KR20220142994A

KR20220142994A - 인간 유도 다능성 줄기 세포의 비용 효과적인 배양 배지 및 프로토콜

Info

Publication number: KR20220142994A
Application number: KR1020227012446A
Authority: KR
Inventors: 폴 버릿지
Original assignee: 노쓰웨스턴 유니버시티
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-10-24
Also published as: WO2021055841A1; US20210087525A1; EP4031652A4; IL291473A; EP4031652A1; JP2022548776A; BR112022005225A2; CN115103903A; AU2020351221A1

Abstract

낮은 시딩 밀도 조건하에서 높은 성장 속도를 유지하며 최소한의 배지 교체를 필요로 하도록, 그리고 분화 재현성을 유지하면서도 낮은 비용으로 철저하게 최적화된 신규 배양 배지 방식이 제공된다. 이와 같은 방식은 >100 계대 동안 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 생성 및 배양 둘 다를 유지할 수 있다. 배지 100 리터를 제조하는 데에 적합한 B8 보충 분취물의 생성은 기본적인 장비가 구비된 어떠한 연구 실험실에서도 간단하며, 완성품 병의 배지의 비용은 리터 당 ~$12 USD이다. 이와 같은 제제를 사용하면, 주말이 자유로운 hiPSC 세포 배양법이 가능하다.

Description

인간 유도 다능성 줄기 세포의 비용 효과적인 배양 배지 및 프로토콜

[상호-참조]

본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2019년 9월 19일자 U.S. 가출원 제62/902,561호의 우선권을 주장한다.

[정부 권리]

본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 교부되는 약정 HL121177하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권리를 가진다.

[서열 목록 참조]

본 출원은 ASCII 포맷으로 전차 제출되었으며 그 전체가 의거 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2020년 9월 1일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 47460-108_ST25.txt이며, 크기가 16,452 바이트이다.

[기술 영역]

특히 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hiPSC)의 다능성 세포 상태 및 세포 증식을 유지하는 데에 필요한 성분 및 농도에 있어서 최적화된 세포 배양 배지가 제공된다.

인간 유도 다능성 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell) (hiPSC)는 기능상 불멸이며, 분화 가능성을 유지하면서 가설상으로 모두 ~220 세포 계대까지 인간 신체 내에서 제한 없이 증식할 수 있다. CD71⁺ 혈액 전적혈구모세포 (문헌 [Chou et al., 2015]; [Chou et al., 2011]; [Tan et al., 2014]) 또는 골수 세포 (문헌 [Eminli et al., 2009]; [Staerk et al., 2010]) 증폭 및 상업용 센다이 바이러스-기반 리프로그래밍 인자 발현 (문헌 [Fujie et al., 2014]; [Fusaki et al., 2009])의 용이성으로 인하여, hiPSC 생성은 일상적인 것이 되어 있다. 이와 같은 용이성은 재생 의학, 질환 모델링, 약물 발견 및 약리유전체학을 포함한 많은 분야에 걸쳐 hiPSC-유래 세포의 잠재적인 적용에 대한 증가된 열망을 초래하였다.

그러나, 이러한 적용은 많은 수의 환자로부터 유래하는 hiPSC 또는 hiPSC 세포주 중 어느 하나의 다량 배양을 필요로 하는데, 여기에는 하기의 3가지 주요한 제한들이 드러나 있다: 1. 많은 환자-수의 프로젝트를 방해하는, 대-규모 다능성 세포 배양의 비용; 2. 업계의 실험실에서 특히 문제가 되는, 매일 배지 교체라는 시간-소모성 요건; 3. 다능성 배양 일관성 및 방법론에 고도로 의존하는, 분화 효능에 있어서의 세포주-간 가변성.

[발명의 개요]

인간 유도 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 배양이 일상적인 것이 되어 있기는 하지만, 다능성 세포 배지 비용, 빈번한 배지 교체 및 분화의 재현성은 여전히 제한적으로 남아 있어서, 대-규모 프로젝트의 가능성을 제한하고 있다. 본원에서는, 본 발명자들은 다능성 상태 및 세포 증식에 대한 각 성분의 필요성 및 상대적 기여를 확립하는 배지 성분 및 농도의 포괄적인 최적화의 결과로서의 신규한 hiPSC 배양 배지 (B8) 제제에 대해 기술한다. B8은 시중 배지 비용의 97 %를 삭감한다. B8 방식은 특히 낮은 시딩 밀도에서의 빠른 성장 및 강건성에 최적화된다.

본 발명자들은 B8에서의 29종 hiPSC 세포주들의 유도는 물론, 핵형 안정성을 보존하면서도 장-기간의 다능성 유지를 입증하였다. 이와 같은 방식은 성장 속도 또는 분화 능력을 희생하지 않으면서도 주말이-자유로운 공급 일정도 가능하게 한다. 따라서, 이와 같이 단순하고 비용-효과적인 B8 배지는 약리유전체학에서 수행되는 것들과 같은 대형 hiPSC 질환 모델링 프로젝트 및 재생 의학에서 필요로 하는 대-규모 세포 생성을 가능하게 하게 된다. 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 배양이 일상적인 것이 되어 있기는 하지만, 다능성 세포 배지 비용, 빈번한 배지 교체 및 분화의 재현성은 여전히 제한적으로 남아 있어서, 대-규모 프로젝트의 가능성을 제한하고 있다. 본원에서는, 본 발명자들은 다능성 상태 및 세포 증식에 대한 각 성분의 필요성 및 상대적 기여를 확립하는 배지 성분 및 농도의 포괄적인 최적화의 결과로서의 신규한 hiPSC 배양 배지 (B8) 제제에 대해 기술한다.

기타 방법, 특징 및/또는 장점들은 하기 도면 및 상세한 설명의 검토시 알거나 드러나게 될 것이다. 모든 그와 같은 추가적 방법, 특징 및 장점들은 본 상세한 설명 내에 포함되며 첨부된 청구범위에 의해 보호되는 것으로 하고자 한다.

[서열의 간단한 설명]

서열식별번호(SEQ ID NO): 1은 인간 FGF1의 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 2는 인간 FGF1-4X의 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 3은 인간 FGF2의 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 4는 인간 FGF2 K128N의 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 5는 인간 FGF2-G3 R31L, V52T, E54D, H69F, L92Y, S94I, C96N, S109E, T121P의 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 6은 FGF1-4X의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 7은 FGF2- K128N의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 8은 FGF2-G3의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 9는 NRG1의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 10은 TGFB1의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 11은 TGFB1m의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 12는 TGFB3의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 13은 TGFB3m의 성장 인자 플라스미드를 생성시키기 위한 뉴클레오티드 서열이다:

서열식별번호: 14는 K128N 치환이 있는 FGF2 서열이다:

서열식별번호: 15는 FGF2-G3 서열이다:

서열식별번호: 16은 TGFB3 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 17은 NRG1의 감축된 버전이다:

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도 1. 매트릭스 농도의 최적화 및 배지 방식들의 비교. a, 마트리겔(Matrigel)^® (코닝(Corning)^®) 또는 쿨트렉스(Cultrex)^® (트레비겐(Trevigen))의 희석물 상에서의 hiPSC의 상대적 성장, 쿨트렉스^®는 젤트레스(Geltrex)^® (기브코(Gibco)™)와 등가물임.
도 2a-f. 단-기 성장 검정을 사용한 기본 인간 다능성 줄기 세포 배지 성분의 최적화. 결과를 짙은 회색 막대로 나타낸 최초 배지 성분 농도에 대하여 정규화하고, 단-기 6-일 성장 검정을 사용하여 최적화를 완료하였다. 최적화된 성분 농도는 대각선 해시(hash)로 나타내었다. (a) 상대적 성장에 대한 재조합 인간 IGF1 LR3 (n = 3) 및 재조합 인간 인슐린 (n = 18-22) 농도의 효과 비교. (b) L-아스코르브산 2-포스페이트 (n = 19-27). (c) 트랜스페린 (n = 2-20). (d) 소듐 셀레나이트 (n = 3-20). (e) FGF2-K128N (n = 3-12). (f) TGFb1 (n = 20-25). n = 전체 실험 반복수, 비쌍형성 스투던트 T-검정, ^*P ≤ 0.05, ^**P ≤ 0.01, ^***P ≤ 0.005, ^****p ≤ 0.0001, n.s. = 유의성 없음.
도 3a-h. 단-기 검정에서의 추가적인 인간 다능성 줄기 세포 배지 성분의 최적화. E8 배지 성분 농도를 짙은 회색 막대로 나타내었으며, 단순한 6-일 성장 검정을 사용하여 최적화를 완료하였다. 최적화된 성분 농도는 대각선 해시로 나타내었다. (a) 계대 후 처음 24시간 동안의 Y27632 (10 μM)를 사용한 ROCK1/2 억제제의 존재 및 부재 하에 클론 성장을 유지하는 재조합 트랜스페린 (10 μg ml^- ¹)의 적합성 비교 (n = 3). (b) 상대적 성장에 대한 계대 후 처음 24시간 동안만의 2종의 통상적인 ROCK1/2 억제제의 비교 (n > 5). (c) 상대적 성장에 대한 비-필수 아미노산 (NEAA) 및 화학적으로 정의되는 지질 첨가의 효과 비교 (n = 5). (d) 무-지방산 알부민 (n = 4). (e) 소듐 비카르보네이트 (n = 5). (f) pH (n = 9). (g) 오스몰농도 (n = 8). (h) FGF2-G3 (n = 3). n = 전체 실험 반복수, 비쌍형성 스투던트 T-검정, ^*P ≤ 0.05, ^**P ≤ 0.01, ^***P ≤ 0.005, ^****p ≤ 0.0001, n.s. = 유의성 없음.
도 4a-b. 재조합 성장 인자를 생성시키는 데에 사용된 플라스미드. (a) 정제를 위한 이중 6×His 부위 및 트롬빈 절단 부위를 나타내는 FGF2-K128N. (b) 변형된 FGF2 플라스미드를 생성시키는 데에 사용된 아미노산 서열.
도 5a-p. 장-기 성장 검정을 사용한 B8 배지 성분의 최적화. 결과를 짙은 회색 막대로 나타낸 최초 배지 성분 농도에 대하여 정규화하고, 장-기 5-계대 4-일 성장 검정을 사용하여 최적화를 완료하였다. (a) 상대적 성장에 대한 재조합 인간 인슐린 농도의 효과 비교 (n = 10). (b) L-아스코르브산 2-포스페이트 (n = 10). (c) 재조합 트랜스페린 (n = 10). (d) 소듐 셀레나이트 (n = 5). (e) 자체 제조 FGF2-G3 (n = 6). (g) NODAL (n = 5). (h 액티빈 A (n = 5). (i) 시중의 TGFbl과 비교한 9 계대 후 자체 제조 TGFb3 (n = 9). (j) 40 ng ml^-1 FGF2-G3에의 NRG1의 첨가 (n > 5). (k) 최종 B8 방식. n = 전체 실험 반복수, 비쌍형성 스투던트 T-검정, ^*P ≤ 0.05, ^**P ≤ 0.01, ^***P ≤ 0.005, ^****p ≤ 0.0001, n.s. = 유의성 없음.
도 6. 성장 인자 플라스미드를 생성시키는 데에 사용된 DNA 서열. FGF2-G3 및 TGFb3가 N-말단 6×His 태그/융합 단백질의 절단에 대한 필요성 없이 기능하는 것으로 나타나며, 그에 따라 추가적인 6×His 태그를 판독하여 정제 효율을 향상시키기 위해 C-말단 정지 코돈도 제거되었음에 유의한다.
도 7a-e. hiPSC 생성 및 배양에 적합한 것으로서의 B8의 정성. (a) 유동 세포측정법에 의해 평가된 B8에서 유래하는 29종 hiPSC 세포주들에서의 다능성 마커들의 유지 입증. (b) 다양한 B8-유래 hiPSC 세포주들에서의 다능성 마커들의 발현. (c) 혈액으로부터의 B8에서 유래하는 4종 hiPSC 세포주들의 G-밴딩 핵형 분석의 예. (d) E8과 비교한 B8에서의 낮은 시딩 밀도에서의 hiPSC 성장 (n = 8). (e) 자체 생성 FGF2-G3을 시중의 FGF2 (페프로테크(Peprotech))와 비교한, 37 ℃에서 2 또는 7일 동안 배지를 저장한 후의 포스포-ERK의 자극 평가. hiPSC를 24시간 동안 FGF2 고갈시킨 다음, 웨스턴 블럿을 위한 수집 전에 1시간 동안 지시된 배지를 사용하여 처리하였다. 총 ERK를 적재 대조로 사용하였다.
도 8a-h. 단층 분화와 여전히 상용성인 주말이-자유로운 계대 일정의 최적화. (a) 최적 4-일 배지 교체 일정의 확립. (b) 배지 교체 일정이 있는 7일 계대. (c) 7일 계대 단독 일정. (d) 0.5 mg ml^-1 알부민의 첨가가 있거나 없는 2종의 주말이-자유로운 7-일 계대 일정을 사용할 때의 성장 비교 (n = 2). (e) 7-일 계대 및 배지 교체 일정에 대한 가변 수준의 알부민 (mg ml^-1) 첨가의 비교 (n = 4). (f) 7-일 계대 및 배지 교체 일정을 사용할 때의 심장 분화 효율 (n = 5). (g) 7-일 계대 및 배지 교체 일정을 사용할 때의 내피 분화 효율 (n = 6). (h) (g) 7-일 계대 및 배지 교체 일정을 사용할 때의 내피 분화 효율 (n = 5).

본원에서 입증하는 것은 낮은 시딩 밀도 조건하에서 높은 성장 속도를 유지하며 최소한의 배지 교체를 필요로 하도록, 그리고 분화 재현성을 유지하면서도 낮은 비용으로 철저하게 최적화된, 신규한 배지 방식 (B8)이다. 이와 같은 방식은 >100 계대 동안 hiPSC 생성 및 배양 둘 다를 유지할 수 있다. 배지 100 리터를 제조하는 데에 적합한 B8 보충 분취물의 생성은 기본적인 장비가 구비된 어떠한 연구 실험실에서도 용이하며, 완성품 병의 배지의 비용은 리터 당 ~$12 USD이다.

단순한 3개 단계에서의 재조합 단백질 생성을 위한 상세한 지침을 포함한 전체 프로토콜이 제공된다. 상기 프로토콜은 하기 3종 이. 콜리 (E. coli )-발현 코돈-최적화 재조합 단백질의 실험실-내 생성에 의해 가능하게 된다: 향상된 열안정성을 가지는 조작된 형태의 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2) (FGF2-G3); 형질전환 성장 인자 β3 (TGFβ3) - 이. 콜리에서 발현될 수 있는 더 강력한 TGFβ; 및 EGF-유사 도메인을 함유하는 뉴레귤린(neuregulin) 1 (NRG1)의 유도체. 단백질 제조를 위한 모든 플라스미드는 애드진(Addgene) 사를 통하여 가용하다. 이러한 프로토콜의 상업화에 의해, 본 발명자들은 hiPSC를 사용하여 달성가능한 것을 실질적으로 증가시키는 것이 가능하다고 여기는데, 다능성 세포 배양 비용의 거의 제거 및 세포 배양과 연관되는 노동의 최소화에 기인한다.

하기 5종의 성분만이 hiPSC 배양에 필수적이었다: 인슐린, 소듐 셀레나이트, FGF2, DMEM/F12 (FIG 2), 그리고 중요한 것으로서 다섯 번째 성분 TGFβ1은 장기 검정에서만 드러났음 (도 2 및 5). 다른 3종의 성분인 아스코르브산 2-포스페이트, 트랜스페린 및 NRG1은 hiPSC 성장에 있어서 생략가능하기는 하지만, 그의 제거가 감소된 성장 속도를 초래한다.

수많은 놀라운 것들이 배양 배지의 개발로 이어졌다. 예를 들어, 알부민의 첨가는 그것이 많은 학술 및 상업용 배지 방식의 공통 성분임에도 불구하고 긍정적이거나 부정적인 효과가 없었다 (도 3d). 액티빈 A는 다양한 다른 시중에서 가용한 방식에서의 그의 포함에도 불구하고 TGFβ1을 포함하는 것 또는 포함하지 않는 것에서 적합하지 않았다 (도 5). 본 발명자들은 매우 낮은 투여량에서 액티빈 A가 TGFβ1에 비해 더 적은 정도이기는 하지만 성장을 유지할 수 있다는 것을 증명하였다.

일부 시중 배지의 주요 문제는 주말이-자유로운 일정이 실현가능하기는 하지만 hiPSC의 성장이 상당히 더 느려서, 저-밀도 콜로니로서 세포를 성장시킬 것이 권장된다는 것이다. 대부분의 계대에서 매우 흔하게 된 바와 같이, 이러한 저-밀도 콜로니는 이후의 단층 분화 프로토콜과 상용성이 아니다. 구체적으로 빠른 단층 성장을 위한 B8 배양 배지의 최적화는 열안정성 FGF2-G3의 혼입과 함께 통상적인 분화 프로토콜과의 상용성을 유지하면서도 많은 이러한 문제들을 극복한다.

성장 인자 FGF2 및 TGFβ1은 총 배지 비용 중 80 % 초과에 상당하였다. 플라스미드 및 필요할 경우 티오레독신 융합 단백질 생성의 최적화는 그렇지 않았을 경우 필요하였을 포함체 및 결과적인 재폴딩 과정과 연관되어 있는 복잡한 것들 중 많은 것을 제거한다. 2일이 걸리며 기본적인 실험실 기술을 필요로 하는 통상적인 1 리터 이. 콜리 배양물은 보통 B8 800 리터에 충분한 80 mg의 FGF2-G3을 제공하게 된다. 마찬가지로, TGFβ3 또는 NRG1의 500 ml 배양물은 통상적으로 수년의 작업에 충분한 단백질 (B8 배지 ~800,000 리터)을 제공하게 된다. 또한, 이들 성분의 농도는 성장 속도에 실질적인 영향을 주지 않으면서도 75 %까지 감소될 수 있는데 (모두 5 μg ml^-1에서) (도 5), 이러한 절약을 기반으로, 저-비용으로 최적화된 B8의 제제를 개발하였다 (도 8).

구체적으로, 세포 배지는 인간 유도 다능성 줄기 세포의 성장을 위하여 세포 배양 기본 배지; 섬유모세포 성장 인자 2; 인슐린; 및 셀레늄의 공급원을 포함한다. 세포 배양 배지가 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1), 액티빈 A 또는 알부민을 함유할 필요는 없다. 즉, 세포 배양 배지는 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1), 액티빈 A 또는 알부민을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 세포 배양 배지는 미량의 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1), 액티빈 A 또는 알부민을 함유할 수도 있다. 세포 배양 배지는 측정가능한 양의 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1), 액티빈 A 또는 알부민을 함유할 수 있지만, 세포 성장, 분화 또는 건강에 영향을 주기에 충분한 농도는 아니다.

일부 측면에서는, 인슐린 또는 IGF1이 배양 배지에 사용될 수 있다. 재조합 형태의 인슐린, IGF1, 기능에 대하여 어떠한 손해도 없이 생성시키는 데에 비용 효과적인 임의의 유도체 또는 변이체가 인슐린 또는 IGF1을 대체할 수도 있다. 마찬가지로, 셀레늄의 공급원은 셀레늄 염, L-셀레노메티오닌, 셀레노시스테인, 메틸셀레노시스테인 또는 유사 화합물을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 세포 배양 배지는 TGFβ3, NRG1; 트랜스페린, 아스코르브산 또는 이들의 조합을 함유할 수도 있다. 세포 배양 배지는 티아조비빈을 함유할 수도 있다. 세포 배양 배지는 7.1의 pH 또는 310 mOsm/l의 오스몰농도를 특징으로 할 수 있다. 세포 배양 배지는 2438 μg/ml 양의 소듐 비카르보네이트를 특징으로 할 수도 있다.

일부 측면에서, 세포 배양 기본 배지는 DMEM/F12이다. 일부 측면에서, FGF2는 서열식별번호: 4, 5 또는 15, 또는 이들의 혼합 중 어느 하나로 정의되는 재조합 단백질이다. 일부 측면에서, FGF2는 재조합 단백질 FGF2-G3 (서열식별번호: 15)이다. 일부 측면에서, 셀레나이트 염은 소듐 셀레나이트이다. 일부 측면에서, TGFβ3는 서열식별번호: 16의 재조합 단백질이며, NRG1은 서열식별번호: 17의 재조합 단백질이다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 하기를 포함한다: DMEM/F12 배양 배지 중에 배합된 40 ng/ml의 FGF2-G3, 20 μg/ml의 인슐린, 20 ng/ml의 소듐 셀레나이트. 대안으로서, 세포 배양 배지는 DMEM/F12 배양 배지 중에 배합된 40 ng/ml의 FGF2-G3 (서열식별번호: 15), 20 μg/ml의 인슐린, 20 ng/ml의 소듐 셀레나이트, 20 μg/ml의 트랜스페린, 0.1 ng/ml의 TGFβ3 (서열식별번호: 16), 0.1 ng/ml의 NRG1 (서열식별번호: 17), 200 μg/ml의 아스코르브산 2-포스페이트, 2438 μg/ml의 소듐 비카르보네이트를 포함할 수 있다.

역시 본원에서 제공되는 것은 세포 배양 배지의 제조를 위한 키트이며, 상기 키트는 하기를 포함한다: FGF2-G3, TGFβ3 및 NRG1을 코딩하는 플라스미드; 및 FGF2-G3, TGFβ3 및 NRG1 단백질의 제조, 및 세포 배양 배지의 제조를 위한 지침. 상기 키트는 추가로 배양 배지, 소듐 셀레나이트, 인슐린, 트랜스페린, 아스코르브산 2-포스페이트, 소듐 비카르보네이트 또는 티아조비빈을 포함할 수 있다.

역시 본원에서 제공되는 것은 배양물 중에서의 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hiPSC)의 성장 및 패싱(passing) 방법이며, 상기 방법은 하기를 포함한다: DMEM/F12 배양 배지 중에 배합된 FGF2-G3 (서열식별번호: 15), 인슐린, 소듐 셀레나이트, 트랜스페린, TGFβ3 (서열식별번호: 16), NRG1(서열식별번호: 17), 아스코르브산 2-포스페이트, 소듐 비카르보네이트를 포함하는 세포 배양 배지를 수득하는 것; 매트릭스 코팅된 플레이트를 제조하는 것; 0일차에, hiPSC를 매트릭스에 첨가하는 것; 1일차에, 세포 배양 배지를 교체하는 것; 3.5일 패싱 또는 7-일 세포 성장 주기 중 적어도 1일은 세포 배양 배지의 교체를 필요로 하지 않을 것이라는 전제하에, 3.5일차에 세포를 패싱하는 것 또는 7 연속일 동안 세포를 성장시키는 것.

기본 배지

본원에서 기술되는 배양 배지는 배양 배지 베이스로서 DMEM/F12의 사용을 제안한다. 그러나, 임의의 적절한 배양 배지 베이스가 본원에서 기술되는 바와 같은 인슐린, 아스코르브산, 트랜스페린, 셀레나이트, FGF2, TGFβ 및 NRG1과 조합될 수 있다. 실제로, 문헌 [Chen et al.]은 DMEM/F12와 비교적 단순한 MEMα 사이에서 유사한 결과를 보였다. 기본으로 정의되어 있는 임의의 다른 배양 배지들도 본원에서 기술되는 바와 같은 인슐린, 아스코르브산, 트랜스페린, 셀레나이트, FGF2, TGFβ 및 NRG1과 조합으로 사용될 수 있다.

선행 기술 배양 배지의 결함

인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 데에 필요한 배지 조건들은 지난 15년에 걸쳐 꾸준히 발전되어 왔었는데, 의미있는 돌파구는 고농도 FGF2에 대한 필요성의 발견 (문헌 [Xu et al., 2005]), TGFβ1의 사용 (문헌 [Amit et al., 2004]), 그리고 21종의 성분을 함유하는 TeSR 방식을 사용한 녹아웃(knockout) 혈청 대체 (KSR)의 배제 (문헌 [Ludwig and Thomson, 2007]; [Ludwig et al., 2006a]; [Ludwig et al., 2006b]) 후 이어진 8종의 주요 성분만으로 이루어진 첫 번째 강력한 화학적으로 정의된 방식인 E8 (문헌 [Beers et al., 2012]; [Chen et al., 2011])에서 비롯되었다. 하기를 포함하는 수많은 대안적인 비-화학적으로 정의되는 다능성 제제들이 기술되어 있다: CDM-BSA (문헌 [Hannan et al., 2013]; [Vallier et al., 2005]; [Vallier et al., 2009]), DC-HAIF (문헌 [Singh et al., 2012]; [Wang et al., 2007]), hESF9T (문헌 [Furue et al., 2008]; [Yamasaki et al., 2014]), FTDA (문헌 [Breckwoldt et al., 2017]; [Frank et al., 2012]; [Piccini et al., 2015]) 및 iDEAL (문헌 [Marinho et al., 2015]) (도 S1A).

가용한 제제들 각각은 하기 3종의 주요 신호전달 성분들을 핵심으로 하여 이루어진다: 1) INSR 및 IGF1R에 결합하여 PI3K/AKT 경로에 신호를 전달함으로써 생존 및 성장을 촉진하는 인슐린 또는 IGF1; 2) 각각 FGFR1/FGFR4 또는 ERBB3/ERBB4에 결합하여 PI3K/AKT/mTOR 및 MAPK/ERK 경로를 활성화하는 FGF2 및/또는 NRG1; 및 3) TGFBR1/2 및/또는 ACVR2A/2B/1B/1C에 결합하여 TGFβ 신호전달 경로를 활성화하는 TGFβ1, NODAL 또는 액티빈 A. NODAL은 보통 시험관 내에서의 고농도 요건을 초래하는 (문헌 [Chen et al., 2011]) 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC)에서의 NODAL 길항제 LEFTY1/2의 발현 (문헌 [Besser, 2004]; [Sato et al., 2003])으로 인하여, 다능성 배지 제제에서는 덜 사용된다. 또한, 소형 분자들을 이용하여 hPSC 배양물 중 일부 또는 전체 성장 인자를 대체하는 수많은 무-성장 인자 방식들이 기술되어 있지만 (문헌 [Burton et al., 2010]; [Desbordes et al., 2008]; [Kumagai et al., 2013]; [Tsutsui et al., 2011]), 이들이 성공적으로 통상적인 사용으로 이어진 바는 없다. 최근에는, 크게 감소된 증식 및 콜로니 성장은 물론 성장에 있어서의 증가된 세포주간 가변성이 있기는 하지만, 하기의 억제제: GSK3B (1-아자켄파울론), DYRKl (ID-8) 및 칼시뉴린/NFAT (타크롤리무스/FK506)를 조합하는 무-성장인자 방식인 AKIT가 입증되었다 (문헌 [Yasuda et al., 2018]). 마지막으로, 15종이 넘는 시중의 다능성 배지들이 가용하기도 한데, 이들은 방식이 독자적인 것으로, 연구자들에게 개시되어 있지 않다. 이들 배지는 대부분의 hiPSC 실험실에서 주요 비용에 상당함으로써, 연구 노력을 상당히 제한하고 있다. 이러한 배지 방식들 중 일부는 예컨대 그렇지 않을 경우 37 ℃에서 빠르게 분해될 FGF2를 헤파린 술페이트를 사용하여 안정화하며 (문헌 [Chen et al., 2012]; [Furue et al., 2008]) 다면성 항산화제로 작용하는 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함시키는 것에 의해, 매일 배지 교체가 없거나 '주말이-자유로우면서도' hiPSC 성장을 유지한다는 것을 시사하고 있다.

[ 실시예 ]

하기에서는 실시예의 형태로 특정 실시양태들을 기술한다. 실시양태들이 상당히 상세하게 기술되기는 하지만, 그와 같은 세부사항 또는 임의의 특정 실시양태로 첨부되는 청구범위의 영역을 한정하거나 임의의 방식으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 실시예 전체에 걸쳐, 하기 실험 절차를 사용한다.

실험 절차

인간 유도 다능성 세포 배양

모든 다능성 및 재프로그래밍 세포 배양물은 5 % CO₂ 및 5 % O₂를 사용하여 헤라셀(Heracell)™ VIOS 160i 직열 가습 인큐베이터 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)™)에서 37 ℃로 유지하였다. 분화 배양물은 5 % CO₂ 및 주변 (~21 %) O₂로 유지하였다. 모든 배양물 (다능성 및 분화)은 표면적 9.6 cm² 당 배지 2 ml 또는 등가량으로 유지하였다. 모든 배지는 4 ℃에서 사용하였으며, FGF2의 열안정성 우려로 인하여 (문헌 [Chen et al., 2012]) 세포에 첨가하기 전에는 37 ℃로 가온하지 않았다. 본 발명자들은 저온 배지를 사용하는 것에서 세포 성장에 대한 검출가능한 효과를 발견하지 못하였다. 모든 배양물은 일상적으로 마이코알러트(MycoAlert)™ 플러스(PLUS) 키트 (론자(Lonza)) 및 384-웰 바리오스칸(Varioskan)™ 럭스(LUX) (써모 사이언티픽™) 플레이트 판독기를 사용하여 마이코플라스마에 대해 시험하였다. E8 배지는 기존에 기술되어 있는 바와 같이 (문헌 [Burridge et al., 2015]; [Chen et al., 2011]) 자체적으로 제조하였으며, DMEM/F12 (코닝^®, 10-092-CM), 20 μg ml^-1의 이. 콜리-유래 재조합 인간 인슐린 (기브코™, A11382IJ), 64 μg ml^-1의 L-아스코르브산 2-포스페이트 트리소듐 염 (와코(Wako), 321-44823), 10 μg ml^-1의 오리자 사티바 ( Oryza sativa)-유래 재조합 인간 트랜스페린 (옵티페린(Optiferrin), 인비트리아(InVitria), 777TRF029-10G,), 14 ng ml^-1의 소듐 셀레나이트 (시그마(Sigma), S5261), 100 ng ml^-1의 재조합 인간 FGF2-K128N (자체적으로 제조, 하기 참조), 2 ng ml^-1의 재조합 인간 TGFβ1 (112개 아미노산, HEK293-유래, 페프로테크, 100-21)로 이루어졌다. 세포는 일상적으로는 1:800 희석된 성장 인자 감축 마트리겔^® 상의 E8 배지에서 유지하였다 (하기 참조). 계대 후 처음 24시간 동안, 10 μM Y27632 디히드로클로라이드 (LC 랩스(Labs), Y-5301)를 E8에 보충하고, 이후 E8Y로 지칭하여다. 표준 배양용으로는, ~70-80 %의 전면성장을 달성한 후 DPBS (Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 없음, 코닝^®) 중 0.5 mM EDTA (인비트로겐 울트라퓨어(Invitrogen UltraPure))를 사용하여 4일마다 1:20의 비로 세포를 계대시켰다. 세포주는 계대 20 내지 100 사이에서 사용하였다. 시험된 다른 배지 성분들은 하기였다: 인간 긴 R3 IGF1 (시그마, 91590C), 티아조비빈 (LC 랩스, T-9753), 재조합 인간 TGFβ3 (셀 가이던스 시스템즈(Cell Guidance Systems), GFH109), 소듐 비카르보네이트 (시그마), NEAA (기브코™), CD 지질 (기브코™), 무-지방산 알부민 (진데포(GenDEPOT), A0100). pH는 10 N HCl 또는 1 N NaOH (둘 다 시그마)를 사용하여 조정하였으며, 세븐컴팩트(SevenCompact)™ pH 측정기 (메틀러톨레도(MettlerToledo))를 사용하여 측정하였다. 오스몰농도는 소듐 클로라이드 (시그마) 또는 세포 배양수 (코닝^®)를 사용하여 조정하였으며, 오스모미터(osmometer) (어드밴스드 인스트루먼츠(Advanced Instruments))를 사용하여 측정하였다.

마트리겔^® 최적화

본 발명자들의 전체적인 표준 조건은 6-웰 플레이트의 웰 당 DMEM (코닝^®, 10-017-CV) 2 ml에 희석된 1:800 감축 성장 인자 마트리겔^® (코닝^®, 354230) 2 ml 또는 등가량이었다. 역시 시험된 것은 젤트렉스^® (기브코™) 및 쿨트렉스^® (트레비겐)였다. 플레이트를 제조하고, 1개월 이하 동안 37 ℃로 인큐베이터에서 유지하였다.

FGF2-K128N 생성

K128N 치환 (볼드체/밑줄)이 있는 전체 길이 (154개 아미노산) FGF2 서열 (서열식별번호: 14) AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVAL K RT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS를 서열 개시 (5')에서의 BamHI 부위 및 말단 (3')에서의 EcoRI 부위의 첨가에 의해 이. 콜리에 대하여 코돈 최적화하였다. 이와 같은 서열은 바이오엑스피(BioXp) 3200 (신서틱 제노믹스(Synthetic Genomics))에서 합성하였다. 다음에, BamHI 및 EcoRI (안자(Anza), 인비트로겐)을 사용하여 삽입물을 분해하고, T4 DNA 리가제 (안자)를 사용하여 pET-28a 발현 벡터 (노바겐(Novagen)/밀리포어시그마(MilliporeSigma))에 라이게이션시킨 후, 원 샷(One Shot)™ BL21 스타(Star)™ (DE3) 화학 적격 이 . 콜리 (인비트로겐)로 클로닝하였다. 이. 콜리를 25 % 글리세롤 (울트라퓨어, 인비트로겐)에서 -80 ℃로 저장하였다. 박테리아 튜브 (코닝^® 팔콘(Falcon))에 50 μg ml^-1 카나마이신 술페이트 (피셔 바이오리에이전츠(Fisher BioReagents))가 보충된 테리픽 브로스(Terrific Broth) (피셔 바이오리에이전츠) 10 ml를 접종하여 개시 배양물을 제조하고, 인노바(Innova)^®-44 인큐베이터-진탕기 (뉴 브룬스위크(New Brunswick)™)에서 37 ℃ (NRG1용) 또는 30 ℃ (FGF2 또는 TGFβ3용)에 220 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 단백질 발현은 2800 ml 배플구비 진탕기 플라스크 (BBV2800, 피셔브랜드(Fisherbrand)™)를 사용하여 하기와 같이 수행하였다: 50 μg/ml 카나마이신 술페이트가 보충된 매직미디어(MagicMedia)™ (K6815, 인비트로겐™) 500 ml에 전체 10 ml의 개시 배양물을 첨가하고, 37 ℃ (NRG1의 경우) 또는 30 ℃ (FGF2 또는 TGFβ3의 경우)에서 24시간 동안 상기에서와 같이 인큐베이션하였다. 배양물을 2×250 ml 원심분리 병 (날진(Nalgene)^®, 3120-0250)에 수확하고, 옵티마(Optimia)™ XPN-100 초원심분리기 (베크만 쿨터(Beckman Coulter))에서 SW 32 Ti 로터를 사용하여 5,000×g의 4 ℃로 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 부어 제거하고, 펠렛을 칭량한 후, 하류 처리를 위하여 -80 ℃로 저장하였다. 세포 펠렛을 박테리아 세포 펠렛 그램 당 B-PER 완전 시약 5 ml를 사용하여 B-PER 용해 완충제 (써모 사이언티픽™, 78248)에 재현탁하였다. 약하게 흔들면서 RT에서 15분 동안 세포를 인큐베이션하였다. 다음에, 용해물을 함유하는 병을 초원심분리기에서 16,000×g에서 4 ℃로 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 세포 잔사를 폐기하였다. 3 ml의 히스푸르(HisPur)™ Ni-NTA 회전 정제 키트 (써모 사이언티픽™, 88229)를 사용하여 제조자의 권장사항에 따라 정제를 완료하였다. 수지 상에의 단백질 결합 효율을 향상시키기 위하여, 샘플을 4 ℃로 30분 동안 인큐베이션하였다. 10분마다 하나씩, 4개의 용리물을 수집하였다. 컬럼은 제조자의 재생 프로토콜에 따라 재사용하였다. 단백질 농도는 큐빗 3 형광측정기에서 퀀트-잇(Quant-iT)™ 큐빗(Qubit)^® 단백질 검정 키트 (인비트로겐, Q3321)를 사용하여 평가하였다. 6xHis 태그는 절단하지 않았는데, 그것이 FGF2 기능을 방해하지 않는 것으로 이전에 입증되었기 때문이다 (문헌 [Soleyman et al., 2016]). 표준 1 리터 배양물은 80 mg의 FGF2를 산출하였다.

FGF2-G3 생성

R31L, V52T, E54D, H59F, L92Y, S94I, C96N, S109E 및 T121P 치환 (볼드체)이 있는 154개 아미노산 서열 (서열식별번호: 15) AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GTRDKSDPFI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEEN NYNTYRSRKY PSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS를 이. 콜리에 대하여 코돈 최적화하고, 상기와 같이 생성시켰다. FGF1-4X를 유사하게 생성시켰다.

TGFβ3 생성

112개 아미노산 서열 (서열식별번호: 16) ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS를 이. 콜리에 대하여 코돈 최적화하고, 상기와 같이 생성시켜, pET-32a 발현 벡터에 라이게이션시키고, 원 샷™ BL21 스타™ (DE3)로 클로닝하였다. pET-32a의 사용은 포함체에서의 단백질 발현을 방지하는 티오레독신-TGFBβ3 융합 단백질의 생성을 초래한다. TGFBβ3가 활성이 되도록 하기 위하여 티오레독신을 절단할 필요는 없다. TGFβ1, TGFβ1m (C77S) 및 TGFβ3m (C77S)를 유사하게 생성시켰다.

NRG1 생성

EGF 도메인만을 함유하는 NRG1의 감축된 버전인 65개 아미노산 서열 (서열식별번호: 17) SHLVKCAEKE KTFCVNGGEC FMVKDLSNPS RYLCKCPNEF TGDRCQNYVM ASFYKHLGIE FMEAE를 이. 콜리에 대하여 코돈 최적화하고, 상기와 같이 생성시켜, pET-32a 발현 벡터에 라이게이션시키고, 원 샷™ BL21 스타™ (DE3)로 클로닝하였다. pET-32a의 사용은 포함체에서의 단백질 발현을 방지하는 티오레독신-NRG1 융합 단백질의 생성을 초래한다. 트롬빈 클린클리브(Thrombin CleanCleave)™ 키트 (밀리포어시그마)를 사용하여 티오레독신을 절단하는 것 후 이어지는 상청액을 유지하면서의 재정제에 대한 필요성이 있다는 것이 발견되었다.

배지 가변성 최적화 프로토콜

37 ℃에서 3분 동안 트라이플(TrypLE) (기브코™, 12604-013)을 사용하여 hiPSC 세포주 19-3을 해리시키고, 세포를 DMEM/F12에 재현탁한 후, 15 ml 원추형 튜브 (팔콘(Falcon))로 옮기고, 200×g로 3분 동안 (소르발(Sorvall) ST40) 원심분리하였다. 펠렛을 DMEM/F12에 재현탁하고, ml 당 1 × 10⁵개 세포로 희석하고, 처음 24시간 동안 2 μM 티아조비빈과 함께 시험될 배지 중 마트리겔^® (l:800)-코팅된 12-웰 플레이트 (그레이너(Greiner))에서 웰 당 10,000개의 세포를 플레이팅하였다. 배지를 매일 교체하면서, 세포를 6일 동안 성장시켰다. 이와 같이 정상에 비해 더 낮은 시딩 밀도를 사용하여 더 극한적인 조건하에서만 검출가능한 인자들의 발견을 가능하게 하고 그에 따라 제제에 대한 강건성에 대한 데이터를 제공한다.

웨스턴 블럿

150 mM NaCl, 20 mM 트리스(Tris) pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA 및 1 % 트리톤(Triton) X-100으로서 용해 완충제 모액을 제조하고, 4 ℃에서 저장하였다. 1× 프로테아제 억제제 (로체(Roche), 5892791001), 1× 포스파타제 억제제 칵테일 2 (P5726, 시그마), 1× 포스파타제 억제제 칵테일 3 (시그마, P0044), 2 mM PMSF (시그마, P7626) 및 1 % SDS 용액 (피셔 사이언티픽, BP2436200)의 최종 농도를 사용하여, 새로운 완전 용해 완충제를 제조하였다. FGF2가 없는 B8을 사용하여 24시간 동안 hiPSC를 고갈시킨 다음, 상응하는 FGF2를 함유하는 배지를 사용하여 1시간 동안 처리하였다. 다음에, 배지를 제거하고, DPBS를 사용하여 세포를 1회 세척하고, DPBS 중 0.5 mM EDTA를 사용하여 수확하고, 튜브로 옮겼다. 500×g에서의 3분 동안의 원심분리에 의해 샘플을 펠렛화하고, 상청액을 폐기하였다. 펠렛을 150 μl의 완전 용해 완충제에 재현탁하고, 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 4 ℃에서 10,000×g로 10분 동안의 원심분리에 의해 투명한 용해물을 수집하였다. 큐빗 단백질 검정 키트 (인비트로겐, Q33211) 및 큐빗 4 형광측정기를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 용해물은 사용 전에 -80 ℃로 저장하였다. 누페이지(NuPAGE)™ LDS 샘플 완충제 (인비트로겐, B0007) 및 누페이지™ 환원제 (인비트로겐, B0009)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 10 μg의 샘플을 제조하고, 볼트(Bolt) MES SDS 전개 완충제 (인비트로겐, B000202)를 사용하여 100 V로 1시간 동안 누페이지™ 10 % 비스-트리스 젤 (인비트로겐, NP0302BOX) 및 미니 젤 탱크 시스템 (인비트로겐, A25977)에서 전개하였다. 시블루 플러스(SeeBlue Plus)2 사전-염색 단백질 표준 (인비트로겐, LC5925)을 래더(ladder)로 사용하였다. 다음에, 미니 트랜스-블롯 셀 시스템(Mini Trans-Blot Cell system) (바이오-래드(Bio-Rad), 1703930)에서 240 mA로 1시간 30분 동안 PVDF 전달 멤브레인 (써모 사이언티픽™, 88518) 상으로 젤을 옮겼다. 1 % TBST (피셔 사이언티픽, BP2471-1, BP337-100) 중 5 % BSA (진데포, A0100)를 사용하여, 밤새 멤브레인을 블로킹하였다. 모든 일차 및 이차 항체들을 1 % TBST 중 5 % BSA로 희석하였다. 짧은 세정 후 이어지는 각각 5분 동안의 5회의 긴 세척으로 세척을 수행하였다. 일차 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 9101, 9102) 및 이차 항체 (92632211, LI-COR) 둘 다를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 오디쎄이(Odyssey) CLx (LI-COR)를 사용하여 블럿을 이미지화하였다. 리스토어(Restore)™ 플러스(PLUS) 웨스턴 블럿 탈거 완충제 (써모 사이언티픽™, 46430)를 사용하여 RT에서 15분 동안 블럿을 탈거하고, 1 % TBST를 사용하여 세정한 후, 5 % BSA를 사용하여 30분 동안 재블로킹하였다.

인간 유도 다능성 줄기 세포 유도

프로토콜은 노스웨스턴 대학교 연구 검토 위원회에 의해 승인되었다. 사전고지 서면 동의서에 따라, ~9 ml의 말초 혈액을 각 지원자로부터 채취하여 4 ℃에서 저장하고, 히스토패크(Histopaque)^®-1077 (시그마)이 충전되어 있는 류코세프(Leucosep) 튜브 (그레이너)로 샘플을 옮겼다. 10 ng ml^-1 IL3, 50 ng ml^-1 SCF (KITLG), 40 ng ml^-1 IGF1 (모두 페프로테크), 2 U ml^-1 EPO (칼바이오켐(Calbiochem)), 1 μM 덱사메타손 (시그마)이 보충된 (문헌 [Chou et al., 2015]) SFEM II (스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies)) 2 ml 중 24-웰 조직 배양-처리 플레이트 (그레이너)에서 1×10⁶개의 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC)를 성장시켰다. 2일마다 50 %의 배지를 교체하였다. 성장 12일 후, 제조자 권장사항의 5 % (1:20)로 희석된 사이토튠(CytoTune)™-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트 바이러스 입자 인자 (기브코™)가 보충된 (문헌 [Fujie et al., 2014]; [Fusaki et al., 2009]) 성장 인자가 있는 SFEM II 500 μL 중 24-웰 플레이트의 웰로 6×10⁴개의 세포를 옮겼다. 세포를 각각 MOI 5:5:3 (KOS:MYC:KLF4)의 hKOS (0.85×10⁸ CIU ml^-1), hMYC(0.85×10⁸ CIU ml^-1) 및 hKLF4 (0.82×10⁸ CIU ml^-1) 3.5 μL, 3.5 μl 및 2.2 μl로 처리하였다. 24시간 후 성장 인자가 있는 새로운 SFEM II 2 ml로의 원심분리 (300×g, 4분)에 의해 100 %의 배지를 교체하고, 1:800 마트리겔^®이 코팅된 6-웰 플레이트 (그레이너) 중 하나의 웰로 세포를 옮겼다. 2일마다 50 %의 배지를 조심스럽게 교체하였다. 형질도입 후 8일차에, 100 %의 배지를 B8 배지로 교체하였다. 배지를 매일 교체하였다. 17일차에, 개별 콜로니들을 마트리겔^®-코팅 12-웰 플레이트로 선발하였다 (웰 당 1개 콜로니).

다능성 세포 유동 세포측정법

트라이플™ 익스프레스(Express) (기브코™)를 사용하여 37 ℃에서 3분 동안 hiPSC를 해리시키고, 1×10⁶개의 세포를 유동 세포측정법 튜브 (팔콘, 352008)로 옮겼다. DPBS 중 0.5 % 무-지방산 알부민 중에서 1:20 마우스 IgG₃ SSEA4-488 클론 MC-813-70 (R&D 시스템즈(Systems), FAB 1435F, lot. YKM0409121) 및 1:20 마우스 IgM TRA-1-60-488 클론 TRA-1-60 (BD 바이오사이언시즈(Biosciences), 560173, lot. 5261629)을 사용하여 얼음상에서 30분 동안 세포를 염색한 다음, 세척하였다. 이소형 대조군인 마우스 IgG₃-488 클론 J606 (BD 바이오사이언시즈, 563636, lot. 7128849) 및 마우스 IgM-488 클론 G155-228 (BD 바이오사이언스, 562409, lot. 7128848)을 사용하여 게이팅(gating)을 확립하였다. 사이트엑스퍼트(CytExpert) 2.2 소프트웨어가 구비된 사이토플렉스(CytoFLEX) (베크만 쿨터)를 사용하여 모든 세포를 분석하였다.

면역형광 염색

0.5 mM EDTA를 사용하여 hiPSC를 해리시키고, B8 배지 중 마트리겔^®-처리 눈크 랩-테크(Nunc Lab-Tek) II 8-챔버 슬라이드 상에 3일 동안 플레이팅하였다 (처음 24시간 동안 B8T). 세포를 고정하고, 투과화한 후, PSC 4-마커(Marker) 면역세포화학 키트 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), A24881, Lot. 1610720)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 OCT4, SSEA4, SOX2, TRA-1-60에 대하여 염색하였다. 세포를 3회 세척하고, 프로롱(ProLong)™ 다이아몬드 안티페이드 마운턴트(Diamond Antifade Mountant)를 사용하여 DAPI (인비트로겐)를 탑재하였다. NIS-엘리먼츠(Elements) 4.4 어드밴스드(Advanced) 소프트웨어를 사용하는 Ti-E 역전 형광 현미경 (니콘 인스트루먼츠(Nikon Instruments)) 및 자일라(Zyla) sCMOS 카메라 (안도르(Andor))를 사용하여 슬라이드를 이미지화하였다.

군집 배가 수준 평가

하기 식에 따라 군집 배가 수준 (PDL)을 계산하였다:

PDL = 3.32[log₁₀(n/n₀)]

(식 중 n = 세포 수이며, n₀ = 시딩된 세포 수임).

심장 분화

약간의 변형이 있는 기존에 기술되어 있는 프로토콜 (문헌 [Burridge et al., 2015]; [Burridge et al., 2014])에 따라, 심장근육세포로의 분화를 수행하였다. 간단하게 말하자면, 상기와 같이 0.5 mM EDTA를 사용하여 hiPSC들을 1:20 비로 분할하고, B8 배지에서 4일 동안 ~75 % 전면성장에 도달하도록 성장시켰다. 분화 개시시에 (0일차), RPMI 1640 (코닝^®, 10-040-CM), 500 μg ml^-1 무-지방산 소 혈청 알부민 (진데포) 및 200 μg ml^-1 L-아스코르브산 2-포스페이트 (와코)로 이루어진 CDM3 (화학적으로 정의되는 배지, 3종 성분) (문헌 [Burridge et al., 2014])으로 B8 배지를 교체하였다. 처음 24시간 동안, 6 μM의 글리코겐 신타제 키나제 3-β 억제제 CHIR99021 (LC 랩스(Labs), C-6556)을 사용하여 CDM3 배지를 보충하였다. 1일차에는 배지를 CDM3로 교체하였으며, 2일차에는 2 μM의 Wnt 억제제 Wnt-C59 (바이오르빗(Biorbyt), orb181132)이 보충된 CDM3로 배지를 교체하였다. 다음에, 배지를 4일차에, 그리고 2일마다 CDM3로 교체하였다. 7일차부터, 수축 세포가 관찰되었다. 분화 14일차에, 37 ℃에서 20분 동안의 DPBS 후 이어지는 37 ℃에서 20분 동안의 DPBS에 희석된 1:200 리베라제(Liberase) TH (로체)를 사용하여 심장근육세포를 해리시키고, 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 100 μm 세포 여과기 (팔콘)를 통하여 여과하였다.

내피 분화

hiPSC를 대략 50-70 % 전면성장으로 성장시키고, 기존에 기술되어 있는 프로토콜 (문헌 [Patsch et al., 2015])의 적합화된 버전에 따라 분화시켰다. 분화 5일차에, 37 ℃에서 5분 동안의 아큐타제(Accutase)^® (기브코™)를 사용하여 내피 세포를 해리시키고, 300g에서 5분 동안 원심분리한 후, 분석하였다.

상피 분화

상기와 같이 0.5 mM EDTA를 사용하여 hiPSC들을 1:20 비로 분할하고, B8T 배지에서 1일 동안 분화 개시시에 ~15 % 전면성장에 도달하도록 성장시켰다. 기존의 기술되어 있는 프로토콜 (문헌 [Li et al., 2015]; [Qu et al., 2016])의 적합화된 버전에 따라 표면 외배엽 분화를 수행하였다. 분화 4일차에, 37 ℃에서 5분 동안의 아큐타제 (기브코™)를 사용하여 상피 세포를 해리시키고, 300g에서 5분 동안 원심분리한 후, 분석하였다.

분화 세포 유동 세포측정법

심장근육세포는 상기한 바와 같이 리베라제 TH를 사용하여 해리시키고, 유동 세포측정법 튜브로 옮기고, 4 % PFA (일렉트론 마이크로스코피 서비시즈(Electron Microscopy Services))를 사용하여 RT에서 15분 동안 고정한 다음, 0.1 % 트리톤 X-100 (피셔 바이오리에이전츠)을 사용하여 RT에서 15분 동안 투과화하고, DPBS로 1회 세척하고, 1:33 마우스 단일클론 IgG₁ TNNT2-647 클론 13-11 (BD 바이오사이언시즈, 565744, lot. 7248637)을 사용하여 RT에서 30분 동안 염색하고, 다시 세척하였다. 이소형 대조군인 마우스 IgG₁-647 클론 MOPC-21 (BD 바이오사이언시즈, 565571, lot. 8107668)을 사용하여 게이팅을 확립하였다. 내피 세포는 상기한 바와 같이 아큐타제^®를 사용하여 해리시키고, 유동 세포측정법 튜브로 옮기고, 1:100 마우스 IgG2a CD31-647 클론 M89D3 (BD 바이오사이언시즈, 558094, lot. 8145771)를 사용하여 얼음상에서 30분 동안 염색한 다음, DPBS로 1회 세척하였다. 이소형 대조군인 마우스 IgG₁-647 클론 MOPC-21 (BD 바이오사이언시즈, 565571, lot. 8107668)을 사용하여 게이팅을 확립하였다. 상피 세포는 상기한 바와 같이 아큐타제^®를 사용하여 해리시키고, 유동 세포측정법 튜브로 옮기고, 4 % PFA (일렉트론 마이크로스코피 서비시즈)를 사용하여 RT에서 10분 동안 고정한 다음, DPBS 중 0.1 % 사포닌 (시그마)을 사용하여 RT에서 15분 동안 투과화하였다. 세척 완충제 (5 % FBS, 0.1 % NaN₃, 0.1 % 사포닌을 포함하는 DPBS) 중에서 세포를 1회 세척하고, 1:200 마우스 IgG₁ KRT18-647 클론 DA-7 (바이오레전드(BioLegend), 628404, lot. B208126)을 사용하여 RT에서 30분 동안 염색한 다음, 세척 완충제로 2회 세척하였다. 이소형 대조군인 마우스 IgG₁-647 클론 MOPC-21 (BD 바이오사이언시즈, 565571, lot. 8107668)을 사용하여 게이팅을 확립하였다. 모든 세포를 사이트엑스퍼트 2.2 소프트웨어가 구비된 사이토플렉스 (베크만 쿨터)를 사용하여 분석하였다.

통계법

데이터는 엑셀(Excel) 또는 R에서 분석하고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 8에서 그래프화하였다. 상세한 통계 정보는 상응하는 도면 범례에 포함되어 있다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 비교는 P < 0.05 (^*), P < 0.01 (^**), P < 0.005 (^***) 및 P < 0.0001 (^****)으로 정의되는 유의성 있는 차이로 비쌍형성 2-측 스투던트 t-검정을 통하여 수행하였다. 샘플 크기를 사전결정하는 데에는 통계법을 사용하지 않았다. 실험은 무작위화되지 않은 것이었으며, 실험 및 결과 평가 동안 할당에 대하여 조사자들은 맹검이 아니었다.

실시예 1: 단-기 검정을 사용한 배지 성분의 최적화

첫 번째 단계로서, hiPSC가 성장되는 매트릭스의 농도를 확인하였다. 라미닌(laminin)-511 (문헌 [Rodin et al., 2010]), 라미닌-521 (문헌 [Rodin et al., 2014]), 비트로넥틴(vitronectin) (문헌 [Braam et al., 2008]) 및 신테막스(Synthemax)™-II (문헌 [Melkoumian et al., 2010])가 hiPSC 배양에 적합하기는 하지만 (문헌 [Burridge et al., 2014]), 아무것도 적절하게 비용-효과적이지는 않으며, 비트로넥틴 또는 신테막스-II의 경우에는 이후의 분화에도 적합하지 않다 (문헌 [Burridge et al., 2014]). 미정 생성물이기는 하지만 (문헌 [Hughes et al., 2010]), 마트리겔^®은 비용-효과적이며, 50 μg cm^-2에서 그것이 사용되는 실질적인 데이터를 가지는 통상적으로 사용되는 매트릭스이다 (문헌 [Ludwig et al., 2006a]). 2종의 유사한 시중 생성물인 마트리겔^® (코닝^®) 및 쿨트렉스^®/젤트렉스^® (트레비겐/기브코™)를 비교함으로써, 본 발명자들은 둘 다가 10 μg cm^-2 (1:1000 희석) 만큼 낮은 농도로 사용된다는 것을 발견하고 (도 1), 이후 모든 향후 실험에서 보존적 1:800 희석으로 사용하였다.

해리된 세포의 자동화된 세포 계수 (6-웰) 또는 소형 포맷 생존 검정 (즉 96-웰) 모두가 적합하게 강건하지 않은 것으로 결정된 후, 문헌 [Ludwig et al.] 및 [Chen et al.]에 의해 사용된 것에서 모델링되는 다능성 성장 검정을 확립하였다. 성장 검정은 하기와 같이 개괄될 수 있다:

이와 같은 검정 플랫폼 개발 동안, 본 발명자들은 상대적 성장과 관련한 정밀한 측정이 다능성 상태 측정기준 (예컨대 NANOG 발현)의 적합한 대용물이라는 것을 발견하였다. 세포가 자발적으로 분화하기 시작할 때, 예컨대 TGFβ1이 방식에서 생략될 경우, 결과적인 성장의 지체가 용이하게 검출될 수 있었다.

시중에서 가용한 세포 배양 배지의 각 성분을 성능 및 비용 효과성에 대하여 평가하였다. 상기 시중에서 가용한 세포 배양 배지는 하기를 포함한다:

6종 주요 hiPSC 배지 성분 (도 2a-f) 각각의 농도 범위를 평가하였다. 이와 같은 단계 동안, 본 발명자들은 인슐린이 필수적이며, 매우 높은 수준의 IGF1 LR3 (≥1 μg ml^- ¹)에 의해서만 대체될 수 있지만, 그것이 비용-효과적이지는 않다는 것을 확실히 하였다 (도 2a). 인슐린의 효과는 20 μg ml^-1까지 투여량-의존성이었다. 기존에 입증되어 있는 바와 같이 (문헌 [Prowse et al., 2010]) 아스코르브산 2-포스페이트는 필수적이지는 않았으나, 더 높은 수준 (≥200 μg ml^- ¹)이 성장을 향상시켰다 (도 2b). 주목할 것은 이와 같은 수준의 아스코르브산 2-포스페이트가 심장 분화 배지 CDM3에서 최적화되는 수준과 유사하다는 것이다 (문헌 [Burridge et al., 2014]). 트랜스페린 역시 배지 방식에 필수적이지는 않았으나, 투여량-의존성인 방식으로 성장을 향상시킴으로써, 비용-효율을 유지하면서도 20 μg ml^-1에서 최적의 성장을 나타내었다 (도 2c). 셀레늄의 공급원은 필수적인 것으로 나타나기는 하였지만, 2-200 ng ml^-1 사이의 소듐 셀레나이트 농도는 성장에 유의성 있게 영향을 주지 않았으며, ≥200 ng ml^-1에서는 소듐 셀레나이트가 독성이 되었다 (도 2d). FGF2-K128N은 ≥40 ng ml^-1에서 최적이었으며 (도 2e), 이와 같은 단순한 1 계대 성장 검정에서 TGFβ1은 ≥0.5 ng ml^-1이면 충분하였다 (도 2f).

실시예 2: 추가적인 배지 성분들의 최적화

이제 도 3을 참조하면, 실시예 1 단-기 검정에서의 추가적인 배지 성분들을 평가하였다. 도 3a는 계대 후 적어도 처음 24시간 동안의 ROCK1/2 억제제의 포함이 최적이라는 것을 시사한다.

처음 24시간 동안의 2 μM 티아조비빈의 첨가는 10 μM Y27632에 비해 상당히는 아니라 할지라도 약간 성장을 향상시켰는데, ~5× 더 비용-효과적인 선택이었다 (도 3b).

일부 최근의 hiPSC 성장 방식들은 높은 수준 (2×)의 비-필수 아미노산 (NEAA) 및/또는 낮은 수준 (0.1×)의 화학적으로 정의되는 지질의 첨가가 성장을 향상시킨다는 것을 시사하였다 (도 3c). 본 검정에서는, NEAA가 성장을 증대시키지 않았으며, 지질의 첨가는 최저 수준을 제외하고는 모두 억제성이었다 (도 3c).

통상적인 hPSC 배지 성분인 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용한 보충은 성장에 대하여 긍정적이거나 부정적인 효과를 가지지 않았으므로, 화학적으로 정의되는 방식을 유지하는 데에 배제되었다 (도 3d).

코닝^®의 DMEM/F12 기본 배지는 다른 제조자의 DMEM/F12에 비해 더 높은 수준의 소듐 비카르보네이트 (~29 mM 또는 2438 mg l^- ¹)를 함유한다. 20 mM의 추가적인 소듐 비카르보네이트를 사용한 14 mM의 소듐 비카르보네이트를 함유하는 기브코™ DMEM/F12의 보충이 최근 배지의 산증을 억제하는 것에 의해 hiPSC 성장 속도에 유리하다는 것이 입증된 바 있다 (문헌 [Liu et al., 2018]). 그러나, 도 3e에 따르면, 표준 29 mM의 소듐 비카르보네이트가 최적이었다.

성장에 대한 pH 및 오스몰농도의 효과도 평가하였다. pH 7.1 (도 3f) 및 310 mOsm l^-1의 오스몰농도 (도 3g)가 최고 성장 속도를 촉진한다는 것이 발견되었다. 본 발명자들의 모든 실험은 더 높은 수준의 소듐 비카르보네이트를 필요로 하는 일부 (문헌 [Ludwig et al., 2006b])에 의해 제안되는 고도의 N₂ 사용 또는 10 % CO₂로 인한 상당한 비용 증가가 없이 5 % O₂ 및 5 % CO₂로 최적화되었다.

FGF2

최초 연구에서는, 시중의 재조합 인간 FGF2를 제공하였다. 이와 같은 성분은 배지 비용의 >60 %를 차지하였다. 다음에는, 추가적인 FGF2 변이체들을 평가하였다. 수율을 향상시키기 위한 이. 콜리-최적화 코돈 용법을 가지며 열안정성을 향상시키기 위한 K128N 점 돌연변이를 가지는 (문헌 [Chen et al., 2012]) FGF2 서열을 정제 동안 절단되지 않은 이중 6×His 태그를 이용하여 재조합 단백질 생성 플라스미드 (pET-28a)에 삽입하였다 (도 4). 이어서, 본 발명자들은 하기 2종의 추가적인 열안정성 FGF2 변이체를 생성시켰다: FGF1-4X (문헌 [Chen et al., 2012]) 및 FGF2-G3 (문헌 [Dvorak et al., 2018]). 본 발명자들은 9개의 점-돌연변이가 있는 FGF2-G3이 FGF2-K128N보다 더 강력하다는 것을 발견하였으며, 이는 5 ng ml^-1에서의 100 ng ml^-1의 FGF2-K128N과 유사한 성장 속도에 대한 효과를 나타낸다 (도 3h).

실시예 3: 장-기 검정을 사용한 배지 성분의 최적화

본 발명자들의 최초 단-기 실험으로서 예비 최적화를 제공하였으나, 본 발명자들은 기존의 실험으로부터 TGFβ1의 제거와 같은 일부 변수가 단-기적으로 최소한의 효과를 가지며 장-기 실험에서는 검출가능한 부정적인 효과만을 가지게 된다는 것을 알았다. 이에 따라, 하기의 검정 프로토콜을 사용하여 장-기 검정의 효과성을 평가하였다:

각 실험은 개별적으로 적어도 5회 반복하였다. 이러한 실험들은 다시 인슐린 (20 μg ml^-1; 도 5a), 아스코르브산 2-포스페이트 (200 μg ml^-1; 도 5b), 트랜스페린 (20 μg ml^-1; 도 5c), 소듐 셀레나이트 (20 ng ml^-1; 도 5d) 및 FGF2-G3 (40 ng ml^-1 도 5e)의 농도를 확인해 주었다.

TGFβ1이 현재 가장 고가의 성분인 바 (총 비용의 ~20 %), 본 발명자들은 장-기 검정에서도 이것이 기존에 제안되어 있던 것 (0.1 ng ml^- ¹)에 비해 더 낮은 농도로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다 (도 5f). 본 발명자들은 NODAL과 같은 다른 액티빈/NODAL/TGFβ1 신호전달 공급원들은 비용상-엄청난 높은 수준 (100 ng ml^-1)으로 요구되며 (도 5g), 액티빈 A는 TGFβ1과 동일한 수준까지 성장을 유지하는 데에 적합하지 않다는 것을 발견하였다 (도 5h). TGFβ1과의 조합으로서의 액티빈 A는 성장에 대한 부정적인 효과도 가지고 있었다 (도 5i). TGFβ1은 2개 TGFB1 유전자 생성물의 단일이량체이며, 그에 따라 통상적으로 포유동물 세포에서는 재조합 단백질이 생성됨으로써 기초 연구 실험실에서 생성시키는 것을 복잡하게 한다. 이러한 포유동물 세포는 글리코실화, 인산화, 단백질분해 프로세싱, 그리고 이. 콜리에는 존재하지 않는 디술피드 결합의 형성과 같은 생물학적 활성에 중요한 번역-후 변형을 제공한다. 이와 같은 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 점 돌연변이로 인하여 이량체를 형성할 수 없는 TGFβ1의 버전 (TGFβ1m)을 생성시켰다. 이와 같은 단량체성 단백질은 TGFβ1에 비해 ~20-배 덜 강력할 것으로 예측되나, 이. 콜리에서 다량으로 용이하게 생성될 수 있다 (문헌 [Kim et al., 2015]). 본 발명자들의 최초 실험은 이. 콜리-최적화된 코돈 용법을 가지는 TGFB1 서열이 포함체에서 발현된다는 것을 입증하였다. 이를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 세포질에서의 발현을 가능하게 하는 티오레독신 융합 단백질을 생성하도록 설계된 단백질 생성 플라스미드 (pET-32a)에 서열을 삽입하였다. TGFβ3가 TGFβ1에 비해 더 강력하다는 것도 입증되어 있다 (문헌 [Huang et al., 2014]). 본 발명자들은 TGFβ1, TGFβ1m, TGFβ3 및 TGFβ3m을 비교함으로써, TGFβ3가 이. 콜리에서 생성될 수 있으며 0.1 ng ml^-1로 사용하기에 적합한 최고의 조합을 제공한다는 것을 발견하였으며 (도 5j-l), 그에 따라 최종 방식으로 선택되었다.

마지막으로, 본 발명자들이 연구한 2종의 hESC 배지 제제인 DC-HAIF 및 iDEAL은 FGF2 및 뉴레귤린 1 (NRG1) 둘 다를 함유한다. 본 발명자들은 시험된 모든 수준의 NRG1을 사용한 보충이 FGF2-G3 단독에 비해 >15 %까지 성장을 향상시키지만 (도 5m-n), NRG1은 FGF2의 부재하에서는 성장을 유지할 수 없다는 것을 발견하였다 (도 5o). 본 발명자들은 포함체로서의 생성을 방지하는 pET-32a를 사용하여 유사하게 재조합 NRG1 단백질을 생성시켰으며, 이후에 트롬빈을 사용하여 절단하여 활성 단백질을 형성시켰다 (도 5p 및 도 6).

이러한 장-기 검정 최적화로부터 유도된 본 발명의 한 가지 최종 B8 배지 제제는 하기이다:

실시예 4: hiPSC 생성에의 B8의 적합성 입증

hiPSC 세포주를 생성시키는 데에 있어서의 B9 배지의 적합성을 확인하였다. 본 발명자들은 확립되어 있는 프로토콜을 사용하나 B8을 사용하여, 26명의 환자로부터 hiPSC 세포주들을 생성시켰다. 모든 공여자로부터 세포주들을 성공적으로 생성시키고, SSEA4 및 TRA-1-60에 대한 유동 세포측정법 (도 7a), SSEA4, POU5F1, SOX2 및 TRA-1-60에 대한 면역형광 염색 (도 7b) 및 핵형 안정성 (도 7c)을 포함한 표준 다능성 검정을 통과시켰다. 이후 본 발명자들은 이와 같은 B8 방식을 시중에서 가용한 E8 방식과 비교하여, 통상적으로 사용되는 분할 비 전체에 걸쳐 B8과 성장이 유사하다는 것을 발견하였다 (도 7d). 시중의 FGF2와 달리, FGF2-G3과 같은 FGF2의 열안정성 변이체는 배지가 이전에 37 ℃에서 장기간 동안 저장된 후에도 (문헌 [Chen et al., 2012]; [Dvorak et al., 2018]) FGF-고갈된 세포에서 pERK를 유도할 수 있다는 것이 입증되었다. 본 발명의 FGF2-G3가 유사하게 수행한다는 것을 확인하기 위하여 본 발명자들은 대등한 검정을 수행함으로써, FGF2-G3가 37 ℃에서 7일 후 안정했던 반면, 시중의 FGF2는 37 ℃에서 2일 후 pERK를 자극할 수 없었다는 것을 확실하게 하였다. 스템플렉스(StemFlex)와 같은 통상적인 '주말이-자유로운' 배지 방식들은 알부민을 사용하는 것으로 복귀하였으며 어쩌면 헤파린을 함유하는데, 이들 둘 다는 화학적으로 정의되지 않는 것이어서, 본 발명자들은 본 검정에서 이들 성분의 기능도 평가하고, 모두 FGF2-G3의 안정성을 향상시킨다는 것을 발견하였다 (도 7e).

실시예 5: 주말이-자유로운 배양에의 B8의 적합성 입증

B8이 다양한 준-최적 조건에 걸쳐 hiPSC 성장을 유지한다는 이해를 바탕으로 (도 7d), 본 발명자들은 배지 교체일을 생략하는 데에 있어서의 이와 같은 방식의 적합성을 확립하였다. 본 발명자들은 티아조비빈의 존재 및 부재 하에 둘 다에서 배지 교체일의 매트릭스를 확립하고 (도 8a), 매일 B8 배지 교체 (상단 행)가 놀랍게도 성장 속도에 대하여 최소로 적합하다는 것을 증명하였다. 배지 교체가 없는 B8T 처리가 최소로 효과적인 티아조비빈-함유 프로토콜이었던 반면 (저부 행), B8T 후 이어지는 B8 (짙은 회색 막대)은 성장 속도와 티아조비빈에의 연장된 노출 사이의 적합한 타협이었다. 다양한 배지 교체-생략 일정의 영향에 대한 지식을 바탕으로, 본 발명자들은 3.5일마다 세포를 계대시키는 것으로 이루어진 7-일 일정을 고안하였는데, 현 hiPSC 배양 프로토콜의 주요 단점인 주말 배지 교체의 생략을 가능하게 한다 (도 8b 및 8c). 본 발명자들의 데이터는 처음 24시간 후의 배지 교체를 동반하는 3.5-일 일정이 장-기적으로 적합하였던 반면, 배지 교체가 없는 것 (즉 계대 단독)은 적합하지 않다는 것을 입증하였다 (도 8d). 또한, 0.5 mg ml^-1의 알부민을 사용한 배지의 보충은 이와 같은 결함을 해소하지 못하였다 (도 8d). 다양한 투여량의 알부민 또는 헤파린을 사용한 추가적인 실험은 이들이 B8에서 부가적인 효과를 가지지 못한다는 것을 추가로 확인해 주었다 (도 8e). 배지 교체를 생략하는 것의 주요 단점 중 한 가지는 분화 효율 및 재현성이 감소된다는 것이다. 본 발명자들은 본 발명자들의 기존 심장 (문헌 [Burridge et al., 2014]), 내피 (문헌 [Patsch et al., 2015]) 및 상피 분화 (문헌 [Li et al., 2015]; [Qu et al., 2016]) 프로토콜을 사용하여 B8이 매일 배지 교체 또는 우리의 7-일 프로토콜 중 어느 하나와 유사하게 높은 수준까지 분화를 유지한다는 것을 입증하였다 (도 8f 및 8g).

장기간 시간 동안의 임의 배지에서의 세포 배양이 그러하듯이, 다른 인자들이 고려되어야 한다. 본 발명자들은 예를 들면, 배지 중 L-글루타민은 37 ℃에서 불안정하다는 것, 그리고 4일에 걸쳐 농도가 약 3분의 1까지 감소된다는 것을 알고 있다. 본 발명자들은 세포가 암모니아를 생성시키면서 배지의 pH를 감소시키기는 하지만 이는 부분적으로 HEPES 및 소듐 비카르보네이트에 의해 완충된다는 것도 알고 있다. 마지막으로, hiPSC는 분화를 유도할 수 있는 자가분비 또는 주변분비 인자들을 배지로 방출하는데, 시간 경과에 따른 이들 인자의 증가는 영양소의 사용 및 대사 폐기물의 생성과 분리될 수 없다.

"약"은 주어지는 값이 원하는 결과에 영향을 주지 않으면서 종말점을 "약간 초과하거나" 그의 "약간 미만일" 수 있도록 함으로써, 숫자 범위 종말점에 유연성을 제공하는 데에 사용된다.

본원에서의 "포함한", "포함하는" 또는 "가지는"이라는 용어 및 이들의 변형의 사용은 그 이후에 열거되는 요소 및 그의 등가물들은 물론 추가적인 요소도 포괄하여 의미하는 것이다. 특정 요소를 "포함한", "포함하는" 또는 "가지는" 것으로 언급되는 실시양태는 그 특정 요소로 "본질적으로 이루어지는 것" 및 그것으로 "이루어지는 것"도 고려한다. 본원에서 사용될 때, "및/또는"은 연관되어 열거되는 항목들 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합은 물론, 대안 ("또는")으로 해석되는 조합의 부재도 지칭하여 포괄한다.

본원에서 사용될 때, 전이 구 "본질적으로 이루어지는" (및 문법상 변형)은 언급되는 재료 또는 단계 및 청구되는 발명의 "기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들"을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 그에 관해서는, Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (원문 강조)를 참조하고; 또한 MPEP §2111.03을 참조하라. 이에 따라, "본질적으로 이루어지는"이라는 용어가 "포함하는"과 등가물로 해석되어서는 안 된다. 또한, 본 개시내용은 일부 실시양태에서 임의의 특징 또는 특징 조합이 배제되거나 생략될 수 있을 것을 고려한다.

예시하자면, 명세서에서 복합체가 구성요소 A, B 및 C를 포함하는 것으로 언급되는 경우, 그것은 구체적으로는 A, B 또는 C, 또는 이들의 조합 중 어느 것이 단독 또는 임의의 조합으로서 생략되거나 부인될 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 값 범위의 언급은 단순히 범위 내에 속하는 각 개별 값을 개별적으로 언급하는 것의 단축 방법으로 사용하고자 하는 것으로서, 각 개별 값은 그것이 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 개재된다. 예를 들어, 농도 범위가 1 % 내지 50 %로 언급되는 경우, 2 % 내지 40 %, 10 % 내지 30 % 또는 1 % 내지 3 % 등과 같은 값들이 본 명세서에서 명시적으로 열거되는 것을 의미한다. 이는 구체적으로 의도되는 것의 예일 뿐으로서, 열거되는 최저 값과 최고 값 사이 및 그들을 포함하는 모든 가능한 숫자 값 조합이 본 개시내용에서 명시적으로 언급되는 것으로 간주되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술 용어들은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

상기에서 언급된 바와 같이, 본 출원이 실시양태의 기술에 의해 예시되기는 하였지만, 그리고 상기 실시양태가 상당히 상세하게 기술되기는 하였지만, 그와 같은 세부사항으로 첨부되는 청구범위의 영역을 한정하거나 임의의 방식으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 출원의 혜택을 받게 되면, 관련 기술분야 통상의 기술자에게 추가적인 장점 및 변형들이 용이하게 드러나게 될 것이다. 따라서, 더 넓은 측면에서, 본 출원이 구체적인 세부사항 및 예시적으로 나타낸 예로 제한되는 것은 아니다. 일반적인 본 발명 개념의 기술사상 또는 영역에서 벗어나지 않고도 그와 같은 세부사항 및 예로부터의 변경이 이루어질 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> NORTHWESTERN UNIVERSITY <120> COST EFFECTIVE CULTURE MEDIA AND PROTOCOL FOR HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS <130> 47460-109 <150> 62/902,561 <151> 2019-09-19 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr 1 5 10 15 Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val 20 25 30 Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser 35 40 45 Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro 65 70 75 80 Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95 Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu 100 105 110 Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140 <210> 2 <211> 141 <212> PRT <213> 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ttcgcgaaaa atcagatccg 180 cacatcaagc tgcagttaca ggcggaagaa cgtggcgttg tgagcatcaa gggcgtttgt 240 gcaaaccgct atttagcgat gaaagaagac ggccgcctgt tagcgagcaa gtgtgtgacc 300 gacgaatgct tcttcttcga acgcctggaa agcaacaact acaacaccta ccgcagccgc 360 aagtacacca gctggtatgt tgcgttaaac cgtaccggcc agtacaaatt aggcagcaaa 420 accggcccgg gtcagaaagc gattctgttt ctgcctatga gcgcgaagag ctgagaattc 480 <210> 8 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 ggatccatgg cagcaggttc gatcactaca ttaccggcac tgccggaaga tggtggttca 60 ggtgcatttc ctcctggcca cttcaaagac cctaaactgc tgtactgcaa gaatggcggc 120 ttctttctgc gcattcaccc ggatggccgt gttgatggta ctcgcgataa atcagatccg 180 ttcatcaagc tgcagctgca agcggaagaa cgtggcgtgg tgagcattaa gggcgtttgt 240 gcaaaccgtt atttagcgat gaaggaagac ggccgcctgt acgcgatcaa gaacgtgacc 300 gacgaatgct tcttctttga acgcctggaa gaaaacaact acaacaccta ccgcagccgc 360 aagtacccga gctggtatgt tgcgttaaag cgtaccggcc agtataaatt aggcagcaaa 420 accggtccgg gccagaaggc gattctgttt ctgcctatga 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taacaccctg aacccggaag cgagcgcgag cccgagctgc 240 gtgccgcagg atctggaacc gctgaccatt ctgtattatg tgggccgcac cccgaaagtg 300 gaacagctga gcaacatggt ggtgaaaagc tgcaaatgca gctgaaggga attc 354 <210> 14 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val 85 90 95 Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 <210> 15 <211> 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Trp Lys Trp 20 25 30 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 17 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn 1 5 10 15 Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr 35 40 45 Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys His Leu Gly Ile Glu Phe Met Glu Ala 50 55 60 Glu 65

Claims

세포 배양 기본 배지;
섬유모세포 성장 인자 2;
인슐린 또는 IGF1;
셀레늄의 공급원
을 포함하는, 인간 유도 다능성 줄기 세포의 성장을 위한 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1), 액티빈 A 또는 알부민을 실질적으로 함유하지 않는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, TGFβ3, NRG1; 트랜스페린, 아스코르브산 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 티아조비빈을 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 7.1의 pH를 추가로 특징으로 하는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 310 mOsm/l의 오스몰농도를 추가로 특징으로 하는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 2438 μg/ml 양의 소듐 비카르보네이트를 추가로 특징으로 하는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 세포 배양 기본 배지가 DMEM/F12인 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, FGF2가 서열식별번호: 4, 5 또는 15로 이루어진 군에서 선택되는 재조합 단백질인 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 셀레나이트 염이 소듐 셀레나이트인 세포 배양 배지.
제3항에 있어서, TGFβ3이 서열식별번호: 16의 재조합 단백질이거나, NRG1이 서열식별번호: 17의 재조합 단백질인 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, DMEM/F12 배양 배지 중에 배합된 40 ng/ml의 FGF2-G3, 20 μg/ml의 인슐린, 20 ng/ml의 소듐 셀레나이트를 포함하는 세포 배양 배지.
제12항에 있어서, DMEM/F12 배양 배지 중에 배합된 40 ng/ml의 FGF2-G3 (서열식별번호: 15), 20 μg/ml의 인슐린, 20 ng/ml의 소듐 셀레나이트, 20 μg/ml의 트랜스페린, 0.1 ng/ml의 TGFβ3 (서열식별번호: 16), 0.1 ng/ml의 NRG1 (서열식별번호: 17), 200 μg/ml의 아스코르브산 2-포스페이트, 2438 μg/ml의 소듐 비카르보네이트를 포함하는 세포 배양 배지.
세포 배양 기본 배지; 섬유모세포 성장 인자 2-G3; 인슐린 또는 IGF1; 셀레늄의 공급원, TGFβ3, NRG1; 트랜스페린 및 아스코르브산으로 본질적으로 이루어지는 배양 배지.
세포 배양 기본 배지; 섬유모세포 성장 인자 2-G3; 인슐린 또는 IGF1; 셀레늄의 공급원, TGFβ3, NRG1; 트랜스페린 및 아스코르브산으로 이루어지는 배양 배지.
FGF2-G3, TGFβ3 및 NRG1을 코딩하는 플라스미드;
FGF2-G3, TGFβ3 및 NRG1 단백질의 제조, 및 세포 배양 배지의 제조를 위한 지침
을 포함하는, 세포 배양 배지의 제조를 위한 키트.
제16항에 있어서, 하기 중 1종 이상을 추가로 포함하는 키트:
배양 배지, 소듐 셀레나이트, 인슐린 또는 IGF1, 트랜스페린, 아스코르브산 2-포스페이트, 소듐 비카르보네이트 또는 티아조비빈.
DMEM/F12 배양 배지 중에 배합된 FGF2-G3 (서열식별번호: 15), 인슐린 또는 IGF1, 소듐 셀레나이트, 트랜스페린, TGFβ3 (서열식별번호: 16), NRG1 (서열식별번호: 17), 아스코르브산 2-포스페이트, 소듐 비카르보네이트를 포함하는 세포 배양 배지를 수득하는 것;
매트릭스 코팅된 플레이트를 제조하는 것;
0일차에, hiPSC를 매트릭스에 첨가하는 것;
1일차에, 세포 배양 배지를 교체하는 것;
3.5일차에 세포를 패싱하는 것 또는 7 연속일 동안 세포를 성장시키는 것
을 포함하며, 여기서 3.5일 패싱 또는 7-일 세포 성장 주기 중 적어도 1일은 세포 배양 배지의 교체를 필요로 하지 않게 되는 것인,
배양물 중에서의 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hiPSC)의 성장 및 패싱 방법.