CN114746436A - 改善温度稳定性和蛋白酶抗性的fgf2多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多肽,其具有FGF2活性,并改善温度稳定性和蛋白酶抗性。多肽包含选自序列第1位至第28位天冬氨酸(D)被谷氨酸(E)取代、或者第78位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代、或者第96位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)或色氨酸(W)取代中的至少一种取代。
Description
技术领域
本公开涉及一种改善温度稳定性和蛋白酶抗性的FGF2多肽及其用途。
背景技术
FGF(成纤维细胞生长因子)是一种在调节细胞生长、增殖和分化中起重要作用的因子。为了维持人体各组织的功能,生成各种类型的FGF,它们在细胞分化和增殖中发挥独特的功能。然而,随着年龄的增长,皮肤等各组织中FGF的浓度逐渐降低,因此细胞的再生和分裂功能减弱,从而导致皮肤产生皱纹,弹性降低。
在各种FGF中,FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)主要由155个氨基酸组成,分子量约为18kDa。FGF2具有广泛的有丝分裂(mitogenic)和细胞存活活性(cell survivalactivity),并在伤口愈合、血管生成和神经系统生长中发挥强大的媒介作用。
因此,FGF2不仅开发成一种促进血管新生、促进伤口愈合、促进软骨形成或骨形成、促进神经发生(neurogenesis)的药物,而且广泛用作皮肤再生、去除皱纹或增加弹性的化妆品原料。此外,由于具有维持细胞处于多能状态的功能,作为主要因子添加到用于培养人多能干细胞(PSC)的培养基中。
据报道,与上皮细胞生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)相比,如上所述在人体内具有各种功能的FGF2的热力学稳定性较差。另外,还存在容易被蛋白酶切割的问题。因此,为了使FGF2适用于工业用途,保证FGF2的热力学稳定性和/或蛋白酶抗性是必不可少的条件。
发明内容
技术问题
本公开旨在提供一种改善温度稳定性和蛋白酶抗性的FGF2多肽。
本公开旨在提供一种含有改善温度稳定性和蛋白酶抗性的FGF2多肽的药用或美容用组合物。
本公开旨在提供一种含有改善温度稳定性和蛋白酶抗性的FGF2多肽的人多能干细胞培养基。
技术方案
根据实施例的改善温度稳定性的FGF2多肽是包含选自序列第1位至第28位天冬氨酸(D)被谷氨酸(E)取代、或者第78位半胱氨酸(C)被亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)取代、或者第96位半胱氨酸(C)被色氨酸(W)或异亮氨酸(I)取代中的至少一种取代并具有FGF2固有活性的改善温度稳定性(thermally stable)的多肽。
根据实施例的组合物包含改善温度稳定性和蛋白酶抗性的多肽和药学或美容上可接受的载体。
根据实施例的人多能干细胞培养基作为有效成分包含改善温度稳定性和蛋白酶抗性的多肽。
发明效果
根据实施例的FGF2多肽制成产品后,与野生型人FGF2多肽对比时,呈现改善的温度稳定性和蛋白酶抗性。
不同于现有的野生型人FGF2产品,改善温度稳定性和蛋白酶抗性的多肽在流通和保存期间也能维持活性。因此,可以用作药用或美容用组合物的有效成分。此外,当用作人多能干细胞培养基的有效成分时,与野生型FGF2相比,具有诱导未分化增殖的活性能够长时间保持的优点。
附图说明
图1是野生型FGF2的多肽(序列第1位)。
图2示出野生型FGF2和FGF2变体(pQE80_hFGF2(S137P)、pQE80_hFGF2(D28E,S137P))的SDS-PAGE。
图3示出用于检测野生型FGF2(△9N-hFGF2)和FGF2变体(△9N-hFGF2(D28E,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96W,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96W,S137P))的37℃下的稳定性的SDS-PAGE。
图4示出用于检测野生型FGF2(△9N-hFGF2)和FGF2变体(△9N-hFGF2(D28E,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96W,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96W,S137P))的45℃下的稳定性的SDS-PAGE。
图5是检测野生型FGF2和FGF2变体(pQE80_hFGF2(S137P)、pQE80_hFGF2(D28E,S137P))的37℃下的细胞增殖活性变化的柱状图。
图6是检测野生型FGF2(△9N-hFGF2)和FGF2变体(△9N-hFGF2(D28E,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P))的37℃下的细胞增殖活性变化的柱状图。
图7是检测野生型FGF2(△9N-hFGF2)和FGF2变体(△9N-hFGF2(D28E,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P))的42℃下的细胞增殖活性变化的柱状图。
图8示出用于检测野生型FGF2(△9N-hFGF2)的对蛋白酶的抗性的SDS-PAGE。
图9示出用于检测FGF2变体(△9_hFGF2 D28E+C78L+C96I+S137P)的对蛋白酶的抗性的SDS-PAGE。
具体实施方式
在下文中,将详细描述实施例,以使本技术领域的普通技术人员容易实施本发明。实施例能够以各种不同方式实施,不限于本文所述的具体实施例。
除非本公开中使用的某些术语在下文中另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本公开中描述的方法和工艺通常根据本申请中提供的常规方法来执行。通常,本公开中使用的分子生物学、生物化学、分析化学和细胞培养中的命名法和实验室程序是本领域公知的并且与常用的相同。
变体
本公开提供了通过定点诱变实现热稳定的FGF2多肽。在本公开中,通过生物信息分析和利用计算机的蛋白设计在未知的新位置上合理预测最佳氨基酸后,通过定点诱变制备突变体。
图1示出野生型人FGF2多肽序列。
在本公开中,术语“野生型”是指具有物种成员中最普遍的氨基酸序列的天然型FGF2。在本公开中,野生型FGF2是作为155个氨基酸长度(序列第1位,图1)的18kDa蛋白的人FGF2。
在本公开中,“片段”是指具有FGF2活性的FGF2多肽的功能片段。此外,“片段”是指与序列第1位的序列具有85%以上的序列一致性的FGF2多肽的功能片段。FGF2多肽的片段至少还包含根据本发明的一种以上的取代。优选地,序列一致性至少为96%、97%、98%、99%或100%。片段意指仅由完整的多肽序列和部分结构组成的多肽,可能存在变体的C-末端缺失或N-末端缺失。此类功能片段可具有根据本发明的目标FGF2蛋白的细胞结合区和肝素结合片段。
在本公开中,“序列一致性”是指在如上所述的根据本发明的FGF2多肽中发现相同氨基酸残基。将FGF2多肽的氨基酸序列的指定连续片段比对后与对应于参考分子的特定氨基酸序列进行对比时,野生型人FGF2多肽用作参考。序列一致性的百分比如下计算:检测两个序列中存在相同氨基酸残基的位置数,由此计算出一致的位置数后,除以与参考分子对比的片段的总位置数,再乘以100,从而计算出序列一致性的百分比。序列比对方法是所属技术领域中公知的。本申请中使用的参考序列是指根据本发明的具体相应野生型人FGF2蛋白。例如,对于哺乳动物物种如小鼠、大鼠、兔、灵长类、猪、狗、牛、马和人类等,FGF2高度保存,在广泛的物种中表现出85%以上的序列一致性。优选地,序列一致性至少为96%、97%、98%或99%以上或100%。所属技术领域的技术人员应该理解,在根据本发明的FGF2蛋白全长中,剩余15%以下的氨基酸是可变的,这是因为例如使用不同来源的FGF2物种或者附加所属技术领域中通常已知的适合的非FGF2肽序列或标签等而导致的。相对于野生型FGF2,具有85%以上的一致性的根据本发明的实施方案的FGF2蛋白,其FGF家族的其他成员通常具有很低的序列一致性,因此不太可能包含类似的FGF2以外的其他蛋白。
本发明人确认,野生型人FGF2中第28位点或第137位点是与FGF2多肽的热稳定性和/或蛋白酶抗性相关的位置,而且暴露于FGF2表面的半胱氨酸中第78位点或第96位点的半胱氨酸是与热稳定性和/或蛋白酶抗性相关的位置。
在与热稳定性和/或蛋白酶抗性相关的位置替换成最合适的氨基酸需要发明人的努力(inventive step)。
本发明人确认,通过用谷氨酸(E)取代第28位点的天冬氨酸(D),可以改善热稳定性。
本发明人还确认,通过用脯氨酸(P)取代第137位点的丝氨酸(S),可以进一步改善热稳定性。
本发明人还确认,通过同时取代第28位点和第137位点,可以进一步改善热稳定性。
对于第78位点和第96位点,通过SDM((http://marid.bioc.cam.ac.uk,University of Cambridge)和Discovery studio 2019(BIOVIA)对比19个突变后的稳定性,以此进行确认。
对于第78位点,在SDM分析结果中,突变为亮氨酸(L)时,预测值(Predictedpseudo△G)为0.33,预测值最高,在Discovery studio中,突变为异亮氨酸(I)时,突变能量变化值(kcal/mol)为-1.20,预计最稳定。
对于第96位点,在SDM分析结果中,突变为异亮氨酸(L)时,预测值(Predictedpseudo△G)为0.19,预测值最高,在Discovery studio中,突变为色氨酸(W)时,突变能量变化值(kcal/mol)为-0.39,预计最稳定。
US9169309、US2017-0291931、EP3380508、US20180319857等中公开第78位的半胱氨酸被丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)取代,或者第96位的半胱氨酸被丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)或天冬酰胺(N)等取代的内容。对于这些被取代的氨基酸,大部分是具有亲水性和不带电荷的氨基酸,而本公开中被取代的氨基酸是疏水性氨基酸,可以认为属于由现有技术不易预料到的范畴。
因此,在本公开中,可实现的变体可以是下表1所示的各种变体中的任何一种。
【表1】
在上述各种变体中,虽然单一位置的突变也能改善热稳定性和/或蛋白酶抗性,但是2个以上突变会更有利于改善热稳定性和/或蛋白酶抗性。进一步地,3个到4个突变会更有利于改善热稳定性和/或蛋白酶抗性。通常,将FGF2的编码基因克隆后,使其在转化的有机体,优选在微生物中表达。宿主有机体在表达条件下表达外源基因,以生产FGF2。此外,合成重组FGF2可以在真核生物如酵母和人类细胞中形成。根据重组生产方法,FGF2可以是146个氨基酸形式、153-155个氨基酸形式或它们的混合形式。本申请首次证明,野生型FGF2中的部分变化会构建具有高于野生型蛋白的温度稳定性和长半衰期的FGF2突变。只要满足本申请中指定的标准(即具有野生型FGF2的优选生物活性以及热稳定),用于插入本申请中描述的取代的根据本发明的FGF2蛋白可以来源于任何哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔、灵长类动物、猪、狗、牛、马和人类。优选地,目标FGF2蛋白来源于人源。然而,相对于用作对比标准的序列第1位的人FGF2蛋白的氨基酸序列,具有85%以上、最优选为约96%以上、97%以上、98%以上或99%以上的序列一致性的哺乳类FGF2的所有生物活性变体均可用于本发明。
在部分实施方案中,本申请中描述的根据本发明的稳定的FGF2多肽可以进一步包含所属技术领域中公知的任何其他FGF肽以外的序列或标签,以便用于检测、纯化、标记特定组织或细胞、改善稳定性、延长活性、改善表达等。
药学和美容组合物
表1中公开的各种变体可以作为药学和/或美容组合物与药学或美容上可接受的载体一起提供。
表1中公开的各种变体可施用于需要促进血管新生、促进伤口愈合、促进软骨形成或骨形成、或促进神经发生的对象、或需要改善皮肤状态如改善皱纹、改善皮肤弹性、预防皮肤老化、防脱发或促进生发、改善皮肤水分、去除老年斑或治疗痤疮的对象。表1中公开的各种变体可以以“原始状态”形式施用,或者如果需要,可以以盐、酯、酰胺、前药、衍生物等形式施用,但是所述盐、酯、酰胺、前药或衍生物可以选自药理学上适合的物质,即对本方法有效的物质。对于合成有机化学领域的技术人员而言,肽的盐、酯、酰胺、前药和其他衍生物是已知的,例如可通过已知的标准程序来制备。
表1中公开的各种变体可以配制成透皮施用型产品如气雾剂、膏霜(cream)、乳清(serum)和贴剂形式,以用于皮下、肠胃外、局部、口服、鼻腔(或以其他方式吸入)、直肠或局部施用。根据施用方法,组合物可以各种单位剂型施用。合适的单位剂型可以包含但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂、贴剂、鼻喷雾剂、注射剂、可植入的缓释制剂、脂质复合物等。
当表1中公开的各种变体与美容上可接受的载体组合而形成美容组合物时,可以进一步包含填充剂(例如透明质酸填充剂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球和胶原蛋白填充剂)等。本组合物优选可以局部、皮下或透皮施用。
本组合物可以是注射用组合物。
本组合物还可包含胶原蛋白(例如,牛、猪、人的胶原蛋白)、透明质酸。胶原蛋白可以是合成胶原蛋白,透明质酸可以是鸡冠或微生物的发酵产物。
本组合物还可包含麻醉剂(例如,利多卡因)。
本组合物可以是皮肤霜(例如,面霜)。
本组合物可以是乳清或调色剂形式的液态制剂。
本组合物可以是凝胶状的半固态制剂。
药学上可接受的载体可以包含得到联邦或州监管机构的批准或者美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物、更具体地用于人类或动物、更具体地用于人类的载体。“载体”是指例如与本文所述的一种以上肽一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助剂或媒介物(vehicle)。
药学上可接受的载体例如可以含有一种以上生理学上可接受的化合物,起到使组合物稳定或者使表1中公开的各种变体的吸收增加或减少的作用。生理上可接受的化合物例如可以包含碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白、保护和吸收增强剂(如脂质)、降低肽的清除能力或水解的化合物或其他赋形剂、稳定剂和/或pH调节缓冲剂。
尤其,用于制造片剂、胶囊、凝胶帽等的其他生理上可接受的化合物可以包含但不限于结合剂、稀释剂/填充剂、崩解剂、润滑剂和助悬剂。
可以将赋形剂、任选崩解剂、结合剂、任选润滑剂等附加到表1中公开的各种变体,并对所得的组合物进行压缩,以制备口服剂型(例如,片剂)。如果需要,可以使用已知的方法涂覆压缩产物,以用于味道封闭或肠溶或缓释。
可以与表1中公开的各种变体配制成剂型的其他生理上可接受的化合物可包含湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂,这些对防止微生物的生长或作用特别有用。赋形剂可以灭菌使用且不含污染物。
可以将表1中公开的各种变体掺入美容用剂型并局部涂覆,而且可以配制成皮肤霜(例如,面霜)或润肤露、除皱霜,或者可以掺入化妆品、防晒霜或保湿剂。
另外,可以将表1中公开的各种变体掺入任选地进一步包含填充剂、保湿剂、维生素(例如,维生素E)和/或着色剂/染料的剂型中。
合适的可注射化妆品剂型可包含但不限于与一种以上填充剂物质一起掺入表1中公开的各种变体的剂型。可用作注射用化妆品皱纹填充剂的示例性物质可包含但不限于临时(吸收性)填充剂如胶原蛋白(例如,合成胶原蛋白、牛胶原蛋白、猪胶原蛋白、人胶原蛋白等)、透明质酸凝胶、氢氧化钙磷灰石(通常以凝胶形式植入)或多聚-L-乳酸(PLLA)等。肽也可以掺入含有永久性(非吸收性)填充剂的可注射化妆品剂型中。说明性的“永久性”填充剂可以包含但不限于聚甲基丙烯酸甲酯珠粒(PMMA微球)。
可以将表1中公开的各种变体掺入真皮填充剂、可注射剂型或者与之一起施用:这样的可注射剂型可以进一步包含麻醉剂(例如,利多卡因或其类似物)。可注射剂型基本上灭菌或无菌或者符合皮下注射填充剂管理机构指南。
可以使用本领域已知的任何途径将表1中公开的各种变体施用于对象,该途径例如包含注射(例如,静脉内、腹膜内、皮下、肌内或皮内)、吸入、透皮施用、直肠施用、阴道施用或口服。优选的施用途径包含皮下、透皮或局部施用。
有效量的表1中公开的各种变体可通过局部(即,非全身)施用如经由包含但不限于外周肌内、线内和皮下施用的外周施用进行施用。
表1中公开的各种变体的施用可以采用任何方便的方式,例如注射、静脉内和动脉支架(包含洗脱支架)、导管、口服、吸入、透皮施用、直肠施用等。
对于表1中公开的各种变体,在施用之前,如上所述,可与药学上可接受的载体一起配制成剂型。对于药学上可接受的载体,一部分由待施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。
在本申请中描述方法的上下文中,施用于对象的剂量应足以随着时间的推移在所述对象中产生有益的治疗反应(例如,增加皮下脂肪生成)。剂量取决于所采用的特定媒介物/递送方法的功效、施用部位、施用途径和所述对象的状况以及要治疗的对象的体重或表面积。剂量的大小也取决于在特定对象中施用特定肽所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度。
表1中公开的各种变体可以根据本领域技术人员众所周知的标准方法全身性地(例如,口服或作为注射剂)施用。可以以诸如锭剂、气雾剂、漱口水、涂覆拭子等各种形式将肽施用于口腔。也可以考虑各种口服和舌下剂型。当表1中公开的各种变体配制成注射剂时,可以以长效(depot)剂型的形式施用,以在一段时间内提供治疗。
表1中公开的各种变体例如可以局部施用于皮肤表面、局部病变或伤口、外科手术部位等。
可以使用常规的透皮药物递送系统,即透皮“贴剂”,通过皮肤递送表1中公开的各种变体,通常作为贴在皮肤上的药物递送装置所提供的层叠结构内可含有表1中公开的各种变体。
用于局部递送的其他剂型包含但不限于软膏、凝胶、喷雾剂、液剂和膏霜。软膏可以是半固态制剂,其通常基于凡士林或其他石油衍生物。与其他载体或媒介物一样,软膏基质应该是惰性的、稳定的、非刺激性的且不致敏的。含有被选择的表1中公开的各种变体的膏霜通常可以是粘性液体或半固态乳液,常常是水包油或油包水。膏霜基质通常是可水洗的,并且含有油相、乳化剂和水相。如本领域技术人员所理解的,要使用的特定的软膏或膏霜基质是为了最佳药物递送而提供的基质。
对于表1中公开的各种变体,可以作为准备用于稀释的储存容器(例如,以预先测量的体积)中的“浓缩物”或者是作为准备加入到大量水、酒精、过氧化氢或其他稀释剂中的可溶性胶囊中的“浓缩物”来提供。例如,可以将肽冻干以待后续复溶。
表1中公开的各种变体可以有多种用途。表1中公开的各种变体可以具有应用于很多方面的用途。例如,皮下脂肪为皮肤提供丰满度和紧实度,因此在整容手术中具有增强皮下脂肪形成的用途。老化的皮肤含有较少的皮下脂肪。因此,将一种以上本文所述的表1中公开的各种变体施用于所需部位,以促进形成皮下脂肪,使得皮肤更丰满、显得更年轻。这种方法可以替代通常成功率较低的从人体其他部位(例如,大腿或臀部)移植脂肪细胞的现有方法。
可以施用表1中公开的各种变体,以选择性地改善皮下脂肪组织(例如,在基本上不增加内脏脂肪和/或其他脂肪组织的情况下,用于改善皮下脂肪组织)。响应于施用表1中公开的各种变体,在真皮成纤维细胞中形成脂肪细胞,并且可在对象中选择的皮下部位内增加体积。
表1中公开的各种变体可用于减少疤痕。这可以通过以足以减少疤痕部位和/或改善疤痕部位的外观的量施用一种以上表1中公开的各种变体来实现。疤痕例如可以是烧伤所产生的疤痕、手术所产生的疤痕、痤疮所产生的疤痕、活组织检查所产生的疤痕或受伤引起的疤痕。
表1中公开的各种变体例如可用于各种化妆过程中,以改善皮肤外观。这可以通过以足以改善皮肤外观的量向对象部位施用一种以上肽来实现。这样的施用可以包含皮下施用至诸如嘴唇、眼睑、脸颊、前额、下巴、脖子等区域。所述肽可用于减少皱纹,减少松弛皮肤,改善皮肤的表面质感,减少、去除或填充皱纹,去除或减少老年斑和/或去除眼底黑眼圈的方法中。这些化妆应用是示例性的,而不是限制性的。
表1中公开的各种变体可用于改善对象部位的组织体积。这可以通过以足以增加对象部位的组织体积的量施用本文所述的一种以上肽来实现。例如,增加组织体积可以包含使乳房组织紧实或增大和/或使臀部组织或身体或面部的其他部位紧实或增大。
此时,所使用的FGF2,其使用量可为0.01至10ppm。如果超过10ppm,则由于过量,可能会引起副作用。因此,实际使用范围为0.01~10ppm,优选为0.01~2ppm。
表1中公开的各种变体也可用于软化对象部位内的皮肤。这可以通过以足以软化所需部位的皮肤的量施用本文所述的一种以上肽来实现。所述软化可以包含软化痤疮造成疤痕的皮肤、软化脂肪团部位、软化或减少妊娠纹和/或拉平皱纹。
表1中公开的各种变体可用于对象中动员干细胞形成皮下脂肪。这可以通过以足以动员干细胞形成皮下脂肪的量施用表1中公开的各种变体来实现。例如,这一点在各种重建手术过程中具有实用性。
表1中公开的各种变体可用于在对象中重建组织。这样的重建例如可以包含乳房重建(例如,在去除肿瘤的手术之后)、或者面部或肢体重建(例如,在车祸或烧伤之后)。这可以通过以足以在组织重建过程中或之后增加组织体积的量施用表1中公开的各种变体来实现。表1中公开的各种变体可以任选与组织移植物质或改善皮肤或受伤组织治疗的其他方法一起使用。
对于表1中公开的各种变体,通过施用足以减轻所述对象行走时经历的脚跟疼痛的量,可以用于减轻对象的脚跟疼痛。
可以施用表1中公开的各种变体,以增加皮下脂肪,用于增加体温调节和/或改善免疫功能。可以用表1中公开的各种变体处理,以预防疾病或治疗与器官脂肪增加有关的进行性疾病,该进行性疾病包含但不限于心血管疾病和其他与肥胖症有关的疾病。
这些方法中任何一种都可以是局部或全身施用,并且可以通过本文所述的任何途径进行,例如局部、皮下、透皮、口服、经鼻、阴道和/或直肠施用。优选地,表1中公开的各种变体可以通过皮下注射施用。作为替代方案,所述表1中公开的各种变体可以以诸如面霜之类的皮肤霜的形式局部施用,或者通过透皮贴剂透皮施用。
尽管已经结合人体的使用描述了上述用途和方法,但是也适用于动物,例如兽医用途。因此,优选的生物包含但不限于人类、非人类的灵长类、犬科动物、马、猫、猪、有蹄类动物、兔子等。
培养基
表1中公开的各种变体的含量可以是“培养基有效量”,以提供给人多能干细胞培养基,“培养基有效量”相当于至少5次传代培养期间以未分化状态维持多能干细胞所需的量。
在本公开中,术语“人多能干细胞”包含人胚胎干细胞和衍生的多能干细胞,其特征是自我更新能力(self-renewal capacity)-形成相同的自身后代的能力和允许生成人体的几乎所有细胞类型的多能性。
在本公开中,术语“维持干细胞处于多能状态”是指将细胞维持在具有可分化为几乎所有细胞类型的能力的未分化状态。这种多能状态取决于最重要的生长因子为FGF2的生长因子的支持干性(sternness-supporting)的混合物(cocktail)。FGF2通过以下几种方式支持自我再生:将丝裂原-活化蛋白激酶途径直接活化,并间接促进转化生长因子β1和激活素信号传递(Greber等人,2008,Stem Cells 25,455-464)。通过细胞附着和存活功能,FGF2以多种方式促进人PSC的多能性(Eisellova等人,2009,Stem Cells 27,1847-1857)。
本公开提供适合于改造的目标FGF2的表征、证明蛋白中的取代效果、人PSC培养中蛋白的利用方法以及以未分化状态培养人PSC的含有本申请中描述的一种以上耐热性FGF2蛋白的培养基。本申请中提供的实施例中采用的人胚胎干细胞(ESC)源自供体知情同意下获得的胚泡期胚胎。使用了29-41次传代表征良好的人ESC细胞株(Adewumi等人,2007,NatBiotechnol 25,803-816)CCTL14(Centre of Cell Therapy Line)。如人诱导多能干细胞(iPSC),利用基于山中混合物(Yamanaka's cocktail)和仙台病毒转染(Sendai virustransfection)的皮肤成纤维细胞的重编程衍生的AM13细胞株采用了34-41次传代状态(Kruta等人,2014,Stem Cells and Development 23,2443-2454)。
在下文中,将给出优选的实验例,以有助于理解本发明,但是下述实验例只是例示本发明而已,本发明的范围不限于下述实施例。
实验例1:利用pQE80载体的突变体的构建、纯化和热稳定性分析
将FGF2的1个位置的突变(S137P)和2个位置的突变(D28E,S137P)合成,并亚克隆到具有His-Tag的pQE80L载体。将插入FGF2的重组载体转化到osetta(DE3)pLysS细胞中进行表达。
接种到10ml的LB培养基(Ambrothia)(使用0.25g)中,并加入10ul的氨苄青霉素(Ampicillin,50mg/ml),然后在37℃下预培养。
将10ml的预培养液和1ml的氨苄青霉素(Ampicillin,50mg/ml)接种到1L的LB培养基(ambrothia)(使用25g)中,并在37℃下进行主培养。当OD600的值为0.6时,将培养液在4℃的冰箱中冷却10分钟,然后加入0.5mM的β-D-1-硫代半乳糖苷(β-D-l-thiogalactopyranoside;IPTG),从而获得在20℃下诱导表达20小时的大肠杆菌细胞。
将表达的pQE80_FGF2溶解在裂解缓冲液(20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl,3mMDTT)中进行超声处理后,在13000r.p.m下进行离心分离30分钟,然后进行纯化。
在离心分离后,将最终溶解的上清液注入到有肝素珠的柱子中。用3倍于注入柱子中的pQE80_FGF2蛋白体积的第一洗涤(wash)缓冲液(20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl,3mMDTT)和第二洗涤(wash)缓冲液(20mM Tris pH 8.0,500mM NaCl,3mM DTT)进行洗涤,通过用60ml的洗脱缓冲液(elution buffer,20mM Tris pH 8.0,1800mM NaCl,3mM DTT)进行洗脱来完成第一次纯化。
最后,对pQE80_FGF2蛋白分段通过利用HiLoadTM 16/60 Superdex 75(AmershamBiosciences)柱子和1XPBS缓冲液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,pH7.4)、(WELGENE)的凝胶过滤法进行纯化。
对于纯化后的FGF2蛋白,基本使用1XPBS缓冲液以0.5mg/ml的浓度在37℃下反应0、2、4、6天,用考马斯亮蓝染色试剂染色,并实施15%SDS-PAGE电泳,其结果例示于图2中。
如图2所示,从通过15%SDS-PAGE确认的FGF2多肽条带可知,与没有突变的hFGF2(野生型)多肽相比,两种突变多肽(pQE80_hFGF2(S137P)、pQE80_hFGF2(D28E,S137P))的SDS-PAGE上的稳定性均得到改善。
实验例2:利用pET17b载体的突变体的构建、纯化和热稳定性分析
将FGF2的1个位置的突变(S137P)、2个位置的突变(D28E,S137P)、4个位置的突变((D28E,C78L,C96I,S137P)、(D28E,C78L,C96W,S137P)、(D28E,C78I,C96I,S137P)、(D28E,C78I,C96W,S137P))合成,并亚克隆到具有His的pET17b载体。将插入FGF2的重组载体转化到Rosetta(DE3)pLysS细胞中进行表达。
接种到10ml的LB培养基(Ambrothia)(使用0.25g)中,并加入10ul的氨苄青霉素(Ampicillin,50mg/ml),然后在37℃下预培养。
将10ml的预培养液和1ml的氨苄青霉素(Ampicillin,50mg/ml)接种到1L的LB培养基(ambrothia)(使用25g)中,并在37℃下进行主培养。当OD600的值为0.6时,将培养液在4℃的冰箱中冷却10分钟,然后加入0.5mM的β-D-1-硫代半乳糖苷(β-D-l-thiogalactopyranoside;IPTG),从而获得在20℃下诱导表达20小时的大肠杆菌细胞。
将表达的pET17b_FGF2溶解在裂解缓冲液(20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl,3mMDTT)中进行超声处理后,在13000r.p.m下进行离心分离30分钟,然后进行纯化。
在离心分离后,将最终溶解的上清液注入到有肝素珠的柱子中。用3倍于注入柱子中的pET17b_FGF2蛋白体积的第一洗涤(wash)缓冲液(20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl,3mMDTT)和第二洗涤(wash)缓冲液(20mM Tris pH 8.0,500mM NaCl,3mM DTT)进行洗涤,通过用60ml的洗脱缓冲液(elution buffer,20mM Tris pH 8.0,1800mM NaCl,3mM DTT)进行洗脱来完成第一次纯化。
对于4个位置的突变体,在亲和色谱法中使用配制成缓冲液和洗脱缓冲液均不含3mM DTT的溶液进行纯化。
最后,对pET17b_FGF2蛋白分段通过利用HiLoadTM 16/60 Superdex 75(AmershamBiosciences)柱子和1XPBS缓冲液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,pH7.4)、(WELGENE)的凝胶过滤法进行纯化。
37℃稳定性实验
对于纯化后的FGF2蛋白,基本使用1XPBS缓冲液以0.5mg/ml的浓度在37℃下反应0、3、6、9天,用考马斯亮蓝染色试剂染色,并实施15%SDS-PAGE电泳,其结果例示于图3中。
如图3所示,从通过15%SDS-PAGE确认的FGF2多肽条带可知,变体的热稳定性有所提高。
对于密度检测,使用imageJ程序(Wanyne Rasband)检测SDS-PAGE凝胶的密度,其结果示于下表2中。
【表2】
变体 | 0天 | 3天 | 6天 | 9天 |
△9N_hFGF2 | 100 | 84 | 69 | 65 |
△9N_hFGF2(D28E,S137P) | 100 | 100 | 65 | 17 |
△9N_hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P) | 100 | 86 | 102 | 89 |
△9N_hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P) | 100 | 98 | 102 | 103 |
△9N_hFGF2(D28E,C78L,C96W,S137P) | 100 | 99 | 96 | 94 |
△9N_hFGF2(D28E,C78I,C96W,S137P) | 100 | 112 | 92 | 65 |
单位%,从表2的结果可知,与野生型hFGF2相比,4个位置的变体的热稳定性有所提高。特别是,与其他变体相比,△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96W,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P)的热稳定性相对更好。
45℃稳定性实验
对于纯化后的FGF2蛋白,基本使用1XPBS缓冲液以0.5mg/ml的浓度在45℃下反应0、1、2、3、4、5、6天,用考马斯亮蓝染色试剂染色,并实施15%SDS-PAGE电泳,其结果例示于图4中。
如图4所示,从通过15%SDS-PAGE确认的FGF2多肽条带可知,变体的热稳定性有所提高。
对于密度检测,使用imageJ程序(Wanyne Rasband)检测SDS-PAGE凝胶的密度,其结果示于下表3中。
【表3】
从表3的结果可知,与野生型hFGF2相比,变体的热稳定性有所提高。特别是,与其他变体相比,△9N-hFGF2(D28E,C78L,C96I,S137P)、△9N-hFGF2(D28E,C78I,C96I,S137P)的热稳定性相对更好。
实验例3:确认利用pQE80载体的突变体的细胞增殖能力
对通过与实验例1相同的方法制备的突变体使用了BALB3T3细胞,并在含有10%牛血清的DMEM培养基中培养和维持。为了确认基于FGF2的细胞增殖活性,在含有10ug/ml胰岛素(insulin)、1uM地塞米松(dexamethasone)、10ug/ml转铁蛋白(transferrin)、10ng/ml亚硒酸钠(sodium selenite)、100ug/ml卵清蛋白(ovalbumin)、5ug/ml纤连蛋白(fibronectin)的F12/DMEM培养基中培养细胞。
96孔板中培养成细胞数为0.5x104/孔,并用肝素(heparin)(10ug/ml)和FGF2(0.3ng/ml)处理42小时。对于细胞数的增加,通过使用WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐]检测由电子介质(electronmediator)和细胞内脱氢酶(dehydrogenases)形成的WST-8甲瓒(formazan)生成程度进行确认。WST-8甲瓒生成程度可以通过吸光度(450nm)进行确认。实验重复3次,并用“平均+标准偏差”方式表示。FGF2蛋白分别在37℃下保存0、2、4、6天后,再确认细胞增殖活性变化。
其结果例示于图5中。参见图5,hFGF2在37℃下保存2天后观察到活性降低,在37℃下保存4天后观察到活性不足37℃下保存0天的蛋白的60%。另一方面,hFGF2 S137P变体在37℃下保存2天后观察到活性低于hFGF2,在37℃下保存4天后观察到活性不足37℃下保存0天的蛋白的60%。另一方面,hFGF2 D28E+S137P变体在37℃下保存日期越长活性越低,但是活性降低远小于hFGF2和hFGF2 S137P变体。
实验例4:确认利用pET17b载体的突变体的细胞增殖能力
对通过与实验例2相同的方法制备的突变体使用了BALB3T3细胞,并在含有10%牛血清的DMEM培养基中培养和维持。为了确认基于FGF2的细胞增殖活性,在含有10ug/ml胰岛素(insulin)、1uM地塞米松(dexamethasone)、10ug/ml转铁蛋白(transferrin)、10ng/ml亚硒酸钠(sodium selenite)、100ug/ml卵清蛋白(ovalbumin)、5ug/ml纤连蛋白(fibronectin)的F12/DMEM培养基中培养细胞。
96孔板中培养成细胞数为0.5x104/孔,并用肝素(heparin)(10ug/ml)和FGF2(0.3ng/ml)处理42小时。对于细胞数的增加,通过使用WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐]检测由电子介质(electronmediator)和细胞内脱氢酶(dehydrogenases)形成的WST-8甲瓒(formazan)生成程度进行确认。WST-8甲瓒生成程度可以通过吸光度(450nm)进行确认。实验重复3次,并用“平均+标准偏差”方式表示。FGF2蛋白分别在37℃下保存0、3、6、9、12天后,再确认细胞增殖活性变化。
其结果例示于图6中。参见图6,△9_hFGF2(野生型)在37℃下保存3天后活性降低,并确认37℃下保存6天后几乎丧失活性。△9_hFGF2D28E+S137P变体具有比野生型蛋白更长的活性,并且37℃下保存9天后活性降低。与这些不同,△9_hFGF2 D28E+C78L+C96I+S137P突变蛋白和△9_hFGF2 D28E+C78I+C96I+S137P变体在37℃下保存12天也没有观察到活性降低。由此可以确认,根据实施例的变体在37℃下稳定地维持蛋白的活性。
FGF2蛋白分别在45℃下保存0、1、2、3、4、5、6、7天后,再确认细胞增殖活性变化。其结果例示于图7中。参见图7,△9_hFGF2(野生型)在45℃下保存1天后活性急剧降低,在45℃下保存2天后几乎丧失活性。△9_hFGF2 D28E+S137P突变蛋白具有比野生型蛋白更长的活性,但是在45℃下保存2天后活性降低。与这些不同,△9_hFGF2 D28E+C78L+C96I+S137P突变蛋白和△9_hFGF2 D28E+C78I+C96I+S137P突变蛋白的活性根据45℃下的保存日期逐渐降低,但是比野生型维持更长的活性,即使在45℃下保存6天,仍然维持2倍以上的增殖活性能力。
实验例5:确认利用pET17b载体的突变体的对蛋白酶切割的抗性
检测通过与实验例2相同的方法制备的△9_hFGF2(野生型)和△9_hFGF2 D28E+C78L+C96I+S137P突变蛋白的对蛋白酶切割的抗性。
图8和图9分别示出检测△9_hFGF2(野生型)和△9_hFGF2 D28E+C78L+C96I+S137P突变蛋白的SDS-PAGE的结果。在图8和图9中,No.1是蛋白酶处理后没有孵育直接检测的结果,No.2是蛋白酶处理后在37℃下孵育3小时后检测的结果,No.3至14是对0.25mg/mL的FGF2分别用0.0025mg/mL的12种不同的蛋白酶处理后在37℃下孵育3小时后检测的结果。
对于各条带的密度检测,使用imageJ程序(Wanyne Rasband)检测SDS-PAGE凝胶的密度,其结果示于下表4中。
【表4】
从图8和图9的结果及表4的内容可知,与△9_hFGF2(野生型)相比,△9_hFGF2D28E+C78L+C96I+S137P突变蛋白的对蛋白酶的抗性整体上有所提高。特别是,对α-胰凝乳蛋白酶(α-C)、胰蛋白酶(TR)、枯草杆菌蛋白酶(SU)、蛋白酶K(P-K)、梭菌蛋白酶(Endoproteinase-Arg-C)(CL)、嗜热菌蛋白酶(TH)、肌动蛋白酶(A-E)的抗性相对提高很大。
在上文中,描述了各种实施例,但是权利范围不限于所述实施例。在本发明的说明书和附图范围内,可以对具体实施方案进行各种修改,这自然也落入权利范围内。
工业实用性
可应用于化妆品或药物技术领域。
<110> KIOST
KBIO HEALTH
<120> 改善温度稳定性和蛋白酶抗性的FGF2多肽及其用途
<130> OPP20203831KR
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<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
20 25 30
Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
35 40 45
Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu
50 55 60
Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80
Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
85 90 95
Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr
100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
115 120 125
Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys
130 135 140
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
145 150 155
Claims (8)
1.一种改善温度稳定性的多肽,其中,
所述多肽包含选自序列第1位至第28位天冬氨酸(D)被谷氨酸(E)取代、或者第78位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代、或者第96位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)或色氨酸(W)取代中的至少一种取代,并且具有FGF2活性。
2.根据权利要求1所述的改善温度稳定性的多肽,其中,
第137位丝氨酸(S)被脯氨酸(P)取代。
3.根据权利要求2所述的改善温度稳定性的多肽,其中,
所述取代是2个、3个或4个。
4.根据权利要求3所述的改善温度稳定性的多肽,其中,
所述第28位天冬氨酸(D)被谷氨酸(E)取代,
所述第78位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代,
所述第96位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)取代,
所述第137位丝氨酸(S)被脯氨酸(P)取代。
5.根据权利要求3所述的改善温度稳定性的多肽,其中,
所述第28位天冬氨酸(D)被谷氨酸(E)取代,
所述第78位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)取代,
所述第96位半胱氨酸(C)被异亮氨酸(I)取代,
所述第137位丝氨酸(S)被脯氨酸(P)取代。
6.根据权利要求1所述的改善温度稳定性的多肽,其中,
所述多肽与所述序列第1位或它的片段具有至少85%以上的序列一致性。
7.一种组合物,其包含:
根据权利要求1至6中任何一项所述的改善温度稳定性的多肽;以及
药学或美容上可接受的载体。
8.一种人多能干细胞培养基,其作为有效成分包含根据权利要求1至6中任何一项所述的改善温度稳定性的多肽。
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