过表达FGFR2IIIc-S252W+P253R基因组。

具体实施方式

在以下的实施例中，所涉及的材料来源为：

(1)菌种、质粒和细胞株：大肠杆菌DH5α菌株为本领域技术人员熟知的，常规分子生物学实验室均有保存，可购自日本TOYOBO公司(产品目录号DNA-903)，T载体pGEM-T Easy可购自美国Promega公司(产品目录号A1360)；哺乳动物细胞表达质粒pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司(产品目录号V80020)；入门载体pENTR-11、包括大肠杆菌Stab1、293FT细胞、慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST、慢病毒包装质粒Packing Mix和杀稻瘟素的慢病毒表达系统购自美国Invitrogen公司(产品目录号V496-10和11819-018)，腺病毒穿梭载体pshuttle-CMV和包括腺病毒表达载体pAdEasy-1、细胞293A和大肠杆菌BJ5138等的腺病毒表达系统购自加拿大Qbiogene公司(产品目录号分别为AES1021和AES1016)；人骨肉瘤Saos-2(ATCC编号HTB-85)，人前列腺癌PC-3(ATCC编号CRL-1435)，人成骨细胞HFOB1.19(ATCC编号CRL-11372)，间充质干细胞C3H10T1/2(ATCC编号CCL-226)均购自美国菌种保藏中心ATCC。

(2)工具酶和生化试剂：各种限制性内切酶、DNA高保真聚合酶Pyrobest、DNA分子量标准均购自TaKaRa公司，DNA连接酶2×Lightion High反应混合液以及RT反转录酶Ace购自日本ToYoBa公司，DNA重组酶LR、阳离子脂质体Lipofection2000和细胞培养基Opti-MEMI购自美国Invitrogen公司，DNA纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、RNA抽提试剂盒购自美国Qiagen公司，细胞培养液DMEM、细胞总RNA提取试剂Trizol均购自美国Gibco公司，其它生化试剂均为国产分析纯。

(3)寡核苷酸引物：本实施例所涉及的引物均由上海英骏生物技术有限责任公司合成。

实施例1  FGFR2IIIc类似物基因的获得

1.1人源野生型FGFR2IIIc基因的获得

本发明通过从人胎盘组织中提取总RNA，获得cDNA，并进行PCR扩增的方法来获得人源野生型FGFR2IIIc基因：

首先，通过Trizol方法(见Gibco/BRL公司相关操作手册)从健康人胎盘组织中提取总RNA，然后采用逆转录酶聚合反应从该提取的总RNA中获得cDNA。设计如下引物：IIIC-F：5’<atg gtc agc tgg ggt cgt ttc atc>3’，IIIC-R：5’<tca tgt ttt aac act gcc gtt tat>3’，以该cDNA为模板，按如下反应体系：cDNA模板1μl、IIIC-F(10pmol/μl)1μl IIIC-R(10pmol/μl)1μl、dNTP(10mM)10μl、10×缓冲液2μl、高保真酶(5IU/μl)0.5μl和三蒸水4.5μl共20μl；PCR参数为94℃4min，然后94℃30s、58℃30s、72℃90s共循环32次，最后72℃10min，获得的PCR产物大小为2500bp左右的核苷酸片段，克隆入pGEM-Teasy载体，交由测序公司进行测序；结果正确，获得人源野生型FGFR2IIIc基因。

1.2  FGFR2IIIc-S252W、FGFR2IIIc-P253R、FGFR2IIIc-S252W+P253R类似物基因的获得

首先设计如下引物：

人源野生型FGFR2IIIc基因第252位丝氨酸突变为色氨酸(Ser252Trp)的突变引物：(TCG→TGG)：

IIIc-F252：5’<GGAGCGA

CCTCACCGG>3’

IIIc-R252：5’<GCCATCGCT

CAACATCGC>3’

人源野生型FGFR2IIIc基因第253位脯氨酸突变为酪氨酸(Pro253Arg)的突变引物：(CCT→CGT)：

IIIc-F253：5’<GAGCGATCG

CACCGGC>3’

IIIc-R253：5’<CCGGTG CGATCGCTCCA>3’

人源野生型FGFR2IIIc基因第252位丝氨酸突变为色氨酸(Ser252Trp)和第253位脯氨酸突变为酪氨酸(Pro253Arg)的突变引物：(TCGCCT→TGGCGT)：

IIIc-F252+253：5’<GGAGCGA CACCGGC>3’

IIIc-R252+253：’<CCGGTG

TCGCTCC>3’

以获得FGFR2IIIc-S252W类似物基因为例，以人源野生型FGFR2IIIc基因为模板，首先以IIIc-F和IIIc-R252和IIIc-R和IIIc-F252这两对引物分别扩增获得两条在突变位点有重叠的核苷酸序列，再以这两条核苷酸序列为模板，再以IIIc-F和IIIc-R为引物扩增，获得全长为2500bp左右的PCR产物(具体过程可见图1所示)，再克隆入pGEM Teasy载体，交由测序公司进行测序，选择序列正确的基因，命名为FGFR2IIIc-S252W类似物基因。具体PCR反应体系和扩增参数如下：

第一轮PCR反应体系和扩增参数为：野生型FGFR2IIIc基因1μl、引物IIIC-F(10pmol/μl)和IIIC-R252(10pmol/μl)各1μl、dNTP(10mM)10μl、10×缓冲液2μl、高保真酶Pyrobest(5IU/μl)0.5μl和三蒸水4.5μl共20μl，以及野生型FGFR2IIIc基因1μl、引物IIIC-F252(10pmol/μl)和IIIC-R(10pmol/μl)各1μl、dNTP(10mM)10μl、10×缓冲液2μl、高保真酶Pyrobest(5IU/μl)0.5μl和三蒸水4.5μl共20μl，PCR扩增参数：94℃4min，然后94℃30s、58℃30s、72℃90s共循环32次，最后72℃10min；获得两条大小不等的PCR扩增产物。

第二轮PCR反应体系和扩增参数：以第一轮获得的2种PCR扩增产物为模板，各1μl，dNTP(10mM)10μl、10×缓冲液2μl、高保真酶(5IU/μl)0.5μl和三蒸水4.5μl共20μl，PCR扩增参数为94℃4min，然后94℃30s、58℃30s、72℃90s一个循环32次，最后72℃10min，再加入引物HIC-F(10pmol/μl)和IIIC-R(10pmol/μl)各1μl，按如下PCR扩增参数94℃30s、58℃30s、72℃150s共循环32次，最后72℃10min，最终获得目的条带为2500bp左右的PCR扩增产物，进一步克隆到pGEM-T easy载体进行测序，结果正确，最终获得FGFR2IIIc-S252W类似物基因。

如上所述的方法，同样获得FGFR2IIIc-P253R、FGFR2IIIc-S252W+P253R类似物基因。

实施例2  构建包含FGFR2IIIc类似物基因的重组表达载体

2.1  包含FGFR2IIIc类似物基因的重组质粒载体的构建

根据如上所获得的各类似物基因，设计将FGFR2IIIC类似物基因克隆到pcDNA3.1质粒载体上的引物，上游采用BamHI酶切位点，下游采用Hind III酶切位点：

IIIC-P-F：5’<catg

gccgcc acc atg gtc agc tgg ggt cgt ttc atc tgc>3’

IIIC-P-R：5’<ccg

tca tgt ttt aac act gcc gtt tat gtg>3’

以所获得的各FGFR2IIIc类似物基因为模板，取如上设计的引物，加上适量的三蒸水和Pyrobest聚合酶反应混合液，PCR反应参数为94℃ 4min，94℃ 30s 60℃45s，72℃90s共32个循环，72℃10min。

用BamHI和Hind III双酶切FGFR2IIIc类似物核苷酸序列片段和pcDNA3.1质粒载体，纯化后用DNA连接酶2×Ligation High进行连接，16℃1h，转化进入大肠杆菌DH5α中，涂布在添加了氨卞青霉素的LB固体培养基上，隔天挑取单克隆，做BamH I和HindIII双酶切和PCR鉴定，鉴定出阳性克隆送测序公司分析插入基因的序列。

测序正确证明重组成功的重组子再大量扩增，提取重组质粒，分别命名为pcDNA-FGFR2IIIc、pcDNA-FGFR2IIIc-S252W、pcDNA-FGFR2IIIc-P253R和pcDNA-FGFR2IIIc-S252W+P253R。

2.2  包含FGFR2IIIc类似物基因的重组慢病毒载体的构建

根据如上所获得的类似物基因，设计将FGFR2IIIC类似物基因克隆到pENTR11载体上的引物，上游采用NcoI酶切位点，因为本身在41bp位置开始有一个NcoI位点(见下划线所示)，故设计的引物较长，将ccatgg突变成caatgg；下游采用Xho I酶切位点：

IIIC-L-F：5’<catg

tc agc tgg ggt cgt ttc atc tgc ctg gtc gtg gtc a ca atg gca acc tt>3’

IIIC-L-R：5’<ccg

tca tgt ttt aac act gcc gtt tat gtg>3’

以所获得的各FGFR2IIIc类似物基因为模板，取如上设计的引物，加上适量的三蒸水和Pyrobest聚合酶反应混合液，PCR反应参数为94℃ 4min，94℃ 30s 60℃45s，72℃90s共32个循环，72℃10min。

将获得的PCR产物进行NcoI、Xho I双酶切，取入门载体pENTR-11进行NcoI、Xho I双酶切，二者取适量混合，加入DNA连接酶2×Lightion High反应混合液，16℃1h。然后转化感受态大肠杆菌DH5α，涂含氨卞青霉素的LB平板，37℃培养12-18h，挑单菌落，于5ml的含氨卞青霉素的LB⁺培养液扩增培养，提取质粒，酶切和PCR鉴定，将鉴定得到的pENTR-FGFR2IIIc类似物系列重组质粒交上海英骏生物技术公司测序。

取克隆成功测序正确的pENTR-FGFR2IIIc类似物重组质粒与pLenti6/V5-DEST载体适量混合，加入重组酶LR和适量三蒸水，反应4h，直接转化之后转化大肠杆菌Stb13感受态，涂含链霉素和氨卞青霉素的LB平板，37℃12至18h培养，挑单菌落，于5ml的含链霉素和氨卞青霉素的LB培养液中扩增培养，提取质粒，进行PCR鉴定。重组成功的重组子再转化进入DH5α大肠杆菌中，大量扩增重组子，提取重组慢病毒表达载体。获得的重组慢病毒表达载体分别命名为分别命名为pLenti-FGFR2IIIc、pLenti-FGFR2IIIc-S252W、pLenti-FGFR2IIIc-P253R和pLenti-FGFR2IIIc-S252W+P253R。

2.3  包含FGFR2IIIc类似物基因的重组腺病毒载体的构建

根据如上所获得的基因，设计将FGFR2IIIC类似物基因克隆到pShuttle-CMV腺病毒载体上的引物，上游采用KpnI酶切位点，下游采用Hind III酶切位点，在C端加入

Myc标签：：

IIIC-A-F：5’<catg

gccgcc acc atg gtc agc tgg ggt cgt ttc atc tgc>3’

IIIC-A-R：5’<ccg tca  cag atc ctc ttc tga gta gag ttt ttg ttc tgt ttt aac act gcc gtt tatgtg>3’

以所获得的各FGFR2IIIc类似物基因为模板，取如上设计的引物，加上适量的三蒸水和Pyrobest聚合酶反应混合液，PCR反应参数为94℃ 4min，94℃ 30s 60℃45s，72℃90s共32个循环，72℃10min。

用Kpn I和Hind III双酶切FGFR2IIIc类似物核苷酸序列片段和pShuttle-CMV，纯化后用DNA连接酶2×Ligation High进行连接。16℃1h，转化进入大肠杆菌DH5α中，涂布在添加了卡那霉素的LB固体培养基上，隔天挑取单克隆，做Kpn I和Hind III双酶切鉴定，鉴定出阳性克隆送测序公司分析插入基因的序列。

将克隆成功测序正确的pShuttle-CMV-FGFR2IIIc类似物重组质粒用Pme I限制性内切酶单酶切，完全线性化后与腺病毒的骨架质粒pAdEasy-1按照10∶1的量共转化进入重组细胞BJ5138大肠杆菌中，在BJ5138细胞内两种质粒发生重组反应。挑取单克隆抽提质粒用Pac I限制性内切酶单酶切后电泳，鉴定重组情况。重组成功的重组子再转化进入DH5α大肠杆菌中，大量扩增重组子，提取重组腺病毒表达载体。获得的重组腺病毒表达载体分别命名为分别命名为pAd-FGFR2IIIc、pAd-FGFR2IIIc-S252W、pAd-FGFR2IIIc-P253R和pAd-FGFR2IIIc-S252W+P253R。

实施例3  包含FGFR2IIIc类似物基因的药物组合物的制备

3.1  包含FGFR2IIIc类似物基因的非病毒重组表达载体的药物组合的制备

取实施例2.1所获得的各类重组子，按5％～10％的比例接种于50ml～500ml的含氨卞青霉素的LB培养液中大量扩增，然后采用碱裂解法大量制备和用PEG沉淀法纯化，具体步骤详见《分子克隆实验指南》第32页和第48页。获得的各非病毒重组表达载体pcDNA-FGFR2IIIc、pcDNA-FGFR2IIIc-S252W、pcDNA-FGFR2IIIc-P253R和pcDNA-FGFR2IIIc-S252W+P253R可以冻干保存，使用时采用灭菌三蒸水溶解；或直接加入灭菌三蒸水于-70℃保存备用。

3.2  包含FGFR2IIIc类似物基因的重组慢病毒颗粒的药物组合物的制备

利用脂质体转染法分别将pLenti-FGFR2IIIc、pLenti-FGFR2IIIc-S252W、pLenti-FGFR2IIIc-P253R和pLenti-FGFR2IIIc-S252W+P253R和Packing Mix、Lipofectine2000和293FT细胞混合于Opti-MEMI培养基培养24h后，更换DMEM完全培养基以便于慢病毒颗粒包装，48h后，培养基上清采用0.45μm的滤膜过滤纯化以收集各重组病毒颗粒。

将病毒颗粒按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度依次加入到六孔板中的目的细胞中，与之共培养24h，换用新鲜培养基培养24h后加入杀稻瘟素筛选12d，根据每孔所形成的克隆数计算滴度。

所获得的各重组病毒颗粒溶液于-70℃保存备用。

3.3  包含FGFR2IIIc类似物基因的重组腺病毒颗粒的药物组合物的制备

取各重组腺病毒载体pAd-FGFR2IIIc、pAd-FGFR2IIIc-S252W、pAd-FGFR2IIIc-P253R和pAd-FGFR2IIIc-S252W+P253R，采用脂质体法转染293A细胞后，隔两天给细胞换液一次，培养基除胎牛血清改为5％之外，其他成分不变，每隔12小时镜检观察细胞一次，看细胞是否出现病变反应。转染7-10天后细胞会出现病变效应，表现为贴壁细胞变圆、核浓缩、脱落，出现病毒空斑。

出现病变后3-4天，收集293A细胞，离心，去上清，用不含血清的DMEM或者PBS溶液重悬细胞，37℃和-70℃反复冻融4次，使细胞裂解，离心除去沉淀里的细胞碎片，上清即为具有感染性的重组腺病毒颗粒，收集病毒颗粒。

然后可用病毒颗粒以1∶2的细胞数量重新感染293A细胞，以扩增病毒颗粒，同法收集第二、三、四代病毒颗粒。

通过PFU(空斑形成单位)法来测定重组腺病毒颗粒的滴度，293A细胞以2×10⁴cell/孔铺24孔板，待细胞融合度达到90％时，用腺病毒颗粒感染，通过以下公式计算病毒滴度T：T(PFU/ml)＝稀释度×(P1+P2+......P4)/(n+V)，P＝某一稀释度每孔的空斑数；n＝复孔数；V＝每孔的接种量(ml)。

所获得的病毒颗粒溶液于-70℃保存备用。

实施例4  表达FGFR2IIIc类似物之各重组细胞株的筛选及鉴定

以人骨肉瘤细胞Saos-2为例，与6cm²的细胞培养皿中培养至细胞铺板率为70～90％，加入含FGFR2IIIc类似物的重组慢病毒颗粒上清感染24h后，去上清，加入含杀稻瘟毒素的完全培养基培养筛选。于培养皿中目测到有单克隆细胞群落出现，用克隆环挑取至96孔板，再放大至24孔、6孔板和10cm²培养皿培养，然后分别取1×10⁶细胞提取RNA和基因组进行PCR扩增和酶切鉴定。将获得的Saos-2各重组细胞株分别命名为Saos-2-IIIc、Saos-2-S252W、Saos-2-P253R、Saos-2-S252W+P253R等。

同样方法获得各人骨肉瘤细胞MG-63重组细胞株，分别命名为MG-63-IIIc、MG-63-S252W、MG-63-P253R、MG-63-S252W+P253R等。

同样方法获得各人前列腺癌细胞PC3重组细胞株，分别命名为PC3-2-IIIc、PC3-S252W、PC3-P253R、PC3-S252W+P253R等。

同样方法获得各人成骨细胞HFOB1.19重组细胞株，分别命名为HFOB-2-IIIc、HFOB-S252W、HFOB-P253R、HFOB-S252W+P253R等。

同样方法获得各鼠间充质干细胞C3H10T1/2重组细胞株，分别命名为C3H10T-2-IIIc、C3H10T-S252W、C3H10T-P253R、C3H10T-S252W+P253R等。

实施例5  在FGF-2诱导下对Saos-2各重组细胞株的MTT法检测

以人骨肉瘤细胞Saos-2重组细胞为例，取对数生长期Saos-2重组细胞，胰酶消化，通过细胞计数将其浓度调整到4×10⁴个细胞/mL。将此细胞悬液以100μL/孔均匀接种到细胞培养板上培养24h后，换成1％培养基，饥饿培养24h；用DMEM培养液溶解FGF-2，按1∶5剂距进行系列稀释。将稀释后的待测上清分别按100μL/孔额量逐一加入靶细胞培养孔中，每个稀释度做3个复孔。加样后置于37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养24小时；每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)，继续培养4小时；弃去培养液，加入DMSO溶液150μL/孔，置于微量振荡器张充分振动15min，以混匀；最后以570nm为检测波长，630nm为参考波长，用酶标仪测定各孔的吸光值(OD)。取3个复孔的平均OD值做数据分析。

人前列腺癌细胞PC3各重组肿瘤细胞株的MTT法检测方法相同。

结果：Saos-2重组细胞：与野生型相比，S252W组明显抑制增殖，S252W+P253R组次之，见图2。

实施例6  在FGF-2诱导下对各重组细胞株的细胞周期检测

方法：细胞克隆接种到10cm²培养皿中，待细胞达70～80％贴壁率后，加入FGF-2继续培养，用胰酶消化，细胞计数，保证细胞数量在1×10⁶以上，PBS洗2次，弃上清，加入70％乙醇固定，用手指轻轻弹散细胞沉淀，离心，弃上清，加入50mg/L的碘化丙啶(PI)和1％TritonX-100染色，边加入边混匀防止细胞聚集成块，制备成单细胞悬液。流式细胞仪上检测细胞周期。各重组细胞株的细胞周期检测数据见如表1-4所示：

表1  FGFRIIIc类似物基因抑制Saos-2的细胞周期(n＝3)

	G1期	S期	G2期
				Mock组	60.3±1.6	26.8±2.5	12.8±2.1
野生型FGFRIIIc	62.9±2.4	21.11±2.2	16.1±1.5
				FGFRIIIc-S252W	71.3±1.9	20.7±2.1	17.5±2.8
FGFRIIIc-S252W+P253R	65.1±1.8	22.6±1.8	16.9±1.7

表2  FGFRIIIc类似物基因抑制PC-3的细胞周期(n＝3)

	G1期	S期	G2期
				Mock组	52.6±1.5	33.6±2.3	13.8±2.1
野生型FGFRIIIc	63.3±2.3	29.8±3.1	16.2±1.0
				FGFRIIIc-S252W	66.9±1.1	20.2±1.1	17.3±2.3
FGFRIIIc-S252W+P253R	55.9±1.6	27.2±2.1	16.9±1.3

表3  FGFRIIIc类似物基因抑制C3H10T1/2的细胞周期(n＝3)

	G1期	S期	G2期
				Mock组	72.5±1.5	19.2±2.3	6.6±2.1
野生型FGFRIIIc	73.3±2.3	19.8±3.1	6.2±1.0
				FGFRIIIc-S252W	80.4±1.1	10.7±1.1	7.8±2.3
FGFRIIIc-S252W+P253R	75.6±1.6	15.6±2.1	6.3±1.3

表4  FGFRIIIc类似物基因抑制HFOB1.19的细胞周期(n＝3)

	G1期	S期	G2期
				Mock组	55.5±1.4	25.3±2.0	10.3±2.1
野生型FGFRIIIc	46.1±1.5	22.1±2.3	5.53±1.5
				FGFRIIIc-S252W	69.1±2.1	13.3±1.8	13.6±2.2
FGFRIIIc-S252W+P253R	66.8±1.7	18.9±1.9	12.2±1.5

结果说明：G1期为DNA合成前期、S期为DNA合成期、G2期为DNA合成后期细胞分裂前期，所以如果待测细胞在G1期的细胞越多而G2期的细胞越少，则说明其分裂增殖能力越差，分化或凋亡能力越强。

实施例7  在FGF-2诱导下对各重组细胞株成骨矿化早期指标碱性磷酸酶(ALP)的染色

以Saos-2细胞为例，取各Saos-2重组细胞株，铺板，生长至约90％的密度；饥饿24h后；加入含不同浓度FGF-2的含5％小牛血清的培养基培养，每周换液2～3次，连续3周；去培养基，加入PBS清洗2～3次；采用95％乙醇固定10min，再晾干；加入反应底物液(每100ml中含0.32％β-甘油磷酸钠、1％巴比妥钠、0.6％MgSO₄、2％硝酸钙)，37℃4h；加入1％硝酸钴2min，冲洗1～2m，加入1％硝酸铵2min，冲洗；晾干后镜下观察。

人前列腺癌细胞PC3各重组肿瘤细胞株检测方法相同。

(1)Saos-2各重组细胞株染色结果：

表5  FGF-2诱导Saos-2各重组细胞株三周后ALP染色结果

备注：+和-：表示染色程度，+越多则越深，反之则越浅。

(2)PC3各重组细胞株染色结果：

表6  FGF-2诱导PC-3各重组细胞株三周后ALP染色结果

备注：+和-：表示染色程度，+越多则越深，反之则越浅。

结果说明：镜下观察，各细胞株的细胞中可见浅棕色至棕黑色的细小颗粒；目测，各培养孔中棕黑色程度明显不同，棕黑色程度越深，表明分化能力越强。

实施例8  在FGF-2诱导下对各重组细胞株成骨矿化晚期指标钙结节茜素红染色

以Saos-2细胞为例，取各Saos-2重组细胞株，铺板，生长至约90％的密度；饥饿24h后；10mMβ-甘油磷酸钠和FGF-2分别加入1％小牛血清的培养基培养，每周换液2～3次，连续3周；去培养基，加入PBS清洗2～3次；采用95％乙醇固定10min，再清洗3～4次；2mg/ml茜素红染色，室温15m；三蒸水清洗，晾干后镜下观察。

人前列腺癌细胞PC3、鼠间充质干细胞C3H10T1/2各重组细胞株和人成骨细胞HFOB1.19各重组细胞株的检测方法与如上方法相同。

Saos-2各重组细胞株染色结果结果见图3。

PC3各重组细胞株染色结果见图4。

C3H10T1/2各重组细胞株染色结果见图5。

HFOB1.19各重组细胞株染色结果见图6。

结果说明：镜下观察，在细胞密集处可见红色沉着物，并呈团样向四周放射，中心颜色明显加深。目测可见各培养孔中红色沉着程度有不同。红色沉着程度越深，表明分化能力越强。

实施例9  骨肉瘤重组细胞株在体肿瘤形成效果检测

BALB/C裸小鼠(由中山医科大学动物中心提供)，5～8周龄，雌雄不拘，在无特殊致病菌环境中饲养随机分成3组，每组6只。各重组肿瘤细胞株经含＝10％小牛血清的DMEM培养液培养后，将新鲜消化的1×10⁶/L浓度细胞悬液0.5ml分别接种于裸鼠颈背部皮下。每隔3天检测一次，用游标卡尺测量肿瘤的短径(W)和最大长径(L)观察肿瘤生长情况，计算公式：肿瘤体积＝L×W²/Z。数据进行统计后按均数加标准差方法表示。

根据各实验组，取其中最短生存时间的一组做对照，比较其余各组的生长生存情况，进行观察和记录。

表7.G-63重组细胞株在裸鼠体内形成肿瘤瘤重和生存时间统计结果(n＝6)

分组	Mock组	野生型组	S252W组	S252W+R253R组
					瘤重(mg)	562±18	656±14	708±16	712±13
最长生存时间	15天	18天	25天	23天

结果说明：结果说明：生存时间越长，表明肿瘤生长被抑制的效果越好，反之越差。瘤越重，说明肿瘤发生转移的可能性越低，抑癌效果越好。

实施例10  裸鼠骨肉瘤模型的建立和骨肉瘤基因治疗效果检测

BALB/C裸小鼠(由中山医科大学动物中心提供)，5～8周龄，雌雄不拘，在无特殊致病菌环境中饲养。未处理的肿瘤细胞株经含＝10％小牛血清的DMEM培养液培养后，将新鲜消化的1×10⁶/L浓度细胞悬液0.5ml分别接种于3只裸鼠皮下。裸鼠荷瘤生长时间总体为21～23d。

处死这3只裸鼠，取形成的瘤组织进一步分离骨肉瘤细胞，再分别接种于裸鼠皮下。接种7d后，取建立好的裸鼠模型，随机分成3组，每组6只，开始每天在裸鼠腹腔注射本发明的药物组合物，用游标卡尺测量肿瘤的短径(W)和最大长径(L)观察肿瘤生长情况，计算公式：肿瘤体积＝L×W²/Z。根据各检测组，每隔3天检测一次；并检测平均存活时间，数据进行统计后采用均数加标准差的方法表示。

表8  裸鼠骨肉瘤基因治疗后瘤重和瘤体积统计结果(n＝6)

分组			Mock组	野生型组	S252W组	S252W+R253R组
							平均存活时间(天)			24±2	28±1	31±1	29±2
骨肉瘤体积(mm3)	给药天数	1	443±13	381±15	291±12	352±16
							4	720±15	680±14	425±17	524±12
		8	859±14	820±15	530±17	675±16
							12	1374±13	1175±14	762±16	852±12
		16	1961±12	1486±14	1004±16	1192±14

说明：MOCK组为空白对照，注射生理盐水；

野生型组为注射含野生型FGFR2IIIc基因的重组腺病毒颗粒的药物组合物；

S252W组为注射含野生型FGFR2IIIc-S252W基因的重组腺病毒颗粒的药物组合物；

S252W+R253R组为注射含野生型FGFR2IIIcS252W+P253R基因的重组腺病毒颗粒的药物组合物。

结果说明：在统计天数内瘤体积相对越小，或平均存活时间越长，说明注射的药物组合物的基因治疗的效果越好。

  一种包含成纤维细胞生长因子受体2 IIIc类似物基因的药物组合物序列表.txt

         SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>成纤维细胞生长因子受体2 IIIc类似物基因

<130>一种包含成纤维细胞生长因子受体2 IIIc类似物基因的药物组合物

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2463

<212>DNA

<213>Homo sapiens(human)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2463)

<220>

<221>mutation

<222>(755)..(755)

<223>c or g

<220>

<221>mutation

<222>(758)..(758)

<223>c or g

<400>1

atg gtc agc tgg ggt cgt ttc atc tgc ctg gtc gtg gtc acc atg gca    48

Met Val Ser Trp Gly Arg Phe Ile Cys Leu Val Val Val Thr Met Ala

1               5                   10                  15

acc ttg tcc ctg gcc cgg ccc tcc ttc agt tta gtt gag gat acc aca    96

Thr Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ser Phe Ser Leu Val Glu Asp Thr Thr

            20                  25                  30

tta gag cca gaa gag cca cca acc aaa tac caa atc tct caa cca gaa    144

Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr Gln Ile Ser Gln Pro Glu

        35                  40                  45

gtg tac gtg gct gca cca ggg gag tcg cta gag gtg cgc tgc ctg ttg    192

Val Tyr Val Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu Glu Val Arg Cys Leu Leu

    50                  55                  60

aaa gat gcc gcc gtg atc agt tgg act aag gat ggg gtg cac ttg ggg    240

Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys Asp Gly Val His Leu Gly

65                  70                  75                  80

ccc aac aat agg aca gtg ctt att ggg gag tac ttg cag ata aag ggc    288

Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu Tyr Leu Gln Ile Lys Gly

                85                  90                  95

gcc acg cct aga gac tcc ggc ctc tat gct tgt act gcc agt agg act    336

Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Thr Ala Ser Arg Thr

            100                 105                 110

gta gac agt gaa act tgg tac ttc atg gtg aat gtc aca gat gcc atc    384

Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val Asn Val Thr Asp Ala Ile

        115                 120                 125

tca tcc gga gat gat gag gat gac acc gat ggt gcg gaa gat ttt gtc    432

Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Ala Glu Asp Phe Val

    130                 135                 140

agt gag aac agt aac aac aag aga gca cca tac tgg acc aac aca gaa    480

Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu

145                 150                 155                 160

aag atg gaa aag cgg ctc cat gct gtg cct gcg gcc aac act gtc aag    528

Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys

                165                 170                 175

ttt cgc tgc cca gcc ggg ggg aac cca atg cca acc atg cgg tgg ctg     576

Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met Pro Thr Met Arg Trp Leu

            180                 185                 190

aaa aac ggg aag gag ttt aag cag gag cat cgc att gga ggc tac aag     624

Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys

        195                 200                 205

gta cga aac cag cac tgg agc ctc att atg gaa agt gtg gtc cca tct     672

Val Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met Glu Ser Val Val Pro Ser

    210                 215                 220

gac aag gga aat tat acc tgt gtg gtg gag aat gaa tac ggg tcc atc     720

Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile

225                 230                 235                 240

aat cac acg tac cac ctg gat gtt gtg gag cga tsg cst cac cgg ccc     768

Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val Val Glu Arg Xaa Xaa His Arg Pro

                245                 250                 255

atc ctc caa gcc gga ctg ccg gca aat gcc tcc aca gtg gtc gga gga     816

Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly

            260                 265                 270

gac gta gag ttt gtc tgc aag gtt tac agt gat gcc cag ccc cac atc     864

Asp Val Glu Phe Val Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile

        275                 280                 285

cag tgg atc aag cac gtg gaa aag aac ggc agt aaa tac ggg ccc gac     912

Gln Trp Ile Lys His Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp

    290                 295                 300

ggg ctg ccc tac ctc aag gtt ctc aag gcc gcc ggt gtt aac acc acg     960

Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr

305                 310                 315                 320

gac aaa gag att gag gtt ctc tat att cgg aat gta act ttt gag gac    1008

Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg Asn Val Thr Phe Glu Asp

                325                 330                 335

gct ggg gaa tat acg tgc ttg gcg ggt aat tct att ggg ata tcc ttt    1056

Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Ile Ser Phe

            340                 345                 350

cac tct gca tgg ttg aca gtt ctg cca gcg cct gga aga gaa aag gag    1104

His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Ala Pro Gly Arg Glu Lys Glu

        355                 360                 365

att aca gct tcc cca gac tac ctg gag ata gcc att tac tgc ata ggg    1152

Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala Ile Tyr Cys Ile Gly

    370                 375                 380

gtc ttc tta atc gcc tgt atg gtg gta aca gtc atc ctg tgc cga atg    1200

Val Phe Leu Ile Ala Cys Met Val Val Thr Val Ile Leu Cys Arg Met

385                 390                 395                 400

aag aac acg acc aag aag cca gac ttc agc agc cag ccg gct gtg cac    1248

Lys Asn Thr Thr Lys Lys Pro Asp Phe Ser Ser Gln Pro Ala Val His

                405                 410                 415

aag ctg acc aaa cgt atc ccc ctg cgg aga cag gta aca gtt tcg gct    1296

Lys Leu Thr Lys Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser Ala

            420                 425                 430

gag tcc agc tcc tcc atg aac tcc aac acc ccg ctg gtg agg ara aca    1344

Glu Ser Ser Ser Ser Met Asn Ser Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile Thr

        435                 440                 445

aca cgc ctc tct tca acg gca gac acc ccc atg ctg gca ggg gtc tcc    1392

Thr Arg Leu Ser Ser Thr Ala Asp Thr Pro Met Leu Ala Gly Val Ser

    450                 455                 460

gag tat gaa ctt cca gag gac cca aaa tgg gag ttt cca aga gat aag    1440

Glu Tyr Glu Leu Pro Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Lys

465                 470                 475                 480

ctg aca ctg ggc aag ccc ctg gga gaa ggt tgc ttt ggg caa gtg gtc    1488

Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val Val

                485                 490                 495

atg gcg gaa gca gtg gga att gac aaa gac aag ccc aag gag gcg gtc    1536

Met Ala Glu Ala Val Gly Ile Asp Lys Asp Lys Pro Lys Glu Ala Val

            500                 505                 510

acc gtg gcc gtg aag atg ttg aaa gat gat gcc aca gag aaa gac ctt    1584

Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Glu Lys Asp Leu

        515                 520                 525

tct gat ctg gtg tca gag atg gag atg atg aag atg att ggg aaa cac    1632

Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys His

    530                 535                 540

aag aat atc ata aat ctt ctt gga gcc tgc aca cag gat ggg cct ctc    1680

Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro Leu

545                 550                 555                 560

tat gtc ata gtt gag tat gcc tct aaa ggc aac ctc cga gaa tac ctc    1728

Tyr Val Ile Val Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr Leu

                565                 570                 575

cga gcc cgg agg cca ccc ggg atg gag tac tcc tat gac att aac cgt    1776

Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Met Glu Tyr Ser Tyr Asp Ile Asn Arg

            580                 585                 590

gtt cct gag gag cag atg acc ttc aag gac ttg gtg tca tgc acc tac    1824

Val Pro Glu Glu Gln Met Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys Thr Tyr

        595                 600                 605

cag ctg gcc aga ggc atg gag tac ttg gct tcc caa aaa tgt att cat    1872

Gln Leu Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Lys Cys Ile His

    610                 615                 620

cga gat tta gca gcc aga aat gtt ttg gta aca gaa aac aat gtg atg    1920

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asn Asn Val Met

625                 630                 635                 640

aaa ata gca gac ttt gga ctc gcc aga gat atc aac aat ata gac tat    1968

Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Asn Asn Ile Asp Tyr

                645                 650                 655

tac aaa aag acc acc aat ggg cgg ctt cca gtc aag tgg atg gct cca    2016

Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro

            660                 665                 670

gaa gcc ctg ttt gat aga gta tac act cat cag agt gat gtc tgg tcc    2064

Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser

        675                 680                 685

ttc ggg gtg tta atg tgg gag atc ttc act tta ggg ggc tcg ccc tac    2112

Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr

    690                 695                 700

cca ggg att ccc gtg gag gaa ctt ttt aag ctg ctg aag gaa gga cac    2160

Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His

705                 710                 715                 720

aga atg gat aag cca gcc aac tgc acc aac gaa ctg tac atg atg atg    2208

Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met Met

                725                 730                 735

agg gac tgt tgg cat gca gtg ccc tcc cag aga cca acg ttc aag cag    2256

Arg Asp Cys Trp His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln

            740                 745                 750

ttg gta gaa gac ttg gat cga att ctc act ctc aca acc aat gag gaa    2304

Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu Glu

        755                 760                 765

tac ttg gac ctc agc caa cct ctc gaa cag tat tca cct agt tac cct    2352

Tyr Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Glu Gln Tyr Ser Pro Ser Tyr Pro

    770                 775                 780

gac aca aga agt tct tgt tct tca gga gat gat tct gtt ttt tct cca    2400

Asp Thr Arg Ser Ser Cys Ser Ser Gly Asp Asp Ser Val Phe Ser Pro

785                 790                 795                 800

gac ccc atg cct tac gaa cca tgc ctt cct cag tat cca cac ata aac    2448

Asp Pro Met Pro Tyr Glu Pro Cys Leu Pro Gln Tyr Pro His Ile Asn

                805                 810                 815

ggc agt gtt aaa aca                                                2463

Gly Ser Val Lys Thr

            820

<210>2

<211>821

<212>PRT

<213>Homo sapiens(human)

<220>

<221>misc_feature

<222>(252)..(252)

<223>The’Xaa’at location 252 stands for Trp，or Ser.

<220>

<221>misc_feature

<222>(253)..(253)

<223>The’Xaa’at location 253 stands for Arg，or Pro.

<400>2

Met Val Ser Trp Gly Arg Phe Ile Cys Leu Val Val Val Thr Met Ala

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Ala Arg Pro Ser Phe Ser Leu Val Glu Asp Thr Thr

            20                  25                  30

Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr Gln Ile Ser Gln Pro Glu

        35                  40                  45

Val Tyr Val Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu Glu Val Arg Cys Leu Leu

    50                  55                  60

Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys Asp Gly Val His Leu Gly

65                  70                  75                  80

Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu Tyr Leu Gln Ile Lys Gly

                85                  90                  95

Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Thr Ala Ser Arg Thr

            100                 105                 110

Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val Asn Val Thr Asp Ala Ile

        115                 120                 125

Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Ala Glu Asp Phe Val

    130                 135                 140

Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro Tyr Trp Thr Asn Thr Glu

145                 150                 155                 160

Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys

                165                 170                 175

Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met Pro Thr Met Arg Trp Leu

            180                 185                 190

Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys

        195                 200                 205

Val Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met Glu Ser Val Val Pro Ser

    210                 215                 220

Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile

225                 230                 235                 240

Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val Val Glu Arg Xaa Xaa His Arg Pro

                245                 250                 255

Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala Ser Thr Val Val Gly Gly

            260                 265                 270

Asp Val Glu Phe Val Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile

        275                 280                 285

Gln Trp Ile Lys His Val Glu Lys Asn Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Asp

    290                 295                 300

Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Asn Thr Thr

305                 310                 315                 320

Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg Asn Val Thr Phe Glu Asp

                325                 330                 335

Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Ile Ser Phe

            340                 345                 350

His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Ala Pro Gly Arg Glu Lys Glu

        355                 360                 365

Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Glu Ile Ala Ile Tyr Cys Ile Gly

    370                 375                 380

Val Phe Leu Ile Ala Cys Met Val Val Thr Val Ile Leu Cys Arg Met

385                 390                 395                 400

Lys Asn Thr Thr Lys Lys Pro Asp Phe Ser Ser Gln Pro Ala Val His

                405                 410                 415

Lys Leu Thr Lys Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser Ala

            420                 425                 430

Glu Ser Ser Ser Ser Met Asn Ser Asn Thr Pro Leu Val Arg Ile Thr

        435                 440                 445

Thr Arg Leu Ser Ser Thr Ala Asp Thr Pro Met Leu Ala Gly Val Ser

    450                 455                 460

Glu Tyr Glu Leu Pro Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Lys

465                 470                 475                 480

Leu Thr Leu Gly Lys Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val Val

                485                 490                 495

Met Ala Glu Ala Val Gly Ile Asp Lys Asp Lys Pro Lys Glu Ala Val

            500                 505                 510

Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Asp Ala Thr Glu Lys Asp Leu

        515                 520                 525

Ser Asp Leu Val Ser Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys His

    530                 535                 540

Lys Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro Leu

545                 550                 555                 560

Tyr Val Ile Val Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr Leu

                565                 570                 575

Arg Ala Arg Arg Pro Pro Gly Met Glu Tyr Ser Tyr Asp Ile Asn Arg

            580                 585                 590

Val Pro Glu Glu Gln Met Thr Phe Lys Asp Leu Val Ser Cys Thr Tyr

        595                 600                 605

Gln Leu Ala Arg Gly Met Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Lys Cys Ile His

    610                 615                 620

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asn Asn Val Met

625                 630                 635                 640

Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Asn Asn Ile Asp Tyr

                645                 650                 655

Tyr Lys Lys Thr Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro

            660                 665                 670

Glu Ala Leu Phe Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser

        675                 680                 685

Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr

    690                 695                 700

Pro Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His

705                 710                 715                 720

Arg Met Asp Lys Pro Ala Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met Met

                725                 730                 735

Arg Asp Cys Trp His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln

            740                 745                 750

Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu Glu

Tyr Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Glu Gln Tyr Ser Pro Ser Tyr Pro

    770                 775                 780

Asp Thr Arg Ser Ser Cys Ser Ser Gly Asp Asp Ser Val Phe Ser Pro

785                 790                 795                 800

Asp Pro Met Pro Tyr Glu Pro Cys Leu Pro Gln Tyr Pro His Ile Asn

                805                 810                 815

Gly Ser Val Lys Thr

            820

Claims (10)

1.一种包含FGFR2IIIc类似物基因的药物组合物，其特征在于该类似物基因的核苷酸序列编码Seq No.2所示的氨基酸序列且同源性与Seq No.1所示的核苷酸序列达到90％以上。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征是该组合物所包含的基因编码的氨基酸序列在第252位由丝氨酸突变成色氨酸和/或第253位由脯氨酸突变为精氨酸。

3.如权利要求1的药物组合物，其包含FGFR2IIIc类似物基因是以被包括在非病毒重组表达载体或重组病毒表达颗粒中的形式提供的。

4.权利要求1所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)获得含有如权利要求1所述的FGFR2IIIc类似基因的核苷酸序列片段；

(2)对该核苷酸片段进行适当的修饰或突变；

(3)对(1)或(2)所得的核苷酸核苷酸两端加入适当的限制性内切酶位点序列；

(4)将(3)所述的序列片段克隆入适当的表达载体中形成重组表达载体；

(5)对(4)获得的重组病毒载体进一步转化包装细胞获得重组病毒颗粒，并扩增纯化；或对(4)所获得的非病毒重组表达载体进行扩增纯化；

(6)对(5)所获得的纯化产物添加适当的溶液进一步制备成药物组合物。

5.如权利要求4所述的的制备方法，其特征在于所述适当的表达载体是指可在哺乳动物细胞中表达的非病毒表达载体和病毒表达载体。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述适当的病毒表达载体是逆转录病毒表达载体或腺病毒表达载体。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述适当的溶液是指能保护或稳定被保存的非病毒重组表达载体或重组病毒颗粒的溶剂。

8.如权利要求1所述的药物组合物在制备诱导细胞分化、凋亡、抑制细胞增殖或在抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述细胞指的是各种来源的胚胎干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、肿瘤细胞或转化细胞；所述的肿瘤是人源的各种肿瘤。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述细胞指的是来源于人或鼠的各种胚胎间充质干细胞、成体间充质干细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成软骨细胞或成骨细胞；所述的肿瘤是各种人骨肉瘤、人前列腺癌、人乳腺癌、人肺癌或人鼻咽痛。

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