JP2011503019A - 薬学的使用のための新規のニュールツリン複合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリオールと共役するニュールツリンタンパク質産物に、ならびに生物学的利用能増大を示す活性成分としてのニュールツリン複合体、好ましくはＰＥＧ化ニュールツリン複合体、またはその変異体に関する。

Description

本発明は、その血清半減期および薬物動態プロフィールを増大するためのヒトニュールツリンの修飾に関する。特に、本発明は、ポリオール部分、好ましくはポリエチレングリコールと共有結合されるニュールツリンまたはその生物学的活性断片を含む新規のニュールツリン複合体に関する。本発明はさらに、糖尿病および神経変性の療法、治療、予防および／または診断のための活性作用物質としてのニュールツリン複合体を含む生物学的利用能を有する製剤組成物に関する。

膵臓β細胞は、血糖レベル上昇に応答してインスリンを分泌する。ホルモンの中でもとりわけインスリンは、燃料代謝の調節に重要な役割を果たす。インスリンは、グリコーゲンおよびトリグリセリドの貯蔵を、ならびにタンパク質の合成を引き起こす。筋肉および脂肪細胞中へのグルコースの進入は、インスリンにより刺激される。Ｉ型真性糖尿病またはＬＡＤＡ（成人性潜伏型自己免疫性糖尿病、Pozzilli & Di Mario, 2001, ,Diabetes Care. 8: 1460-1467）に罹患している患者では、β細胞は、自己免疫性襲撃のために破壊されつつある。残存する膵島細胞により産生されるインスリンの量は低すぎて、血糖レベル上昇（高血糖症）を生じる。ＩＩ型真性糖尿病では、肝臓および筋肉細胞は、正常血中インスリンレベルに応答するそれらの能力（インスリン抵抗性）を失う。高血糖レベル（そして高血中脂質レベルも）は、順次、β細胞機能の減損を、そしてβ細胞死増大を引き起こす。興味深いことに、β細胞再生過程、例えば新生および複製は、ＩＩ型糖尿病におけるβ細胞量の損失を補償するようには見えず、したがって、長時間に亘って総β細胞量の低減を引き起こす。結局、外因性インスリンの適用が、血糖レベルの適切な制御のために、ＩＩ型糖尿病において必要となる。

β細胞が自己免疫性襲撃により破壊されつつあるＩ型糖尿病では、免疫系を調整し、島破壊を停止するかまたは強力に低減し得る治療が考案されてきた（Raz et al., 2001, Lancet 358: 1749-1753；Chatenoud
et al., 2003, Nat Rev Immunol. 3: 123-132；Homann et
al., Immunity. 2002, 3: 403-415）。しかしながら、ヒトβ細胞の相対的に遅い再生のため、このような治療は、それらが、β細胞再生を刺激し得る治療と組合される場合、よりうまくいく。

今日の一般的な抗糖尿病薬は、高および低血糖レベルの出現を完全に防止するのに十分良好に血糖レベルを制御するわけではないため、糖尿病は高不能状態の疾患である。しばしば、血糖レベル上昇は有毒であり、例えば腎症、網膜症、神経疾患および末梢血管性疾患のような長期合併症を引き起こす。β細胞の広範囲に亘る損失は、膵臓α細胞からのグルカゴン分泌の調節解除も生じ、これは、危篤な低血糖性事象の危険増大に関与する。肥満症、高血圧症、心臓疾患および高脂血症のような多数の関連症状も存在し、それらのために、糖尿病罹患者は実質的に危険にさらされる。

患者に関するクオリティ・オブ・ライフの減損とは別に、糖尿病およびその長期合併症の治療は、われわれの保健医療システムに漸増傾向を伴う莫大な財政上の負担を提示する。したがって、Ｉ型真性糖尿病およびＬＡＤＡの治療に関して、そしてＩＩ型真性糖尿病の後期段階の治療に関しても、膵臓インスリン産生β細胞の再生を誘導する因子を同定することが、当該技術分野では強く求められている。これらの因子は、その機能が一旦減損されると、内分泌腺膵臓の正常機能を回復し得るし、あるいはそうなった場合、Ｉ型糖尿病、ＬＡＤＡまたはＩＩ型糖尿病の発症または進行を防止し得る。

ニュールツリンは、胚性膵臓中で発現される分泌タンパク質である。組換えニュールツリンは、インスリン産生細胞へのマウス胚性幹細胞の分化を刺激することが示されている。さらに、膵臓中のニュールツリンレベル上昇を示すトランスジェニックマウスは、膵臓β細胞量の実質的増大を示す。これらの知見に基づいて、糖尿病のような膵臓性障害の治療のためのニュールツリンの使用が提案されてきた（例えば、ＷＯ０３／９９３１８およびＷＯ２００５／０５１４１５参照）（これらの開示内容は参照により本明細書中で援用される）。

ニュールツリンは、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミンおよびペルセフィンからなるＧＤＮＦファミリーのリガンド（ＧＦＬ）の一成員である。成熟ニュールツリンは、１０２のアミノ酸単量体からなる２３．６ｋＤａのサイズを有するホモ二量体である。各単量体は、３つの鎖内ジスルフィド結合を含有して、シスチン結節を形成する。付加的ジスルフィド架橋が、単量体を結びつけている。

ニュールツリンは、従来、神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン病、運動神経障害、脊髄損傷または聴覚障害のための治療として提案されてきた（ＷＯ９７／０８１９６、ＷＯ９９／０６０６４；Akerud et al. J Neurochem. 1999; 73(1): 70-78；Koeberle & Ball Neuroscience. 2002; 110(3): 555-567；Bilak et al. Mol Cell Neurosci. 1999; 13(5): 326-336；Perez-Navarro et al. Neuroscience. 2000; 98(1): 89-96；Rosenblad et al, Eur J Neurosci. 1999; 11(5): 1554-1566）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。

しかしながら、ラット脳中への対流強化型送達（ＣＥＤ）時に、ニュールツリンおよび関連因子ＧＤＮＦの分布容積は限定される、ということが判明した（Hamilton et al., Exp Neurol. 2001; 168(1): 155-161）。タンパク質は、典型的には、注射により投与されねばならない。注射後、ほとんどのタンパク質が身体から迅速に除去され、頻繁な注射を必要とする。われわれ自身の研究において、哺乳類におけるニュールツリンの皮下および静脈内注射後の生物学的利用能は低い、ということを見出した。皮下注射ニュールツリンの約１０％だけが、循環中に進入する。その結果、患者においてタンパク質の治療的に有用な血中レベルを達成することは難しい。

したがって、患者における利用能増強を有するニュールツリン変異体を開発し、それを用いて、「使用者に好都合な」タンパク質療法の必要性を満たすために、活性作用物質としてのニュールツリンが頻繁に注射されなければならないということのないよう、身体中のタンパク質療法の循環半減期（生物学的利用能）の延長方法を開発することが強く求められている。

したがって、本発明の基礎を成す問題は、その生物学的利用能を増強するニュールツリンの新規の変異体および処方物を提供することであった。

問題は、特許請求の範囲で特徴づけられる実施形態を提供することにより解決される。

本発明は、ヒトニュールツリンタンパク質産物と共有結合されるポリオール部分を含む新規のニュールツリン複合体に関する。

本発明は、さらに、活性成分としての少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と共役する少なくとも１つのニュールツリンタンパク質産物および／またはその生物学的活性断片を、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む製剤組成物に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、活性成分としての少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と共役する少なくとも１つの修飾ニュールツリンタンパク質産物またはその生物学的活性断片を、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む製剤組成物をそれを必要とする被験者に投与するための方法に関する。

活性成分としての少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と共役する少なくとも１つの修飾ニュールツリンタンパク質産物またはその生物学的活性断片を、低分子量物質と一緒に、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む製剤組成物をそれを必要とする被験者に投与するための方法を提供することは、本発明のさらなる態様である。

本発明の組成物は、膵臓性障害または神経変性疾患、特に膵臓性自己免疫障害、例えば自己免疫性糖尿病、例えばＩ型糖尿病またはＬＡＤを予防し、または治療するのに適しているが、ＩＩ型糖尿病を予防し、治療するのにも適している。
（発明の詳細な説明）

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような共有結合ポリオール部分を含むニュールツリン複合体、ならびにニュールツリン複合体、およびその変異体、誘導体または生物学的活性断片を含む製剤組成物を提供する。

具体的な定義が提示されない限り、関連して利用される用語、ならびに本明細書中に記載される実験室手順、技術および方法は、当該技術分野で既知のものである。標準化学記号および略語は、このような記号により表される正式名と互換的に用いられる。標準技術は、化学合成、化学分析、製剤調製、組成物、送達および患者の治療のために用いられ得る。標準技術は、組換えＤＮＡ法、オリゴヌクレオチド合成、組織培養等のために用いられ得る。反応および精製技術は、当該技術分野で一般に成し遂げられるように、または本明細書中に記載されるように、例えば、メーカーの使用説明書に従ってキットを用いて実施され得る。前記の技術および手順は、一般的に、当該技術分野でよく知られた慣用的方法に従って、そして本明細書全体を通して引用され、考察される種々の一般的なまたはより具体的な参考文献に記載されているように、実施され得る。

「類似体」という用語は、構造がニュールツリンに似ており、同様の機能を有するポリペプチドを指す。

「生物学的に活性な」または「生物学的活性」という用語は、本明細書中で用いる場合、ニュールツリン産物が、始原細胞、例えば幹細胞からのインスリン産生細胞の分化を誘導し、および／または刺激するか、および／またはin vivoまたはin vitroで、インスリン産生細胞、例えばβ細胞の保護、生存または再生を促進する、ということを意味する。本明細書中に開示されるような修飾ニュールツリンタンパク質産物の生物学的活性は、ＷＯ９３／０６１１６に、および米国特許出願第０８／５３５，６８１号に記載されたＧＤＮＦ活性の確定に関して開示されるような、あるいは本発明の実施例に記載されるような、標準in vitro検定で容易に確定され得る。

本明細書中で用いる場合、ニュールツリンの「断片」とは、任意の方法、例えばニュールツリンの酵素的消化および化学的切断（例えばＣＮＢｒ）、ならびにポリペプチドの物理学的剪断（これらに限定されない）により生成されるニュールツリンの一部を指す。ニュールツリンの断片は、例えば組換えＤＮＡ技術によっても、およびアミノ酸合成によっても生成され得る。

本発明で用いられるようなニュールツリンの「活性断片」または「生物学的活性断片」は、このような断片または前駆体がニュールツリンの同一の生物学的活性を示す場合、単独で、または関連分子またはそれと結合される残基、例えば糖またはリン酸塩の残基、あるいはポリペプチド分子の集合体と組合せて、ニュールツリンのポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体を指す。「生物学的活性断片」という用語は、始原細胞、例えば幹細胞からのインスリン産生細胞の分化を誘導し、および／または刺激するか、および／またはin vivoまたはin vitroで、インスリン産生細胞、例えばβ細胞の保護、生存または再生を促進するニュールツリン産物の断片を説明する。本明細書中に開示されるような修飾ニュールツリンタンパク質産物の断片の生物学的活性は、ＷＯ９３／０６１１６に、および米国特許出願第０８／５３５，６８１号に記載されたＧＤＮＦ活性の確定に関して開示されるような、あるいは本発明の実施例に記載されるような、標準in vitro検定で容易に確定され得る。

「相同体」という用語は、共通の先祖タンパク質配列に由来するニュールツリンに関連するポリペプチドに関連づけるために本明細書中で用いられる。相同体という用語は、遺伝子重複の事象により分離されるタンパク質間の関係に当てはまり得る。

「低分子量物質」という用語は、１００〜１２０００Ｄａの、好ましくは２００〜８０００Ｄａの、最も好ましくは約５００〜７０００Ｄａの平均分子量を有する物質を指す。

低分子量物質は、天然または合成のものである、そして複数の陰イオン基、例えばカルボン酸基および／または硫酸基を含有するポリ陰イオン性ポリマーであり得る。例えば、ポリ陰イオン性ポリマーは、低分子量硫酸化サッカリド、硫酸化シクロデキストリンまたは硫酸化合成ポリマー、例えばアクリル酸ポリマー、芳香族ポリマーおよび／またはポリアルコールから選択され得る。さらに特定的には、ポリ陰イオン性ポリマーは、低分子量ヘパリンまたはヘパリン誘導体、硫酸ヘパリン、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、化学修飾ヘパリン由来オリゴ糖（Wang等（2002）（上記）から列挙）、ヘパリン様オリゴ糖、硫酸デキストラン、硫酸化低分子量グリコサミノグリカン、デキストリン−２−スルフェート、硫酸セルロースおよび硫酸ナフタレンポリマー（例えば、PRO 2000）、ＰＡＶＡＳ（アクリル酸と硫酸ビニルアルコールとのコポリマー）、スルホン酸化ポリマーＰＡＭＰＳ［ポリ（２−アクリル−アミノ−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）］（分子量、例えば約７０００〜１２０００）、硫酸コンドロイチン、硫酸化シクロデキストリン、硫酸ラミナリン（Alban, S. in Carbohydrates in Drug Design (Ed. Z.J. Witczak, K.A.
Nieforth) Dekker, New York, 1997, pp 209）、硫酸ポリグリセリン（Turk,
H., Haag, R., Alban, S. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 162）、ポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）およびその誘導体、例えばラクトース修飾ポリ硫酸ペントサン、分別ＰＰＳ／低分子量ＰＰＳ、フコイダン、あるいはその誘導体または組合せから選択される。

低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）類似体、例えばエノキサパリン、ダルテパリンまたはフラグミンは、適切なポリマーの好ましい例である。それらは、ヘパリンの分別および／または限定酵素的または化学的消化により得られ、そして好ましくは約３０００〜約７０００ダルトンの平均分子量を有する（Weitz 1997、上記）。

「修飾ニュールツリンタンパク質産物」という用語は、本明細書中で用いる場合、化学修飾ニュールツリンタンパク質複合体、ならびに共有結合ポリオール部分を含む細胞発現複合体に関する。

化学修飾ニュールツリン複合体は、本明細書中の開示を考えれば当業者により、あるいは当該技術分野で既知の方法により、調製され得る。

本発明のニュールツリン複合体のポリオール部分は、線状または分枝鎖を有する任意の水溶性一または二機能性ポリ（アルキレンオキシド）であり得る。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかしながら、他のポリオール、例えばポリ（プロピレングリコール）、ならびにポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーが適切に用いられ得る、と当業者は認識する。他のニュールツリン複合体は、ニュールツリンを水溶性ポリマーと結合させることにより調製され得る。このようなポリマーの非限定例としては、他のポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えばポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが挙げられる。ポリアルキレンオキシドベースのポリマーの代替物として、有効非抗原性物質、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマー等が用いられ得る。

タンパク質複合体は、当該技術分野でよく知られた原核生物または真核生物細胞中でも発現され得る。

「ニュールツリン複合体」という用語は、ニュールツリンのアミノ酸と共有結合されるポリオール部分、例えばポリエチレングリコールを含むニュールツリンタンパク質産物に関する。アミノ酸は、Ｎ末端アミノ酸で、または任意の他のアミノ酸で部位特異的であり得る。ＰＥＧ複合体は、ニュールツリンタンパク質分子の任意の適切な部位と共有結合される1つまたは複数のＰＥＧ分子を含有し得る。

本明細書中で互換的に用いられる「ニュールツリンタンパク質産物」、「ニュールツリン産物」、「ニュールツリンタンパク質」または「ニュールツリン」という用語は、GenBank寄託番号ＮＰ_００４５４９（配列番号１、図３）として公表されているアミノ酸番号を有するニュールツリン前駆体の切断を生じる生物学的に活性なヒトニュールツリン産物との、あるいはヒトニュールツリン前駆体それ自体との同一性度、すなわち、７０％より多い、好ましくは８０％より多い、さらに好ましくは９０％より多い、もっとも好ましくは９５％より多い同一性度を有するタンパク質またはペプチド、その変異体または誘導体に関する。マウスおよびヒトタンパク質間の同一性度は約９１％であり、好ましい哺乳類ニュールツリンタンパク質は同様に高い同一性度を有する、と意図される。ニュールツリン産物およびヒトニュールツリンタンパク質または前駆体の同一性パーセンテージは、標準手法に従って、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いることにより、確定され得る。好ましくは同一性パーセンテージは、１００アミノ酸の長さの４つのギャップがそのアラインメントの助けとなるよう導入され得る場合、比較されている配列中の同一アミノ酸残基と一列に並ぶ２つの配列のうちの小さい方に見出されるアミノ酸残基のパーセンテージとして算定される。

「オルソログ」という用語は、特殊化により共通の先祖遺伝子から進化した異なる種におけるポリペプチドに関する。オルソログは、進化の過程で同一機能を保持する。

「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、ＰＥＧそれ自体ならびにその誘導体に関する。ポリマーＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（ｍ−ＰＥＧ）として一般に用いられ、この場合、一端は相対的に不活性なメトキシ基であり、一方、他端は、化学的修飾に付されるヒドロキシル基である。分枝鎖ＰＥＧも一般に用いられている。分枝腕の数（ｍ）は、３〜１００またはそれ以上の範囲であり得る。ヒドロキシル基は、さらに化学的修飾に付される。別の分枝鎖形態、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／２１４６９に記載されているものは、化学的修飾に付される単一末端を有する。さらに別の分枝鎖形態は、ＰＥＧ鎖の末端というよりむしろ、ＰＥＧ主鎖に沿って、反応性基、例えばカルボキシルを有する。これらのＰＥＧ形態のほかに、ポリマーはさらにまた、主鎖中に弱いまたは分解可能な連結を伴って調製され得る。例えば、Harrisは、米国特許出願第０６／０２６，７１６号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）において、加水分解に付されるポリマー主鎖中のエステル結合を伴ってＰＥＧが調製され得る、ということを示した。この加水分解は、より低分子量の断片へのポリマーの切断を生じる。エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーは、それらの化学的性質においてＰＥＧと密接に関連し、それらはその用途の多くにおいてＰＥＧの代わりに用いられ得る。

「ＰＥＧ化」という用語は、ポリエチレングリコール分子と、タンパク質であり得る物質との共有結合を包含する。タンパク質のＰＥＧ化は当該技術分野の状態で広範に知られており、例えばVeronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により再検討されている。ＰＥＧは、異なる官能基および異なる分子量を有するポリエチレングリコール、線状および分枝鎖ＰＥＧならびに異なる連結基を用いて、連結され得る（Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9
(1992(249-304))も参照）。

ＰＥＧ化は、好ましくは５〜４０ｋＤａの分子量のＮＨＳ活性化線状または分枝鎖ＰＥＧ分子を用いて、例えばＷＯ００／４４７８５に記載されたようなＰＥＧ化試薬を有する水溶液中で実施され得る。ＰＥＧ化は、Lu, Y. et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って固相でも実施され得る。

Ｎ末端アミノ酸での選択的ＰＥＧ化は、Felix, A.M., et al., ACS Symp. Ser 680 (Poly(ethylene glycol))
(1997) 218-238に従って実施され得る。選択的Ｎ末端ＰＥＧ化は、Ｎ−ＰＥＧ化アミノ酸誘導体をペプチド鎖のＮ末端アミノ酸と結合することにより、固相合成中に達成される。側鎖ＰＥＧ化は、Ｎ−ＰＥＧ化アミノ酸誘導体を成長中の鎖と結合することにより、固相合成中に実施される。併合Ｎ末端および側鎖ＰＥＧ化は、固相合成内で上記のように、またはアミノ脱保護化ペプチドに活性化ＰＥＧ試薬を適用することにより液相合成によって、プロセシングされる。

適切なＰＥＧ誘導体は、約５〜約４０ｋＤａ、さらに好ましくは約２０〜約４０ｋＤａ、最も好ましくは約３０ｋＤａの好ましい平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は、線状または分枝鎖ＰＥＧであり得る。

活性化ＰＥＧ誘導体は当該技術分野で知られており、例えばＰＥＧ−ビニルスルホンに関してはMorpurgo, M., et al., J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363-368に記載されている。線状鎖および分枝鎖ＰＥＧ種は、ＰＥＧ化断片の調製に適している。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧおよびメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホン（ｍは好ましくは約４５０〜約９００の整数であり、Ｒは、１〜６個の炭素原子を有する線状または分枝鎖の低級アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル等であり、メチルが好ましい）である。

本明細書中で用いる場合、「ＰＥＧ」または「ＰＥＧ部分」という用語は、線状および分枝鎖ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、加水分解的または酵素的に分解可能なＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ、デンドリマーＰＥＧ、ＰＥＧと1つまたは複数のポリオールのコポリマー、ならびにＰＥＧとＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸））のコポリマーを包含するよう意図されるが、これらに限定されない。

「ＰＥＧ化ニュールツリン」または「ＰＥＧ化により修飾されるニュールツリン」または「ポリエチレングリコール部分を含むニュールツリン複合体」という用語は、ＰＥＧ部分が共有結合されてこれらのＰＥＧ化タンパク質を形成する方法により産生されるニュールツリンタンパク質産物に関する。

「製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバント」という用語は、製薬的に用いられ得る製剤への活性成分（単数または複数）のプロセシングを促す1つまたは複数の薬学的および生理学的に許容可能な化合物、例えば賦形剤および補助剤に関する。詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版に見出され得る。

「非修飾対照ニュールツリンタンパク質産物」という用語は、対照として用いられる相互関連修飾ニュールツリンタンパク質産物と同一起源のニュールツリンタンパク質産物に関する。

「変異体」という用語は、本明細書中で用いる場合、ネイティブポリペプチドに比して、以下でさらに記載されるような1つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得るポリヌクレオチド変異体に関する。「変異体」という用語は、異種起源の相同的ポリペプチドも包含する。典型的には、ニュールツリン変異体は、例えば下記のように特定の検定を用いて確定され得るような、生物学的活性を、完全に、その実質的部分を、または少なくとも部分的に保持する。「変異体」という用語は、本明細書中で用いる場合、置換、付加または欠失によりタンパク質配列を変更して、当該技術分野でよく知られているような機能的に等価の分子を提供することにより修飾されたニュールツリンも包含する。後者は、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基により置換されて生物学的サイレント交換を生じる変更配列を包含する。

ニュールツリン変異体は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望のポリペプチドのin vitro化学合成により、調製される。欠失、挿入および置換が成されて、ニュールツリン生物学的活性を提示するタンパク質産物変異体を生じる、と当業者により理解される。

1つまたは複数の選択アミノ酸残基のこのような置換、挿入または欠失のための突然変異誘発技術は、当業者によく知られている（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））。

好ましい一実施形態では、アミノ酸変化は、成熟ヒトニュールツリンのアミノ酸４７〜６９、好ましくは５１〜６５の間の領域に導入される（図３に示されるようなアミノ酸１４１〜１６４、好ましくは１４７〜１６０）。これらのアミノ酸変化は、この領域中のアルギニン残基、例えばアルギニン残基５１、５２、５４、５６、５７、５８、６０、６１および／または６５の少なくとも１つの欠失または置換を含み得る。好ましいのは、中性または酸性アミノ酸、例えばグリシン、セリン、アラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸によるアルギニンの置換である。特に好ましいのは、グルタミン酸による置換、例えばＲ５１Ｅ、Ｒ５２Ｅ、Ｒ５４Ｅ、Ｒ５６Ｅ、Ｒ５７Ｅ、Ｒ５８Ｅ、Ｒ６０Ｅ、Ｒ６１ＥおよびＲ６５Ｅ、またはこれらの置換のうちの少なくとも２つを含むニュールツリン変異体である。

代替的には、および／または付加的には、例えば上記領域中のニュールツリンのアミノ酸残基、特にアルギニン残基は、ポリオール基との結合を助長するために、リシンにより置換され得る。成熟ヒトニュールツリン中にリシンは存在しないので、このような変化はポリオール基を用いた部位特異的修飾を可能にする。特に好ましいのは、上記領域中のリシンによる置換、例えばＲ５１Ｋ、Ｒ５２Ｋ、Ｒ５４Ｋ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５７Ｋ、Ｒ５８Ｋ、Ｒ６０Ｋ、Ｒ６１ＫおよびＲ６５Ｋ、またはこれらの置換のうちの少なくとも２つを含むニュールツリン変異体である。

ニュールツリン置換変異体は、除去されるヒトまたはマウスニュールツリンアミノ酸配列のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびにその場所に挿入される異なる残基を有する。このような置換変異体は、アミノ酸変化を生じることも生じないこともある種集団における天然ヌクレオチド配列変化により特性化される対立遺伝子変異体を包含する。

意外にも、開示されるような製剤組成物は、共役ニュールツリンを含まない製剤組成物と比較して、その活性成分、上記共役ニュールツリンおよび／またはその生物学的活性断片の生物学的利用能増大を示す、ということが本発明人等により判明した。ＰＥＧのようなポリオールとのニュールツリンタンパク質の共役は、ニュールツリン産物の血清半減期および生物学的利用能を改善する、ということを本発明は実証する。ニュールツリン産物の生物学的利用能の改善は、順次、皮下に適用された場合、注射部位での作用物質の蓄積またはプロセシングを低減し得るし、このようにして局所的耐容性を改善し得る。

本発明は、治療効果を有するために、非修飾対照ニュールツリンと比較してはるかに低い用量で、患者に活性作用物質としての本発明のニュールツリン複合体を適用する方法を提供する。これは、「使い勝手のよいタンパク質療法薬」に対する必要性を満たし、さらにまた、活性作用物質および／または製剤組成物を製造するためのコストをより低くし得る。

本発明のニュールツリン複合体は、非修飾ニュールツリンと比較してより高い水溶性も有し、これが活性作用物質の処方を簡単にし得る。

さらなる利点として、ポリオール、例えばＰＥＧをニュールツリンと結合すると、ニュールツリンに対する免疫原性を低減し、したがって中和抗体の形成または活性作用物質に対するアレルギー反応を低減し得る。

好ましくは、本発明のニュールツリンタンパク質産物は、ヒトニュールツリンまたはその生物学的活性断片である。ニュールツリンタンパク質産物は、好ましくは、組換え技術により産生されるが、それは、このような方法が高純度で多量のタンパク質を生じ得るし、細菌、植物、哺乳類または昆虫細胞系で発現される産物に限定されないためである。

組換えニュールツリンタンパク質産物としては、グリコシル化および非グリコシル化形態のタンパク質が挙げられる。概して、組換え技術は、ニュールツリンタンパク質産物をコードする遺伝子を単離すること、適切なベクターおよび／または細胞型中で遺伝子をクローニングすること、必要な場合には所望の変異体をコードするために遺伝子を修飾すること、そしてニュールツリンタンパク質産物を産生するために遺伝子を発現することを包含する。

代替的には、所望のニュールツリン産物をコードするヌクレオチド配列は、化学合成され得る。ニュールツリン産物は、遺伝暗号の変性または対立遺伝子変異、あるいは選択細胞によるタンパク質産物の産生を助長するために成される変更のために、コドン使用頻度を変えるヌクレオチド配列を用いて発現され得る、ということが意図される。

Kotzbauer et al., Nature 384: 467-470は、配列番号１として本明細書中で同定されるニュールツリンタンパク質に関するマウスｃＤＮＡおよびアミノ酸配列とヒトｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の同定を記載する。

本発明によるニュールツリン産物は、種々の手段により単離されるかまたは生成され得る。ニュールツリン産物を産生するための例示的方法は、特許出願ＷＯ９７／０８１９６（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。ニュールツリンタンパク質の発現のための種々のベクター、宿主細胞および培養増殖条件、ならびにニュールツリンタンパク質産物の変異体の合成方法も、本明細書中に記載される。大腸菌中でのニュールツリンタンパク質産物の発現に適した付加的ベクターは、特許番号ＥＰ０４２３９８０（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されている。

生物学的活性形態のタンパク質ニュールツリンは、精製ニュールツリンの分子量により確定され得るジスルフィド結合二量体である。細菌系中での発現後に単離される物質は、本質的には生物学的に不活性であり、単量体として存在する。生物学的に活性名ジスルフィド結合二量体を産生するためには、リフォールディングが必要である。細菌系中で発現されるニュールツリンのリフォールディングおよび成熟に適したプロセスは、ＷＯ９３／０６１１６に記載されたものと実質的に同様である。ニュールツリン活性の確定のための標準in vitro検定も、ＷＯ９３／０６１１６に、そして米国特許出願第０８／５３５，６８１号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたようにＧＤＮＦ活性を確定するものと実質的に同様である。

ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）としても知られている不活性、非毒性の大型分解可能ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のニュールツリンとの共有結合は、バイオテクノロジーおよび医療において重要な用途を有する。ニュールツリンのＰＥＧ化は、薬理学的改善を生じて持続時間を延長し、安全性を改善し（例えば、毒性、免疫原性および抗原性をより低くする）、効率を増大し、用量投与頻度を低減し、薬剤溶解性および安定性を改善し、タンパク質分解を低減し、そして制御薬剤放出を助長する。

本発明は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に連結されるニュールツリンタンパク質産物、例えば原核生物発現ニュールツリンである誘導体、またはその変異体の使用を、ならびにアシルまたはアルキル結合を介して1つまたは複数のポリエチレングリコール分子と結合されるニュールツリンまたはその変異体の使用を意図する。ＰＥＧ化は、当該技術分野で知られているペギル化反応のいずれかにより実行され得る。例えば、以下を参照されたい：Focus on Growth Factors, 3(2): 4-10, 1992；ＥＰ０１５４３１６（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）；ＥＰ０４０１３８４；およびＰＥＧ化に関して本明細書中で引用されるその他の出版物。

本発明の製剤組成物は、ＰＥＧ化ニュールツリンを含有しない製剤組成物と比較して、哺乳類、例えばヒトにおける活性成分の生物学的利用能増大を示す（図２参照）。好ましくは、ＰＥＧ化ニュールツリンは、活性成分の生物学的利用能の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍の増大を提供する量で存在する。

生物学的利用能の増大は、本出願の実施例に示されるように確定され得る。さらに特定的には、所定量または用量で活性成分を含有する組成物は、ＰＥＧ化を伴わない同一用量の活性成分を含有する製剤組成物と比較される。両組成物の生物学的利用能は、実験動物、例えばマウスへの皮下投与後の血漿濃度から確定され得る。好ましくは、血漿濃度は、少なくとも１２０分、好ましくは２４０分、最も好ましくは２４時間の期間に亘って測定される（図２参照）。

本発明の製剤組成物は、任意の有効な経路により、例えば経口、鼻、直腸、肺、局所、経皮または非経口経路の投与による投与のために適合され得る。したがって、組成物は、固体または液体組成物、例えば錠剤、カプセル、粉末、クリーム、ゲル、軟膏、溶液、乳濁液、懸濁液、凍結乾燥物等であり得る。しかしながら、好ましくは、組成物は、注射または注入により、さらに好ましくは注射により、例えば皮下または静脈内注射により投与される。製剤組成物は、好ましくは水溶液である。

活性成分および任意に低分子量物質、例えばポリ陰イオン性ポリマーのほかに、製剤組成物は、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバント、例えば緩衝剤、張度を調整するための作用物質、安定化剤、充填剤、崩壊剤、増粘剤等を含み得る。

製剤組成物は、治療的有効量または用量で、活性成分を含有する。治療的有効用量は、活性成分の種類、治療されるべき疾患の種類および多様性、ならびに投与の型に依っている。活性成分としてニュールツリンを含有する非経口組成物に関しては、治療的有効用量は、好ましくは１日当たり約０．００１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは約０．０５〜約１００ｍｇ、最も好ましくは約０．０１〜約５ｍｇの範囲である。

組成物は、好ましくは、哺乳類、特にヒトに投与される。したがって、組成物は、ヒトおよび獣医学的医療に適している。組成物は、神経変性または膵臓性障害、特に膵臓性自己免疫障害、例えばＩ型糖尿病およびＬＡＤＡまたはＩＩ型糖尿病の予防および／または治療のために特に適している。

本明細書中に記載されるようなニュールツリン複合体は、当業者に知られているような任意の適切な手段により、好ましくは経腸的にまたは非経口的にまたは膵臓に直接局所的に、投与され得る。具体的用量は、体重、体表面積または器官サイズを考察することにより算定され得る。上記の組成物の各々を包含する治療のための適切な投与量を確定するために必要な計算のさらなる精査は、当業者によりルーチンに成され、そしてルーチンに実施される作業の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量−応答データと関連して利用される投与量を確定するための確立された検定の使用により確認され得る。上記の症状を治療するための方法に関与する最終投与量レジメンは、担当医により、薬剤の作用を修飾する種々の因子、例えば患者の年齢、症状、体重、性別、食餌、任意の感染の重症度、投与時間およびその他の臨床的因子を考察して確定される。試験が実行される場合、種々の疾患および症状の治療のための適切な投与量レベルに関するさらなる情報が明らかになる。

本明細書中に記載されるようなニュールツリン複合体の連続投与または持続性送達は、所定の治療のために有益であり得る、と考えられる。連続投与は機械的手段により、例えば注入ポンプを用いて成し遂げられ得るが、一方、連続的またはほぼ連続的な投与のその他の方式が実行され得ることが意図される。例えば、化学的誘導体化または封入は、確定投与量レジメンに基づいて、予測可能量での、連続的存在の作用を有する徐放性形態のタンパク質を生じ得る。したがって、ニュールツリンタンパク質産物は、このような連続投与を達成するために誘導体化されるかまたは別の方法で処方されるタンパク質を包含する。

さらなる好ましい実施形態では、in vitroまたはin vivoでのインスリン産生細胞の分化を刺激するために、ニュールツリン複合体は、始原細胞、例えば幹細胞に直接送達され得る。本発明のこの実施形態では、ニュールツリン複合体は、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で付加され得る。

本明細書中に開示されるようなニュールツリン複合体は、単一療法に、あるいは他の薬学的作用物質を伴う組合せ療法で、用いられ得る。例えば、それは、膵臓疾患および／または肥満症および／または代謝症候群の治療または予防に適した他の薬学的作用物質と一緒に、特に、始原細胞からのインスリン産生細胞の分化を刺激しおよび／または誘導するのに適したその他の薬学的作用物質とともに投与され得る。さらに、それは、免疫抑制活性を有する薬学的作用物質、例えばＷＯ２００５／５１４１５に開示されているような抗体、ポリペプチドおよび／またはペプチド性または非ペプチド性低分子量物質と一緒に用いられ得る。

本発明のさらなる一実施形態は、野生型ヒトニュールツリンと比較して、少なくとも１つ、例えば１、２、３または４つのアミノ酸変化を含むヒトニュールツリンの変異体である。ヒトニュールツリンの変異体は、ネイティブポリペプチドに比して、詳細に上記されたような1つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得る。ニュールツリン変異体は、上記のように調製され得る。

好ましい一実施形態では、アミノ酸変化は、成熟ヒトニュールツリンのアミノ酸４７〜６９、好ましくは５１〜６５の間の領域に存在する（図３に示されるようなアミノ酸１４１〜１６４、好ましくは１４７〜１６０）。これらのアミノ酸変化は、この領域中のアルギニン残基、例えばアルギニン残基５１、５２、５４、５６、５７、５８、６０、６１および／または６５の少なくとも１つの欠失または置換を含み得る。好ましいのは、中性または酸性アミノ酸、例えばグリシン、セリン、アラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸によるアルギニンの置換である。特に好ましいのは、グルタミン酸による置換、例えばＲ５１Ｅ、Ｒ５２Ｅ、Ｒ５４Ｅ、Ｒ５６Ｅ、Ｒ５７Ｅ、Ｒ５８Ｅ、Ｒ６０Ｅ、Ｒ６１ＥおよびＲ６５Ｅ、またはこれらの置換のうちの少なくとも２つを含むニュールツリン変異体である。

ヒトニュールツリンの変異体も好ましく、この場合、代替的には、および／または付加的には、例えば上記領域中のアミノ酸残基、特にアルギニン残基は、リシンにより置換される。それにより、ポリオール基とのニュールツリン変異体の部位特異的結合が助長される。特に好ましいのは、上記領域中のリシンによる置換、例えばＲ５１Ｋ、Ｒ５２Ｋ、Ｒ５４Ｋ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５７Ｋ、Ｒ５８Ｋ、Ｒ６０Ｋ、Ｒ６１ＫおよびＲ６５Ｋ、またはこれらの置換のうちの少なくとも２つを含むニュールツリン変異体である。

本発明によるニュールツリン置換変異体は、除去されるヒトニュールツリンアミノ酸配列のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびにその場所に挿入される異なる残基を有する。このような置換変異体は、アミノ酸変化を生じることも生じないこともある種集団における天然ヌクレオチド配列変化により特性化される対立遺伝子変異体を包含する。

本発明はさらに、それを必要とする被験者に製剤組成物を投与するための方法を提供するが、この場合、上記組成物は、少なくとも１つのポリオール、例えばＰＥＧと共役される薬学的活性量または用量の少なくとも１つのニュールツリンタンパク質産物、またはこのような共役ニュールツリンの生物学的活性断片を活性成分として、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む。

本発明はさらに、それを必要とする被験者に製剤組成物を投与するための方法を提供するが、この場合、上記組成物は、薬学的活性量または用量の少なくとも１つの修飾ニュールツリンタンパク質産物、またはその生物学的活性断片を活性成分として、低分子量物質と一緒に、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む。

以下の図および実施例は、本発明を例証し、以下で特許請求されるような本発明の非限定的実施形態である。図面の以下の説明を考察すれば、本発明の多数の付加的態様および利点が当業者に明らかになる。

細胞培養中のＰＥＧ化ニュールツリンの生物学的活性：レポーター細胞株を漸増濃度のニュールツリンまたはＰＥＧと共役されるニュールツリン（ＰＥＧ化ニュールツリン）に曝した。その結果生じたレポーター遺伝子活性（ｙ軸上に示される相対発光量）を、最終濃度の試験作用物質に対してプロットした（ｎｇ／ｍｌでｘ軸上に示される；図１ＡおよびＢ）。非修飾ニュールツリンの２つの独立して産生されるバッチを実験対照として用い（PeproTech；Ｌｏｔ０８０５１１２およびＬｏｔ０１０６１１２）、それらの相対活性を３つのＰＥＧ化複合体（モノ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−ニュールツリン、モノ−ｍＰＥＧ−ＣＨＯ−ニュールツリンおよびモノ−ＣＥＳ０３１０−ニュールツリン）の活性と比較した。所定の値は、少なくとも３つのウエル±Ｓ．Ｄ．の平均である。種々の試験の算定ＥＣ_５０を以下に示す：ニュールツリン（Ｌｏｔ０８０５１１２、非修飾タンパク質）：ＥＣ_５０＝２．２ｎｇ／ｍｌ、ニュールツリン（Ｌｏｔ０１０６１１２、非修飾タンパク質）：ＥＣ_５０＝１．２ｎｇ／ｍｌ、モノ−ＣＥＳ０３１０−ニュールツリン：ＥＣ_５０＝１２ｎｇ／ｍｌ（図１Ａ）およびニュールツリン（Ｌｏｔ０１０６１１２、非修飾タンパク質）：ＥＣ_５０＝３．８ｎｇ／ｍｌ、モノ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−ニュールツリン：ＥＣ_５０＝９．７ｎｇ／ｍｌおよびモノ−ｍＰＥＧ−ＣＨＯ−ニュールツリン：ＥＣ_５０＝７．４ｎｇ／ｍｌ（図１Ｂ）。 マウスにおける試験作用物質の皮下投与後の薬物動態（ＰＫ）試験：図２ＡおよびＢは、マウスへの０．０５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ（図２Ａ）または０．５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ（図２Ｂ）ニュールツリンまたはＰＥＧ化ニュールツリンの投与後の種々の時点でのニュールツリン血漿濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。その結果生じた血漿レベルを、ニュールツリンＥＬＩＳＡ検定により確定した。時点０は、このＥＬＩＳＡ検定を用いたマウス血清中のニュールツリンに関する平均バックグラウンドシグナルを示す。バックグラウンド値を、１２（図２Ａ）または１１（図２Ｂ）未処理マウスの血清からの独立測定値から算定した。他の指示値は、３動物±ＳＤからの測定血清レベルの平均である。図２Ａは、２つの個々の実験（モノ−ＮＨＳ−ニュールツリン_Ｅｘｐ．１および_Ｅｘｐ．２）に由来するニュールツリン複合体モノ−ＮＨＳ−ニュールツリンに関するＰＫデータを示す。図２Ｂは、マウスを０．０５ｍｇ／ｋｇ ＢＷモノ−ＮＨＳ−ニュールツリンで処理したさらに別の実験に由来するデータを示す。すべての測定時点に及ぶ曲線下面積（ＡＵＣ）分析に関して、基線を０．６ｎｇ／ｍｌ（０時点での平均バックグラウンド値）：ニュールツリン非修飾タンパク質：１８．８ｎｇ^＊分／ｍｌ、モノ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−ニュールツリン_Ｅｘｐ１：４０９ｎｇ^＊分／ｍｌ、モノ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−ニュールツリン_Ｅｘｐ２：９１８ｎｇ^＊分／ｍｌ、モノ−ＣＥＳ０３１０−ニュールツリン：ＥＣ_５０＝１４２ｎｇ^＊分／ｍｌ（図２Ａ）、ならびにニュールツリン非修飾タンパク質：３２４ｎｇ^＊分／ｍｌ、モノ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−ニュールツリン：１１５７ｎｇ^＊分／ｍｌおよびモノ−ｍＰＥＧ−ＣＨＯ−ニュールツリン：８４５ｎｇ^＊分／ｍｌ（図２Ｂ）に設定した。ニュールツリン血清レベルの曲線下面積（ＡＵＣ）分析（図２ＡおよびＢ）に関して、基線を０．６ｎｇ／ｍｌニュールツリンに設定したが、これは、非処理マウスの血清中で確定される平均バックグラウンドレベルに対応する。 米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により公表されたようなヒトニュールツリン前駆体のタンパク質配列（寄託番号：ＮＰ_００４５４９）生物学的ならびに薬理学的活性形態に対応する成熟タンパク質の配列を、太字で強調している。 図４Ａ．ヒトニュールツリンおよび突然変異化ニュールツリン変異体の発現。ニュールツリンおよびニュールツリン変異体を発現するＨＥＫ−２９３細胞からの濃縮上清のネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロット（成熟ヒトニュールツリンの配列に従って位置に番号を付した。Ｒ：アルギニン、Ｅ：グルタミン酸）。図４Ｂ．ニュールツリンＥＬＩＳＡ：大腸菌から発現されるヒト組換えニュールツリンを用いた代表的標準曲線。 ニュールツリンの生物学的活性の定量：図５Ａ．細胞ニュールツリンの生物学的活性検定：漸増血清濃度と組合せた漸増濃度での大腸菌からの外因性ヒト組換えニュールツリンにより刺激されるチロシンヒドロキシラーゼレポーター遺伝子活性。図５Ｂ．ニュールツリン変異体の生物学的活性（ｎ．ｄ．：検出されず）。 異なる脊椎動物種からのニュールツリン配列のアラインメント：成熟ヒトニュールツリンのアミノ酸４７〜６９を示す（成熟ヒトニュールツリンペプチドの配列に従って位置に番号を付した。GenBank寄託番号ＮＰ_００４５４９、成熟ペプチド ａａ９６〜１９７）。ヒトニュールツリンと異なるアミノ酸変異を太字で印刷し、下線を付してある（括弧内はGenBank寄託番号）。 ニュールツリン発現構築物のＤＮＡ配列：Ｋｒ−Ｇ３−Ｈ６−Ｇ３−Ｘａ−ｒｈニュールツリン（ｗｔ） ｐＭＡベクター中でクローン化されるＫｒ−Ｇ３−Ｈ６−Ｇ３−Ｘａ−ｒｈニュールツリン（ｗｔ）。センスおよびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を、制限部位ならびにその結果生じるコード領域のアミノ酸配列と一緒に示す。 抗ニュールツリン抗体ＥＬＩＳＡ 抗ニュールツリン抗体ＥＬＩＳＡ：左：抗ニュールツリンＩｇＧを用いる標準曲線、右：抗ニュールツリンＩｇＧ／ＩｇＭを用いる標準曲線

本発明の１つまたはいくつかの態様に関して考察される好ましい実施形態もすべて、他の態様のすべてに関連する、ということに留意すべきである。

以下の実施例により本発明の多用途性を例証するが、それはそれらの実施例により限定されない。

実施例１−ニュールツリンのＰＥＧ化
ポリエチレングリコール基（ＰＥＧ）を、ＰＥＧ化と呼ばれるプロセスによりニュールツリンと共役させた。この技術は治療用タンパク質の修飾のために広範に用いられ、当該手順は当業者によく知られている。本発明においては、単一ＰＥＧ分子を、ホモ二量体の２つのサブユニットのうちの１つのＮ末端アミノ酸と連結することにより、モノＰＥＧ化ニュールツリン複合体を製造した。結合ＰＥＧのサイズおよび構造が異なり、ならびにＰＥＧをタンパク質と共役させる製造方法が異なるモノＰＥＧ化ニュールツリンの２つの異なる複合体を製造した。約５ｋＤａの線状ＰＥＧ試薬（ｍＰＥＧ−スクシニミジルスクシネート；NOF, Japan）を用いて、本明細書中で「モノ−ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−ニュールツリン」として開示される複合体を製造した。このいわゆる「ＮＨＳ法」は、可溶性タンパク質のＰＥＧ化のために最も一般的に用いられる方法である。さらに、線状５ｋＤａポリエチレングリコールブチルアルデヒド（Nektar、０８２Ｍ０Ｈ０１）を用いて、「モノ−ｍＰＥＧ−ＣＨＯ−ニュールツリン」として開示される複合体を生成した。特定実験条件下で、ＮＨＳエステルまたはアルデヒドは、タンパク質およびペプチドの遊離アミノ基と効率的に反応する。「モノ−ＣＥＳ０３１０−ニュールツリン」として開示されるさらに別の複合体では、ニュールツリンホモ二量体の１つの鎖のＮ末端アミノ酸を、従来技術で既知のＰＥＧ化法を用いて、約５ｋＤａの６腕分枝鎖ＰＥＧと共役させた（例えばＤＥ２００５ １００ ０４ １５７．０、ＥＰ １ ６３１ ５４５ Ａ２；Ｗ０４／１０８６３４；ＷＯ０７／０２５７６３；ＣＡ２５２８６６７（これらに限定されない）参照）。ニュールツリンはリシン残基を含有せず、したがって、上記のＰＥＧ化反応は、主に、ニュールツリンホモ二量体のＮ末端アミノ酸の反応性アミノ基を介して、Ｎ末端ＰＥＧ化をもたらすと予測される。当業者に既知の標準生化学的方法を用いて、ＰＥＧ化産物の質（サイズおよび純度）を確証した。
実施例２−ＰＥＧ化ニュールツリン複合体またはその変異体の生物学的活性

細胞ベースの受容体検定を用いて、ニュールツリン複合体の生物学的活性を評価した。その表面にニュールツリン受容体を発現する細胞株中のレポーター遺伝子構築物を活性化するニュールツリンまたはそのＰＥＧ化複合体の強さを確定した。この検定では、両方のＰＥＧ化ニュールツリン複合体が、非修飾ニュールツリンに比して３〜１０倍低減されることが見出された（図１ＡおよびＢ）。

細胞表面でニュールツリンに関する受容体を発現するヒト神経芽細胞腫細胞株ＴＧＷ（ＪＣＲＢ０６１８）を、ニュールツリンレポーター遺伝子構築物により安定的にトランスフェクトした。レポーター遺伝子構築物は、反復結成応答素子（ＳＲＥ）の転写的制御下で、特に調節素子であるルシフェラーゼ遺伝子を含有する。これらの細胞中では、ルシフェラーゼの発現は、例えばニュールツリンとその表面受容体の結合により、ＭＡＰＫ経路の活性化に応答して刺激される。９６ウエルプレート中で検定を実行する。ウエルにルシフェリン基質を付加することによりルシフェラーゼ活性を測定し、ルミネッセンスモードで操作するAnalyst読取装置（Molecular Devices）で読出しを生じた。
実施例３−ＰＥＧ化ニュールツリン複合体またはその変異体の生物学的利用能の改良

マウスにおけるＰＫ試験の助けを借りて、ニュールツリンのＰＥＧ化複合体の相対的生物学的利用能を概算した（図２ＡおよびＢ）。これらの実験では、タンパク質をマウスの頸領域に皮下注射した。その後、特定のニュールツリンＥＬＩＳＡ検定を用いて、タンパク質の送達後の限定時点で、ニュールツリンの血清濃度を確定した（図２ＡおよびＢ）。ニュールツリンで処理されなかったマウスからの血清を用いて検出されるようなマウス血清の存在下での相対的に高いバックグラウンドシグナル（ゼロ点値）のため、このニュールツリンＥＬＩＳＡ検定の感度を限定した。０．０５０ｍｇ／体重（ＢＷ）１ｋｇの非修飾ニュールツリンの注射後、ニュールツリン血清レベルは、任意の時点でこのバックグラウンドレベルを有意に超えなかった。一方、同量のＰＥＧ化ニュールツリンを適用した場合、ＰＥＧ修飾の種類に関係なく、注射タンパク質の血清レベルの有意の増大が検出された（図２Ａ）。注射非修飾ニュールツリンの量を１０倍増大する（０．５ｍｇ／体重１ｋｇ）と、６０、９０、１２０および１８０分の時点で、血清中にタンパク質が有意に検出された（図２Ｂ）。Ｔ検定を用いてこの観察の意義を確証し、ｐ値＜０．０５を算定した。さらにまた、０．５ｍｇ／体重１ｋｇ用量で投与されたＰＥＧ化ニュールツリン誘導体の血清レベルは、非修飾タンパク質のものより２〜３倍高かった（図２ＡおよびＢ）。

本明細書中に提示されるニュールツリン複合体は一貫して、非修飾タンパク質のレベルに比してより高い血清レベルを実証する。要するに、ニュールツリンのＰＥＧ化は、ニュールツリンの生物学的利用能を有意に改善する。
実施例４−ニュールツリン変異体

ニュールツリンの塩基性パッチ（成熟タンパク質のアミノ酸５１〜６５）内に位置する塩基性アルギニン残基を、部位特異的ＰＣＲベースの突然変異誘発により、酸性グルタミン酸残基に取り替えた。要するに、所望の突然変異：
Ｒ５１Ｅ、Ｒ５２Ｅ、Ｒ５４Ｅ、Ｒ５６Ｅ、Ｒ５７Ｅ、Ｒ５８Ｅ、Ｒ６０Ｅ、Ｒ６１Ｅ、Ｒ６３ＥまたはＲ６５Ｅ（成熟ヒトニュールツリンペプチドの配列に従って位置に番号を付す。GenBank寄託番号ＮＰ_００４５４９、成熟ペプチドａａ ９６〜１９７。この配列は図３にも示されている；Ｒ：アルギニン；Ｅ：グルタミン酸）を導入するミスマッチプライマーを用いてＰＣＲベースの突然変異誘発により、付加的Ｎ末端真核生物分泌シグナルペプチドを伴う成熟ヒトニュールツリンのコード配列を修飾した。

その結果生じたプラスミドを精製し、シーケンシングによりコード配列の正確さを検査した。真核生物発現のために、ＨａｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を側面に配置することにより、ｐＣＤＮＡ３．１＋ベクター（Invitrogenカタログ番号Ｖ７９０−２０）中にコード配列をクローニングした。

真核生物発現のために、各々２５ｍｌ培地を有する１７５ｃｍ^２組織培養容器上で培養されるＨＥＫ−２９３細胞中で、これらのベクター、ならびにトランスフェクション対照としての空対照ベクターおよびＧＦＰ発現ベクターを、一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後に培地採取を実施して、限外濾過カラムを用いて培地上清を各々約０．４ｍｌに濃縮した。

検出のためにニュールツリン特異的抗体を用いて、ネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロットにより、野生型ヒトニュールツリンおよび突然変異化変異体の発現を先ず制御した（図４参照）。対照として、大腸菌から発現されたヒト組換えニュールツリンを用いた。

図４Ａは、ヒト野生型ニュールツリン（ｗｔ）ならびにすべての修飾ニュールツリン変異体が、Ｒ６３Ｅを除いて、同様の量で発現された、ということを示す。ニュールツリン変異体の見掛けの質量は、野生型ニュールツリンと同様の２０〜２５ｋＤａの範囲であった。

ニュールツリンに特異的なＥＬＩＳＡにより、発現ニュールツリンの収量を確定した。要するに、ニュールツリン含有濃縮培地上清からのニュールツリン捕捉のために、ウサギ抗ニュールツリン抗体をマイクロウエル上で被覆した。洗浄後、ビオチン接合ヤギ抗ニュールツリン抗体を用いたルミネッセンス読出しと、その後のペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジンの使用により、捕捉ニュールツリンを定量した。大腸菌から発現されるヒト組換えニュールツリンを用いて、標準曲線を確立した（図４Ｂ参照）。

さらに、発現ニュールツリン変異体の生物学的活性を、特定細胞検定で定量した。検定原理は、Tanaka et al., 2002, 2003（Tanaka M, Xiao H,
Kiuchi K. Heparin facilitates glial cell line-derived neurotrophic factor
signal transduction. Neuroreport. 2002 Oct 28; 13(15): 1913-6；Tanaka M, Xiao H, Hirata Y, Kiuchi K. A rapid assay for glial cell
line-derived neurotrophic factor and neurturin based on transfection of cells
with tyrosine hydroxylase promoter-luciferase construct. Brain Res Brain Res
Protoc. 2003 May; 11(2):119-22）による、ヒトＴＧＷ神経芽細胞腫細胞株中で安定的に発現されるニュールツリンによるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）レポーター遺伝子構築物の誘導を示す実験に基づいている。要するに、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）レポーター遺伝子構築物を過剰発現するＴＧＷ細胞を、ニュールツリン含有試料で処理して、ニュールツリンシグナル伝達によるＭＡＰＫ経路の誘導をもたらす。レポーター遺伝子構築物は、反復血清応答素子（ＳＲＥ）の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有する。ルシフェラーゼの発現は、ＭＡＰＫ経路活性化に依っている。９６ウエルプレート中で検定を実行する。ニュールツリン媒介性ルシフェラーゼ発現をルシフェリンの付加により測定し、ルミネッセンス読取装置で解析する。

漸増血清濃度と組合せて、標準として大腸菌中で発現さえるヒト組換えニュールツリンを用いるニュールツリンの生物学的活性の定量を実証する代表的実験を、図５Ａに示す。

野生型組換えヒトニュールツリンならびにすべてのニュールツリン変異体が、Ｒ６３Ｅを除いて、同量で発現されて、１．２〜１．７ｇ／ｌのタンパク質濃度を生じ、そしてすべての発現変異体が、０．３２〜０．８９ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する野生型組換えヒトニュールツリンと比較して、in vitroで同様の生物学的活性を示したということを、図５Ｂは示す（図５Ｂ参照）。比較のために用いられる大腸菌からのヒト組換えニュールツリンは、おそらくは試料中で適正にリフォールディングされなかったニュールツリンの一部に起因する２．２０ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有するより弱い効力を示した（図５Ｂ参照）。

したがって、ニュールツリンの「ヒール」領域における修飾、例えば塩基性パッチ中への負荷電産生アミノ酸の導入は、概して、ニュールツリンの生物学的活性を損なわない、ということを図５は示す。ヒール領域中の塩基性または酸性アミノ酸からの修飾がニュールツリンの生物学的活性を妨害するということを従来技術が示しているということは意外である（上記のような他のＧＦＬとの配列および構造比較を参照）。

ニュールツリン変異体Ｒ６３Ｅ発現の不首尾は、この部分では、アルギニンからグルタミン酸への変化が耐容されない、ということを示す。それにもかかわらず、アミノ酸変化の完全変化を生じない他の修飾は、機能的である。既知のニュールツリン相同体の配列比較は、Ｒ６３Ｅ変異体が、カモノハシ（Ornithorhynchus anatinus）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis
domestica）およびニワトリ（Gallus gallus）のヒトニュールツリン相同体中に存在する、ということを示す。さらにまた、位置５２、５７、５８および６１でのアルギニン残基の天然変異体は、異なるニュールツリン相同体中に存在する（図６参照）。

改善された生物学的利用能を有する生物学的に活性なニュールツリン変異体を作製するために、本発明人等は、「ヒール」領域中の塩基性アルギニンをリシンに置き換えた。アルギニンおよびリシンは構造的に関連するので、このような交換は、最低限に限って、ニュールツリン分子の構造に影響を及ぼすと予測される。このような変化は、実質的アミノ酸変化を耐容することが示されるタンパク質の一領域中のリシン側鎖の第一アミンを介してニュールツリンの部位特異的定方向ＰＥＧ化を可能にしており、したがって、このことは、生物学的活性に関しては重要でない。この反応は、リシンが成熟ネイティブヒトニュールツリン配列中に存在しないため、非常に特異的である。活性化ＰＥＧと他のアミンとの反応は、反応条件、例えばｐＨ、温度および反応時間を最適化することにより最小限にされる。「ヒール」領域の塩基性パッチ内にＰＥＧ修飾を置くことにより、以下の２つの目的が達成される：（ｉ）タンパク質活性に及ぼす作用を最小限にしながら、タンパク質ＰＥＧ化の利点（腎クリアランス低減、免疫原性低減、タンパク質安定性改善による生物学的利用能改善）が得られること、ならびに（ｉｉ）この領域におけるＰＥＧ化は、負荷電細胞表面プロテオグリカンとの相互作用を防止することにより塩基性パッチを遮蔽すると予測され、これもタンパク質生物学的利用能を改善すると予測される。

第一段階では、ヒトコドン使用のために最適化される成熟ヒトニュールツリンのコード配列（真核生物分泌のための付加的Ｎ末端シグナルペプチドを有する）、ならびに付加的精製タグ（因子Ｘａを用いたこの精製タグの切断のための付加的部位を有する６つのヒスチジン残基の反復）が、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発により修飾される。ここで、コドンは、アルギニン残基５１、５２、５４、５６、５７、５８、６０、６１、６３または６５で、リシン残基に関するコドンと交換される。

その結果生じる本発明におけるＫｒ−Ｇ３−Ｈ６−Ｇ３−Ｘａ−ｒｈニュールツリンと呼ばれる発現構築物は、以下の特徴を含有する：
・Ｋｒ：ヒトコドン使用のために最適化される細胞質分泌に関するマウスクリングル含有膜貫通タンパク質２、アミノ酸１〜２６、シグナルペプチド（GenBank寄託番号ＮＰ_０８２６９２）のＤＮＡ配列（アミノ酸配列：ＭＧＴＰＨＬＱＧＦＬＬＬＦＰＬＬＬＲＬＨＧＡＳＡＧＳ；配列番号２）。
・Ｇ３：ヒトコドン使用のために最適化されるグリシンスペーサーのＤＮＡ配列（アミノ酸配列：ＧＧＧ；配列番号３）。
Ｈ６：ヒトコドン使用のために最適化される精製目的のための６−ヒスチジンタグのＤＮＡ配列（アミノ酸配列：ＨＨＨＨＨＨ；配列番号４）。
Ｘａ：ヒトコドン使用のために最適化される因子Ｘａプロテアーゼ認識部位のＤＮＡ配列（アミノ酸配列；ＩＥＧＲ；配列番号５）。因子Ｘａプロテアーゼはアルギニンの後でＣ末端を切断する。
ｒｈニュールツリン：ヒトコドン使用のために最適化される成熟組換えヒトニュールツリンのＤＮＡ配列（アミノ酸配列：ＡＲＬＧＡＲＰＣＧＬＲＥＬＥＶＲＶＳＥＬＧＬＧＹＡＳＤＥＴＶＬＦＲＹＣＡＧＡＣＥＡＡＡＲＶＹＤＬＧＬＲＲＬＲＱＲＲＲＬＲＲＥＲＶＲＡＱＰＣＣＲＰＴＡＹＥＤＥＶＳＦＬＤＡＨＳＲＹＨＴＶＨＥＬＳＡＲＥＣＡＣＶ；配列番号６）。位置５１、５２、５４、５６、５７、５８、６０、６１、６３または６５の単一アルギニンコドンは、それぞれのニュールツリン変異体発現構築物中のリシンコドンＡＡＧにより置き換えられる。

ｐＭＡベクター中でクローン化されるＫｒ−Ｇ３−Ｈ６−Ｇ３−Ｘａ−ｒｈニュールツリン（ｗｔ）の完全ＤＮＡ配列を、図７（配列番号７）に示す。
実施例５−ニュールツリン変異体のＰＥＧ化

その結果生じた構築物を、上記のような修飾ニュールツリン変異体の発現のためにＨＥＫ−２９３細胞中にトランスフェクトされる真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋中でクローン化する。

限外濾過により、そして導入精製タグを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、発現ニュールツリン変異体を精製する。

その結果生じるニュールツリン変異体調製物の構造、純度および生物学的活性を、上記のようなネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロットおよびニュールツリン活性検定により検査する。

十分な収量で発現され、許容可能な純度に精製される生物学的に活性ナニュールツリン変異体を、異なる単分散ＰＥＧでの共有的修飾のために用いる。このＰＥＧは、好ましくは２．５〜３０ｋＤａのサイズを有し、線状または分枝鎖であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルで活性化される。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、第一アミンと自発的反応性であり、タンパク質の効率的ＰＥＧ化を提供する。他のＰＥＧ誘導体は、例えば、異なるサイズを有し、単分散性でないか、あるいは異なる分枝パターンを有する分子（これらに限定されない）であって、同様に結合化学が適用され得る。

反応後、精製タグを因子Ｘａにより導入プロテイナーゼ部位で切断し、ＰＥＧ−ニュールツリン変異体を、サイズ排除および／またはアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。

多数の付加的精製タグおよびプロテアーゼ部位／組換えプロテアーゼ組合せが当該技術分野でよく知られており、Ｈｉｓ−Ｔａｇおよび／または因子Ｘａ部位／因子Ｘａ切断を取替え得る。代替的には、導入ＰＥＧ化部位（単数または複数）を含有するニュールツリンタンパク質は、クロマトグラフィー法により、精製タグを用いずに、真核生物発現系の上清から、あるいは過剰発現細菌の溶解物または上清から精製され得る。

その結果生じるＰＥＧ−ニュールツリン変異体調製物の構造、純度および生物学的活性を、上記のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット、ネイティブＰＡＧＥ／ウエスタンブロットおよびニュールツリン活性検定により検査する。

マウスおよびラットへの５０μｍｏｌ／ｋｇ ｓ．ｃ．の皮下投与後のその薬物動態行動に関して、in vitroで十分な生物学的活性を示す精製ＰＥＧ−ニュールツリン変異体をin
vivoで検定する。基線での、ならびに投与後０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、６および８時間目に、ニュールツリンＥＬＩＳＡにより、血漿ニュールツリン濃度を確定する。

野生型ニュールツリンと比較して生物学的利用能改善を示す選択ＰＥＧ−ニュールツリン変異体を、５０μｍｏｌ／ｋｇを毎日１回、６日間、ｎｅｏＳＴＺラットに皮下投与することにより、in vivoでのそれらの効力に関して試験する。β細胞機能を検定するために、ビヒクル対照および野生型ニュールツリン群と比較して、血糖を毎日測定し、膵臓インスリン含量を６日処理後に測定する。
実施例６−ＰＥＧ化ニュールツリンの免疫原性能力

ヒト組換え野生型ニュールツリンは、２週間より長い間の成体マウスへの投与後の抗ニュールツリン抗体の出現により実証されるような免疫原性能力を有する。抗ニュールツリン抗体を、特定の検定で検出した。要するに、組換えヒトニュールツリンをマイクロプレート上で被覆して、血清抗体を捕捉した。洗浄後、ビオチン接合ヤギ抗ＩｇＧ抗体またはヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を用いたルミネッセンス読出しと、その後のペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジンの使用により、捕捉抗ニュールツリン抗体を定量した。血清中に希釈した抗ニュールツリンＩｇＧおよび抗ニュールツリンＩｇＭを用いて、標準曲線を確立した（図８参照）。

薬理学的に活性名タンパク質のＰＥＧ化はそれらの免疫原性能力を低減するので、生物学的利用能改善および効力持続を示す選択ＰＥＧ−ニュールツリン変異体を、成体マウスにおいて５０μｍｏｌ／ｋｇを毎日１回、２８日間皮下投与することにより、それらの免疫原性能力に関して試験する。ビヒクル対照および野生型ニュールツリン群と比較して、毎週、抗ニュールツリン抗体ＥＬＩＳＡにより、抗ニュールツリン抗体の出現を測定する。

Claims (33)

1. ヒトニュールツリンタンパク質産物またはその生物学的活性断片と共有結合されるポリオール部分を含むニュールツリン複合体。
2. 配列番号１で記述されるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチド、あるいはその相同体、オルソログ、変異体、類似体、誘導体、生物学的活性断片または生物学的活性突然変異体を含む請求項１記載のニュールツリン複合体。
3. 前記ポリオール部分がポリエチレングリコール部分である請求項１または２記載のニュールツリン複合体。
4. 前記ポリオール部分が一本鎖ポリオール部分である請求項１〜３のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
5. 前記ポリオール部分が分枝鎖ポリオール部分である請求項１〜３のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
6. 前記ポリオール部分がポリアルキレングリコール部分である請求項１〜３のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
7. ネイティブヒトニュールツリンと同一のまたはそれより高いin vivoニュールツリン活性を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
8. ヒトニュールツリンと比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
9. 前記アミノ酸変化が成熟ヒトニュールツリンのアミノ酸４７〜６９、好ましくは５１〜６５の間である請求項８記載のニュールツリン複合体。
10. アルギニン残基５１、５２、５４、５６、５７、５８、６０、６１または６５のうちの少なくとも１つが欠失されるかまたは置換される請求項８または９のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
11. 少なくとも１つのアルギニン残基が中性または酸性アミノ酸残基、例えばグルタミン酸により置換される請求項１０記載のニュールツリン複合体。
12. 少なくとも１つのリシン残基が導入される請求項８〜１０のいずれか一項に記載のニュールツリン複合体。
13. 活性成分としての少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と共役する少なくとも１つのニュールツリンタンパク質産物および／またはその生物学的活性断片を製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む製剤組成物。
14. 前記ニュールツリンタンパク質産物がヒトニュールツリンタンパク質産物またはその生物学的活性断片である請求項１３記載の組成物。
15. 前記修飾ニュールツリンタンパク質産物がモノ−ＰＥＧ化され、単一ポリエチレングリコール分子鎖を含む請求項１３または１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記修飾ニュールツリンタンパク質産物がオリゴ−またはポリ−ＰＥＧ化され、２、３、４つまたは数個のポリエチレングリコール分子鎖を含む請求項１３または１４のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記修飾ニュールツリンタンパク質産物が少なくとも１つの線状ポリエチレングリコール分子鎖を含む請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記修飾ニュールツリンタンパク質産物が少なくとも１つの分枝鎖ポリエチレングリコール分子鎖を含む請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記ポリエチレングリコール分子が１００〜１００００Ｄａの、好ましくは２００〜８０００Ｄａの、最も好ましくは１０００〜７０００Ｄａの平均分子量を有する請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記ポリエチレングリコール分子が前記修飾ニュールツリンタンパク質産物のＮ末端アミノ酸に連結される請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 前記ポリエチレングリコール分子がアシルまたはアルキル結合を介して前記修飾ニュールツリンタンパク質産物に連結される請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記ポリエチレングリコール分子がＯＨ−、ＯＣＨ_３−またはＯＥｔ−基により終結される請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 非修飾対照ニュールツリンタンパク質産物と比較して活性成分の生物学的利用能増大を示す請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記修飾ニュールツリンタンパク質が活性成分の生物学的利用能の少なくとも２倍の、好ましくは少なくとも５倍の、さらに好ましくは少なくとも１０倍の増大を提供する量で存在する請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
25. 注射または注入のための請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 皮下または静脈内注射のための請求項２５記載の組成物。
27. 膵臓または神経変性障害の予防または治療のための請求項１３〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. Ｉ型真性糖尿病、ＬＡＤＡおよびＩＩ型真性糖尿病の予防または治療のための請求項２７記載の組成物。
29. 哺乳類、特にヒトへの投与のための請求項１３〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
30. 野生型ヒトニュールツリンと比較して少なくとも１つの、例えば１、２、３または４つのアミノ酸変化を含むヒトニュールツリンの変異体。
31. アミノ酸変化が請求項９〜１２に定義されたものと同じである請求項３０記載のヒトニュールツリンの変異体。
32. 活性成分としての少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と共役する少なくとも１つの修飾ニュールツリンタンパク質産物またはその生物学的活性断片を、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む製剤組成物をそれを必要とする被験者に投与するための方法。
33. 活性成分としての少なくとも１つのポリエチレングリコール分子と共役する少なくとも１つの修飾ニュールツリンタンパク質産物またはその生物学的活性断片を、低分子量物質と一緒に、製薬上許容可能な担体、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含む製剤組成物をそれを必要とする被験者に投与するための方法。

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