KR20090083062A - 모노－페길화된 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체 있어서, 상기 bFGF 변이체는 그의 N-말단 또는 C-말단에 추가적인 Cys 잔기를 포함하며 상기 추가적인 Cys 잔기는 PEG(polyethylene glycol) 단일 분자와 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상술한 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 개선용 조성물 및 창상 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체는 비변형 bFGF와 거의 동일한 세포 증식효과를 가지며, 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체는 고온 등에서 물리화학적인 안정성 증가를 통해 생리활성의 저하를 최대한으로 경감시키고, 체내외에서의 잔존 시간을 증가시킴으로써 기존의 비변형 bFGF보다 향상된 효능을 갖는다. 본 발명의 조성물을 의약, 화장품 및 의약부외품과 같은 체외에서의 제형에 사용한다면 피부 개선 및 창상 치료에 큰 진전을 가져올 수 있다.
염기성 섬유아세포 성장인자, 폴리에틸렌글리콜, 컨쥬게이트, 페길화
Description
본 발명은 사람으로부터 유래된 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자의 변이체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자의 N-말단 또는 C-말단에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)로 모노-페길화된 변이체 및 그의 용도에 관한 것이다.
섬유아세포 성장 인자(FGF)는 1974년 Gospodarowicz (Nature, 249:123-127(1974)))에 의해 처음 소개되었다. 소의 뇌로부터 분리된 유사분열촉진인자는 뇌하수체로부터 분리된 것과 다른 것임이 추후 보고 되었다. 이들은 유사한 생물학적 활성을 가지나 아미노산 서열 및 등전점이 서로 다르기 때문에, 이들 두 인자에 대해서 각각 산성(acidic) 및 염기성(basic) FGF로 명명했다. 산성 FGF(aFGF) 및 염기성 FGF(bFGF)는 내피세포, 평활근 세포, 부신피질 세포, 전립선 및 망막 상피 세포, 과돌기 신경 교세포, 성상세포, 크론도사이트(chrondocyte), 근원세포 및 조골세포를 포함하는 다수의 중배엽- 및 신경외배엽- 유래세포의 일반적인 증식 능력에 영향을 미치는 일종의 헤파린 결합 성장인자(Heparin binding growth factor) 그룹에 속하는 것으로 분류되고 있다(Burgess and Maciag, Ann . Rev . Biochem . 58:584(1989)).
FGF는 세포증식을 자극하는 유사 분열촉진 반응을 유도할 뿐 아니라, 대다수의 세포 유형을 자극하여 비유사 분열촉진 방식으로 반응하기도 한다. 이들 활성은 상처부위로의 세포이동 촉진(화학 주성), 새로운 혈관 형성의 개시(맥관형성), 신경 재생의 조절(향신경성), 특정 세포 단백질 발현, 세포 외 간질생성 및 치유 과정에서 중요한 세포 생존의 자극 또는 억제를 포함한다(Burgess, W.H. and Maciag, T. Ann . Rev . Biochem . 58:584-588(1989)). 세포 성장 촉진작용과 함께 이들 성질은, 상처 치유를 촉진하기 위한 치료, 혈전증, 동맥경화증 등에 대한 치료 등에서 섬유아세포 성장인자의 사용에 관한 근거를 제공한다. 따라서 FGF는 외상의 치유를 촉진하기 위해서(Davidson, J. M., et al. J. Cell Bio . 100:1219-1227(1985)), 심장 질환 및 외과수술에서 심근층 손상을 최소화하기 위해서(미국 특허 제4,378,347호), 및 신경단위 생존 및 축색 확대를 증가시키기 위해서(Walicke, P., et al. Proc . Nat . Acad . Sci . USA 83:3012-3016(1986)) 제시되었다.
bFGF는 분자량 약 18 kDa에 달하는 염기성 단백질(pI 9.58)로서 뇌하수체에서 주로 분비되며 다양한 중배엽 유래 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 혈관 내막 세포 및 평활근 세포의 성장을 촉진하는 단백질로서 외상치료 및 맥관 형성에 탁월한 효능을 나타내고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 유지하며, 정상적인 세포의 성장을 돕고 상처로부터의 회복을 촉진하고, 그 치유작용을 수행하는 것으로 알려져 있다(Pilcher BK., et al. J. Biol Chem . 272(29):18147-18154(1997)). 아울러 bFGF는 두피 내의 혈액 순환과 모근 세포를 활성화시켜 주는 것으로 보고되고 있다(Kristen L. Mueller. et al. J. Neurosci . 22(2):9368-9377(2002)).
그러나 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 펩티드 성장 인자들의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, 특히 bFGF의 경우 그 구조상에 이황화결합을 형성하지 않는 4개의 시스테인 잔기를 가짐으로 인하여 특히 그 안정성에 많은 영향을 받는다는 문제점이 있다.
또한 bFGF와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 플라즈마 반감기 및 프로테아제 열화에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 방해한다. bFGF를 더욱 효과적으로 용도를 개발하기 위해서는 체내에서의 안정성 외에도 체외에서의 물리 화학적 안정성을 향상 시켜야 의약부외품 및 크림 등의 화장품에서의 사용이 증가할 것이다.
이러한 물리화학적 안정성을 우리가 원하는 단백질에 부여하는 법으로서 폴리에틸렌글리콜 고분자를 단백질에 공유결합으로 영구적으로 붙여서 안정성과 산알칼리하에서의 안정성을 향상시키는 방법이 제한적이나마 다양하게 시도되어 왔다 (Maria A Longo et al. J. Chem . Technol . Biotechnol . 74:25-32(1999); P. Christakopoulos et al. Carbohydrate Research 314:9599(1998)).
폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG)은 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 의약 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한 적절하게 결합시키면 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 결합된 단백질의 분자량을 증가시키는 것에 의해, 신장여과를 감소시키고 외부항원을 인식하는 세포와 항체로부터 단백질을 보호하며 분해효소에 의한 단백질의 분해도 감소시킬 수 있다. 이와 같이 단백질에 결합 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000-100,000으로, PEG 분자량이 1,000 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. PEG의 분자량 범위가 1,000-6,000인 것은 전신에 분포하고 신장을 통해 대사되며, 특히 분자량 40,000의 PEG 분자는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어지는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 단백질 및 폴리에틸렌글리콜(PEG) 모두에 공유 결합된 결합 모이어티(moiety)를 통해 단백질을 PEG와 같은 중합체에 결합시킴으로써 각종 단백질 분해효소에 의한 가수분해가 극복될 수 있음은 여러 특허와 논문에 기술되어 있다(대한민국 특허 등록 제0689212호). 또한, 이런 PEG 결합 생체 분자는 임상적으로 유용한 특성을 갖는 것을 보여주었다(Inada, et al., J. Bioact . and Compatible Polymers, 5:343(1990); Delgado, et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249(1992); 및 Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91(1993)).
상기한 종래기술 중 몇몇은 단백질의 더 나은 물리적 및 열적 안정성을 보이 며, 효소적 열화에 대한 민감성을 보호하고, 증가된 용해도, 생체 내에서 더 길어진 순환반감기. 감소된 클리어런스(clearance), 감소된 면역원성과 항원성 및 감소된 독성을 보인다.
통상의 PEG와 단백질의 결합에는 이와 같은 장점 외에 결점도 존재한다. 즉, PEG는 대개 결합할 단백질의 하나 또는 그 이상의 자유 라이신(lysine, Lys) 잔기에 공유결합을 통해 결합하게 되는데, 이때 단백질의 표면 부위 중 단백질의 활성도와 직접적인 관계가 있는 부위가 PEG와 결합할 경우, 그 부위는 더 이상 생물학적 기능을 수행할 수 없게 되어 단백질의 활성도가 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나게 되므로 결합 위치에 따라 많은 종류의 PEG-단백질 컨쥬게이트들이 혼합물로 존재하게 되고, 따라서 원하는 컨쥬게이트를 순수 분리하는 과정이 복잡하고 어려워지게 된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 피부상태를 개선할 수 있고, 창상을 치료할 수 있는 펩타이드 접합체 물질을 개발하기 위하여, 다양한 종류의 변형된 인간 bFGF 펩타이드 접합체를 제조 및 스크리닝하고, 그 중 상술한 효능이 우수할 뿐만 아니라 안정성도 우수한 펩타이드를 선별함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체 있어서, 상기 bFGF 변이체는 그의 N-말단 또는 C-말단에 추가적인 Cys 잔기를 포함하며 상기 추가적인 Cys 잔기는 PEG(polyethylene glycol) 단일 분자와 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체를 제공한다.
본 발명자들은 피부상태를 개선할 수 있고, 창상을 효율적으로 치료할 수 있는 물질을 개발하기 위하여, 다양한 종류의 페길화(PEglyation)된 인간 bFGF-PEG 컨쥬게이트를 제조 및 스크리닝하였고, 그 중 상술한 효능이 우수할 뿐만 아니라 안정성도 우수한 bFGF-PEG 컨쥬게이트를 최종적으로 개발하였다.
본 발명은 모노-페길화된 bFGF 변이체에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 bFGF는 인간으로부터 유래한 bFGF로서, 바람직하게는 서열목록 제1서열의 bFGF로부터 유래된 것이다.
본 발명에서 이용되는 염기성 섬유아세포 성장 인자는 페길화(Pegylation)를 통하여 안정성이 향상되었다.
본 발명에서 명세서 용어 “염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)”는 분자량 약 18 kDa에 달하는 염기성 단백질(pI 9.58)로서 뇌하수체에서 주로 분비되며 다양한 중배엽 유래 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 혈관 내막 세포 및 평활근 세포의 성장을 촉진하는 단백질로서 외상치료 및 맥관 형성에 탁월한 효능을 나타내고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 유지하며, 정상적인 세포의 성장을 돕고 상처로부터의 회복을 촉진하고, 그 치유작용을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 네이티브(native) bFGF에 추가적인 Cys 잔기를 도입시켜 여기에 PEG를 컨쥬게이션 시키는 것이다. 추가적인 Cys 잔기는 bFGF의 N-말단 또는 C-말단에 도입시킬 수 있다. 네이티브 bFGF에 Cys 잔기를 도입하는 것은 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, 화학적 방법 또는 분자 생물학적 방법을 통하여 Cys 잔기를 도입시킬 수 있다.
PEG는 추가적인 Cys 잔기의 티올기에 컨쥬게이션되며, 이를 통하여, bFGF의 안정성, 예컨대, 인 비보 및 인 비트로 안정성이 크게 증가된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 추가적인 Cys 잔기는 서열목록 제1서열의 네이티브(native) bFGF의 C-말단에 결합된다. 보다 바람직하게는, C-말단에 추가적인 Cys 잔기가 도입된 본 발명의 bFGF(bFGF-Cys)는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “페길화(PEGylation)”는 목적의 단백질, 즉 bFGF에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 컨쥬게이션 시키는 것을 의미한다.
본 발명의 특징 중 하나는 bFGF의 모노-페길화이다. 용어 “모노-페길화”는 bFGF의 특정 위치에 PEG 단일 분자를 컨쥬게이션 시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “폴리에틸렌글리콜(PEG)"는 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 적합한 PEG는 다음의 구조식으로 표현된다: (OCH2CH2)n (상기 화학식에서 n 2 내지 4000의 정수이다) 또한, 본 발명에 적합한 PEG 분자는 CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2” 및 “(OCH2CH2)nO”를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 PEG는 다양한 말단기 및 “말단 캡핑”그룹을 갖는 구조를 포함 한다. 예를 들어, 상기 말단 캡핑 그룹은 C1 -20 알콕시기(예컨대, 메톡시)를 포함한다.
본 발명에서 페길화에 이용되는 PEG는 그 분자량에 특별한 제한은 없다. 바람직하게는, 페길화에 이용되는 PEG는 200-50,000 Da, 보다 바람직하게는 2000-50,000 Da, 보다 더 바람직하게는 2000-8000 Da, 가장 바람직하게는 4000-7000 Da의 분자량을 갖는다.
본 발명에서 추가적인 Cys 잔기가 도입되는 bFGF는 서열목록 제1서열의 네이티브 bFGF일 수 있으며 또한 내부의 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환되도록 변형된 bFGF일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 추가적인 Cys 잔기가 도입되는 bFGF 변이체는 서열목록 제1서열의 78번째 Cys 잔기 및 96번째 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것이다. 예를 들어, 78번째 Cys 잔기 및 96번째 Cys 잔기는 서로 독립적으로 Cys 이외의 다른 아미노산, 예컨대, Ala, Gly, Ser, Thr, Met, Tyr, His, Leu 또는 Ile으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 서열목록 제1서열의 78번째 Cys 잔기 및 96번째 Cys 잔기는 Thr으로 치환된다.
가장 바람직하게는, 78번째 Cys 잔기 및 96번째 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환되고 추가적인 Cys 잔기가 도입된 bFGF 변이체(C/T bFGF-Cys)는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 모노-페길화 bFGF 변이체는 다양한 방법을 통하여 제조할 수 있으 나, 시스테인의 티올기에 특이적으로 결합하는 메톡시 폴리에틸렌글리콜-말레인아마이드(methoxy PEG-Maleimide)를 사용하는 구체적인 일 실시예를 설명하면 다음과 같다: 메톡시 폴리에틸렌글리콜-말레인아마이드는 가수분해에 강한 우레탄 결합(urethane bond)으로 bFGF에 결합하여 가수분해에 약한 천연의 bFGF에 비하여 향상된 약동학 및 약리학적 성질을 가질 수 있고 화장품과 같은 체외에서 사용되는 제형상에서 더욱 향상된 열 등의 물리적 인자에 대한안정성을 가질 수 있다. bFGF와 컨쥬게이트 형성에 사용되는 메톡시 폴리에틸렌글리콜-말레인아마이드 유도체의 양은 적어도 염기성 섬유아세포 성장인자와 동일한 당량(equimolar)으로 가해 주어야 하며, C-말단의 시스테인의 티올기와의 완전한 반응을 유도하기 위해 과량 첨가(bFGF 1 몰 대 PEG의 몰비가 1-10배의 범위)하는 것이 바람직하다. bFGF를 용해하는 용매역할을 하는 완충용액은 인산염 완충용액이 바람직하며, pH는 6-8, 바람직하게는 6.5-7.5이다. bFGF와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응은 2-100시간 동안 4℃-25℃에서 실시하는 것이 바람직하다. 만일 반응시간이 2시간 미만이면 폴리에틸렌글리콜의 컨쥬게이션 효율에 문제가 있고, 100시간을 초과하면 알칼리 용액에 오래 노출되는데서 기인하는 단백질의 안정성 문제가 있다. 반응온도가 4℃ 미만이면 반응속도가 너무 느리다는 문제가 있고, 25℃ 초과하면 bFGF의 3차구조 유지가 어렵다는 문제가 있다. 만일, 컨쥬게이트를 제조할 때, 환원제의 존재하에서 실시하는 경우, bFGF와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응은 2-100시간 동안 4℃-25℃에서 실시하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 반응시간은 12-24시간, 온도는 4℃-10이다.
본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체는 천연의 bFGF에 비하여 생체내의 분해정도를 낮출 수 있을 뿐 아니라 생체외에서도 열 등의 물리화학적인 인자에 대해 안정성이 매우 우수하다.
또한, 본 발명의 페길화된 bFGF 변이체는 bFGF 1 분자 당 1 분자의 PEG가 bFGF의 말단 부위에 결합하기 때문에, bFGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않으며, 결국 천연의 bFGF 변이체의 고유한 활성에는 거의 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 거의 동일한 활성의 섬유아세포의 세포 성장 촉진능력을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선에 이용된다.
흥미롭게는, 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체는 창상 치료에 매우 탁월한 효능을 발휘하며, 이는 하기의 실시예에서 입증되고 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 폐쇄창(closed wound) 및 개방창(open wound)의 치료에 이용된다. 폐쇄창의 예는 좌상(contusion or Burise)을 포함하고, 개방창의 예는 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 결출상(Avulsion), 관통상(penetrated wound) 및 총상(gun shot wound)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물과 화장품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 모노-페길화된 bFGF 변이체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추 가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.
본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피 부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 bFGF 변이체와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 컨쥬게이트는 비변형 bFGF와 거의 동일한 세포 증식효과를 갖는다.
(ⅱ) 본 발명의 모노-페길화된 bFGF 변이체는 고온 등에서 물리화학적인 안정성 증가를 통해 생리활성의 저하를 최대한으로 경감시키고, 체내외에서의 잔존 시간을 증가시킴으로써 기존의 비변형 bFGF보다 향상된 효능을 갖는다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물을 의약, 화장품 및 의약부외품과 같은 체외에서의 제형에 사용한다면 피부 개선 및 창상 치료에 큰 진전을 가져올 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1: C-말단 시스테인을 가지는
bFGF
및 C/T
bFGF
의 제조
사람 유래의 cDNA로부터 (1) 5’-catatggctgctggtagtattaccacgctg-3’ 및 (2) 5’-ctcgagtcattaacagctcttagcagacattggaagaaaaag-3’의 서열을 갖는 프라이머(이 서열상에는 NdeI과 XhoI의 제한효소절단 서열이 포함되어 있으며, 또한 bFGF의 C-말단에 시스테인의 코돈에 해당하는 염기 서열이 추가되어 있다)로 중합효소연쇄반응을 통하여 bFGF의 C-말단에 시스테인이 추가된 bFGF-Cys의 DNA를 제조하였다.
먼저, bFGF 아미노산 서열 중 78번과 96번의 시스테인을 트레오닌으로 변경하기 위해 (3) 5’-gctatgaaggaagatggaaggttactggcttctaaatctgttacggatg-3’ 및 (4) 5’-aaccttccatcttccttcatagccaggtaacggttagcagtcactcc-3’의 서열을 갖는 프라이머를 설계하였다. 제조된 bFGF DNA를 주형가닥으로 해서 (1)번과 (4)번 프라이머를 사용하여 78번 시스테인을 트레오닌으로 변경한 C/T bFGF-Cys DNA의 5’쪽 단편을 완성하고, 동일한 방법으로 (2)번과 (3)번 프라이머를 사용하여 96번의 시스테인을 트레오닌으로 변경한 C/T bFGF-Cys DNA의 3’쪽 단편을 완성하였다. 그 후 두 가닥을 연결하고, (1) 및 (2) 프라이머를 사용하여 치환된 C/T bFGF-Cys의 DNA를 PCR을 통해 증폭하였다. 또한, 사람 유래의 cDNA로부터 (1) 및 (2) 프라이머를 사용하여 bFGF-Cys를 PCR 증폭하였다. 증폭된 DNA의 서열을 시퀀싱(sequencing)하여 정확한 서열의 bFGF-Cys 및 C/T bFGF-Cys임을 확인하였다. 증폭된 각각의 DNA에 NdeI과 XhoI의 제한효소(Fermentas, 미국)를 처리한 후 동일한 제한효소로 절단이 되어 준비된 pCGK 벡터에 T4 결합효소(Fermentas, 미국)를 사용하여 형질전환용 원형 플라스미드 벡터 2종을 준비하였다. 준비된 플라스미드는 염화칼슘 법을 사용하여 E. coli BL21(DE3)(Novagen, 미국) 균주명 및 구입처를 추가하여 주시기 바랍니다)에 형질전환 하였다. 즉, 100 mM의 염화칼슘에 의해 컴피턴트화(competent)된 대장균 균주를 준비한 후, 상기 제조된 2종의 벡터를 각각 넣고 43℃에서 1분 30초간 열처리하여 백터를 균주내로 삽입시키고 SOC배지 1 ml을 첨가한 후 37℃에서 45분간 배양하여 형질전환 균주를 준비하였다.
항생제 내성 유전자를 갖는 대장균을 선별하기 위해서 가나마이신 항생제 가 첨가된 LB(Luria-Bertani) 한천 배지에서 18시간 동안 1차 배양한 후 동일 배지에서 2차 배양을 진행하였다. 600 nm 파장에서의 흡광도가 약 0.7정도일 때 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Merck, 미국)를 사용하여 발현을 유도하였다. bFGF-Cys 및 C/T bFGF-Cys가 발현된 세포를 분리하기 위하여 원심 분리한 후 밑에 남아있는 펠릿을 회수하였다. 회수한 세포를 세포파쇄기(Microfluidizer, Microfludics, 미국)로 파쇄한 후 다시 원심 분리하여 상등액 만을 회수하였다. 이어, 에스피 세파로즈(SP Sepharose, Amersham, 미국)를 수행하여 상등액에서 단백질을 정제한 후, 헤파린 컬럼(heparin Sephadex, Amersham, 미국)을 사용하여 2차 정제를 수행하여 2종 단백질을 확보하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE, 질량분석기 및 고성능 액체 크로마토그라피 등으로 정성 한 뒤 bFGF 면역효소법(ELISA, R&D Systems, 미국)을 통해 천연의 bFGF에 대한 상대치로 정량분석 하였다. 확보된 DNA를 이용한 단백질의 1차 서열은 도 1과 같다.
실시예 2: bFGF-Cys-PEG와 C/T bFGF-Cys-PEG의 제조
유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 대장균 숙주의 발현으로부터 제조된 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자 2종을 동결 건조하였다. 동결 건조된 염기성 섬유아세포 성장인자 10 mg과 분자량이 5000인 메톡시 폴리에틸렌글리콜-말레인아마이드(썬바이오, 한국) 50 mg을 도데실라우릴황산나트륨(Sodium dodecyl lauryl sulfate: SDS, 시그마, 미국) 0.1%가 들어간 인산염 완충용액(50 mM, pH 7.0)에서 4℃에서 24시간 동안 반응시켜 염기성 섬유아세포 성장인자-폴리에틸렌글리 접합체 를 제조하고, 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 대하여 투석하였다.
접합체의 성공적인 합성은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-polyacrylamide electrophoresis)으로 확인을 하였으며(도 2), 약 18 kDa이었던 PEgylation이 안된 bFGF-cys 또는 C/T bFGF-cys-PEG이, 23 kDa의 크기로 변경된 것을 보아 한 분자의 PEG가 부착되었음을 알 수 있다. 또한, 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용한 정성시험에서도 확인을 수행하였다(도 3). 도 3은 각각 별도로 분석한 bFGF-Cys와 bFGF-Cys-PEG 두 물질을 혼합하여 분석한 경우에서 확연한 머무름 시간(retention time)의 지연을 통해 정성적으로 PEG가 정확하게 부착되었음을 알 수 있다. 화살표는 각각 bFGF-cys와 bFGF-cys-PEG를 가리킨다.
실시예 3: 나노화 컨쥬게이트의 제조
상기 실시예에서 얻은 bFGF-Cys-PEG 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 접합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 및 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 화장품 제조용으로 사용되었다. 동일한 방법으로 C/T bFGF-Cys-PEG 나노좀을 제조하였다.
제형예
1: 유연화장수
상기 실시예 3에서 제조된 bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀 또는 C/T bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| bFGF-Cys-PEG 또는 C/T bFGF-Cys-PEG 나노좀 | 0.001 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 6.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| PEG 1500 | 1.0 |
| 소듐히알루로네이트 | 1.0 |
| 폴리솔베이트 20 | 0.5 |
| 에탄올 | 8.0 |
| 방부제, 색소 | 적량 |
| 벤조페논-9 | 0.05 |
| 향 | 미량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합 계 | 100 |
제형예
2: 영양크림
상기 실시예 3에서 제조된 bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀 또는 C/T bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양 크림을 일반적인 영양 크림 제조방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| bFGF-Cys-PEG 또는 C/T bFGF-Cys-PEG 나노좀 | 0.001 |
| 메도우폼오일 | 3.0 |
| 세테아릴알콜 | 1.5 |
| 스테아린산 | 1.5 |
| 글리세릴스테아레이트 | 1.5 |
| 유동 파라핀 | 10.0 |
| 밀납 | 2.0 |
| 폴리솔베이트60 | 0.6 |
| 솔비탄 세스퀴올레이트 | 2.5 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 3.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.5 |
| 토코페릴아세테이트 | 0.5 |
| 방부제, 색소 | 적량 |
| 향 | 적량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합 계 | 100 |
제형예
3: 영양화장수
상기 실시예 3에서 제조된 bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀 또는 C/T bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양 화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| bFGF-Cys-PEG 또는 C/T bFGF-Cys-PEG 나노좀 | 0.002 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 4.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 세테아릴알콜 | 0.8 |
| 글리세릴스테아레이트 | 1.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.13 |
| 토코페릴아세테이트 | 0.3 |
| 유동파라핀 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 마카다미아너트오일 | 2.0 |
| 폴리솔베이트60 | 1.5 |
| 솔비탄세스퀴올레이트 | 0.5 |
| 카르복시비닐폴리머 | 1.0 |
| 방부제,색소 | 적량 |
| 향 | 적량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합 계 | 100 |
제형예
4: 에센스
상기 실시예 3에서 제조된 bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀 또는 C/T bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| bFGF-Cys-PEG 또는 C/T bFGF-Cys-PEG 나노좀 | 0.005 |
| 글리세린 | 10.0 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 5.0 |
| PEG 1500 | 2.0 |
| 알란토인 | 0.1 |
| DL-판테놀 | 0.3 |
| EDTA-2Na | 0.02 |
| 히드록시에틸 셀룰로오스 | 0.1 |
| 소듐히알루로네이트 | 8.0 |
| 카르복시비닐폴리머 | 0.2 |
| 트리에탄올아민 | 0.18 |
| 옥틸도데세스-16 | 0.4 |
| 에탄올 | 6.0 |
| 향, 방부제, 색소 | 적량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합 계 | 100 |
제형예
5: 상처치료용
하이드로
겔
상기 실시예 3에서 제조된 bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀 또는 C/T bFGF-Cys-PEG-함유 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 하이드로겔 패취(Hydrogel patch)를 제조하였다. 닥터브레이드와 롤러로 가공한 뒤 소성하여 3.5 X 3.5 cm2의 하이드로겔 박편을 만들어 실험에 사용하였다. 박편의 모양을 도 4에 기재하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| bFGF-Cys-PEG 또는 C/T bFGF-Cys-PEG 나노좀 | 0.005 |
| 글리세린 | 10.0 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 5.0 |
| 잔탄검 | 2.0 |
| 아크릴레이드 중합체 | 23 |
| 아가로스 | 2 |
| 호호바 오일 | 5 |
| 향, 방부제, 색소 | 적량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합 계 | 100 |
시험예
1:
bFGF
-
Cys
-
PEG
와 C/T-
bFGF
-
Cys
-
PEG
의 세포성장 효능 검증
제조된 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG의 활성도는 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res ., 48, 4266(1988))을 참조하여 마우스의 NIH 3T3 섬유아세포주를 이용하여 [3H]-티미딘의 흡수율로 측정하였다. 3T3 섬유 아세포주를 250 ㎖ 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 100% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 EMEM(Earle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 3T3 섬유 아세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양 용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 수집하였다. 이를 FBS가 함유되지 않은 EMEM 배양액에 재현탁한 후, 24 웰 조직 배양용 평판에 각 웰당 2 x 104 cells/0.3㎖의 배양액이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. 본 발명의 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG의 비교군으로 천연의 bFGF를 0.2% 소 혈장 알부민(bovine serum albumin)(w/v)이 함유된 EMEM 배양액으로 5 ng/㎖ 농도로부터 두 배씩 연속적으로 희석하여 각 웰에 0.3 ㎖씩 첨가한 후 37℃, 7% CO2 조건하에서 6시간 더 배양하였다. 그 후, 각 웰에 0.5μCi의 [3H]-티미딘 (Amersham, TRK 686, 68 Ci/mmol)을 넣고 밤새 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 각 웰에 0.25% 트립신 용액 0.1 ㎖씩을 넣고 37℃에서 5분간 방치한 후 세포들을 배양판에서 분리하였다. 10% FBS가 함유된 EMEM 배양액 0.5 ㎖씩을 각 웰에 첨가하고, 세포 포집기(12 well cell harvester, Millipore, 미국)를 사용하여 세포를 유리섬유 필터에 부착시켰다. 필터를 1 ㎖의 증류수로 1회 그리고 1 ㎖의 에탄올로 1회 각각 수세한 후 60℃에서 30분간 방치하여 건조시켰다. 건조된 필터를 2 ㎖의 섬광 칵테일(scintillation cocktail)과 함께 섬광 바이알(scintillation vial)에 넣고 30분간 상온에서 방치시킨 후, 섬광계수기(scintillation counter) (Beckman, U.S.A)로 세포 내에 흡수된 방사능 양을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 제조된 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG의 경우, bFGF에 비교해 거의 동일한 생리활성도를 나타냄을 알 수 있었다.
시험예
2: 제조된
bFGF
-
Cys
-
PEG
및 C/T
bFGF
-
Cys
-
PEG
의 열 안정성
제조된 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 천연의 bFGF를 20 ㎍/㎖의 농도로 조제하고 37℃에서 24시간 보관하였다. 이 시료를 원심 분리하여 변성된 단백질을 제거하고 상층액에 남아있는 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 천연의 bFGF를 면역효소법(ELISA, R&D Systems, 미국)으로 정량 하였다. 제조된 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG가 천연의 bFGF보다 잔존량이 높았다. NIH-3T3 세포(한국세포주은행)에 대한 MTT 분석(Scudiero, D. A., et al. Cancer Res . 48:4827-4833(1988))를 실시하여 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG의 열에 대한 안정성을 시험하였다. 24시간이 경과한 시료에서 bFGF보다 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG의 활성도가 더 높았음을 알 수 있었다(도 6).
시험예
3: 제조된
bFGF
-
Cys
-
PEG
, C/T
bFGF
-
Cys
-
PEG
및 천연의
bFGF
의 마우스 신장
효소액에
대한 구조적 안정성
건강한 마우스 한 마리를 도살한 뒤 약 1.5 g 무게의 신장을 절제하고 PBS로 세척하였다. 수술 칼로 신장을 잘게 자른 뒤 PBS용액 하에서 호모게나이져를 이용하여 세포를 잘게 마쇄하였다. 18,000 rpm에서 30분간 교반을 하여 상층액을 분리하여 신장 효소액을 제조하고, -70℃에서 냉동 보관하였다. 사전에 37℃로 조절한 마우스 신장 효소액 1 ㎖에 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 천연의 bFGF를 20 ㎍/㎖의 농도가 되도록 각각 배합하였다. 10분, 30분 및 2시간의 시간 간격으로 시료를 채취한 뒤 면역 효소법(ELISA)을 사용하여 잔존하고 있는 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 활성 bFGF의 양을 측정하였다. 제조한 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG가 천연의 bFGF에 비해 월등한 항효소 분해 효과가 있음을 알 수 있었다(도 7).
시험예
4: 제조된
bFGF
-
Cys
-
PEG
의 동물 모델에서의 상처 치유효과
마우스의 등 부위의 털을 제모한 후에 수술용 1회용 칼로 약 3 mm에서 5 mm사이가 되도록 상처를 내었다. 하루가 지난 후에 제조된 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 bFGF를 포함하는 하이드로겔 패취를 각각의 상처 부위에 도포하였다. 3일 후 동량의 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 bFGF를 포함하는 하이드로겔 패취를 상처 부위에 다시 부착하였다. 7일 후에 상처 치유 효과를 육안으로 식별하여 확인하였으며 결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8에서 보는 바와 같이 bFGF만을 처리한 상처 부위에 비하여 C/T bFGF-Cys-PEG 접합체 처리를 한 상처 부위에서 상처 치유 효과가 육안으로 확인되었다. 특히 PEG 접합체 처리를 한 상처 부위는 오랜 시간이 경과할수록 bFGF만을 처리한 상처 부위보다도 현저한 치료 효과를 나타내었다. 이러한 효과는 시험예 1, 2 및 3에서 보는 바와 같이 C/T bFGF-Cys-PEG 접합체가 bFGF보다 체외에서 훨씬 안정하고, 장기간에 걸쳐 상처 부위에서 세포 재생 작용을 하여 나온 결과로 판단된다. 아울러 위의 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 접합체를 포함하는 화장품 및 하이드로 겔의 경우 성장 인자의 활성을 유지하면서 증가된 생체 내 반감기로 인한 피부 개선 효과 및 창상 등의 치료 효과가 극명하리라 판단된다.
시험예
5: 제조된
bFGF
-
Cys
-
PEG
의 이용한 주름 개선 효과
30세 이상의 여성 20명(평균연령 37.5세)을 2 그룹(A 및 B)으로 나누어 A 그룹을 대상으로는 제형예 2의 크림을, B 그룹을 대상으로는 제형예에서 나노좀 성분을 제외한 공크림을 제조하여, 팔의 상박 2 x 2 ㎠의 면적에(2회/일, 0.2g/회) 8주간 도포한 후, 투명한 실리콘 재질의 용액을 이용하여 피부주름의 레플리카(Replica)를 떠서 피부주름측정기(SKIN VISIOMETER SV400, C+K Electronics GmbH. Germany)로 피부주름변화를 측정하였다. 레플리카의 상을 CCD 카메라로 3차원 분석하고, 각각의 주름의 거칠기(Rm: m은 1 이상의 정수)의 합을 주름의 개수로 나눈 값인 하기 식의 평균주름거칠기(Rz)로 주름개선 효과를 분석하였다: Rz = (R1+R2+R3+......+Rm-1+Rm)/(주름의 개수(m))
시험결과는 하기 표 6에 정리되어 있다.
| 항목 | 평균주름거칠기(Rz, ㎛) | |||||
| 실시예 | 비교실시예 | |||||
| T0 | T8 | △Rz | T0 | T8 | △Rz | |
| 피검자 1 | 137 | 95 | -42 | 127 | 110 | -17 |
| 피검자 2 | 125 | 93 | -32 | 135 | 108 | -27 |
| 피검자 3 | 121 | 91 | -30 | 129 | 112 | -17 |
| 피검자 4 | 140 | 100 | -40 | 123 | 100 | -23 |
| 피검자 5 | 125 | 80 | -45 | 132 | 109 | -23 |
| 피검자 6 | 110 | 95 | -15 | 124 | 95 | -29 |
| 피검자 7 | 140 | 88 | -52 | 131 | 113 | -18 |
| 피검자 8 | 115 | 77 | -38 | 120 | 100 | -20 |
| 피검자 9 | 123 | 89 | -34 | 147 | 135 | -12 |
| 피검자 10 | 111 | 93 | -18 | 142 | 115 | -27 |
| 평균 | - | - | -34.6 | - | - | -21.3 |
시험 결과, 8주 후 실시예(제형예 2를 적용한 경우)는 평균주름 거칠기가 34.6 ㎛가 낮아져(p< 0.01), 비교실시예에 비해 약 62.4% 이상 주름이 더 개선되었다. 따라서 bFGF-Cys-PEG의 나노좀을 포함하는 크림은 비교 실시예와 비교하여 상당히 우수한 피부주름 개선효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 한편, 피부의 보습효과와 함께 피부의 거스름 감소 등 피부개선효과에 대한 설문 및 문진 등 시험항목에 대해서도 전체 피검자에 대하여 bFGF-Cys-PEG의 나노좀을 포함하는 크림이 상당한 개선효과를 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 활용된 네이티브 bFGF, bFGF-Cys 및 C/T bFGF-Cys 서열이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG 접합체를 확인하는 SDS-PAGE 결과 이미지이다.
도 3는 본 발명에서 실시예에 의하여 제조된 bFGF-Cys-PEG 및 C/T bFGF-Cys-PEG 접합체를 HPLC로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 bFGF-Cys-PEG 및 bFGF-Cys-PEG 접합체가 함유된 상처치료용 하이드로 겔의 이미지이다.
도 5은 본 발명 실시예에 의하여 제조된 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 네이티브 bFGF의 세포의 성장 촉진 효능을 나타낸 실험 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 네이티브 bFGF의 열 안정성을 37℃ 하에서 비교한 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 bFGF-Cys-PEG, C/T bFGF-Cys-PEG 및 네이티브 bFGF의 마우스 신장 마쇄액 속에서의 안정성을 비교한 실험 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 C/T bFGF-Cys-PEG 와 네이티브 bFGF의 상처 치료 효과에 대한 마우스 실험 결과 이미지이다.
<110> Caregen, Inc.
<120> Mono-Pegylated Basic Fibroblast Growth Factor Variants and Uses
Thereof
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 155
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
20 25 30
Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
35 40 45
Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu
50 55 60
Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80
Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
85 90 95
Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr
100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
115 120 125
Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys
130 135 140
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
145 150 155
<210> 2
<211> 156
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bFGF-Cys
<400> 2
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
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Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
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<220>
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Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys
130 135 140
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser Cys
145 150 155
Claims (10)
- 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체 있어서, 상기 bFGF 변이체는 그의 N-말단 또는 C-말단에 추가적인 Cys 잔기를 포함하며 상기 추가적인 Cys 잔기는 PEG(polyethylene glycol) 단일 분자와 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 모노-페길화된(mono-PEgylated) bFGF(basic fibroblast growth factor) 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추가적인 Cys 잔기는 서열목록 제1서열의 네이티브(native) bFGF의 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 모노-페길화된 bFGF 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 bFGF 변이체는 서열목록 제1서열의 78번째 Cys 잔기 및 96번째 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 모노-페길화된 bFGF 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 PEG는 2000-50,000 Da의 분자량을 가지는 것을 특징 으로 하는 모노-페길화된 bFGF 변이체.
- 제 4 항에 있어서, 상기 PEG는 2000-8000 Da의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 모노-페길화된 bFGF 변이체.
- 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 개선용 조성물.
- 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 모노-페길화된 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물인 것 을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료인 것을 특징으로 하는 조성물.
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| KR20070111556A (ko) * | 2005-10-24 | 2007-11-22 | (주)케어젠 | 섬유아세포 성장인자의 기능을 가지는 펩티드 및 이를이용한 화장품 |
-
2008
- 2008-01-29 KR KR1020080009001A patent/KR100982178B1/ko active IP Right Grant
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| KR20210064042A (ko) * | 2019-11-25 | 2021-06-02 | 한국해양과학기술원 | 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 |
| WO2021107473A1 (ko) * | 2019-11-25 | 2021-06-03 | 한국해양과학기술원 | 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 |
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| JP2023505655A (ja) * | 2019-11-25 | 2023-02-10 | コリア インスティテュート オブ オーシャン サイエンス テクノロジー | 温度安定性およびタンパク質分解酵素抵抗性を向上させたｆｇｆ２ポリペプチド並びにその用途 |
| EP4067374A4 (en) * | 2019-11-25 | 2024-03-06 | Korea Institute of Ocean Science and Technology | FGF2 POLYPEPTIDE WITH IMPROVED TEMPERATURE STABILITY AND PROTEASE RESISTANCE AND USE THEREOF |
| CN114746436B (zh) * | 2019-11-25 | 2024-07-02 | 韩国海洋科学技术院 | 改善温度稳定性和蛋白酶抗性的fgf2多肽及其用途 |
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