CN101395179A - 具有胰岛素样生长因子-i活性的肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有胰岛素样生长因子－1(IGF－I)活性并且由IGF－I衍生的肽以及包含该肽的用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物。本发明的IGF－I模拟肽具有与天然产生的IGF－I相同的功能或作用且比天然产生的IGF－I具有更高的稳定性和皮肤渗透。因此，含有本发明的肽的组合物对需要IGF－I活性的疾病或状态的治疗、预防和改善能够显示出极好的功效。另外，本发明的肽能够有利地应用于药物组合物、准药和化妆品中。

Description

具有胰岛素样生长因子-I活性的肽及其用途
技术领域
本发明涉及具有胰岛素样生长因子-1(IGF-I)活性的肽及其用途。
背景技术
由70个氨基酸组成的分子量为7,649 Da的胰岛素样生长因子-1(IGF-I)在肝脏中由人生长激素生成然后分泌到血液中。它的氨基酸组成显示出与胰岛素的A链约43％的相似性。显示出与胰岛素具有相似作用的IGF-I能够与胰岛素受体及IGF-1受体结合，并且促进细胞增殖。IGF-I因其生长调解活性通常被称为生长调节素C。
已报导，IGF-I受体存在于如脂肪组织、淋巴细胞、骨(bond)和胎盘膜的多种组织以及肝细胞中。IGF-I受体已显示具有与胰岛素受体不同的信号途径。IGF-I与其受体的结合导致经由第二信使促进体细胞分裂。从肝脏分泌进入血液的IGF-I以与结合蛋白的复合体形式(失活形式)循环。IGF-I响应生理改变或一些营养条件而与其结合蛋白分离然后与体细胞上的受体结合从而刺激细胞。
IGF-I用于促进体内几乎全部类型细胞的生长并且抑制碳水化合物代谢中胰高血糖素的合成，从而增强细胞对葡萄糖吸收。由于其与胰岛素的相似作用，它已成为对Laron侏儒症和胰岛素依赖性或非依赖性糖尿病而言有价值的治疗方法的焦点。另外，已研究具有免疫调制活性的IGF-I以提供增强术后患者的免疫应答的疗法和调制由脓毒引起的过敏反应的疗法。特别是，IGF-I促进软骨细胞中蛋白聚糖的合成并且用作对由软骨中蛋白聚糖降解而破坏软骨引起的变性关节炎的有价值的疗法。因此，IGF-I已经成为适用于免疫调制和糖尿病、侏儒症、变性关节炎及肌萎缩性侧索硬化治疗的生物分子中最重要的部分。
IGF-I在其主链中具有三个对其固有活性必要的二硫键(氨基酸6-48，18-61和47-52)，其包括B(1～29)、C(30～41)、A(42～62)和D(63～70)域。其中，已报导B和A域作为其受体的结合域，并且已提出，C和D域有助于B和A域与IGF-1受体的特异性结合。C和D域的缺失或突变使IGF-I的结合亲和性被改变成IGF-I变体优先与胰岛素受体而不是IGF-I受体结合。
为了IGF-I的大规模生产，许多研究人员已对使用大肠杆菌(Ecoli)表达系统制备重组蛋白进行了深入的研究。然而，这些制备遭遇到需要消耗时间和成本的重复步骤(refolding process)并且需要复杂的纯化方法以除去大肠杆菌产生的污染物。为了避免这些缺点，已通过固相合成法制备IGF-I模拟肽。例如，由Jameson等人提交的美国专利No.5,473,054公开了JB2(相当于IGF-I的第29～38位的氨基酸)和JBI(相当于第61～70位的氨基酸)片段具有细胞增殖潜能并且JBI、JB3的对映异构体具有对IGF-I的抑制活性。Teruo等人提交的WO 03/048192记载了每个由第33～37位氨基酸组成的IGF-I的肽片段和四肽衍生的物质-P对伤口愈合发挥互补的功效。另外，Kodama等人报导由第50～70位氨基酸组成的IGF-I的肽片段对小鼠糖尿病具有治疗作用(Autoimmunity，37:481-487(2004))。
贯穿本申请，各种专利和出版物作为参考并且在括号内给出引用出处。为了更加全面地描述本发明以及阐述本发明所属的技术领域，在此通过引用方式将这些专利和出版物的公开内容并入本申请。
发明内容
为了开发与天然产生的IGF-I具有相同的作用且与天然产生的IGF-I相比具有更加显著的特性(例如活性、皮肤渗透和稳定性)的肽，本发明人已进行了深入的研究。结果，本发明人已发现了几个具有上述极好特性的基于天然产生的IGF-I氨基酸序列的IGF-I模拟肽，最终完成本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有IGF-I活性的肽。
本发明的另一目的是提供一种用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物。
本发明的又一目的是提供一种用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的方法。
本发明更进一步的目的是提供本发明的肽在制备用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物中的用途。
连同所附权利要求书和附图，从以下详述的说明中，本发明的其他目的和优点将变得明显。
在本发明的一个技术方案中，提供一种具有胰岛素样生长因子-1(IGF-I)活性并且由IGF-I衍生的肽，该肽包含选自SEQ ID NO:2～8的氨基酸序列。
在本发明的另一技术方案中，提供一种用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物，该组合物包含本发明的肽作为活性成分。
还在本发明的又一技术方案中，提供一种用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的方法，该方法包括向对象施用含有本发明的肽的组合物。
在本发明更进一步的技术方案中，提供本发明的肽在制备用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物中的用途。
为了开发与天然产生的IGF-I具有相同作用且与天然产生的IGF-I相比具有更加显著特性(例如活性、皮肤渗透和稳定性)的肽，本发明人已进行了深入的研究。结果，本发明人已发现了几个具有上述极好特性的基于天然产生的IGF-I氨基酸序列的IGF-I模拟肽。
本发明的肽包含选自SEQ ID NO:2～8的IGF-I衍生的氨基酸序列。优选地，该肽基本上由选自SEQ ID NO:2～8的氨基酸序列组成。最优选地，该肽由选自SEQ ID NO:2～8的氨基酸序列组成。
本文所用的术语“肽”指通过肽键连接氨基酸残基形成的线型分子。
本发明的肽可通过本领域技术人员已知的常规化学合成方法，尤其是，固相合成技术(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart，等人，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.Co.：Rockford，111(1984))来制备。
例如，根据本发明的肽的设计如图1中所示。
SEQ ID NO:7相当于天然产生的IGF-I的第22～27位的氨基酸。在SEQ ID NO:7中，优选第28～29位的氨基酸由其他氨基酸残基取代以更强地与其受体结合，这样产生新序列，SEQ ID NO:6。
由于计算机程序生成的序列表在专利说明书中的限制，由“Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Xaa-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg”表示SEQ ID NO:6的氨基酸序列。  因此，  更确切地说，  由“Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-(Xaa)n-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg″  表示SEQ ID NO:6，其中，Xaa为连接体(肽连接体)，n为1～10的整数(优选1～8、更优选1～5、最优选2)。
SEQ ID NO:6中含有的连接体包括本领域技术人员可利用的任何连接体。优选地，该连接体包含多个氨基酸。在Huston，等人，Methodsin Enzymology，  203:46-88(1991)和  Whitlow，  等人，  Protein Eng.，6:989(1993)中查到了肽连接体的详细资料，该记载在此通过引用方式并入。本发明中适合的连接体包含具有不带电侧链的氨基酸，优选为Gly、Ser、Ala和Cys，最优选为Ala。根据最优选的实施方式，SEQ IDNO：6中含有的连接体为Ala-Ala二聚体、己酸或氨基丁酸。
根据最优选的实施方式，SEQ ID NO:6具体的氨基酸序列如SEQID NO:1中所述。
SEQ ID NO:2相当于IGF-I的第30～41位的氨基酸。
SEQ ID NO:8相当于IGF-I的第46～57位的氨基酸。为了提高SEQID NO：8的肽的活性，Cys残基优选被Ser残基取代，这样产生了新序列，SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:4相当于IGF-I的第52～61位的氨基酸。优选地，在SEQ ID NO:4的氨基酸序列中，连接N-和C-末端的Cys残基以形成二硫键，生成用于增强肽的稳定性的环化肽。
即使本发明的肽本身比天然产生的IGF-I具有更高的稳定性，对其的修饰能使其具有高得多的稳定性。优选地，本发明的肽的C-末端被修饰成具有羟基(-OH)或氨基(-NH2)。
根据优选的实施方式，本发明的肽的N-末端用选自由乙酰基、芴基甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基保护。
上述的肽的修饰极大地增加了本发明的肽的稳定性。本文所用的术语“稳定性”指体内稳定性和贮藏稳定性(例如，在室温下的贮藏稳定性)。上述的保护基保护肽免受体内蛋白酶的攻击。
使用本发明的组合物以预防或治疗IGF-1有效的(胰岛素样生长因子-1有效的)疾病或状态。
作为活性成分包含在本发明组合物中的本发明的肽具有IGF-I活性并且显示出与天然产生的IGF-4相同或相似的体内功能和功效。本文所用的术语“IGF-I活性”指本领域技术人员已知的天然产生的IGF-I的任一和全部活性，例如，包括促进细胞增殖分裂。因为制备了本发明的肽以模拟天然产生的IGF-I的作用，所以其能够发挥天然产生的IGF-I的全部体内活性。
因为本发明的肽具有与天然产生的IGF-I相同或相似的功能和作用并且显示出比天然产生的IGF-I更高的生物活性，所以其能够有利地用于预防或治疗IGF-1有效的疾病或状态。本文所用术语“IGF-1有效的疾病或状态”指通过天然产生的IGF-I能够预防或治疗的疾病或状态。
根据优选的实施方式，可将本组合物的作用表述成对皮肤状态的改善或对牙周疾病的治疗。
当将本组合物应用于牙周疾病时，可将其配制成牙膏或者用于牙齿和口腔清洁或护理的组合物。本文的术语“用于治疗牙周疾病的组合物”可与其它术语“用于牙齿和口腔护理的组合物”和“用于牙齿和口腔清洁的组合物”交替使用。本发明的肽促进齿龈组织中存在的表皮细胞的生物活性并且愈合齿龈伤口以使受损的齿龈组织再生，从而治疗或预防牙周疾病。
根据更优选的实施方式，本组合物具有改善皮肤状态的功效或活性。尤其是，由于其低分子量，本组合物中用作活性成分的肽显示出极好的皮肤渗透。因此，当将本组合物局部应用于皮肤时，很明显地，相当大地改善了皮肤状态。还更优选地，本组合物对皮肤状态的改善包括改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、改善皮肤湿度、去除暗斑、治疗痤疮、伤口愈合和皮肤再生，最优选地，包括改善皱纹或皮肤弹性和预防皮肤老化、伤口愈合以及皮肤再生。
例如，在本组合物中用作活性成分的肽促进角质细胞的增殖，诱导原胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白的生物合成以使角质细胞层、表皮和真皮再生，从而致使：改善皱纹、皮肤弹性和皮肤湿度，预防皮肤老化，伤口愈合，皮肤再生和齿龈组织再生。
可将本组合物制备成药物或化妆品组合物。
根据优选的实施方式，所述组合物为包含(a)药用有效量的本发明的肽；和(b)可药用载体的药物组合物。
本文所用的术语“药用有效量”指足够显示和实现本发明的肽的功效和活性的量。
在本发明的药物组合物中包含的通常在药物制剂中使用的可药用载体包括但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶(rubber arable)、磷酸钾、精氨酸盐(arginate)、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的药物组合物可进一步包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。适合的可药用载体和配方的详细资料可在雷明顿氏制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995))中找到，将其通过引用方式并入本申请。
根据本发明的药物组合物可经口或肠胃外给药，并且优选经肠胃外给药，例如，通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经皮或局部给药。
本发明的药物组合物的适合的剂量可根据药物配制方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、发病状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄率及对所用药物组合物的敏感性而变化。优选地，本发明的药物组合物可以每日0.0001～100μg的剂量给药。
根据本领域技术人员已知的常规技术，可用如上所述的可药用载体和/或溶媒(vehicle)配制根据本发明的药物组合物，最终提供几种形式的单剂量型和多剂量型。所述制剂的非限定性实例包括但不限于，在油或水介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂、浸膏剂、酏剂、粉剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂，并且可进一步包含分散剂或稳定剂。
根据优选的实施方式，所述组合物为包含(a)美容有效量的本发明的肽；和(b)化妆品可用载体的化妆品组合物。
本文所用的术语“美容有效量”指足够实现如上所述的改善皮肤状态的功效的量。
可将本发明的化妆品组合物配制成很多种形式，例如，包括溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂(cream)、洗剂、粉剂、皂剂、包含表面活性剂的清洁剂、油、粉状底霜、乳状底霜、蜡状底霜和喷雾剂。具体地，可将本发明的化妆品组合物配制成柔肤剂、滋养液、滋养霜、按摩霜、精华素、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、美容涂敷剂(pack)、喷雾剂或粉剂的形式。
当化妆品组合物为糊剂、霜剂或凝胶的形式时，其可包含动物和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、皂土、硅石、滑石、氧化锌或这些物质的混合物。
在粉剂或喷雾剂的配方中，其可包含乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末和这些物质的混合物。喷雾剂可另外包含常规推进剂，例如，含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
溶液和乳剂的配方可包含溶剂、增溶剂和乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇、油、甘油脂肪酯、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯。
混悬剂的配方可包含例如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂；混悬剂，例如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、皂土、琼脂及西黄蓍胶或这些物质的混合物。
具有表面活性剂的清洁组合物的配方可包含脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯(sulfosucinnate monoester)、异硫代硫酸酯(isothinate)、咪唑鎓盐衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸酯(sarcocinate)、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基氨基甜菜碱、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧化甘油脂肪酸酯或这些成分的混合物。
此外，本发明的化妆品组合物可包含助剂与作为活性成分的肽及载体。助剂的非限定性实例包括防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、着色剂、气味改进剂或这些物质的混合物。
将本发明的特征和优点总结如下：
(i)本发明的IGF-1模拟肽具有与天然产生的IGF-I相同的功能或活性；
(ii)本发明的肽具有比天然产生的IGF-I更高的稳定性和皮肤渗透能力；
(iii)因此，含有该肽的组合物对需要IGF-I活性的疾病或状态显示出极好的治疗和预防功效；以及
(iv)可将本发明的肽有利地应用于药物组合物、准药(quasi-drug)和化妆品中。
附图说明
图1表示天然产生的胰岛素样生长因子-1(IGF-I)的氨基酸序列和选出的用于制备本发明肽的区域。
图2示意性表示了本发明的肽的制备方法。
图3表示实施例中制备的SEQ ID NO:1的肽的高效液相色谱分析结果。
图4表示实施例中制备的SEQ ID NO:2的肽的高效液相色谱分析结果。
图5表示实施例中制备的SEQ ID NO:3的肽的高效液相色谱分析结果。
图6表示实施例中制备的SEQ ID NO:4的肽的高效液相色谱分析结果。
图7表示实施例中制备的SEQ ID NO:5的肽的高效液相色谱分析结果。
图8显示本发明的肽对角质细胞生长的影响。x轴中标识的数字为肽的类型和量。例如，“1_10”和“1_1000”分别表示用10 ng和1000 ngSEQ ID NO:1的肽的处理结果。
图9a表示证实本发明的肽对角质细胞生长的影响的显微镜图像。肽1～5分别表示SEQ ID NO:1～5的肽。
图9b表示证实本发明的肽对成纤维细胞生长的影响的显微镜图像。肽1～5分别表示SEQ ID NO:1～5的肽。
图10表示对用本发明的肽温育的细胞培养物中升高的原胶原水平的分析结果。肽1～5分别表示SEQ ID NO:1～5的肽。
图11a和11b表示对用本发明的肽温育的细胞培养物中升高的层粘连蛋白(图11a)和纤连蛋白(图11b)水平的分析结果。肽1～5分别表示SEQ ID NO:1～5的肽。
图12表示证实本发明的肽与细胞上的受体结合的图像。
图13为显示施用含有本发明的肽的化妆品的Balb C小鼠的皮肤厚度变化的显微镜图像。肽1～5分别表示SEQ ID NO:1～5的肽。
图14为显示本发明的荧光肽的皮肤渗透的显微镜图像。
现将通过实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员显而易见的是，这些实施例是用来更具体地阐述本发明的并且如所附权利要求书提出的本发明的范围不限于实施例或受实施例的限制。
实施例
制备实施例1：Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Ala-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg(SEQ ID NO:1)的合成
向加入到反映其中的700mg氯三苯甲基氯树脂(CTL树脂，NovaBiochem，目录号01-64-0021)中加入10mL二氯甲烷(MC)并且振荡3分钟。除去溶液后，向生产物中加入10mL二甲基甲酰胺(DMF)，然后进行振荡3分钟，之后除去溶剂。向该反应器中加入10mL二氯甲烷溶液然后向反应器中加入200mmol Fmoc-Arg(pbf)-OH和400mmol二异丙基乙胺(DIEA)，之后通过振荡溶解该混合物，然后振荡的同时进行反应1小时。反应后，将该生成物洗涤并在溶于DCM中的甲醇和DIEA(2:1)中反应10分钟，然后用过量的DCM/DMF(1:1)洗涤该生成物。除去溶剂后，向反应器中加入10mL DMF并振荡3分钟，随后除去溶剂。向反应器中加入10mL脱保护溶液(20％哌啶/DMF)且在室温下振荡10分钟并进行溶液的去除。加入相同体积的脱保护溶液后，进行反应10分钟并且除去溶液，随后依次用DMF、MC和DMF洗涤以制得Arg-(pbf)-CTL树脂。向新的反应器中加入10mL DMF溶液，然后加入200mmol Fmoc-Arg(pbf)-OH、200mmol HoBt和200mmol Bop，随后振荡溶解。向该反应器中加入400mmol DIEA并且进行振荡以溶解全部固体含有物。将溶解的氨基酸溶液引入容纳脱保护树脂的反应器中并且在室温下在振荡的同时进行反应1小时。在除去反应溶液后，用DMF溶液振荡生成物3次以除去未反应的残余物。取少量反应后的树脂通过(水合)茚三酮试验评价反应进度。使用脱保护溶液，以与上述相同的方式进行2次脱保护以制得Arg-(pbf)-Arg-(pbf)-CTL树脂。用DMF和MC洗涤后，进行(水合)茚三酮试验然后如上所述进行氨基酸的连接。基于图1中描述的氨基酸序列，将Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Ala、  Fmoc-Ala、  Fmoc-Lys(Boc)、  Fmoc-Asn(trt)、  Fmoc-Phe、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Phe和Fmoc-Gly依次连接到树脂上。通过与脱保护溶液温育两次每次10分钟除去Fmoc-保护基。依次用DMF、MC和甲醇洗涤该制备的肽基树脂3次，在氮气气流下干燥，在P2O5下通过真空干燥完全干燥，然后在室温下间歇振荡下使其与30 mL离去溶液[包含81.5％TFA、5％蒸馏水、5％苯硫基甲烷、5％苯酚、2.5％EDT和1％TIS]反应2小时。过滤并用少量TFA溶液洗涤该树脂，之后将滤出液与母液合并。在减压下蒸馏以减小至总体积的一半后，使用50mL冷醚诱导沉淀并且通过离心法收集形成的沉淀，随后用冷醚洗涤2次。除去母液后，在氮气气氛下干燥该生成物以提供1.18g未纯化的GFYFNKAAGYGSSSRR(收率69.6％)。使用质量分析器测定终产物的分子量为1770.6(理论MW1769.9)。
制备实施例2：其他肽的合成
用如制备实施例1中所述的方法合成SEQ ID NO:2～5的肽。SEQID NO:2 (Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr：GYGSSSRRAPQT)相当于IGF-I第30～41位的氨基酸；SEQ ID NO:3(Glu-Ser-Ser-Phe-Arg-Ser-Ser-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu：ESSFRSSDLRRL)相当于IGF-I第46～57位的氨基酸；SEQ ID NO:4(Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys：CDLRRLEMYC)相当于IGF-I第52～61位的氨基酸；以及SEQ ID NO:5(Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro：RRLEMYCAPLKP)相当于IGF-I第55～66位的的氨基酸。
将肽的测定的分子量总结于表1中。
表1
Figure A200780007937D00171
制备实施例3：Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys(1，10环化CDLRRLEMYC)的合成
为了增加制备实施例2中制备的SEQ ID NO:4的肽的稳定性，在C-和N-末端使用Cys残基进行环化。在1L10％DMSO/脱保护蒸馏水中溶解100mg SEQ ID NO:4(Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH)的肽。固定pH值为8.0后，在空气下振荡该肽溶液8小时以引起氧化。通过制备色谱法，获得40 mg环化的Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH(1，10环化的)。使用质量分析器测定的最终环化肽的分子量为1302.8。
制备实施例4：FITC-b-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys(2，11环化的FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC)的合成
向加入反应器中的700mg氯三苯甲基氯树脂(CTL树脂，NovaBiochem，目录号01-64-0021)中加入10mL二氯甲烷(MC)并且振荡3分钟。除去溶液后，向生产物中加入10mL二甲基甲酰胺(DMF)，然后进行振荡3分钟，之后除去溶剂。向该反应器中加入10mL二氯甲烷溶液并且向反应器中加入200mmol Fmoc-Cys(trt)-OH和400mmol二异丙基乙胺(DIEA)，之后通过振荡溶解该混合物，然后在振荡同时进行反应1小时。反应后，将该生成物洗涤并在溶于DCM中的甲醇和DIEA(2:1)中进行反应10分钟，然后用过量的DCM/DMF(1:1)洗涤该生成物。除去溶剂后，向反应器中加入10mL DMF并振荡3分钟，随后除去溶剂。向反应器中加入10mL脱保护溶液(20％哌啶/DMF)且在室温下振荡10分钟并进行溶液去除。加入相同体积的脱保护溶液后，进行反应10分钟并且除去溶液，随后依次用DMF、MC和DMF洗涤以制得Cys-(trt)-CTL树脂。向新的反应器中加入10mL DMF溶液，然后加入200mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH、200mmol HoBt和200mmol Bop，随后振荡溶解。向该反应器中加入400mmol DIEA并且进行振荡以溶解全部固体含有物。将溶解的氨基酸溶液引入容纳脱保护树脂的反应器中并且在室温下振荡的同时进行反应1小时。在除去反应溶液之后，用DMF溶液振荡生成物3次以除去未反应的残余物。取少量反应过的树脂通过(水合)茚三酮试验评价反应进度。使用脱保护溶液，以与上述相同的方式进行2次脱保护以制得Tyr-(tBu)-Cys-(trt)-CTL树脂。用DMF和MC洗涤后，进行(水合)茚三酮试验然后如上所述进行氨基酸的连接。基于图1中描述的氨基酸序列，将M、E、L、R、R、L、D、C和Fmoc-b-Ala-OH依次连接到树脂上。通过与脱保护溶液温育两次每次10分钟除去Fmoc-保护基。将100mmol溶于DMF中的FITC与200mmol DIEA混合，加入到树脂中并且保持反应1小时，随后洗涤。依次用DMF、MC和甲醇洗涤该制备的肽基树脂3次，在氮气气流下干燥，在P2O5下通过真空干燥完全干燥，然后在室温下间歇振荡的同时使其与30mL离去溶液[包含81.5％TFA、5％蒸馏水、5％苯硫基甲烷、5％苯酚、2.5％EDT和1％TIS]反应2小时。过滤并用少量TFA溶液洗涤该树脂，之后将滤出液与母液合并。在减压下蒸馏以减小至总体积的一半后，使用50mL冷醚诱导沉淀并且通过离心法收集形成的沉淀，随后用冷醚洗涤2次。除去母液后，在氮气气氛下干燥该生成物以提供0.78g未纯化的FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC(收率52.6％)。其后，使用在肽的C-末端和距离N-末端一个氨基酸处的Cys残基进行环化。在1L10％DMSO/脱保护蒸馏水中溶解100mgFITC-b-Ala-CDLRRLEMYC的肽。固定pH值为8.0后，在空气下振荡该肽溶液8小时以引起氧化。通过制备色谱法，获得45mg环化的FITC-b-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH(2，11  环化的)。
试验实施例1：肽对HaCaT角质细胞和NIH3T3成纤维细胞生长的影响
为了评价在制备实施例1～2中制备的5种肽是否具有胰岛素样生长因子-1相似的活性，根据Rizzino等人的方法(Rizzino，等人CancerRes.，48:4266(1988))，使用HaCaT角质细胞和NIH3T3成纤维细胞进行SRB(磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B))比色分析。
在含有添加了100％FBS(胎牛血清)的EMEM(Eagle′s minimalessential media，Gibco，美国)的250mL烧瓶中培养HaCaT角质细胞(The Korean Cell Line Bank)和NIH3T3成纤维细胞(The Korean CellLine Bank)。用0.25％胰蛋白酶溶液处理培养的细胞以从培养瓶底部分离细胞并且离心分离收集细胞粒。在不包含FBS的EMEM中重悬该细胞，将其等分试样(4×103个细胞)加入到96孔板的每个孔中，并且在37℃、7％CO2下培养24小时。培养24小时后，用不含血清的新鲜培养基更换该培养基并且在如上所述的相同条件下与人胰岛素样生长因子-1(NIBSC，英国)或溶于10％DMSO的5种合成肽(10ng/mL或1,000ng/mL)温育72小时。除去上层清液后，使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤细胞1次并且与SRB溶液(Sigma-Aldrich)温育。用PBS洗涤细胞并且在显微镜下观察到细胞活性。另外，测量590nm的吸光度以分析细胞增殖。图8表示角质细胞生长的分析数据。用肽处理72小时后，在显微镜下观察角质细胞的生长状态(图9a：角质细胞，图9b：成纤维细胞)。
如图8中所示，本发明的5种肽明显地促进了角质细胞的生长，其功效比天然产生的IGF-I好得多。另外，如图9a和9b中所示，可以观察到本发明的肽促进成纤维细胞和角质细胞的生长。
此外，用本发明的肽处理角质细胞并且测量作为显示皮肤皱纹改善指标的原胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白的水平。培养48小时的角质细胞与5 μmol本发明的肽温育72小时。使用原胶原ELISA试剂盒(Takara，日本)、层粘连蛋白ELISA试剂盒(CHEMICON，美国)和纤连蛋白试剂盒(Takara，日本)进行定量。
如图10和11a～11b中所示，显示了本发明的肽提高了细胞中原胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白的水平。
总之，这些结果证实了本发明的肽对改善皮肤状态显示出明显的作用。
试验实施例2：对荧光标记的肽与成纤维细胞上受体的结合的测量
在含有添加了100％FBS(胎牛血清)的EMEM(Eagle′s minimalessential media，Gibco，美国)的250mL烧瓶中培养3T3成纤维细胞。培养48小时后，除去培养基的上清液并且使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤剩余物1次。将制备实施例4中制备的FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC溶于DMSO和PBS至浓度为1mg/mL并且与培养细胞温育1小时。除去培养基后，彻底洗涤细胞并且在荧光和光学显微镜下观察其表面。
图12表示FITC-标记的肽与细胞上受体结合的测量结果。本发明的肽与成纤维细胞表面上的受体结合。
配方实施例1：纳米肽的制备
在500mL蒸馏水中溶解50mg在制备实施例3中合成的肽。将该肽溶液与5g卵磷脂、0.3mL油酸钠、50mL乙醇和少量的油混合并用蒸馏水将其体积调节至1L。该生成的溶液在高压下经微流化床装置以进行乳化，从而提供具有100nm大小的纳米体(nanosome)。该纳米体被制成具有约50ppm的最终浓度并且用作化妆品的成分。
配方实施例2：使用纳米肽的柔肤剂的制备
按照下列成分配制包含配方实施例1中制备的肽纳米体的柔肤剂：
表2
 
成分               含量(wt％)    
肽纳米体           10           
1，3-丁二醇       6.0          
甘油               4.0          
PEG1500          1.0          
透明质酸钠         1.0          
聚山梨醇酯20       0.5          
乙醇               8.0          
防腐剂、色素       适量          
二苯甲酮-9        0.05         
芳香剂             微量          
蒸馏水             余量          
合计               100          
配方实施例3：使用纳米肽的滋养霜的制备
按照下列成分配制包含配方实施例1中制备的肽纳米体的滋养霜：
表3
 
成分                     含量(wt％)    
肽纳米体                 20            
绣线菊油(Meadowfoamoil)                      3.0
棕榈醇                   1.5          
硬脂酸                   1.5          
硬脂酸甘油酯             1.5          
液体石蜡                 10.0        
蜡                       2.0          
聚山梨醇酯60             0.6          
失水山梨糖醇倍半油酸酯   2.5          
角鲨烷                   3.0          
1，3-丁二醇             3.0          
甘油                     5.0          
三乙醇胺                 0.5          
醋酸维生素E              0.5          
防腐剂、色素             适量          
芳香剂                   适量          
蒸馏水                   余量          
合计                     100           
配方实施例4：使用纳米肽的精华素的制备
按照下列成分配制包含配方实施例1中制备的肽纳米体的精华素：
表4
 
成分                   含量(wt％)    
肽纳米体               20            
甘油                   10.0         
1，3-丁二醇           5.0          
PEG 1500              2.0          
尿囊素                 0.1          
消旋泛醇               0.3         
EDTA-2Na              0.02         
羟乙基纤维素           0.1          
透明质酸钠             8.0          
羧基乙烯基聚合物       0.2          
三乙醇胺               0.18        
辛基十二烷醇聚醚       0.4          
乙醇                   6.0          
芳香剂、防腐剂、色素   适量          
 
蒸馏水       余量      
合计         100      
配方实施例5：漱口水的制备
按照下列成分配制包含制备的肽的漱口水：
表5
 
成分                   含量(wt％)    
IGF-1模拟肽           0.005        
乙醇                   15           
甘油                   10           
聚氧乙烯氢化蓖麻油     2             
糖精                   0.15         
苯甲酸钠               0.05         
芳香剂                 适量          
磷酸二氢钠             0.1          
着色剂                 适量          
蒸馏水                 72.7         
配方实施例6：牙膏的制备
按照以下列成分配制包含制备的肽的牙膏：
表6
 
成分                   含量(wt％)    
IGF-1模拟肽           0.005        
磷酸二钙               45            
二氧化硅               2             
甘油                   15            
羧甲基纤维素钠         1             
鹿角菜胶               0.3          
十二烷基硫酸钠         1.5          
糖精钠                 0.1          
芳香剂                 适量          
对羟苯甲酸钠(Sodiumparaoxybenzoate)       0.01
蒸馏水                 35.09        
试验实施例3：肽对BalbC小鼠皮肤厚度的影响分析
为了评价本发明的肽对化妆品的适用性和体内功效，将在配方实施例3中配制的滋养霜应用到小鼠皮肤上。
6周龄Balb C雄性小鼠(Central Lab.Animal，Inc.，韩国)进行1周的适应性饲养并用含巯基乙酸的霜剂部分去除其背部的毛发。将小鼠分成2组；对其中一组局部施用包含含有肽的纳米体的霜剂而对另一组局部施用不含纳米体的霜剂。每天早上(A.M.8:30)及晚上(P.M.6:30)进行施用达5天剂量为100mg。施用后，颈部脱位处死小鼠并将其皮肤组织包蜡。用切片机将包蜡的组织切片至厚度为8μm并用苏木精/曙红着色，然后在光学显微镜下观察。
如图13中所示，包含本发明的肽的纳米体化妆品可促进角化细胞层和表皮层的形成和生长。另外，发现本发明的FUC-标记的肽(SEQ IDNO:3)均匀地局限在细胞内。
因此，能够验证本发明的肽加速了角质细胞和表皮层的生长，从而改善皮肤状态。
综上所述，本发明的IGF-I模拟肽具有与天然产生的IGF-I相同的功能或作用且比天然产生的IGF-I具有更高的稳定性和皮肤渗透。因此，含有本发明的肽的组合物对需要IGF-I活性的疾病或状态的治疗、预防和改善能够显示极好的功效。另外，本发明的肽能够有利地应用于药物组合物、准药和化妆品中。
已经描述了本发明的优选实施方案，应该理解的是，落入本发明实质内的变化和改变对于本领域技术人员是显而易见的，并且本发明的范围由所附权利要求及其等效技术方案所确定。
<110>凯尔杰有限公司
<120>具有胰岛素样生长因子-I活性的肽及其用途
<150>KR10-2006-0021099
<151>2006-03-06
<160>8
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽1
<400>1
Figure A200780007937Q00251
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽2
<400>2
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽3
<400>3
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽4
<400>4
Figure A200780007937Q00261
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽5
<400>5
Figure A200780007937Q00262
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽6
<220>
<221>域
<222>(7)
<223>连接体
<400>6
<210>7
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽7
<400>7
Figure A200780007937Q00271
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF-1模拟肽8
<400>8
Figure A200780007937Q00272

Claims (21)

1、一种肽，该肽具有胰岛素样生长因子-1(IGF-I)活性并且由IGF-I衍生，该肽包含选自SEQ ID NO:2～8中的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的肽，其中，SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的连接体为Ala-Ala二聚体、氨基己酸或氨基丁酸。
3、根据权利要求1所述的肽，其中，SEQ ID NO:6的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
4、根据权利要求1所述的肽，其中，存在于SEQ ID NO:4的氨基酸序列的N-末端和C-末端的Cys残基被连接形成二硫键。
5、根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽的C-末端被修饰成具有羟基(-OH)或氨基(-NH2)。
6、根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽的N-末端用选自由乙酰基、芴基甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基保护。
7、一种用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物，该组合物包含根据权利要求1～6中任一项所述的肽作为活性成分。
8、根据权利要求7所述的组合物，其中，该组合物包含(a)药用有效量的根据权利要求1～6中任一项所述的肽；和(b)可药用载体。
9、根据权利要求7所述的组合物，其中，该组合物包含(a)美容有效量的根据权利要求1～6中任一项所述的肽；和(b)化妆品可用载体。
10、根据权利要求7所述的组合物，其中，所述改善皮肤状态为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、改善皮肤湿度、去除暗斑或治疗痤疮。
11、根据权利要求7所述的组合物，其中，该组合物对牙周疾病具有治疗功效，并且为牙膏或者用于口腔清洁或口腔护理的组合物。
12、一种用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的方法，该方法包括向对象施用包含根据权利要求1～6中任一项所述的肽作为活性成分的组合物。
13、根据权利要求12所述的方法，其中，所述组合物包含(a)药用有效量的根据权利要求1～6中任一项所述的肽；和(b)可药用载体。
14、根据权利要求12所述的方法，其中，所述组合物包含(a)美容有效量的根据权利要求1～6中任一项所述的肽；和(b)化妆品可用载体。
15、根据权利要求12所述的方法，其中，所述改善皮肤状态为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、改善皮肤湿度、去除暗斑或治疗痤疮。
16、根据权利要求12所述的方法，其中，所述组合物对牙周疾病具有治疗功效，并且为牙膏或者用于口腔清洁或口腔护理的组合物。
17、权利要求1～6中任一项所述的肽在制备用于改善皮肤状态或治疗牙周疾病的组合物中的用途。
18、根据权利要求17所述的用途，其中，所述组合物包含(a)药用有效量的根据权利要求1～6中任一项所述的肽；和(b)可药用载体。
19、根据权利要求17所述的用途，其中，所述组合物包含(a)美容有效量的根据权利要求1～6中任一项所述的肽；和(b)化妆品可用载体。
20、根据权利要求17所述的用途，其中，所述改善皮肤状态为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、改善皮肤湿度、去除暗斑或治疗痤疮。
21、根据权利要求17所述的用途，其中，所述组合物对牙周疾病具有治疗功效，并且为牙膏或者用于口腔清洁或口腔护理的组合物。
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