KR100861914B1 - 인슐린 유사 성장인자―１의 활성을 가지는 펩타이드 및그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)로부터 유래되고, 특정 아미노산 서열을 포함하는 IGF-1-미미킹(mimicking) 펩타이드, 그리고 이를 포함하는 피부 상태(conditions)의 개선 또는 치주질환의 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 IGF-1-미미킹 펩타이드는 천연의 인간 IGF-1와 동일한 기능 또는 작용을 할 수 있으며, 안정성이 천연 IGF-1과 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, IGF-1 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘하며, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

인슐린 유사 성장인자-1, 펩타이드, 화장품, 구강용품, 피부, 치주, 주름

Description

인슐린 유사 성장인자―１의 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도{Peptides Having Activities of Insulin Like Growth Factor―１ and Their Uses}

도 1은 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)의 아미노산 서열 및 본 발명의 펩타이드로 선정된 부위를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 실시예에 의한 펩타이드의 합성과정을 나타내는 개략도이다.

도 3은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 서열목록 제2서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 서열목록 제3열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 서열목록 제4서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 서열목록 제5서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드들의 각질세포의 성장에 대한 효과를 표현한 그래프이다. 도 8에서, x 축에 기재된 숫자는 처리된 펩타이드의 종류 및 양을 보여준다. 예를 들어, “1_10” 및 “1_1000”은 서열목록 제1서열의 펩타이드 10 ng 및 1000 ng을 처리한 결과를 나타낸다.

도 9a는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드를 처리한 각질세포의 세포 성장효과를 보여주는 현미경 관찰 사진이다. 펩타이드 1-5는 각각 서열목록 제1서열-제5서열의 펩타이드를 의미한다.

도 9b는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드를 처리한 섬유아세포의 세포 성장효과를 보여주는 현미경 관찰 사진이다. 펩타이드 1-5는 각각 서열목록 제1서열-제5서열의 펩타이드를 의미한다.

도 10은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드를 이용한 세포배양 시 증가된 프로콜라겐 생성량의 증가를 나타낸 그래프이다. PeP 1-5는 각각 서열목록 제1서열-제5서열의 펩타이드를 의미한다.

도 11a-11b는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드를 이용한 세포배양 시 증가된 라미닌(도 11a)과 피브로넥틴(도 11b)의 생성량의 증가를 나타낸 그래프이다. PeP 1-5는 각각 서열목록 제1서열-제5서열의 펩타이드를 의미한다.

도 12는 형광물질이 결합된 본 발명의 펩타이드가 세포 수용체에 결합하는 지 여부를 보여주는 사진이다.

도 13은 합성 펩타이드를 포함하는 화장품이 BalbC 마우스의 피부 두께 증가에 미치는 영향을 보여주는 현미경 사진이다. 펩타이드 1-5는 각각 서열목록 제1 서열-제5서열의 펩타이드를 의미한다.

도 14는 형광물질이 결합된 본 발명의 펩타이드의 피부 투과를 보여주는 현미경 사진이다.

본 발명은 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)의 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다

인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)은 인체 성장 호르몬(human growth hormone)에 의하여 간에서 형성되어 혈액으로 방출되는 분자량 7,649이며 70개의 아미노산으로 구성된 성장인자이다. 아미노산 조성은 인슐린(Insulin)의 A-chain과 약 43%의 유사성을 가지고 있으며, 자신의 수용체(receptor)는 물론 인슐린 수용체(receptor)와도 결합하는 능력을 가지고 있으며, 생체 내에서 세포의 성장을 촉진시키며, 또한 인슐린과 유사한 작용을 하는 것이 알려졌다. 이러한 IGF-1은 성장을 매개한다하여 소마토메딘 C(Somatomedin C)라고도 불리운다.

IGF-1의 수용체는 간세포(hepatocyte)외에도 지방조직(adipose tissue), 임파구(lymphocyte), 뼈(bone) 및 태반 막(placental membrane)등 여러 조직에서 존재하는 것으로 알려져 있고, 인슐린 수용체와는 다른 신호전달 경로를 갖는 것이 규명되었다. 이러한 수용체(receptor)와 IGF-1이 결합하게 되면 2차 메신저를 매개하여 체세포 분열을 촉진시키는 결과를 초래한다. 간에서 혈액으로 분비된 IGF-1은 혈액에서 결합단백질(binding protein)과 결합하여 불활성상태의 결합체로 순환하다가 인체의 영양 상태나 생리적 변화에 의해서 결합단백질과 분리된 후에 체세포의 수용체와 결합함으로써 세포를 자극하게 된다.

IGF-1은 생체내의 거의 모든 세포의 성장을 촉진하는 역할을 하며, 포도당 대사에서는 글루카곤(glucagon)의 합성을 억제함으로써 세포 내로의 포도당의 흡수를 촉진시키는 등의 인슐린과 유사한 효능을 지니고 있음으로 인해, 라론 왜소증 증후군(Laron dwarfism)이나 인슐린 의존성 또는 비의존성 당뇨병의 치료제로 개발되고 있다. 또한, IGF-1은 면역 기능을 조절하는 효능이 있어 수술 후 환자의 면역력 증진 및 폐혈증에 의하여 유발된 과민 면역반응을 조절하는 치료제로도 이용될 수 있다. 특히, IGF-1은 연골내의 프로테오글리칸(proteoglycan) 분해효소에 의하여 프로테오글리칸이 분해되어 결과적으로 연골조직이 붕괴됨으로써 기인하는 퇴행성관절염에 있어서 연골세포 내의 프로테오글리칸의 합성을 촉진시켜 치료에 중요한 역할을 한다. 그러므로, IGF-1은 당뇨병, 왜소증, 면역조절, 퇴행성관절염, 그리고 이외에도 근위축성 측색경화증 등에 적용될 수 있는 유용한 물질이다.

IGF-1은 그 구조상에 3개의 이황화결합(잔기 6-48, 18-61 및 47-52)을 갖고 있으며, 이 결합이 제대로 형성되어야만 그 활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 인슐린의 구조와 비교하여 IGF-1을 B(1-29), C(30-41), A(42-62) 그리고 D(63-70) 도메인으로 구분하고 있다. 이중 B와 A도메인은 수용체와의 직접적인 결합부위인 것 으로 알려져 있으며, C와 D도메인은 B와 A도메인이 IGF-1 수용체와 특이적으로 결합하는데 필요한 것으로 알려져 있다. C와 D도메인을 제거하거나 변이를 유발할 경우 IGF-1 수용체 보다는 인슐린 수용체에 대한 결합력이 상대적으로 증가하는 것으로 알려져 있다.

이러한 IGF-1을 대량으로 생산하기 위하여 많은 연구자들이 대장균 발현시스템을 이용한 재조합 단백질의 생산을 시도하고 있으나, 이 방법은 자연형의 IGF-1을 얻기 위하여 재접힘이라는 추가 공정과 시간이 요구되고, 또한 정제과정에서 대장균유래의 오염원을 제거하기 위한 복잡한 정제 과정을 필요로 하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 IGF-1의 일부분만을 고체상합성의 방법을 이용하여 생산하여 유사기능을 얻고자 하는 시도들이 보고 되었다. 예로 미국 특허 제 5,473,054호에서 Jameson외는 29-38 및 61-70번의 단편을 각각 JB2와 JB1으로 명명하고 이 펩타이드 단편의 세포성장효과와 JB1의 거울상이성질체인 JB3의 IGF-1 저해효과를 보고하였다. 또한 Teruo외는 WO 03/048192에서 IGF-1의 33-37의 단편과 Substance P-유래 tetrapeptide와 상처치유에 있어서의 상호 보완 작용에 대하여 보고하고 있다. 이외에도 Kodama외(2004)는 Autoimmunity 37권 pp.481-487에서 50-70의 단편이 마우스에서 당뇨병 치료에 도움을 주는 것으로 보고하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확 하게 설명된다.

본 발명자들은 자연의 IGF-1과 동일한 기능을 하면서도, 자연의 IGF-1보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 자연의 IGF-1의 아미노산 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 IGF-1 미미킹(mimicking) 펩타이드를 합성함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 IGF-1 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 피부 상태(conditions)의 개선 또는 치주질환의 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 피부 상태를 개선 또는 치주질환을 치료하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 상태의 개선 또는 치주질환의 치료용 조성물을 제조하기 위한 펩타이드의 신규한 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)으로부터 유래되고, 서열목록 제2서열 내지 제8서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열을 포함하는 IGF-1 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태(conditions)의 개선 또는 치주질환의 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태를 개선 또는 치주질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 피부 상태의 개선 또는 치주질환의 치료용 조성물을 제조하기 위한 상기 본 발명의 펩타이드의 신규한 용도를 제공한다.

본 발명자들은 자연의 IGF-1과 동일한 기능을 하면서도, 자연의 IGF-1보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 자연의 IGF-1의 아미노산 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 IGF-1 미미킹(mimicking) 펩타이드를 합성하였다.

본 발명의 펩타이드는 IGF-1-유래의 서열목록 제2서열 내지 제8서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람 직하게는, 본 발명에서의 펩타이드는 서열목록 제2서열 내지 제7서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서의 펩타이드는 서열목록 제2서열 내지 제8서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되어 있다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명에서 펩타이드들의 디자인은 도 1에 예시되어 있다.

서열목록 제7서열은 천연 IGF-1의 아미노산 서열 22-37에 해당하는 것이다. 서열목록 제7서열의 경우, 수용체에 대한 보다 강한 결합을 위하여, 천연 IGF-1의 아미노산 서열 28-29에 해당하는 부위를 다른 아미노산 서열로 치환하는 것이 바람직하다. 이러한 아미노산 치환된 서열목록 제7서열에 해당하는 것이 서열목록 제6서열이다.

서열목록 제6서열의 아미노산 서열은, 특허 문헌에서의 서열목록을 만들기 위한 컴퓨터 프로그램의 한계 때문에, “Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Xaa-Gly-Tyr- Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg"으로 표현되어 있다. 그러나 보다 정확하게는, 서열목 록 제6서열은 “Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-(Xaa)_n-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg"이다. 상기 서열목록 제6서열에서, Xaa는 링커(즉, 펩타이드 링커)를 나타내고, n은 1-10의 정수(바람직하게는 1-8, 보다 바람직하게는 1-4, 가장 바람직하게는 2)이다.

서열목록 제6서열에 포함되는 링커로는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커는 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커이다. 아미노산 서열로 이루어진 링커는 Huston, et al., Methods in Enzymology, 203:46-88(1991), 및 Whitlow, et al., Protein Eng., 6:989(1993))에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명에 적합한 링커는 중성의 아미노산으로 이루어져 있다. 예컨대, Gly, Ser, Ala 및 Cys 등으로 이루어져 있는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 Ala으로 이루어져 있는 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제6서열의 아미노산 서열에서 링커는 Ala-Ala 다이머, 아미노 헥사노산 또는 아미노 부티르산이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제6서열의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열이다.

서열목록 제2서열은 천연 IGF-1의 아미노산 서열 30-41에 해당하는 것이다.

서열목록 제8서열은 천연 IGF-1의 아미노산 서열 46-57에 해당하는 것이다. 서열목록 제8서열의 펩타이드의 활성을 높이기 위하여, 이 서열에 포함되어 있는 Cys 잔기를 Ser으로 치환하는 것이 바람직하며, 이렇게 하여 합성된 것이 서열목록 제3서열의 아미노산 서열이다.

서열목록 제4서열은 천연 IGF-1의 아미노산 서열 52-61에 해당하는 것이다. 바람직하게는, 서열목록 제4서열의 아미노산 서열에서 N-말단과 C-말단의 Cys 잔기는 이황화결합 되어, 환형(cyclized) 펩타이드를 형성함으로써, 펩타이드의 안정성을 향상시킨다.

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 IGF-1보다 안정성이 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH₂)로 변형되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 조성물은 IGF-1-유효성(insulin like growth factor-1-effective) 의 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 IGF-1 활성을 보유하여, 생체에 적용 시 천연 IGF-1이 발휘하는 작용 또는 기능을 발휘한다. 본 명세서에서 용어“IGF-1 활성”은, 천연 IGF-1에 대하여 종래에 규명된 모든 활성, 예컨대 세포증식 및 분열 촉진 등의 활성을 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 천연 IGF-1의 작용을 흉내(mimicking) 내도록 제작된 것이기 때문에, 천연 IGF-1의 다양한 생체내 활성을 모두 발휘할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 펩타이드는 천연 IGF-1와 동일한 기능 또는 작용을 할 뿐만 아니라, 생리활성도는 IGF-1보다 우수하기 때문에, IGF-1-유효성의 질환 또는 상태의 예방 또는 치료에 유리하게 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “IGF-1-유효성의 질환 또는 상태”는 천연의 IGF-1에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질환 또는 상태를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 발휘되는 활성은, 피부 상태의 개선 또는 치주질환의 치료로 표현될 수 있다.

본 발명의 조성물이 치주질환에 적용되는 경우, 본 발명의 조성물은 치약(toothpaste), 구강청정용 조성물 또는 구강보호용 조성물으로 제조될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “치주질환 치료용 조성물”은 “구강보호용 조성물(composition for tooth and mouth care)" 또는“구강청정용 조성물(composition for tooth and mouth cleaning)"로 대체될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 잇몸 조직의 상피세포의 생리활성을 촉진하고 신속한 잇몸 상처의 치유를 통하여 손상된 잇몸 조직을 재생시킴으로써, 치주질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선의 효능 또는 활성을 갖는다. 특히, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 천연 IGF-1보다 분자량이 훨씬 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서, 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부 상태의 개선을 크게 달성할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의한 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료, 상처제거 및 피부재생 효과이며, 가장 바람직하게는, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 상처제거 및 피부재생 효과 이다.

예를 들어, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 각질세포의 증식을 촉진하고, 이들 세포로부터 프로콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌의 합성 증가를 유도하며, 피부의 각질세포층, 상피층 및 진피층을 재생 또는 성장시켜, 결국 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처제거, 피부재생 효과 및 구강세포의 재생 등의 효능을 발휘한다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물과 화장품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-100 ㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카 본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 IGF-1-미미킹 펩타이드는 천연의 인간 IGF-1와 동일한 기능 또는 작용을 할 수 있다.

(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 안정성이 천연 IGF-1과 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다.

(ⅲ) 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, IGF-1 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(ⅳ) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Ala-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg(서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Arg(pbf)-OH 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분간 반응시킨 후, 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하여 Arg-(pbf)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF용액을 넣고 Fmoc-Arg(pbf)-OH 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrine Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Arg(pbf)-Arg(pbf)-CTL Resin 을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 도 1과 같이 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Phe, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Phe 및 Fmoc-Gly 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 만들어진 펩티딜 레진은 DMF, MC, 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5 %, 티오아니졸 (Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5%, TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 GFYFNKAAGYGSSSRR을 1.18 g 합성하였다(수율: 69.6%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1770.6(이론값 : 1769.9)를 얻을 수 있었다.

합성예 2: 다른 펩타이드의 합성

상기 합성예 1과 동일한 방법으로 합성하되, 아미노산은 서열에 부합되는 아미노산을 사용하여 서열목록 제2서열 내지 제5서열의 펩타이드를 합성하였다. 서열목록 제2서열(Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr: GYGSSSRRAPQT)은 IGF-1의 아미노산 잔기 30-41, 서열목록 제3서열(Glu-Ser-Ser-Phe-Arg-Ser-Ser-Asp-Leu- Arg-Arg-Leu: ESSFRSSDLRRL)은 IGF-1의 아미노산 잔기 46-57, 서열목록 제4서열(Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys: CDLRRLEMYC)은 IGF-1의 아미노산 잔기 52-61, 그리고 서열목록 제5서열(Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro: RRLEMYCAPLKP)은 IGF-1의 아미노산 잔기 55-66에 해당하는 것이다.

합성된 펩타이드들에 대한 분자량 측정기 측정 값은 다음 표 1과 같다:

서열 번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
		분석치	이론치
1	GFYFNKAAGYGSSSRR	1770.6	1767.9
2	GYGSSSRRAPQT	1270.88	1266.4
3	ESSFRSSDLRRL	1457.4	1452.6
4	CDLRRLEMYC	1304.8	1303.6
5	RRLEMYCAPLKP	1479.5	1476.8

합성예 3: Cys - Asp - Leu - Arg - Arg - Leu - Glu - Met - Tyr - Cys (1,10 Cyclized CDLRRLEMYC )의 합성

실시예 2에서 제조된 서열목록 제4서열을 보다 안정하게 만들기 위해, C 말단과 N 말단 잔기인 Cys을 이용하여 사슬화를 시도 하였다. 제조한 서열목록 제4서열의 펩타이드 Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH를 100 mg 을 1 L의 10% DMSO/탈기 증류수 용액에 용해하였다. pH를 8.0으로 고정하고, 8시간 교반하며 공기 중에서 교반하여 공기 산화 반응을 유도하였다. 분취용 크로마토그라피를 통해 사슬화 된 Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH(1,10 Cyclized) 40 mg을 수득하였다. 최종적으로 합성된 환형 펩타이드의 질량분석기 측정치는 1302.8이었다.

합성예 4: FITC -b- Ala - Cys - Asp - Leu - Arg - Arg - Leu - Glu - Met - Tyr - Cys (1,10 Cyclized FITC -b- Ala -CDLRRLEMYC)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Cys(trt)-OH 200mmole, 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분간 반응시킨 후, 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine) / DMF) 10ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하여 Cys(trt)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10ml의 DMF용액을 넣고 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 200mmole, HoBt 200mmole, Bop 200mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrine Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Tyr(tBu)-Cys(trt)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 즉, 도 1과 같이 선정된 아미노산 서열에 의거하여 M, E, L, R, R, L, D, C, Fmoc-b-Ala-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 100 mmole의 FITC를 DMF에 녹인뒤 200 mmole의 DIEA와 섞어서 레진에 넣어주고 1시간 반응을 유지한뒤 세척을 하였다. 만들어진 펩티딜 레진은 DMF, MC, 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5 %, 티오아니졸 (Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5%, TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC을 0.78g 합성하였다. (수율 : 52.6%). C 말단의 Cys과 2번 위치의 Cys을 이용하여 사슬화를 시도 하였다. 이때는 제조한 FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC 펩타이드 100 mg 을 취해 1 L의 10% DMSO/탈기 증류수 용액에 녹였다. pH를 8.0으로 고정하고, 8시간 교반하며 공기 중에서 교반하여 공기 산화 반응을 유도하였다. 분취용 크로마토그라피를 통해 사슬화 된 FITC-b-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH(2,11 Cyclized) 45 mg을 수득하였다.

시험예 1: 합성 펩타이드의 HaCaT 각질세포 및 NIH3T3 섬유아세포 성장 효과 능력 분석

합성예 1 및 2에 기재된 5종의 펩타이드에 대한 인슐린 유사 성장인자-1의 유사 효능을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res ., 48: 4266(1988))등을 참조하여 HacaT 각질세포주와 NIH3T3 섬유아세포를 이용한 SRB(Sulforhodamine B)의 비색법을 이용하여 측정하였다.

HaCaT 각질세포주(한국세포주은행) 및 NIH3T3 섬유아세포(한국세포주은행)를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 100% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 Earle's minimal essential media (EMEM, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 EMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 4 x 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 7% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 사람의 인슐린 유사 성장인자-1(NIBSC, UK) 그리고 합성 펩타이드 5종을 물과 10% DMSO에 멸균상태로 녹인 뒤 10 ng과 1,000 ng의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 PBS로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존상태를 측정하였다. 도 8은 각질세포의 성장에 대한 결과가 나타나 있다. 세포에 펩타이드 처리 후 72시간 뒤 세포의 생존상태를 현미경으로 검경하여 각질세포의 성장을 확인하였다(도 9a: 각질세포, 도 9b: 섬유아세포).

도 8에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드 5종은 각질세포의 성장을 크게 증진시키며, 이 증진 효과는 자연의 IGF-1 보다 훨씬 우수하였다. 또한, 현미경 관찰 결과인 도 9a 및 도 9b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 각질세포 및 섬유아세포의 성장을 크게 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.

또한 위의 각질세포에 본 발명의 펩타이드를 처리하여, 피부주름개선의 표지인자인 프로콜라겐(procollagen), 라미닌(Laminin) 및 피브로넥틴(Fibronectin)의 농도 변화를 측정하였다. 48시간을 배양한 각질세포에 펩타이드 1-5를 각 5 μmole을 처리하고, 72시간 경과 후, 프로콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴의 농도를 측정하였다. 농도 측정은, Procollagen ELISA 키트(Takara 일본), Laminin ELISA 키트(CHEMICON, 미국) 및 Fibronectin 키트(Takara 일본)를 이용하여 실시하였다.

도 10 및 도 11a-11b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 프로콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴의 생성량을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

위의 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 펩타이드는 매우 우수한 피부 개선 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다.

시험예 2: 형광 표지 펩타이드의 섬유아세포 수용체 결합 측정

3T3 섬유아세포주를 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 100% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 Earle's minimal essential media (EMEM, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 48시간 배양을 완료한 후, 배양 상층액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 합성예 4에서 제조한 FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC(1-11 Cyclized) 펩타이드를 PBS와 DMSO에 1 mg/ml로 녹인 뒤 상기 배양된 세포에 1시간 동안 처리하였다. 배양액을 제거한 뒤, PBS로 충분히 세척을 한 뒤 형광 및 광학 현미경으로 세포의 표면을 관찰하였다.

도 12는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 형광 FITC로 표지된 서열목록 제4서열의 펩타이드의 세포내 수용체 결합을 나타낸 것이다. 측정 결과, 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 합성 펩타이드는 섬유아세포의 표면에 있는 수용체에 원활히 결합하고 있음을 알 수 있다.

제형예 1: 나노좀화 펩타이드의 제조

상기 합성예에서 얻은 아세틸 데카펩타이드 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 펩타이드 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 화장품 제조용으로 사용되었다.

제형예 2: 나노좀화 펩타이드를 함유하는 유연 화장수의 제조

상기 제형예 1에 의하여 제조된 나노좀화 펩타이드를 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
나노좀화 펩타이드	10
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 나노좀 펩타이드를 함유하는 영양크림의 제조

상기 제형예 1에 의하여 제조된 나노좀화 펩타이드를 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
나노좀화 펩타이드	20
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 나노좀 펩타이드를 함유하는 에센스의 제조

상기 제형예 1에 의하여 제조된 나노좀화 펩타이드를 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
나노좀화 펩타이드	20
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 5: 구강청정액의 제조

상기 합성예에 의하여 제조된 펩타이드를 포함하는 하기 조성으로 이루어진 구강청정제를 일반적인 구강청정제 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
IGF-1 미미킹 펩타이드	0.005
에탄올	15
글리세린	10
폴리옥시에칠렌경화피마자유	2
삭카린	0.15
안식향산 나트륨	0.05
향료	적량
인산2수소나트륨	0.1
착색제	적량
정제수	72.7

제형예 6: 치약의 제조

상기 합성예에 의하여 제조된 펩타이드를 포함하는 하기 조성으로 이루어진 치약제를 일반적인 치약제 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
IGF-1 미미킹 펩타이드	0.005
제2인산칼슘2수염	45
실리카	2
글리세린	15
카르복시메칠셀룰로오스나트륨	1
카라기난	0.3
라우릴황산나트륨	1.5
삭카린나트륨	0.1
향료	적량
파라옥시안식향산나트륨	0.01
정제수	35.09

시험예 3: BalbC 생쥐의 피부 두께 측정 실험

합성한 펩타이드의 화장품으로서의 유용성과 생체내 효능을 알아보기 위하여상기의 제형예 3에 의거해 제조한 크림 및 동일 조성의 펩타이드가 들어 있지 않은 크림을 이용하여 마우스를 이용한 하기의 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 Balb C 마우스는 6주령 수컷으로서 구입 후 일주일간의 안정기를 거친 뒤 등 부위를 티오글리콜산이 함유된 크림을 이용해 부분 제모 하였다. 제모 후 동물을 두 그룹으로 나눠서 한 그룹은 제형예 3의 나노좀 함유 펩타이드를 포함한 크림으로 또 한 그룹은 펩타이드가 들어 있지 않은 공 크림으로 아침 8:30 과 저녁 6:00에 100 mg 씩을 제모한 부위에 발라주었다. 5일간 크림을 처리 후 동물을 경추 탈골시켜 치사한 뒤 피부의 조직을 잘라서 파라핀으로 고정시킨뒤 마이크로톰으로 8 ㎛의 두께로 박편시료를 만든 뒤 슬라이드에 고정시키고 헤마톡실린/에오신 염색을 하여 광학 현미경으로 검경을 하였다.

도 13에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드-포함 나노좀을 포함하는 화장품은 마우스의 각질세포층 및 상피세포층을 확실하게 성장시키고 있음이 관찰되었다. 또한 FITC로 표지된 펩타이드(서열목록 제3서열)를 이용한 동물실험의 경우 염색을 수행하지 않은 마우스의 피부 박편 시료로부터 도 14와 같이 세포내로 골고루 침투한 형광물질이 존재함을 관찰 할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의한 합성 펩타이드는 피부의 각질세포 및 상피세포층을 성장시켜 피부 상태를 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 IGF-1-미미킹 펩타이드는 천연의 인간 IGF-1와 동일한 기능 또는 작용을 할 수 있으며, 안정성이 천연 IGF-1과 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, IGF-1 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘하며, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Caregen, Co. Ltd. <120> Peptides Having Activities of Insulin Like Growth Factor-1 and Their Uses <150> KR10-2006-0021099 <151> 2006-03-06 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 1 <400> 1 Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Ala Ala Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 2 <400> 2 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 3 <400> 3 Glu Ser Ser Phe Arg Ser Ser Asp Leu Arg Arg Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 4 <400> 4 Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 5 <400> 5 Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 6 <220> <221> DOMAIN <222> (7) <223> Linker <400> 6 Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Xaa Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 7 <400> 7 Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg 1 5 10 15 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 mimicking peptide 8 <400> 8 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu 1 5 10

Claims (21)

1. 인간 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)으로부터 유래되고, 서열목록 제1서열, 및 제3서열 내지 제5서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 구성되는 IGF-1 활성을 나타내는 펩타이드.
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7. 상기 제 1 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선용 조성물.
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9. (a) 상기 제 1 항의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물.
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