JP2001517927A - 胚幹細胞を作製する組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞増殖、細胞分化、雄不妊、雄授精能、およびこれらに関与する組成物および方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 胚幹細胞を作製する組成物および方法 政府の支援 本発明は、合衆国政府からの助成金（NIH助成金第CA 48799号）によって一部 支援された。従って、合衆国は、本発明において特定の権利を有し得る。 発明の分野 本発明の分野は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の精子形成である。 発明の背景 骨形成タンパク質（BMP）は、大きな、高度に保存された、トランスフォーミ ング成長因子β（TGF-β）に関連する細胞外ポリペプチドシグナリング分子のフ ァミリーのメンバーである。現在、発現研究から、そして誤発現および変異のイ ンビボ効果から、Bmp遺伝子が、無脊椎動物および脊椎動物の両方において、胚 の発生の多くの異なる段階において重要な役割を果たすという証拠がかなり存在 する(Kingsleyら、1994，Dev．Biol．166:112-122;Massagueら、1994，Trends C ell Biol．4:172-178;Hogan，1995，Sem．Dev．Biol．6:257-265)。マウスにお いて、多くのBmp遺伝子における自発的および誘導された変異の両方が、それら のインビボでの機能に解決の光を投じた。記載されるべき第一の例は、一連の短 い耳変異（ear mutation）であり、これはBmp5遺伝子における変化から生じる(G reen，1968，J．Exp．Zool．167:129-150;Kingsleyら、1992，Cell 71:399-410; Kingら、1994，Dev．Biol．166:112-122)。無発現変異体は生存可能であるが、 骨格系の特定の部分での軟骨の発達における欠陥、ならびにいくつかの遺伝的背 景における肺、腎臓、および尿管における異常を有する。 他のBmp遺伝子における変異は、胚幹細胞における相同組換えによって生成さ れた。例えば、Bmp7ホモ接合性無発現変異体マウスは、目、腎臓、および肢の発 達において主要な欠陥を有し、誕生後まもなく死亡する(Dudleyら、1995，Gene s Dev．9:2795-2807;Luoら、1995，Genes Dev．9:2808-2820)。ほとんどのBmp4 ホモ接合性変異体胚が、嚢胚形成の時点あたりで死亡し、そして多くが胚体外の および後方/腹側中胚葉において欠損を示し（Winnierら、1995，Genes Dev．9:2 105-2116）、これは、Xenopus胚における中胚葉パターン化におけるBMP4の効果 （Jonesら、1992，Development 115:639-647;Graffら、1994，Cell 79:169-179; Harland，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:10243-10246）と一致する知見 である。変異はまた、マウス結節、およびGdf5（短脚症（brachypodism））を含 むBMPスーパーファミリーの他のメンバーにおいて記載されている(Zhouら、1993 ，Nature 361:543-547;Conlonら、1994，Deveopment 120:1919-1928;Stormら、1 994，Nature 368:639-643)。 精子形成は、精巣の精細管の範囲内で起こる。代表的な細管は、外側の基底層 によって覆われている。薄層の内側でそれに結合しているのは、思春期から成人 期の終わりまで非常にゆっくり分裂し続ける精原細胞の層である。自己複製する 精原幹細胞（A₀/A_s細胞として知られる）は、非常に希であり、そしてそれは他 のより原始的でない精原細胞を生じる。これらは、基底層を残して細管の中心に 向かって移動する非分裂性精母細胞を生じる。これらの精母細胞は、減数分裂を 行い、そして最終的には成熟精子を生じる。精原細胞および分化した誘導体は、 体細胞性セルトリ細胞と密接に接触している。精原幹細胞の増殖、それらの精母 細胞への分化、精母細胞の減数分裂への侵入、それらの精子への分化、およびこ の全ての複雑なプロセスがインビボで同調される様式を調節する成長因子/サイ トカインについてはほとんど知られていない。高濃度の最も原始的な精原幹細胞 を有する細胞の集団を得ることは、それらが非常に小さな割合の精巣の全精子形 成細胞を形成することに部分的に起因して、困難であった。さらに、精原細胞の 培養物は、一般に短時間（すなわち、約24〜48時間）しか生存し続けない。 発明の要旨 本発明は、哺乳動物精原幹細胞を増殖する方法であって、精原幹細胞をBMP8、 または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストの存在下で培養し て、この細胞の増殖をもたらす工程を包含する、方法に関する。 また、哺乳動物精原幹細胞を分化させる方法であって、精原幹細胞をBMP、ま たは生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストの存在下で培養して 、この細胞の分化をもたらす工程を包含する、方法が本発明に含まれる。 さらに、本発明は、哺乳動物精原細胞の集団の生存度を拡大する方法であって 、この精原細胞集団をBMP8、または生物学的に活性なフラグメントもしくはその アゴニストの存在下で培養し、それにより培養された精原細胞集団の生存度を拡 大する工程を包含する、方法に関する。 本発明の別の局面において、培養中に精母細胞のアポトーシスを誘導する方法 であって、この精母細胞をBMP8、または生物学的に活性なフラグメントもしくは そのアゴニストの実質的非存在下でインキュベートし、それにより精母細胞のア ポトーシスを誘導する工程を包含する、方法が提供される。 また、培養中に精原幹細胞の増殖を阻害する方法であって、BMP8の実質的非存 在下で精子形成細胞の集団をインキュベートしてこの細胞の増殖を阻害をもたら す工程を包含する、方法が本発明に含まれる。 さらに、哺乳動物精原幹細胞の増殖をインビボで哺乳動物においてもたらす方 法であって、この哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8 、または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し、哺乳 動物においてこの細胞の増殖をもたらす工程を包含する、方法が提供される。 本発明はまた、哺乳動物精原幹細胞の分化をインビボで哺乳動物においてもた らす方法であって、この哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁され たBMP8、または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し 、哺乳動物においてこの細胞の増殖をもたらす工程を包含する、方法を含む。 哺乳動物精原細胞集団の生存度をインビボで哺乳動物において拡大する方法が また提供される。この方法は、哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸 濁されたBMP8、または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを 投与し、それにより哺乳動物において哺乳動物精原細胞集団の生存度を拡大する 工程を包含する。 本発明はまた、精母細胞のアポトーシスをインビボで哺乳動物において誘導す る方法であって、この哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁された BMP8、または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し、 それによりこの哺乳動物において精母細胞のアポトーシスを誘導する工程を包含 する、方法に関する。 精原幹細胞の増殖をインビボで哺乳動物において阻害する方法がさらに提供さ れる。この方法は、哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBM P8のアンタゴニストを投与して、この哺乳動物において細胞の増殖の阻害をもた らす工程を包含する。 さらに別の局面において、本発明は、培養中に精原幹細胞の増殖する集団を選 択的に得る方法であって、細胞の集団にBMP8を添加し、それにより精原幹細胞の 増殖する集団を選択的に得る工程を包含する、方法を含む。 雄哺乳動物における不妊を処置する方法であって、哺乳動物に、薬学的に受容 可能なキャリア中に懸濁されたBMP8、または生物学的に活性なフラグメントもし くはそのアゴニストを投与する工程を包含する、方法がまた含まれる。 好ましい実施態様において、BMP8が上記哺乳動物の精巣に投与される。 本発明は、BMP8アンタゴニストを含む哺乳動物雄避妊薬を含む。 本発明はまた、BMP8のアンタゴニストを同定する方法であって、試験化合物を 精原細胞の培養物中にBMP8の存在下または非存在下で添加し、そして細胞の増殖 または分化のレベルを測定する工程を包含し、ここで試験化合物の非存在下での 細胞の増殖または分化のレベルと比較して、試験化合物の存在下での細胞の増殖 または分化のより低いレベルが、試験化合物がBMP8アンタゴニストであることの 指標である、方法を含む。 BMP8のアゴニストを同定する方法であって、試験化合物を精原細胞の培養物中 にBMP8の存在下または非存在下で添加し、そして細胞の増殖または分化のレベル を測定する工程を包含し、ここで試験化合物の非存在下での細胞の増殖または分 化のレベルと比較して、試験化合物の存在下での細胞の増殖または分化のより高 いレベルが、試験化合物がBMP8アゴニストであることの指標である、方法がさら に含まれる。 さらに、本発明は、哺乳動物において毛の成長を刺激する方法であって、毛の 成長を刺激する量のBMP8をこの哺乳動物の毛包に投与する工程を包含する、方法 に関する。 細胞上のBMP8レセプターを単離する方法がまた提供される。この方法は、BMP8 を細胞のBMP8応答性集団に結合させる工程、およびBMP8が結合する細胞上のタン パク質を単離する工程を包含する。 本発明は、精原幹細胞の精製された集団を特徴とする。 本発明はまた、哺乳動物多能性胚幹細胞の集団を作製する方法であって、増殖 を増強する量の塩基性線維芽細胞増殖因子、白血病阻害因子、膜結合スチール因 子、および可溶性スチール因子を含む組成物中で精原細胞の集団をインキュベー トし、それにより多能性胚幹細胞の集団を作製する工程を包含する、方法を特徴 とする。 ちょうど記載されたばかりの方法により産生される、多能性胚幹細胞の集団も また含まれる。 さらに、BMP8、線維芽細胞増殖因子、白血病阻害因子、膜結合スチール因子、 および可溶性スチール因子を、生殖細胞の増殖を増強し、そして生殖細胞の継続 する増殖および生殖細胞由来の多能性胚幹細胞の形成を可能にする量で含む、組 成物が含まれる。 図面の簡単な説明 図１は、マウスBMP8A/OP2およびBMP8Bの推定アミノ酸配列の比較を示す図であ る。同一の残基は、ダッシュで配列され、類似の残基は、コロンで配列されてい る。 図２は、Bmp8aおよびBmp8bの染色体位置を示す図である。これらの２つの遺伝 子は、Jackson Laboratory種間戻し交配パネルマウス（C57BL/6JEi×SPRET/Ei） F1×SPRET/Ei（Roweら、1994，Mamm．Genome 5:253-274）を用いてマップされた 。両方の遺伝子の場合、（C57BL/6JEi×SPRET）F1×SPRET/Ei戻し交配子孫のう ちの94が、M．domesticusまたはM．spretus対立遺伝子の遺伝について型分類さ れた。 図2Aは、部分第４染色体の連鎖マップであり、右側に、戻し交配においてマッ プされた周囲の遣伝子座に関連して２つの遺伝子の位置を、そして左側に、Mous e Genome Database中の複合マップから得られた周囲の遺伝子の位置を示してい る。 図2Bは、ハプロタイプマップである。黒いボックスは、M．domesticus対立遺 伝子の遺伝を示し、一方白いボックスは、M．spretus対立遺伝子の遺伝を示す。 Ｒは、センチモルガンでの組換え距離であり、SEは標準誤差である。 図3Aは、RNase保護アッセイを用いた胎盤および子宮におけるBmp8aおよびBmp8 b RNAの検出を示す画像である。8.5〜15.5d.p.c.の胚ならびに9.5および14.5d.p .c.の胎盤および子宮からの全RNAの10μgを、Bmp8a UTR380およびBmp8b BN260か ら生成されたアンチセンスリボプローブ（図3Bに示すように）を含む各ハイブリ ダイゼーション混合物において使用した。Bmp8b転写物は、9.5および14.5d.p.c. の胎盤および子宮において検出された。Bmp8b転写物は、胎盤のみにおいて検出 されたが、子宮においては検出されなかった。いずれの遺伝子由来の転写物も、 アッセイされた胚において有意なレベルでは存在しなかった。βアクチンは、実 験におけるRNAレベルの評価のためのコントロールとして用いられた。 図3Bは、Bmp8a、およびBmp8b cDNAの概略図である。プロ領域および成熟領域 を含むコード領域をボックスで囲む。リボプローブの生成のためのDNA構築物に おいて使用した領域を示す。 図４は、インザイチュハイブリダイゼーションによる、子宮および胎盤におけ るBmp8転写物の局在を示す一連の像である。図4A、4B、4D、4E、4G、4H、4J、4K 、4M、および4Nは暗視野顕微鏡写真であり、図4C、4F、4I、4L、および40は明視 野顕微鏡写真である。スケールバーは図4G〜4Iについては200μgであり、そして 図4A〜4Fおよび4J〜40については800μmである。 図4Aは、7.5 d.p.c.移植部位を通る切片であり、対子宮間膜脱落膜細胞(DE)に おいては高レベルだが子宮(UT)の周辺の子宮筋においては高レベルではないBmp8 a転写物を示す。 図4Bおよび図4Cは、8.5 d.p.c.子宮、脱落膜、および胚を通る切片であり、対 子宮間膜脱落膜細胞(AD)においては高レベルのBmp8a転写物を示し、そして子宮 間膜脱落膜細胞(MD)においてはより低いレベルのハイブリダイゼーションシグナ ルを示す。子宮筋および胚においては適切な(^*)ハイブリダイゼーションシグナ ルは観察されない。 図4D、4E、および4Fは、9.5 d.p.c.子宮、胎盤、および胚膜を通る切片であり 、脱落膜においてBmp8a転写物、そして栄養膜細胞(TB)においてBmp8aおよびBmp8 b転写物の両方を高レベルで示すが、子宮の子宮筋または胚外膜においては示さ ない(^*)。 図4G、4H、および4Iは図4Fにおいてボックスで囲んだ領域の高倍率を示し、脱 落膜、海綿状栄養膜細胞(ST)、および胎盤の迷路領域(LT)においてBmp8a転写物 を示すが、巨大栄養膜細胞(GT)および胚外膜においては示さない。Bmp8b転写物 は主に胎盤の迷路領域に局在する。 図4J、4K、および4Lは、10.5 d.p.c.子宮、胎盤および胚の切片であり、対子 宮間膜脱落膜において減少したレベルのBmp8a転写物を示し、子宮間膜脱落膜に おいて増大したレベルのハイブリダイゼーションを示す。Bmp8aおよびBmp8b転写 物の両方は、胎盤の迷路領域において検出される。Bmp8aおよびBmp8b転写物の両 方は、胚においても子宮の子宮筋においても適切に検出されない。 図4Mは、子宮および脱落膜を通る切片であり、脱落膜細胞においてはBmp8a転 写物を示すが、子宮筋においては示さない。 図4Nおよび40は、13.5 d.p.c.胎盤を通る切片であり、迷路栄養膜細胞におい てBmp8b転写物を示すが、海綿状栄養膜細胞、巨大栄養膜細胞または脱落膜細胞 においては示さない。 図５は、精巣におけるBmp8転写物の局在を示す、インサイチュハイブリダイゼ ーションによる一連の像である。3.5週目（中期思春期）、５週目（後期思春期 ）、７週目（若年成体）、および12週目（成体）の動物からの精巣の切片をイン サイチュハイブリダイゼーションおよび組織学に使用した。パネル(A)、(B)、(D )、(E)、(G)、(H)、および(J)、(K)は、図に示すように、Bmp8aおよびBmp8bにつ いてのリボプローブでハイブリダイズされた異なる年齢の精巣の隣接切片を示す 。パネル(C)、(F)、(I)、および(L)は、精細管の正確な段階付けについて過ヨウ 素酸Schiff(PAS)試薬およびヘマトキシリンで染色した切片を示す。Bmp8aおよび Bmp8b転写物は、段階VI〜VIII精細管に、示された異なる年齢の動物において類 似のパターンで局在する。パネルM〜Oは、3.5c週齢精巣由来の隣接切片である。 パネルMおよびNは、両方の遺伝子の転写物が円形（round）精子細胞（矢印）に 主に局在し、そして弱いレベルのシグナルがいくつかのパキテン期精母細胞（大 きな矢印頭）に存在するという事実を示す。パネルOは、PASおよびヘマトキシリ ンで染色され、円形精子細胞（矢印）の先体の形態学により判断される段階VII 精細管を示す。バネルP〜Rは、Bmp8bリボプローブとハイブリダイズした７週間 目精巣由来の切片である。ハイブリダイゼーションシグナルは、パネルQにおい て、段階VII精細管の円形精子細胞（矢印）において観察されるが、段階Vまたは 段階IX精細管の円形精子細胞では観察されない。細長い精子細胞（小さな矢印頭 ）においては、検出可能なシグナルは観察されなかった。パネルP〜Rにおける切 片は５日間露光し、そして他の全ての切片は14日間露光した。スケールバーはパ ネルA〜Lについては100μmであり、そしてパネルM〜Rについては25μmである。 図６は、マウスBmp8a遺伝子座の標的化変異誘発を示す図である。 図6Aは、上がBmp8a野生型対立遺伝子、中が標的化構築物、および下が組換えB mp8a^tmlblh対立遺伝子の概略図である。標的化ベクターにおいて短い(5')および 長い(3')相同性アームとして使用したゲノムDNAフラグメントを、太く黒い線と して示す。コードエキソン２、３、４、５、６、およびエキソン７の前半(Ozkay nakら、1992，J．Biol．Chem．267:25220-25227)を、黒いボックス(E2〜E7)とし て示す。3'非翻訳領域を含むエキソン７の後半を白いボックスとして示す。発現 カセットPGK-TKA+、PGK-nao’(Rudnickiら、1992，Cell 7l:383-390)、およびMC 1DT-A(Yagiら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9918-9922)もまた、下に 転写の方向を示す矢印を有するボックスとして示す。制限酵素略語：(B)BamHI； (E)EcoRI；(S)SalI；(X)XbaI；(Xh)XhoI。 図6Bは、Bmp8bのエキソン２および３に対する配列においてほぼ同一であるBmp 8aのエキソン２および３由来のcDNAプローブにハイブリダイズさせた、ゲノムサ ザンブロットの像である。従って、EcoRI消化DNAは、野生型Bmp8a遺伝子座につ いては９kbフラグメント、および野生型Bmp8b遺伝子座については８kbフラグメ ントを示す。９kb Bmp8a対立遺伝子は、Bmp8a^tmlblh対立遺伝子においては５kb に縮小される。 図6Cは、プローブとしてエキソン４、５、６、および７を含むcDNAフラグメン トにハイブリダイズさせたゲノムサザンブロットである。このプローブはBmp8a に特異的であり、そして野生型対立遺伝子については2.3kb（エキソン４、５、 および６を含む）および2.0kb（エキソン７の一部を含む）の２つのEcoRIフラグ メントを示し、そして変異型対立遺伝子については2.0kbフラグメントのみを示 す。 図７は、精巣重量の野生型(+/+)とBmp8a^tmlblh変異型(+/-および-/-)マウスと の間の比較を示すグラフである。各年齢群由来の精巣を摘出し、ブロットし、そ して重さを計った。いくつかの同腹仔を各群について使用した。平均±S.E.を、 括弧内に示す；Ｎは各群における精巣の総数を示す。一般に、両方の精巣のサイ ズが類似であるような場合、各動物由来の１つの精巣の重さを測った。非常にま れな場合、２つの精巣のサイズが有意に異なるように見える場合、両方を量り平 均を統計学的分析に用いた。 図８は、野生型(+/+)、Bmp8a -/-、Bmp8b -/-、およびBmp8b化合物ヘテロ接合 型遺伝子型の２週齢動物由来の精巣の組織学的比較を示す一連の像である。左側 および右側のパネルは、それぞれ低および高倍率顕微鏡写真である。各遺伝子型 からの代表的な例示的組織学を示す。この年齢では、Bmp8bホモ接合型変異体の 精巣は、他よりも有意に小さく、そして重度な場合では、精細管において上皮の １層のみ存在する（パネルＥおよびF；Zhaoら、1996，Genes and Dev．10:1657- 1669)。対照的に、野生型動物、ホモ接合型変異体および化合物ヘテロ接合型変 異体精巣においでは、精細管上皮において生殖細胞の複数の層が存在する。バー はパネルA、C、E、およびGにおいては200μmであり、そしてパネルB、D、F、お よびHにおいては50μmである。 図９は、野生型と、Bmp8aおよびBmp8bホモ接合型変異体精巣との組織学的比較 を示す一連の像であり、観察された最も進行した生殖細胞の縮退を示す。左側お よび右側のパネルは、それぞれ低および高倍率顕微鏡写真である。パネルAおよ びBは、全ての精細管において正常な精子形成を示す野生型精巣（17週齢）の切 片である（各管の種々の段階をローマ数字で示す；Russellら、1990，Histologi cal and histopathological evaluation of the testis、Russellら編、119-161 頁、Cache River Press，Clearwater，FL）。パネルCおよびDは、最も進行した 生殖細胞の縮退が観察されたホモ接合型Bmp8a変異体精巣（22週齢）の切片であ る。この精巣において、精細管において精子細胞はほとんど観察されなかったが 、その一方減数分裂生殖細胞がほとんどの精細管において見出された。しかし、 少数の管はほとんどの生殖細胞を欠き、そしていくつかのセルトリ細胞さえ消失 した（*で示す）。濃く染色される凝集した核を示すアポトーシス生殖細胞が、 ほとんどの精細管において観察された（矢印）。パネルEおよびFは、全ての精細 管が精子形成を欠き、そしてセルトリ細胞のみがほとんどの精細管において残っ ている（*で示す）、ホモ接合型Bmp8b変異体精巣（22週齢）の切片である。いく つかの濃く染色される細胞（矢印頭）がいくつかの精細管の中心において観察さ れた。これらの精細管は、DhhおよびCp-2のようなセルトリ細胞マーカーを発現 せず(Bitgoodら、1996，Curr．Biol．6:298-304;Wrightら、1986，Biol．Reprod ．35:761-772;Wrightら、1993：Cell and Molecular Biology of the Testis，D esjardinsら編、377-399頁、Oxford Unuv．Press NY)、そして基底層から脱落し た精原生殖細胞のようであった(Zaoら、1996，Genes and Dev．10;1657-1669)。 バーはパネルA、C、およびEにおいては400μmであり、そしてパネルB、D、およ びFにおいては100μmである。 図10は、Bmp8a変異体の成熟精巣において観察された、中程度の形態の組織学 的異常の例を示す一連の像である。パネルA〜Cは、正常な精子形成を示す野生型 精巣（22週齢）の切片である。パネルAは低倍率であり；パネルBは高倍率での段 階X精細管であり；パネルCは高倍率での段階XII精細管であり；パネルD〜Oは異 なるBmp8aホモ接合型ヌル変異体由来の精巣からの代表的な切片である（12〜30 週齢）。パネルDは、低倍率であり、多数の精細管における生殖細胞縮退（＊で 示す）を示し；パネルEおよびFは、パネルDにおいて示した精細管に類似する精 細管の高倍率顕微鏡写真である。精子細胞は存在せず、そしてほんの２〜３の減 数分裂生殖細胞が存在するのみである。矢印頭は、図9Fにおいて示されるように 、Bmp8b変異体精巣において観察されるのに類似の、縮退した管の中心において 濃く染色される細胞の塊を示す。パネルGは、低倍率で、２つの精細管における 生殖細胞縮退（＊で示す）を示す。パネルHおよびIは、パネルGにおいて示した 精細管に類似する精細管の高倍率顕微鏡写真である。パネルHにおいては精子細 胞 は見出されず、そしてほんの少数がパネルIにおいて見出される。凝集かつ濃く 染色される核（小さい矢印）を有する２〜３のアポトーシス精原細胞が、パネル Iに存在する。パネルJは低倍率であり、大きな割合の精細管における生殖細胞縮 退（＊で示す）を示す。パネルKおよびLは、生殖細胞が分裂中期にブロックされ そして縮退する事実を示す２つの例である。これらは濃く染色される染色体およ び好酸球細胞質（矢印）を有し、そしてTUNEL標識によりポジティブに染色され る。パネルMは、管の小領域において凝集かつ濃く染色される核（矢印）を有す る16の見かけのアポトーシス生殖細胞を含む精細管の切片である。これらの細胞 のいくつかは基底膜に近接し、これらが死んだ精原細胞または死んだ前細糸期精 原細胞のいずれかであることを示唆する。パネルNは、精子細胞が存在せず、そ してほとんどの減数分裂生殖細胞が消失した精細管の切片である。しかし、精原 細胞および前細糸期精母細胞集団は、比較的正常なようである。矢印はアポトー シス細胞を示す。パネルOは、ほとんどの減数分裂生殖細胞が縮退したことを示 す精細管の切片である。残っている１次精母細胞は凝集した濃く染色される核を 有する（矢印）。多数の細長い精子細胞の存在は、減数分裂の以前の段階が比較 的影響されていないことを示唆する。バーは、パネルA、D、G、およびJにおいて は200μm、パネルB、C、およびOにおいては50μm、そしてパネルE、F、H、I、K 、L、MおよびNにおいては30μmである。 図11は、ホモ接合型Bmp8a変異体および複合Bmp8a/Bmp8bヘテロ接合型の精巣上 体の組織学的異常を示す一連の像である。パネルAは、排出管(ED)、前部セグメ ント(IS)、近位頭(PC)、遠位頭(DC)、体、および精巣上体尾領域を示す、野生型 成熟精巣上体の組織学を示す。パネルBは、発達した肉芽種の形成を示すBmp8aホ モ接合型変異体の精巣上体尾の切片であり、ここでは成熟精子（＊で示す）は浸 潤白血球（矢印頭）に囲まれている。パネルCは、中心に精子（＊で示す）およ び周辺に白血球浸潤（矢印頭）を有する、精巣上体管の外側の肉芽種形成の２つ の病巣を示す、Bmp8複合ヘテロ接合型の尾精巣上体の切片である。パネルDは、 浸潤白血球（矢印頭）に囲まれている精子（＊で示す）および縮退している精巣 上体管を示す、パネルCと同じ精巣上体尾の切片である。パネルEはパネルBの四 角で囲まれた領域の高倍率表示であり、浸潤白血球（矢印頭）精巣および縮退し ている管（矢印）を示す。パネルFはパネルDの四角で囲まれた領域の高倍率表示 であり、内部に精子（＊で示す）を有して縮退している精巣上体を示す。管の上 皮層は複数の空胞を含み（矢印）、細胞縮退を示唆している。パネルGはパネルC のにおけるのと同じ精巣上体尾切片高倍率表示であり、噴出した精巣上体管（矢 印）の付近におげる精子（＊で示す）を示す。パネルHは、ホモ接合型Bmp8a変異 体の精巣上体尾および精巣を通る切片である。パネルIは、パネルH中のボックス で囲んだ領域の高倍率表示であり、遠位頭領域の細管における空胞化した上皮を 示す。パネルJは、パネルI中の四角で囲んだ領域の高倍率表示であり、精巣上体 管の空胞化した上皮（矢印）を示す。バーはパネルA〜CおよびHにおいては800μ mであり；パネルD、E、およびIにおいては200μmであり；そしてパネルF、G、お よびJにおいては50μmである。 図12は、成熟動物の精巣上体におけるBmp8aおよびBmp7発現を示す、インサイ チュハイブリダイゼーションを示す一連の像である。パネルAは、Bmp8a mRNAの3 '非翻訳領域に対するアンチセンスRNAプローブでハイブリダイズした野生型精巣 および精巣上体を通る切片の暗視野顕微鏡写真である。Bmp8aは、段階６〜８の 円形精子細胞において発現し、従って精巣における段階特異的ハイブリダイゼー ションを示す。Bmp8a転写物はまた、精巣上体頭の前部セグメントにおいても検 出されたが、精巣におけるよりも低いレベルである。パネルBは、パネルAにおけ るのと同じ切片の明視野顕微鏡写真である。パネルCは、Bmp7 mRNAプロ領域に対 するアンチセンスRNAプローブでハイブリダイズした野生型精巣および精巣上体 の暗視野顕微鏡写真である。Bmp7転写物は、精巣上体尾の前部セグメントにおい て高レベルで検出される。パネルDは、パネルCにおけるのと同じ切片の対応する 明視野顕微鏡写真である。IS、前部セグメント；PC、近位頭；およびDC、遠位頭 である。バーは800μmである。 図13は、BMP8AをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。 図14は、BMP8Aのアミノ酸配列である。 図15は、BMP8BをコードするcDNAのヌクレオチド配列である。 図16は、BMP8Bのアミノ酸配列である。 発明の詳細な説明 精母細胞の生存および精原細胞の増殖のためにBMP8が必要なことが、本発明に おいて発見された。従って、本発明は、初期段階の精原幹細胞で富化された細胞 の培養物を得る、高度に有用な手段を提供する。さらに、本発明は、BMP8タンパ ク質を供給することによる、雄における不稔を処置する手段を提供する。本発明 の他の使用および利点は本明細書中にさらに議論される。 ヒトにおいては１つのBMP8遺伝子のみが存在するようであるが、本明細書中に 提示されるデータは、本明細書中でBmp8aおよびBmp8bと称されるマウス中の２つ の高度に関連しかつ近密に連鎖した遺伝子の存在を確立する。ポリ(A)+RNAのノ ーザンブロット分析を用いる以前の研究は、Bmp8a/Op2が8.5および10.5 d.p.c. 細書中に記載されるように、種々の異なる技術（例えば、RNase保護、RT-PCR、c DNAライブラリースクリーニングおよびインサイチュハイブリダイゼーション） を用いて、7.5と10.5 d.p.c.の間に、マウス胚において、Bmp8aかまたはBmp8b転 写物のいずれをもを適切に検出し得なかった。対照的に、胎盤および胚の周りの 子宮の脱落膜細胞において、高レベルのBmp8 RNAを見出した。さらに、本発明に おいて、Bmp8aおよびBmp8bの両方が、精子形成の特定段階の精巣の生殖細胞にお いて発現されていることが発見された。TGF-β遺伝子ファミリーの他の３つのメ ンバー（例えば、ミューラー管阻害基質、アクチビンおよびインヒビン）が精巣 で発現されているにもかかわらず、これらの遺伝子を特定する転写物は体細胞の セルトリ細胞において主に見出される(Cateら1990，Spornら編、Peptide Growth Factors and Their Receptor，Springer-Verlag，Berlin、第２巻、179-210頁) ；Steinbergerら、1976，Endocrinology 99:918-921;Bicsakら、1987，Mol．Cel l．Endocrinol．49:211-217;Meunierら、1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 :247-251;Bhasinら、1989，Endocrinology 124:987-991)。 本発明まで、Bmp8aおよびBmp8bが精巣の生殖細胞において発現されることは知 られていなかった。従って、本明細書中に示されるデータは、BMP8AおよびBMP8B が哺乳動物精子形成および母性-胎生相互作用に必要とされ、そしてこれまで信 じられていたように胚発生には必要とされないということを確立する。 明細書および請求項に使用されるように、「a」は、それが使用される文脈に 依存して１つ以上を意味し得る。 本出願を通して使用される哺乳動物は、例えば、ラット、ウサギ、モルモット 、ヤギ、ブタ、ウジ、およびヒトを含み得る。 用語「Bmp8」は、BMP8タンパク質をコードする核酸をいう。Bmp8は、BMP8をコ ードするDNA、cDNA、またはRNAをいうと解釈される。用語Bmp8の使用はまた、Bm p8aおよびBmp8bの各々が個々に特定されない限り、Bmp8aおよびBmp8bの両方をい うと解釈される。マウスBmp8aおよびBmp8b遺伝子が本明細書中に例示されるが、 用語「Bmp8」の使用はまた、マウスBmp8の遺伝子と相同性を共有するマウスBmp8 の相同体を含むと解釈される。従って、本発明は、マウス由来、および他の任意 の嘘乳動物（ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、およびヒトなど を含む）由来のBmp8遺伝子を含むと解釈される。 同様に、用語「BMP8」の使用は、BMP8の任意の相同体（例えば、マウスBMP8A および／またはマウスBMP8B、ヒトBMP8(Genetics Institute，Cambridge，Massa chusetts)、もしくは単独またはより大きなポリペプチドのいずれかにおける活 性部位）を含むと解釈される。これらのタンパク質はまた、OP-2、OP-3(Creativ e Biomolecules，Hopkinton，Massachusetts)ともいわれる。ヒトOP-2タンパク 質は、マウスBMP8Aと相同性であり、そしてヒトOP-3タンパク質はマウスBMP8Bタ ンパク質と相同性（タンパク質の成熟領域におけるアミノ酸配列において約78％ 同一）である。BMP8の相同体は、本明細書中に記載の、マウスBMP8AまたはBMP8B のいずれかと相同性を共有するタンパク質を含み、そしてそれは本明細書中に記 載のマウスBMP8タンパク質に類似の様式で機能する。BMP8AおよびBMP8Bは一緒に 使用さ得れることもまた意図される。BMP8は、BMP8AまたはBMP8Bのいずれをも意 味し得、特に、個々のタンパク質がそのように特定されない限り、特にヒトBMP8 タンパク質をについて使用されるときそうである。 従って、本発明によって、マウスBMP8AおよびBMP8Bをコードする核酸が最初に 発見され、本明細書中に記載される方法に有用であり、他の哺乳動物組織（好ま しくはヒト組織）から得られたBMP8をコードする遺伝子の使用もまた本発明に含 まれる。さらに、本発明は、ヒト以外の哺乳動物由来のBMP8タンパク質をコード する核酸を含むと解釈される。そのBMP8は、本明細書中に記載のマウスBMP8タン パク質に実質的に類似の様式で機能する。好ましくは、BMP8をコードする核酸は 、マウスBMP8AまたはBMP8Bをコードする核酸に約50％相同であり、より好ましく は約70％相同であり、なおより好ましくは約80％相同であり、そして最も好まし くは約90％相同である。 本明細書中に使用される「相同性」は、２つのポリマー性分子（例えば、２つ の核酸分子（例えば、２つのDNA分子または２つのRNA分子）の間、または２つの ポリペプチド分子の間のサブユニット配列類似性をいう。２つの分子の両方にお けるサブユニット位置が同じモノマー性サブユニットによって占められる場合（ 例えば、２つのDNA分子の各々における位置がアデニンによって占められる場合 ）、これらはこの位置で相同性である。２つの配列の間の相同性は、一致するか または相同な位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの複合配列における 位置の半分（例えば、ポリマーの10サブユニットの長さにおける５つの位置）の 位置が相同である場合、この２つの配列は50％相同であり、90％（例えば、10の うち９が一致または相同である）の位置が相同である場合、２つの配列は90％の 相同性を共有する。例として、DNA配列 3'ATTGCC 5'および3'TATGCG 5'は、50％ の相同性を共有する。 本明細書中に使用される「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに 隣接している配列から分離された、核酸配列、セグメント、またはフラグメント をいい、例えば、フラグメントに通常隣接している配列（例えば、天然に存在す るゲノムにおいてこのフラグメントに隣接する配列）から取り出されたDNAフラ グメントをいう。この用語はまた、核酸に天然に付随する他の成分（例えば、細 胞において天然に付随するRNAもしくはDNAまたはタンパク質）から実質的に精製 された核酸にもまた適用される。 本発明はまた、BMP8をコードする核酸の部分または全体に対してアンチセンス 方向の（すなわち、相補的）配列を有する単離された核酸を含む。「Bmp8遺伝子 の部分または全体に相補的」とは、BMP8をコードしない核酸の配列を意味する。 多少は、細胞において発現される配列はBMP8遺伝子の非コード鎖に同一であり、 従ってBMP8をコードしない。 本明細書中で用いられる用語「相補的」および「アンチセンス」は、完全な同 義語ではない。 「アンチセンス」は特に、タンパク質をコードする２本鎖DNA 分子の非コード鎖の核酸配列、または非コード鎖に実質的に相同である配列をい う。本明細書中で使用される用語「相補的」は、２つの核酸（例えば、２つのDN A分子）の間のサブユニット配列相補性の幅広い概念をいう。両方の分子におけ るヌクレオチドの位置が、通常互いに塩基対形成し得るヌクレオチドによって占 められる場合、核酸をこの位置で互いに相補的であると考える。従って、２つの 核酸は、各分子の対応する位置の実質的な数（少なくとも50％）が、通常互いに 塩基対形成するヌクレオチド（例えば、A:TおよびG:Cヌクレオチド対）によって 占められる場合、互いに相補的である。本明細書中に定義されるように、アンチ センス配列は、タンパク質をコードする２本鎖DNA分子の配列に相補的である。 アンチセンス配列は、DNA分子のコード鎖のコード部分に単独で相補的であるこ とは必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコ ード鎖に特定される調節配列に相補的であり得る。この調節配列は、コード配列 の発現を制御する。 従って、本発明は、BMP8をコードする核酸およびBMP8をコードする核酸のフラ グメント；そして、BMP8をコードする核酸に対してアンチセンス方向である核酸 および核酸のフラグメントを含むと解釈されるべきである。 BMP8をコードする核酸のフラグメントは、本明細書中に定義されるようなBMP8 の生物学的活性を有するBMP8の部分をコードするか、またはBMP8の部分を含むポ リペプチドをコードし、このポリペプチドは、本明細書中で詳細に記載されるよ うに、本発明の方法において有用である。 本発明はまた、本明細書中に記載のBmp8によってコードされる単離されたタン パク質および他のBmp8遺伝子によってコードされる他のBMP8分子を含み、これら は、本発明を一旦心得た（armed）当業者によって単離され得る。好ましくは、 そのように発見されたBMP8タンパク質のアミノ酸配列は、マウスBMP8Aまたはマ ウスBMP8Bのアミノ酸配列に対して約70％相同であり、より好ましくは約80％相 同であり、さらにより好ましくは約90％相同であり、より好ましくは約95％相同 であり、そして最も好ましくは少なくとも約99％相同である。 本明細書中に記載のように得られた実質的に純粋なBMP8タンパク質は、タンパ ク質精製のための以下の公知の手順によって精製され得る。ここで免疫学的、酵 素学的、または他のアッセイが、手順の各段階で精製をモニターするために用い られる。 本明細書中で用いられる用語「実質的に純粋」は、化合物（例えば、天然に伴 う成分から分離されたタンパク質またはポリペプチド）を記載する。代表的には 、化合物は、試料中の全物質の少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％ 、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好まし くは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少 なくとも99％が目的の化合物である場合（容量、湿重量もしくは乾燥重量、また はモルパーセントもしくはモル画分による）、実質的に純粋である。純度は、任 意の適切な方法（例えば、ポリペプチドの場合、カラムクロマトグラフィー、ゲ ル電気泳動、またはHPLC分析）によって測定され得る。化合物（例えば、タンパ ク質）はまた、天然に会合する成分を本質的に含まないか、または天然の状態に おいてそれに伴う生来の夾雑物から分離される場合、実質的に精製される。 本発明はまた、Bmp8遺伝子によってコードされるタンパク質またはペプチドの アナログの使用を提供する。アナログはまた、保存的なアミノ酸配列の差異また は配列に作用しない改変、あるいはその両方によって天然に存在するタンパク質 またはペプチドとは異なり得る。 例えば、保存的なアミノ酸変化が作製され得、これらはタンパク質またはペプ チドの一次配列を変化するにもかかわらず、その機能を通常変化させない。保存 的なアミノ酸置換は、代表的には以下のグループの範囲内の置換を含む： グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン； リジン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン 改変（通常は一次配列を変化しない）は、インビボまたはインビトロでのポリペ プチドの化学誘導体化（例えば、アセチル化、またはカルボキシル化）を含む。 また、改変は、グリコシル化の改変を含む。これは例えば、その合成および処理 の間またはさらなる処理工程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを 改変することによって作製される改変である。さらなる処理工程は、例えば、グ リコシル化に作用する酵素（例えば、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル 化酵素）に対してポリペプチドを曝露することである。また、リン酸化アミノ酸 残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン）を有 する配列が包含される。 また、通常の分子生物学的技術を用いて、タンパク質分解性分解に対するそれ らの耐性を改良するためまたは溶解特性を至適にするために改変されたポリペプ チドを含む。このようなポリペプチドのアナログは、天然に存在するL-アミノ酸 以外の残基（例えば、D-アミノ酸）または天然には存在しない合成アミノ酸を含 むポリペプチドを含む。本発明のペプチドは、本明細書中に列挙される特定の例 示的な処理のいずれの産物に限定されない。 実質的に完全長のポリペプチドに加えて、本発明はポリペプチドの生物学的に 活性なフラグメントを提供する。 BMP8ポリペプチドは、本明細書中の実験の説明の章に記載されるアッセイにお いて精母細胞の生存を適切に支持する場合、「生物学的に活性」である。 本発明はまた、全長または全長未満のいずれかであるBMP8ポリペプチドの使用 を意図する。このようなフラグメントは、本明細書中に記載のように生物学的に 活性であり得るか、またはそれらが精母細胞の生存を適切に支持しない場合は生 物学的に不活性であり得る。後者の場合には、このようなフラグメントは、イン ビトロまたはインビボのいずれかで細胞に添加される場合、BMP8の生物学的活性 を阻害するのに有用であり得る。本発明はまた、BMP8の変異体の使用を意図し、 この変異体は、BMP8タンパク質を不活化する１つ以上の変異を含む。 本明細書中で用いられる用語「フラグメント」（ポリペプチドに適用される） は、通常は、少なくとも約15の連続するアミノ酸長、代表的には少なくとも約25 の連続するアミノ酸長、より代表的には少なくとも約40の連続するアミノ酸長、 たいていは少なくとも約45の連続するアミノ酸長、および好ましくは少なくとも 約50の連続するアミノ酸長である。 哺乳動物由来のBMP8タンパク質をコードするDNAは、本明細書中に記載の手順 に従って、ハイブリダイゼーションアッセイ、PCR反応などのプローブとしてBmp 8aまたはBmp8bの部分を用いて、得られ得る。本質的には、DNAは、所望の哺乳動 物から得られる細胞から抽出される。単離、クローニング、および配列決定、な らびにDNA分子の他の特徴付けのための手順は、当業者に周知であり、例えば、S ambrookら（1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or，NY）に記載される。 本明細書中で示されたデータが確立するように、BMP8は、精子形成において、 少なくとも３つの異なる役割を果たす。それは分化する精母細胞の生存、精原細 胞の増殖、およびこれらの分化のために必要である。 従って、本発明において、特定の哺乳動物細胞に対するBMP8の投与が、これら の細胞の増殖を促進することが見出された。特に、哺乳動物精原幹細胞は、この タンパク質の存在下で増殖を引き起こす。従って、本発明において、哺乳動物精 原細胞を増殖するための方法が提供される。この方法は、BMP8タンパク質の存在 下で、精原幹細胞を培養する工程を包含する。精原細胞を培養するための培養培 地およびこのような細胞を維持する他の条件は、本明細書中の実験の説明の章に 記載されている。精原幹細胞に添加されるBMP8のそれらの増殖を達成する量につ いて、本発明の方法で必要とされるBMP8の量は、細胞およびBMP8が得られる哺乳 動物の型に依存して評価される。一般的に、BMP8は、培養培地の約１ng/ml〜約1 0mg/mlの間の濃度で細胞に添加される。好ましくは、BMP8は、培養培地の約１μ g/ml〜約500μg/mlの濃度で細胞に添加される。 本発明においで、特定の哺乳動物細胞に対するBMP8の投与が、これらの細胞の 分化を促進することもまた見出された。特に、哺乳動物精原幹細胞は、このタン パク質の存在下で分化を引き起こす。精原細胞の培養が、増殖または分化を引き 起こすかどうかは、BMP8を培養物に添加する時点の細胞の発達段階に依存する。 従って、ある発達段階の精原幹細胞は、BMP8に応答して増殖が引き起こされ得る 一方、別の発達段階における細胞は、BMP8の存在下で分化が引き起こされ得る。 精原細胞の発達において、精原幹細胞の任意の特定の培養がBMP8の存在下で増殖 または分化を受けるかどうかは、当業者には明らかである。 従って、本発明において、哺乳動物精原細胞を分化させる方法もまた提供され る。この方法は、BMP8タンパク質の存在下で、精原幹細胞を培養する工程を包含 する。精原細胞を培養するための培養培地およびこのような細胞を維持する他の 条件は、本明細書中の実験の説明の章に記載されている。精原幹細胞に添加され るBMP8のそれらの分化を達成する量について、本発明の方法で必要とされるBMP8 の量は、細胞およびBMP8が得られる哺乳動物の型に依存して評価される。一般的 に、BMP8は、培養培地の約１ng/ml〜約10mg/mlの間の濃度で細胞に添加される。 好ましくは、BMP8は、培養培地の約１μg/ml〜約500μg/mlの濃度で細胞に添加 される。 BMP8を用いる精原細胞の分化については、細胞は分化、任意の実際の一定期間 の分化を引き起こされ、そしてそれゆえのアポトーシスを受ける。従って、本発 明はまた、精母細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。 増殖および分化に加えて、精原幹細胞へのBMP8の添加は、培養中のそれらの維 持をもたらす。増殖および分化に関する状況と同様に、培養中の精原細胞の維持 は、細胞を維持するのに十分なBMP8タンパク質の量を細胞に添加することによっ て達成される。このような維持は、本明細書中で、精原細胞の「生存度を延長す る」という。 一般的には、培養中に細胞に添加されるBMP8の調製物は、細胞培養培地または 細胞の生存度に影響しない他の等張溶液中に懸濁された所望の濃度のBMP8を含む 。このような溶液は、本明細書中に記載の目的のために細胞にタンパク質を投与 することにおいて、当業者に明らかである。 BMP8の非存在下、または細胞培養物中のBMP8の実質的な非存在を達成する物質 の存在下における細胞のインキュベーションが、その培養物中での増殖、および ／または分化、および／または維持の中止を細胞に引き起こすことは、本明細書 中に提供される記載から理解される。このような状況は、雄性不妊症の研究のた めの筋書きを提供する。さらに、インビボで実施する場合、本明細書中に記載の ように、このような状況は、雄哺乳動物における不妊症を誘導する方法を提供す る。 従って、本発明によれば、培養中の精原幹細胞の増殖を停止する方法が提供さ れ、その方法は、BMP8の実質的な非存在下で、細胞をインキュベートする工程を 含む。 さらに、BMP8の実質的な非存在下で細胞をインキュベートする工程を包含する 、培養物中の精母細胞の分化を阻止する方法が提供される。 さらに、BMP8の実質的な非存在下で細胞をインキュベートする工程を包含する 、培養物中の精母細胞の維持を阻止する方法が提供される。 BMP8の実質的な非存在下でのインキュベーションに影響される細胞の特性が、 増殖、分化、または維持であるかどうかが、細胞の発生段階に依存することが認 識される。細胞の適切な発生段階は、細胞発生の当業者に明らかである。 本発明の方法がBMP8の実質的な非存在下での細胞のインキュベーションを必要 とする場合、この方法は、BMP8の非存在下で細胞をインキュベーションする工程 を含み、そしてBMP8の存在下での細胞のインキュベーションを含み、ここでBMP8 活性が任意の所望の手段によって阻害されると解釈されるべきである。このよう な阻害手段は、BMP8に対する抗体の培養物への添加；低分子およびペプチド模倣 物（peptidometics）のようなBMP8機能の他のインヒビターの添加；当業者に周 知の方法論を使用する、BMP8 mRNAに対するアンチセンス核酸の添加によるよう な、BMP8タンパク質の産生の阻害を含む。 「BMP8の実質的な非存在」は、存在するBMP8の量が、精母細胞の生存を十分に 支持しないことを意味する。 BMP8に対する抗体は、当該分野で周知の、そして例えば、Harlowら（1988、An tibodies 、A Labroratory Manual，Cold Spring Harbor，NY）に記載の任意の技 術を使用して生成され得る。BMP8に対する抗体は、ポリクローナル、モノクロー ナル、および合成の抗体を含むと解釈されるべきである。 本明細書中で使用される用語「合成抗体」によって、例えば、バクテリオファ ージによって発現される抗体のような、組換えDNA技術を使用して生成される抗 体が意味される。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって生 成されている抗体を意味し、そしてこのDNA分子は、抗体タンパク質または抗体 を特定するアミノ酸配列を発現すると解釈されるべきである。ここで、このDNA またはアミノ酸配列は、市販のおよび当該分野で周知の、合成DNA技術またはア ミノ酸配列決定技術を使用して得られている。 実質的に純粋な合成抗体の調製物を得るために、抗体は、それが発現されるフ ァージの表面から抽出され得る。このような抽出のための手順は、タンパク質精 製の当業者に周知である。あるいは、実質的に純粋な抗体の調製物は、抗体をコ ードする単離されたDNAの発現ベクターへのクローニング、およびそこからのタ ンパク質の発現によって得られ得る。そのように発現される抗体は、当該分野で 周知の通常のタンパク質精製手順を使用して得られ得る。合成抗体を生成するた めの手順は、Barbas（1995、Nature Medicine 1:837-839）およびKruifら（1995 、J.Mol.Biol．248:97-105）および本明細書中で引用される参考文献に記載され る。 BMP8の生物学的活性を有するペプチド模倣物がまた、提供される。BMP8の生物 学的活性を有するペプチド模倣物は、それらが投与される細胞に対するそれらの 影響が細胞（sell）に有益であり、この有益な影響がBMP8のものと類似であるよ うに、十分なBMP8活性を有する化合物を含む。ペプチド模倣物はまた、通常はBM P8に比較的アクセスしにくい動物中の標的へアクセスし得るように設計され得る という点で、BMP8を超えるさらなる利点を有し得る。 ペプチド模倣物の生成、使用、および投与を記載する情報は、PCT/US93/01201 および米国特許第5,334,702号（これらは本明細書中で参考として援用される） に提供される。これらの２つの参考文献のいずれかに記載される任意の技術が、 本発明においてペプチド模倣物を投与するために使用され得る。 本明細書中に提供される知見を仮定すると、本発明がさらに、低分子、核酸、 ペプチド、抗体、ホルモン、およびBMP8活性に影響を与える他の化合物（すなわ ち、これらの化合物は、BMP8活性のアゴニストまたはアンタゴニストである）を 同定する方法を含むことが認識される。 BMP8活性のアゴニストを同定するために、規定された分化の段階の精子形成細 胞は、コントロールとして全ての化合物の非存在下で、BMP8の存在下で、試験化 合物の存在下で、またはBMP8および試験化合物の存在下でインキュベートされる 。細胞の増殖および／または分化の範囲は、インキュベーション期間後に測定さ れ る。試験化合物の存在下での細胞の増殖および／または分化の程度が、BMP8の存 在下での細胞の増殖および／または分化の程度と等しいかまたはそれより大きい 場合、化合物は、BMP8アゴニストであると考えられる。BMP8および試験化合物の 両方の存在下での細胞の増殖および／または分化の程度がBMP8のみにおける程度 よりも大きい場合、化合物は、BMP8と共作用するBMP8のアゴニストである。 BMP8活性のアンタゴニストを同定するために、規定された分化の段階の精子形 成細胞は、コントロールとして全ての化合物の非存在下で、BMP8の存在下で、試 験化合物の存在下で、またはBMP8および試験化合物の存在下でインキュベートさ れる。細胞の増殖および／または分化の範囲は、インキュベーション期間後に測 定される。試験化合物およびBMP8の存在下での細胞の増殖および／または分化の 程度がBMP8のみの存在下における細胞の増殖および／または分化の程度よりも小 さい場合、化合物は、BMP8のアンタゴニストであると考えられる。 BMP8のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物は、雄性の哺乳 動物において受精能を促進するために、または雄性の哺乳動物において不妊を誘 導するために有用である。 本発明の方法は、インビトロで培養された精子形成細胞の操作に適用可能であ る。これらの方法はまた、哺乳動物中のインビボでの精子形成細胞の操作に適用 可能である。 BMP8、BMP8のフラグメント、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス トは、増殖、分化、維持、またはアポトーシスに関する細胞の操作に影響を与え るために、動物中にインビボで細胞に投与され得る。BMP8、またはそのアゴニス トもしくはアンタゴニストで哺乳動物を処置するためのプロトコルは、当業者に 明らかであり、そして処置される哺乳動物における状況に依存して変化する。意 図される処置レジメンは、単回用量、または１時間毎、１日毎、１週毎、１ヶ月 毎、もしくは１年毎に投与される用量を含む。用量は、アゴニストもしくはアン タゴニストの、またはBMP8の、１μg〜1000mg/kg体重で変化し得、そして化合物 の送達に適切な形態である。投与経路はまた、処置されるべき障害に依存して変 化し得る。 アゴニスト、アンタゴニスト、またはBMP8は、生理食塩水、塩溶液、またはそ のような投与について当業者に明らかである他の処方物のような、薬学的に受容 可能なキャリア中に懸濁されるか、または溶解されることによって投与のために 調製される。本発明の組成物は、従来の様式の１つ（例えば、経口的、非経口的 、経皮的、または経粘膜的(transmucosally)）において、生分解性生体適合性ポ リマーを使用する持続放出処方物中で、またはミセル、ゲル、およびリポソーム を使用するオンサイト（on-site）送達によって、または直腸的（例えば、坐剤 もしくは浣腸によって）もしくは経鼻的に（鼻スプレーによって）、哺乳動物に 投与され得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に明らかであり、 そして投与経路に主に依存する。 動物の精巣への投与のために、この化合物は、注射または当業者に明らかな他 の適切な手段によって精巣に直接投与される。 雄性の哺乳動物において不妊を処置する方法が、本明細書中で提供される。こ の方法は、哺乳動物にBMP8タンパク質を投与し、それにより、精子形成を促進し 、そして不妊を処置する工程を包含する。雄性の哺乳動物において不妊を処置す る方法がまた提供され、この方法は、哺乳動物の精巣細胞にBMP8タンパク質を投 与し、それにより細胞の増殖および分化を促進し、そして不妊を処置する工程を 包含する。詳細には、雄性の哺乳動物は、機能的なBMP8タンパク質の低下したレ ベルによって生じる、精子形成における欠損を有し得る。BMP8タンパク質は、BM P8を機能的にコードする核酸を投与することによって投与され得、それにより、 BMP8タンパク質を提供する。さらに、このタンパク質は、本明細書中で詳述され る方法、および当該分野で公知の他の方法によって投与され得る。BMP8タンパク 質は、例えば、精巣の網状組織領域に注射され得、それにより、輸精管へのタン パク質の拡散を可能にする。 雄性の哺乳動物において不妊を誘導する方法がまた、提供される。精巣の細胞 中で、BMP8の実質的な非存在をもたらす物質の哺乳動物への投与、またはBMP8活 性のアンタゴニストの雄性の哺乳動物への投与は、細胞中のBMP8機能を低下させ るかまたは排除するように作用し、それにより、哺乳動物中の精子形成が低下す るかまたは排除される。BMP8アンタゴニストまたはBMP8活性を低下させるかもし くは排除する他の化合物の投与のための方法、経路、および処方物は、一般に、 雄性の不妊の処置について記載される方法と全く同じであり、そして、本発明で 一旦準備された（armed）当業者に明らかである。 本発明はまた、細胞上のBMP8レセプターを単離する方法を含み、この方法は、 BMP8を細胞のBMP8応答性集団に結合させる工程、およびBMP8が結合する細胞上の タンパク質を単離する工程を包含する。 本明細書中で使用される「細胞のBMP応答性集団」によって、本明細書中で記 載されるアッセイにおいて、BMP8に応答して増殖または分化する細胞の集団が意 味される。 レセプタータンパク質は、例えば、イムノアフィニティー技術、他の生化学的 アフィニティー技術、本明細書中に記載され、そしてタンパク質精製についての 任意の通常の生化学マニュアルに見出され得る技術などを含む、当該分野で有用 な多数のタンパク質単離技術の任意の１つを使用して単離され得る。 BMP8レセプタータンパク質の単離を容易にするために、細胞に結合するBMP8は 、検出可能なマーカーで標識され得るか、同定可能なマーカーでタグ化され得る か、またはそれに結合したタンパク質の単離を容易にするタグに共有結合され得 る（すなわち、融合タンパク質として）、検出可能なマーカーで標識され得る。 レセプタータンパク質の単離のための融合タンパク質の生成は、分子生物学の分 野で周知である。 子宮での胚着床における欠損について哺乳動物を処置する方法がまた、本発明 において提供され、この方法は、哺乳動物にBMP8タンパク質を投与する工程を包 含し、それにより着床を容易にする。投与の期間は、好ましくは脱落膜細胞の増 殖および肥大がピークに到達する時であり得る（Finn、1971、Adv．Reprod．Phy siol.，5:1-26）。化合物が子宮壁に直接投与され得るか、または投与が全身的 に行われ得る。BMP8タンパク質が投与され得るか、またはBMP8をコードする核酸 が投与され得る。操作される細胞の発生の間の適切な時間に発現されるように、 例えば、所望の時間に所望の細胞中で通常発現される遺伝子由来のプロモーター を使用して、核酸が修飾され得る。 妊娠した哺乳動物の胎盤の維持を促進する方法がまた提供され、この方法は、 BMP8タンパク質の維持量を哺乳動物に投与する工程を包含し、それにより胎盤の 維持が促進される。BMP8タンパク質の投与は、例えば、本明細書中で記載される ように、注射によるか、または直接的な適用により得る。 本明細書中で提供されるデータから、BMP8が精子形成細胞以外の細胞に、それ らの発生の種々の段階で影響を与え得ることが明らかである。詳細には、毛包細 胞は、BMP8によって影響されるようであり、すなわち、これらは、毛髪の産生を 刺激するようである。このように、本発明はまた、哺乳動物における毛髪の成長 を刺激する方法を提供し、この方法は、毛包にBMP8の刺激量を投与する工程を包 含し、それにより毛髪の成長を刺激する。組成物は、毛包へのBMP8タンパク質の 適用のために処方され得る。この組成物は、当該分野で公知の、そして例えば、 Martin（編、Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Ea ston，PA.）に記載の、BMP8の局所的な送達のための適切なキャリアを含む。例 えば、ミノキシドール（minoxidol）の投与のために使用される処方物が、本発 明の方法において利用され得る。 Bmp8aホモ接合型ヌルマウスは、Bmp8bホモ接合型変異体と同じ表現型を有し、 そしてこれら２つの遺伝子の発現パターンは、精巣において同じである。これは 、これら２つのタンパク質が哺乳動物の精子形成において同一の機能を有し、実 験的におよび治療的に相互変換可能である証拠である。従って、BMP8タンパク質 は、不妊を処置するために治療的に、および培養物中で精子形成幹細胞の系統を 得るためおよび／または維持するための不可欠な増殖因子として使用され得る。 マウスのBMP8を欠乏させる影響に関して本明細書中で提供されるデータに基づ けば、BMP8は、輸精管における精子形成の特定クラスの欠損による不妊症を有す るヒト男子の処置において治療剤として有用である。例えば、これらの異常は、 Bmp8遺伝子（コードまたは非コード配列）またはBmp8遺伝子の発現を調節するタ ンパク質をコードする他の遺伝子の内部的な遺伝予欠損に起因し得る。あるいは 、外部的なホルモンまたは環境因子はBmp8遺伝子を不活化し得るか、またはその 正常な調節を妨げ得る。これらの患者の不妊症は、全身的なあるいはタンパク質 でコートしたまたはタンパク質を含浸させた徐放性ビーズでのBMP8の投与により 処置され得る。このようなビーズは、一方または両方の精巣中に移植され得る。 BMP8タンパク質でコートしたまたはそれを含浸させたビーズはまた、高速度粒子 「銃」から投与され得る。 本発明の方法において有用であるBMP8は、このタンパク質のＣ末端TGFβ様部 分のダイマーを含む組換えタンパク質であり得る。この組換えタンパク質は、昆 虫細胞／バキュロウイルス発現系で容易に生成され得る。あるいは、COS細胞が 、BMP8の生成に使用され得る。この細胞は、一般に、生物学的に活性な形態での 分泌のためにタンパク質を改変およびプロセスする。このような発現系は、BMP8 に関連するタンパク質（例えば、BMP2およびBMP7/骨形成タンパク質１が前臨床 試験中である）を含む他のサイトカインの産生のために広く利用される。 さらに、レトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療アプローチ（これは、 例えば、EF1-αブロモーター駆動性Bmp8遺伝子を含むが、それに限定されない） は、精原細胞へのBMP8タンパク質の送達のために使用され得る。EF1-αプロモー ターは、トランスジェニックマウスの精原細胞での特異的な遺伝子発現を駆動す ることが知られる（Furuchiら、1996，Development 122:1703-1709）。さらに、 ウイルスベクターの使用に加えて、非ウイルスベクター（例えば、カチオン性リ ポソームであるがこれに限定されない）が、細胞への核酸の送達のために使用さ れ得る。 Bmp8核酸が細胞に添加されるべきである場合、核酸は、例えばシグナル配列を コードする核酸配列を添加して細胞からのタンパク質の分泌を促進することによ り改変され、その結果、周囲の細胞もタンパク質によって影響され得る。 BMP8処置はまた、捕獲された絶滅の危機に瀕した哺乳動物種の受胎能を増大す るために有用であり得る。この動物は、ホルモンもしくは環境因子または老齢に より有効な精子形成能を有さない。 Bmp8遺伝子に変異を含むトランスジェニック動物は、細胞発達におけるBMP8の 役割の研究、インビボでBMP8活性に影響する化合物の同定および試験に有用であ る。このようなトランスジェニック動物の作製を以下に記載する。 本発明はさらに、以下の実験例を参照することで詳細に説明される。これらの 例は、例示の目的でのみ提供され、そして特に特定しない限り限定することを意 図されない。従って、本発明は、決して以下の実施例に限定されるとして解釈さ れるべきではなく、むしろ本明細書中で提供される教示の結果として明らかとな る任意および全での変形を包含すると解釈されるべきである。 哺乳動物精巣由来の精原幹(SS)細胞株の単離、増殖および分化のための方法 ラット、マウス由来の精子形成細胞を（粗均質集団に）精製および短期間培養 するための方法は既に十分に確立されている。これらの方法は、Methods in Enz ymology 225:84-113(1993)中のAnthony R．Bellveによる「精子形成細胞の精製 、培養および分画」において総説されている。 １〜２週齢のBMP8ホモ接合型変異体マウスは、最も原始的な精原幹(SS)細胞が 高度に富化された細胞の集団を得るために使用され得る。この細胞は通常得るこ とが非常に難しい。なぜならそれらは、精巣の全精子形成細胞の非常に小さな割 合を構成するからである。 次いで、幹細胞が富化された単離細胞集団は、低レベルの血清（１〜10％）お よび異なるレベルのBMP8タンパク質（これらのレベルは0.5〜500ng/mlの範囲で あり得る）を含む培養培地の存在下で、単独でまたは（セルトリ細胞の支持機能 を模倣するための）不活化フィーダー細胞の存在下で、培養ディッシュ（コラー ゲンでコートされている）中で培養される。同じ濃度範囲での他の増殖因子（例 えば、線維芽細胞増殖因子（FGF）、スチール因子、LIF、インターロイキン、神 経成長因子、アクチビン）の添加がまた使用され得る。線維芽細胞増殖因子は、 ラットおよびマウスの精原細胞において発現されることが知られる。異なるクラ スの増殖因子（LIF、幹細胞因子およびFGF）の組み合わせは、胎児生殖腺の始原 生殖細胞由来の細胞株の培養について見出されるように有益であり得る。 本発明まで、精原細胞は培養において24〜48時間だけ生存した。本発明により 、単独または他の因子との組み合わせでのBMP8の添加は、この障害を克服し、そ して細胞を無限に増殖し続けさせる。 本明細書中に記載される方法は、新生児もしく非常に若い男子（死後提供され る）または成人男子のいずれかからのヒト精巣に適用する。あるいは、細胞は、 受精用の卵子にマイクロインジェクションするための精巣由来の細胞を得るため に現在使用される技術を用いて被験体から単離され得る。これらの手順は、受精 能試験の分野のものであり、そして例えば、精巣の針生検を含む。 そのようにしで得られた精巣細胞は、分離されそしてSS細胞の増殖を刺激する 増殖因子のカクテルの存在下で培養される。 精巣細胞を得るためのさらなる方法は、以下のとおりである：精巣を摘出し、 そして被膜を取り除く。次いで、精巣を、ウシ血清アルブミンおよびコラゲナー ゼ（最終濃度約0.5mg/ml）を含む緩衝化生理食塩水中で緩やかに振盪させながら 32℃でインキュベートする。組織が分離した後、輸精管を沈降させ、次いで生理 食塩水中で数回洗浄する。コラゲナーゼ処理を繰り返して、管の周囲の全ての細 胞（ライディヒ細胞および結合組織）を取り除く。次いで、管を洗浄し、そして 緩衝化生理食塩水中のヒアルロニダーゼ（最終濃度約0.5mg/ml）で、32℃で、管 が接着物質を含まなくなるまで処理する。管を洗浄し、そしてポリ-Ｌ-リジンで コートした組織培養ディッシュ上に置く。セルトリ細胞はディッシュに強く付着 し、そして広がる。しかし、生殖細胞は懸濁物中に留まる。生殖細胞を、米国特 許第5,453,357号（これは、参考として援用される）に記載されるように、回収 し、そして膜結合および可溶性幹細胞因子、LIFおよび塩基性FGFを含む照射した フィーダー細胞の層上に置く。 本明細書中で使用される用語「多能性胚幹細胞」は、生殖細胞（精子および卵 子）を含む、胚または成体において多くの分化した細胞型を生じ得る細胞を意味 する。多能性胚幹細胞はまた、自己再生し得る。従って、これらの細胞は生殖細 胞系を占め、そして複数の最終的に分化した細胞（成体の特殊化した器官を含む ）を生じるだけでなく、それ自身を再生し得る。この細胞型はまた、本明細書中 で「ES細胞」とも呼ばれる。 本明細書中で使用される用語「線維芽細胞増殖因子」（FGF）は、任意の適切 なFGFを意味する。現在、７つの公知のFGFが存在する。これらのFGFは、FGF-1（ 酸性線維芽細胞増殖因子）、FGF-2（塩基性線維芽細胞増殖因子）、FGF-3（int- 2）、FGF-4（hst/K-FGF）、FGF-5、FGF-6、FGF-7およびFGF-8を含む。 それぞれの適切な因子は、ES細胞を産生または維持するために、本明細書中で 教示される方法において直接使用され得る。それぞれのFGFが本明細書中に記載 される方法でスクリーニングされ、FGFがES細胞またはそれらの祖先の成長を促 進するためまたはそれの継続した増殖を可能にするために適切かどうかを決定し 得る。FGFの種々の例およびFGFを産生する方法は周知である；例えば、米国特許 第4,994,559号；同第4,956,455号；同第4,785,079号；同第4,444,760号；同第5, 026,839号；同第5,136,025号；同第5,126,323号；および同第5,155,214号を参照 のこと。 「スチール因子」(SF)が、本明細書中で使用される。SFはまた、当該分野にお いて、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子およびc-kitリガンドとも呼ばれる。SF は、細胞質ドメインおよび細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質である。可 溶性SFは、特定のタンパク質分解性切断部位において細胞外ドメインから切断さ れたフラグメントをいう。膜結合SFは、切断される前の正常なSFまたはタンパク 質分解性切断が生じ得ないように改変されたSFの両方をいう。SFは、当該分野に おいて周知である；ヨーロッパ特許出願第90310889.1号に対応するヨーロッパ特 許公報第0423980A1号を参照のこと。 「白血病阻害因子」(LIF)がまた、本明細書中で使用される。LIFはまた、DIA または分化阻害活性としても知られる。LIFおよびLIFの使用はまた周知である； 例えば、米国特許第5,187,077号および同第5,166,065号を参照のこと。 BMP8、FGF、SF、およびLIFは全てタンパク質であり、そして従って特定の改変 がタンパク質に対してなされ得ることが認識されるべきである。この改変は、サ イレントであり、そして本明細書に記載されるタンパク質の活性を除かない。こ のような改変は、付加、置換および欠失を包含する。タンパク質を改変する方法 は、当該分野において十分に確立されている（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989）。 一旦ES細胞が確立されると、それらは遺伝子操作されて所望の特徴を生じ得る 。例えば、ES細胞は、遺伝子を非機能的にするように変異され得る（例えば、腫 瘍遺伝子）。あるいは、機能遺伝子が挿入されて、その遺伝子産物（例えば、成 長ホルモンまたは有用なタンパク質）の動物における産生を可能にし得る。 FGF、LIFおよびSFの増殖を促進する量は、細胞の種または株および因子のタイ プまたは純度に依存して変化し得る。一般に、培養液中に0.5〜500ng/mlのそれ ぞれの因子が適切である。より狭い範囲では、βFGFおよびLIFについては10〜20 ng/mlの間、ならびにSFについては10〜100ng/mlの間の量である。実際の量が知 られているか否かにかかわらず、それぞれの因子の最適な濃度は当業者により日 常的に決定され得る。このような決定は、個々のおよび組み合わせの因子の力価 測定により、最適な増殖が得られるまで行われる。さらに、他の因子がまた、ES 細胞増殖に対するFGF、LIFおよびSFの効果を増強するそれらの能力を決定するた めに試験され得る。下記のように、このような他の因子または因子の組み合わせ は、ES細胞増殖を促進するために使用される場合、上記の組成物中に含まれ得る 。また、FGF、LIFおよびSFの化合物およびフラグメント（これらの因子を模倣す る）は、ES細胞になる細胞の成長および増殖を促進するために使用され得、そし て本発明の範囲内に含まれる。 従って、本発明は、哺乳動物の多能性胚幹細胞を作製する方法を提供する。こ の方法は、精原幹細胞を含む出生後の哺乳動物の精巣に由来する細胞集団を、BM P8を実質的に存在させないでインキュベートする工程、次いで得られた細胞集団 を、成長促進量の塩基性線維芽細胞増殖因子、白血病阻害因子、膜結合スチール 因子および可溶性スチール因子を含む組成物中でインキュベートし、それによっ て精原幹細胞からの多能性胚幹細胞を作製する工程、を包含する。精巣において 、これらの精原幹細胞は、自己再生および成熟精原細胞への分化の両方を行い得 る細胞の小集団を表す。 これらの方法は、任意の動物細胞、特に、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ ト、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒトなどを含む哺乳動物細胞を利用して実施され得る。 本方法により産生されたES細胞もまた意図される。 種々の動物に由来する生殖細胞の産生および増殖を促進するに有用である、さ らなる増殖因子が見出され得る。 本明細書中で示される実験の次のセットにおいて使用される方法をここで記載 する。 Bmp8bのゲノムDNAおよびcDNAの単離 λ Fix II(Stratagene)における129/SvJマウスのゲノムDNAライブラリーの約 ５×10⁵個のファージプラークを、NZY-寒天プレート上に広げ、そしてHybondの 陽性に荷電したナイロンメンブレン(Amersham Life Science)に移した。ハイブ リダイゼーションを、0.5M NaH₂PO₄(pH7.2)、７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) 、 1992,J.Biol.Chen.267:25220-25227）と共に65℃で一晩行った。最終洗浄を、0. 2×SSC、0.2%SDS中で30分間65℃にて実施した。Bmp8aの２つの重複するクローン および７つの重複するBmp8bクローンを単離した。Bmp8b cDNAを、14.5d.p.c.の 胎盤から得られた全RNAを用いる5'および3'RACE-PCR（Frohmanら、1988,Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 85:8998-9002；Lohら、1989,Science 243:217-220；Bertchtol d、1989,Nucleic Acids Res．17,453）により単離した。遺伝子特異的プライマ ーは、Bmp8bの成熟領域の一部をコードするエキソン４に由来した（図3B，Bmp8b BN260）。DNA配列決定を、ジデオキシヌクレオチドターミネーション法（Sange rら、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467）により実施した。 染色体マッピング エキソン７の下流の2.0kbのSalI-EcoRI Bmp8aゲノムDNAフラグメントを、高ス トリンジェンシーでのサザンブロットのためのプローブとして使用した。MspIで 消化されたC57BL/6J(2.7kb)およびMus spretus(4.0kb)ゲノムDNAを有する制限フ ラグメント長変種(RFLV)を見出した。イントロン６由来の1.4kbのXbaI Bmp8bゲ ノムDNAフラグメントを、高ストリンジェンシーでのサザンブロットのためのプ ローブとして使用した。MspIで消化されたC57BL/6J(4.1kb)およびMus spretus(1 .5kbおよび0.5kb)ゲノムDNAを有するRFLVもまた見出した。両方のプローブを、M spIで消化したJackson Laboratory種間戻し交配DNAパネル(C57BL/6JEi×SPRET/E i)F1×SPRET/Ei（Roweら、1994,Mamm.Genome 5,253-274）を用いてハイブリダイ ズさせた。両方の遺伝子がマウス第４染色体にマップされ、そしてこのパネルの 94のDNAサンプルにおいてこれらの２つの遺伝子の間に組換え事象は起こらなか った。マッピングデータは、htt://www.jax.org/resources/documents/cmdataで のWorld Wide Web上のJackson Laboratory Backcross Dataに提出されている。 DNA構築物 Bmp8a STR380（図3B）を、380bpのBmp8a cDNAフラグメント（塩基対1273〜165 間でpBluescript KSIIに挿入することにより構築した。Bmp8b BN260を、エキソ ン４を含む260bpのゲノムDNAフラグメントをpBluescript KS II(Stratagene)に 挿入することにより作製した。Bmp8a 3'UTRおよびBmp8b 3'UTR（図3B）は、600b pおよび900bpの各遺伝子の3'UTR（RT-PCRにより生成）をpBluescript SKII(Stra tagene)に挿入することにより構築した。 RNAの調製およびRNase保護アッセイ マウスの組織および胚由来の全RNAを、グアニジンチオシアネート-塩化セシウ ム超遠心分離、ぞしてフェノール／クロロホルム抽出により単離した。RNase保 護アッセイを、各組織由来の10μgの全RNAを用いて実施した。³²Pを用いて標識 したアンチセンスRNAプローブを、T3またはT7 RNAポリメラーゼおよびテンプレ ートDNA（Bmp8a STR380、Bmp8b BN260、およびpTRI-B-アクチン-マウスプラスミ ド(Ambion)）を使用して合成した。完全長のプローブを、５％ポリアクリルアミ ド-尿素ゲル上で精製した。RNase保護アッセイを、RPAIIキット(Ambion)を用い て実施した。 インサイチュハイブリダイゼーション インサイチュハイブリダイゼーションを、以下のようにわずかな改変を伴って 、本質的にZhaoら（1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8633-8637）に記載され るように実施した。新鮮な切開されたマウスの胚および組織をリン酸緩衝化生理 食塩水(PBS)中ですすぎ、次いで、新鮮に調製された４％パラホルムアルデヒド- PBS中で組織の量に依存して２〜12時間固定した。固定の後に、組織をPBS中です すぎ、そして一連の漸増濃度のエタノール中で３〜５時間脱水した。組織を、パ ラプラスト中に包埋した後に、７μｍで切片化した。RNAプローブを、1.2×10⁹c pm/μgの比活性まで[a-³⁵S]UTPを用いて標識した。ハイブリダイゼーションを、 50％ホルムアミド、300mM NaCl、10mM Tris(pH7.4)、10mM NaH₂PO₄(pH6.8)、5mM EDTA(pH8.0)、0.2％ Ficoll400、0.2％ポリビニルピロリドン、10％硫酸デキス トラン、200μg/ml酵母tRNA、および50mMジチオスレイトール(DTT)中で、２×10⁴ cpm/μlのリボプローブを用いて50〜55℃で12〜16時間実施した。２回の30分の 高ストリンジェンシーの洗浄を、２×SSC、50％ホルムアミド中で60〜65℃で実 施した。スライドをNTB-2 Kodakエマルジョンに浸し、次いで４℃にて5〜14日間 曝露した。現像しそして固定した後に、スライドを、Mayerのヘマトキシリン(Si gma)で３〜５分間染色し、次いで写真のためにパーマウント(permount)を用いて マ ウントした。 脱落膜腫の生成 偽妊娠のICR雌を、発情期の雌を精管切除された雄とつがわせることにより生 成した。４日後、50μlの鉱物油を、一つの子宮角(uterus horn)に注入した。注 入の５日後、動物を屠殺した。子宮および／または脱落膜腫を、固定またはRNA 調製のために解剖して取り出した。 配列の比較およびGenBank受託番号 Bmp8aとBmp8bとの間のcDNAおよびタンパク質の配列比較を、National Center for Biotechnology InformationのBLASTプログラムを用いて実施した。Bmp8b cD NA配列は受託番号U39545でGenBankに提出された。 変異マウスの生成 Bmp8aおよびBmp8b遺伝子に変異を有するマウスが、胚幹(ES)細胞における相同 組換えの技術を使用して作製されている。これらのマウスにおいて、特定のタン パク質配列をコードするDNA配列は除去され、そして遺伝子は非機能性にされて いる。 129/SvJマウスゲノムライブラリー由来のBmp8aおよびBmp8bゲノムDNAクローン を単離した。Bmp8aおよびBmp8bについての置換標的化構築物を生成した。標的化 DNA構築物を、129/WvJ胚幹(ES)細胞にトランスフェクトし、そして標的化された ES細胞クローンを、陽性および陰性の薬物選択により選択した。標的化されたES 細胞をマウスの胚盤胞に注入してキメラ動物（キメラ）を生成した。キメラを、 生殖系列の伝達のため（すなわち、ヘテロ接合体(+/-)動物を得るため）に、野 生型(+/+)のBlackswissの雌につがわせた。ヘテロ接合体(+/-)動物を、ホモ接合 体(-/-)変異動物を得るためにつがわせた。 変異マウスの表現型 Bmp8bにおけるヌル変異についての雄マウスのホモ接合体は、小さな精巣を有 し、そして３月齢では生殖力がない。成体ホモ接合体変異体の精細管の分析によ り、精原細胞の間の非常に高いアポトーシスの頻度が示され、このことは、遺伝 子産物（BMP8Bタンパク質）がインビボでのこれらの細胞の生存のために必要で あることを証明する。ホモ接合体変異体マウスはまた、誕生後の精細管における 精子形成の開始を遅延させていた。１週齢および２週齢では、精細管は、基底層 およびセルトリ細胞と接している精原細胞の単一の層のみからなる。１週齢およ び２週齢の動物の全身へのBrdU標識による細胞増殖速度の研究は、精細管の基底 層に隣接する精原幹細胞の増殖が変異マウスにおいて非常に減少していることを 証明している。これは、Bmp8b遺伝子産物はまた、誕生後の精原細胞の増殖を増 強／促進／刺激することにおいて重要な役割を果たすことを証明する。 これらの実験の結果は、ここに記載される。 BMP8をコードする遺伝子の時間的および空間的発現の分析。 ここに記載される実験は、BMP8（Kingsley、1994,Genes Dev.8:133-146）（こ l.Chem.267:25220-25227)）をコードする遺伝子の時間的および空間的発現の分 析を特色とする。 Bmp8bの分子クローニング エキソン２〜７を含むマウスBmp8a cDNAフラグメントを使用して、λFixIIに おけるマウス129/SvJゲノムDNAライブラリーを高ストリンジェンシーでスクリー ニングした。９つの陽性のクローンを、５×10⁵個のプラークから精製した。２ つの重複するクローンはBmp8aに対応し、これはイントロン１の中間から始まっ て、そしてエキソン７の下流で終結する。７つの残りのクローンは、異なるゲノ ムの遺伝子座に由来した。配列分析は、新しい遺伝子座(Bmp8b)がBmp8aのDNA配 列に高度な同一性を有するDNA配列を含むことを明らかにした。推定のエキソン ４の成熟領域における配列情報に基づいて、特異的なオリゴヌクレオチドプライ マーが設計され、14.5d.p.c.の胎盤から単離されたRNAを使用して5'RACE-および 3'RACE-PCRを実施して、Bmp8b cDNAを単離した。BMP8AおよびBMP8Bの推定のアミ ノ酸配列の比較を、図１に示す。 Bmp8遺伝子は高レベルの配列同一性を共有する Bmp8aとBmp8bとの間のヌクレオチドレベルでの配列同一性は、コード領域なら びに5'非翻訳領域(UTR)および3'UTRの両方において隣接する約20の塩基対に制限 される。プロ領域(pro-region)をコードするDNA配列は、91％の同一性を共有す る一方、成熟領域をコードする配列は83％の同一性を共有する。図１に示される ように、BMP8AおよびBMP8Bの両方のタンパク質は、399個のアミノ酸を含む。こ れらのタンパク質のプロ領域におけるアミノ酸配列は、87％の同一性を共有し、 一方、成熟領域のアミノ酸配列は76％の同一性を共有する。これは、全ての、公 知である密接に関連するTGF-βスーパーファミリーメンバー間で例外的である（ ここで、プロ領域は成熟領域よりもより高度な配列同一性を有する）。他のTGF- βスーパーファミリーメンバーを有するマウスBMP8タンパク質の配列相同性は、 BMP8AとBMP8Bとの間で共有される相同性よりも有意に低い。 Bmp8aおよびBmp8bは第４染色体上で密接に連鎖する Jackson Laboratory種間戻し交配DNAパネル(BSS)を使用して、Bmp8aおよびBmp 8bの染色体の所在をマップした。C57BL/6およびMus spretusとの間のRFLVを、3' UTR（エキソン７）の下流のBmp8a DNAフラグメントに由来するまたはイントロン ６におけるBmp8b DNAフラグメントに由来するプローブを使用して、各遺伝子に ついて同定した。両方の遺伝子の場合において、RFLVを制限酵素MspIを使用して 検出した。両方の場合において、94の(C57BL/6JEi×SPRET/Ei)F1×SPRET/Ei戻し 交配の子孫をMus domesticusまたはMus spretus対立遺伝子の遺伝について型分 類し、そして各対立遺伝子の分布パターンを使用して種間マップ上へ遺伝子座を 配置した（Roweら、1994,Mamm.Genome 5:253-274）。図２に示されるように、両 方の遺伝子は第４染色体に割り当てられ、マーカーD4Mitllを有する94の動物に おいて組換えは存在しなかった。これらのデータは、Bmp8aおよびBmp8bが密接に 連鎖することを証明し、そしてこれらの遺伝子が単一の遺伝子の重複により生じ たことを示唆する。 図2Aにおいて、Jackson Laboratory戻し交配パネルのデータに従う、２つのBm p8遺伝子の第４染色体上の局在を、Mouse Genome Database(MGD)の複合第４染色 体(composite chromosome)のマップと比較する。Bmp8a/bにおける変異について の唯一の可能性のある候補は、sks（生殖不能を伴う骨格融合）である（Handel ら、1988,Gamete Res.21:409-423）。この劣性変異についての雄のホモ接合体に おいて、生殖細胞の大多数は、減数分裂の後期段階において拘束される。 発生の間のBmp8遺伝子の発現 Bmp8遺伝子の機能を研究するために、遺伝子の発現パターンを、一連の技術 （ノーザンブロッティング、RNase保護アッセイ（図３）、ホールマウントイン サイチュハイブリダイゼーション、切片のインサイチュハイブリダイゼーション （図４における7.5-10.5d.p.c.）、および8.5d.p.c.のマウス胚cDNAライブラリ ーのスクリーニングを含む）を使用してマウス胚形成の間に試験した。これらの 段階のいずれにおいても、胚において検出可能なレベルのBmp8発現は観察されな かった。それゆえ、これらのデータは以前の報告（高レベルのBmp8a(Op2)転写物 が、8.5および10.5d.p.c.のマウス胚において、ノーザンハイブリダイゼーショ の子宮および胎盤から単離したRNAを使用して、逆転写酵素PCR(RT-PCR)を実施し た場合、高レベルのBmp8a転写物は両方の組織において検出され、そしてBmp8bは 胎盤のみにおいて検出された。これらの組織および胚に由来するRNAを使用したR Nase保護アッセイ（図３）は、RT-PCRを使用して得られた結果を確証した。 胎盤および子宮におけるBmp8転写物を局在化させるために、インサイチュハイ ブリダイゼーションを、Bmp8 mRNAのユニーク(unique)3'非翻訳領域に対応する アンチセンスRNAプローブを使用して実施した。図４に示すように、高レベルのB mp8a転写物が、脱落膜細胞において7.5d.p.c.と10.5d.p.c.との間で検出された 。より低いレベルの発現もまた、栄養芽細胞において検出された（図4D、4G、お よび4J）。非常に低いレベルのBmp8a転写物を非妊娠の子宮においてRT-PCRによ り見出したが、強いインサイチュハイブリダイゼーションシグナルは5.5d.p.c. の脱落膜(deciduum)および子宮において観察されなかった。それゆえ、Bmp8aの 発現は、5.5と7.5d.p.c.との間で有意に増加し、Bmp8a転写物は11.5d.p.c.の後 のインサイチュハイブリダイゼーションにより検出不可能なレベルまで減少する 。 最高レベルのBmp8a発現は、脱落膜の反子宮間膜領域において観察され、そし て減少する勾配が、9.5 d.p.c.前に子宮間膜で示された。10.5 d.p.c.において 、発現の全体のレベルは減少したが、最高レベルの発現は子宮間膜領域において 見出された。脱落膜細胞におけるBmp8a発現は、胚着床非依存性である。これを 、鉱油を偽妊娠マウスの子宮中に注射して、胚の非存在下において脱落膜腫を生 成することにより決定した。脱落膜腫におけるBmp8a発現は、胚着床後の正常発 現パターンを忠実に反映した。 Bmp8b転写物は、約9.5 d.p.c.に開始して胎盤の迷路領域中の栄養膜細胞にお いて優勢に検出され、そして16.5 d.p.c.まで検出可能であった。RNase保護アッ セイにおいて、非常に低レベルのBmp8b転写物が、13.5および15.5 d.p.c.胚にお いて存在するようであったが、転写物は、インサイチュハイブリダイゼーション によっては厳密に胚において検出され得なかった。 雄性生殖細胞におけるBmp8遺伝子における発現 心臓、脳、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胸腺、皮膚、骨格筋、精巣、および卵巣を 含む、RNase保護によりアッセイした成体組織の中で、精巣のみが検出可能なBmp 8シグナルを含んでいた。それゆえ、³⁵S-標識アンチセンスRNAプローブを使用す るインサイチュハイブリダイゼーションを、精巣切片に対して実施した。哺乳動 物精子形成の間、初期の精原細胞（幹細胞）は、有糸分裂して、一次精母細胞を 生じる。次いで、これらの細胞は、有糸分裂を介して二次精母細胞および精子細 胞を生じる。Russellら(1990:Histological and histopathological evaluation of the testis，Cache River Press，Clearwater，FL.，119-161頁）において 概説されるように、マウス精子形成の間に、精細管（これは、生殖細胞および体 セルトリ細胞を含む）は、ローマ数字により示される12の段階に恣意的に分けら れる。この段階付け（staging）系において、精子細胞の先体（過ヨウ素酸およ びシッフ試薬により染色される）および核（ヘマトキシリンで染色される）の形 態は、重要なマーカーとして作用する。精子細胞の発達は、アラビア数字により 示される16の段階に分けられる。異なる段階の生殖細胞管の厳密に調節された細 胞性会合は、精細管の異なる領域において観察され得る。図５に示すように、両 方のBpm8遺伝子を特定する転写は、段階６〜８の円形精子細胞において、類似の 時間的および空間的パターンで検出された。強いハイブリダイゼーションシグナ ルは３週齢の動物の精巣において最初に出現し、これは、円形精子細胞が最初に 段階６に分化した時であった。弱いシグナルはまた、６週齢前のより若い動物の 精巣中のいくつかのパキテン期精母細胞において検出された（図５、パネルＭお よびＮに示すように）。最も強いハイブリダイゼーションシグナルは、後期段階 ７および初期段階８の円形精子細胞において観察され、そして、精子細胞が延長 し始めたときに（段階９）、シグナルは劇的に減少した。 タンパク質のTGF-βスーパーファミリーの公知の近縁のメンバーの中で、BMP8 AおよびBMP8Bは、最高レベルの配列同一性を（特にプロ領域において）示す。こ れらのタンパク質をコードする２つの遺伝子は、マウス第４染色体上で密接に連 鎖し、そして類似のゲノム構成（イントロン／エキソンのサイズおよび境界）を 共有し、このことは、これらが最近の遺伝子複製により生じたことを示唆する。 しかし、それらの発現パターンは類似しているが、それらは同一ではない。雄性 生殖細胞において、両方の遺伝子は段階６〜８の円形精子細胞において最高のレ ベルで、そしてパキテン期精母細胞においてより低いレベルで発現される。発達 中の子宮および胎盤において、Bmp8aは脱落膜細胞において高レベルで、そして 栄養膜細胞において低レベルで発現され、そしてその発現は、11.5 d.p.c.後に インサイチュハイブリダイゼーションにより検出不能なレベルまで減少する。対 照的に、Bmp8bは、胎盤の母性成分ではなく栄養膜の迷路領域において発現され 、ここでその発現は、少なくとも16.5 d.p.c.まで持続する。Bmp8aおよびBmp8b の発現パターンの別の差異は、Bmp8aは、初期の生後の動物の発達中の毛包にお いて高レベルで発現されるが、Bmp8bは、バックグラウンドをわずかに上回るレ ベルで発現されるのみであるということである。発現パターンにおけるそのよう な差異は、Bmp8aおよびBmp8b遺伝子の複製後に、コードエキソンの外側の調節エ レメントが分岐して、いくつかのエレメントを喪失させ、そして／または他を獲 得させたことを示唆する。 BMPおよび胎盤発達 着床および胎盤発達におけるBMPの役割は十分には確立されていないが、Bmp2 、Bmp4、Bmp6（Lyonsら、1990，Development 109:833-844）ならびにBmp8aおよ びBmp8bは全て、インサイチュハイブリダイゼーションによって、胚体外部位に おいて検出された。ここに記載のBmp8aの発現は、Bmp2の発現と重複する。高レ ベルの両方の転写物ば、脱落膜において、着床時ではなく、脱落膜細胞の増殖お よび肥大がピークになるときに存在する（総説については、Finn，1971，Adv．R eprod．Physiol．5:1-26）。Bmp8a発現は、脱落膜の成長が減速するときに減少 する。この時間的および空間的パターンは、これらのリガンドが、子宮間質細胞 の増殖、生存、および／または分化に関与することを示唆する。 胎盤において、迷路領域中の栄養膜細胞は、比較的未分化でありそして迅速に 増殖する集団であり、これは、海綿栄養芽層において細胞を生じる。海綿栄養芽 細胞の外層は、非分裂栄養膜巨細胞にさらに分化する(Billington，1971，Adv． Reprod．Physiol．5:27-66；Crossら、1994，Science 266:1508-1518）。Bmp8b の発現は、迷路栄養膜領域において最高であるが、Bmp4の発現は、海綿栄養芽層 において最高である。この知見は、Bmp8bおよびBmp4が、栄養膜細胞の増殖／生 存を促進する、および／またはそれらの海綿栄養芽層および最終的に栄養膜への 分化を調節することを示唆する。 過去数年において、転写因子をコードする多数の遺伝子が、発達中の胎盤の栄 養膜細胞において検出されている（総説については、Crossら、1994，Science 2 66:1508-1518を参照のこと）。これらの遺伝子産物の中で、証拠は、ヘリックス -ループ-ヘリックス（HLH）転写因子、Mash-2（Johnsonら、1990，Nature 346:8 58-861）、Id-1、Id-2（Crossら、1994，Science 266，1508-1518；Evansら、19 93，Dev．Biol．159，485-499；Janaypourら、1994，Mol．Biol．Cell．5:(補遺 )，453a）、およびHxt（Crossら、1995，Development 121:2513-2523）が栄養膜 の増殖および分化に影響することを示唆する。新たに同定されたeHand転写物は また、栄養膜系列において高レベルで検出された（Cserjesiら、1995，Dev．Bio l．170:664-678）。胎盤におけるBMPおよびHLHタンパク質の発現は、胎盤の成長 および分化の調節におけるこれら２つの群のタンパク質の間の複雑な相互作用を 反映し得る。骨基質から精製されたBMPが、HLHタンパク質のMyoDファミリーの発 現を抑制することにより筋芽細胞の分化を阻害するという事実は（Murrayら、19 93，J．Cell．Biochem．53:51-60）、そのような仮説を支持する。 精子形成におけるBMP8タンパク質の役割 Bmp8遺伝子は、雄性生殖細胞において発現されることが示された最初のTGF-β スーパーファミリーメンバーである。いかなる円形精子細胞が出現する前の若い 動物の精巣において、Bmp8転写物は、一次精母細胞において低レベルで検出され た（図５、3.5週の精巣についてパネルＭおよびＮ）。円形精子細胞が段階６〜 ８に発達した場合、ずっとより高いレベルのBmp8aおよびBmp8bの発現が、これら のハプロイド生殖細胞において検出された（図５ＭおよびＮ）。そのような発現 パターンは、３つの公知のTGF-βスーパーファミリーメンバーであるミューラー 阻害物質（MIS）、インヒビン、およびアクチビンの発現パターンとは異なり、 これらは全て精巣のセルトリ細胞において優勢に発現される。さらに、標的化変 異誘発によるこれらの遺伝子の不活化は、雄性生殖細胞における原発性の欠損に は導かない（Behringerら、1994，Cell 79，415-425；Matzukら、1992、Nature 360:313-319；Vassalliら、1994，Genes Dev.8:414-427；Matzukら、1995，Natu re 374:354-356）。むしろ、ホモ接合型インヒビンヌル変異体における間質細胞 の腫瘍形成は、下垂体における卵胞刺激ホルモン（FSH）産生の阻害による、精 巣機能におけるインヒビンの間接的な役割を支持する。インヒビンの非存在下に おいて、FSHの過剰産生は、間質細胞の過剰増殖および腫瘍形成を引き起こす（M atzukら、1992、前出）。MISの非存在下において、雌性生殖系の発達は、雄性マ ウスにおいて完全には阻害されない。雄における雄性および雌性両方の生殖系の 存在は解剖学的不和合性および不妊症を課するが、精子形成は、比較的影響され ないようである(Behringerら、1994，Cell 79，415-425）。アクチビンＢＢサブ ユニットの非存在下において、精子形成は正常であるが（Vassalliら、前出）、 アクチビンＢＡサブユニットの非存在は周産期死亡率に導き、その結果、精子形 成におけるその役割は、評価され得ない（Matzukら、1995，Nature 374:354-356 ）。しかし、アクチビンレセプターActRcIIの非存在は、精細管の容量の減少を 引き起こすのみであり、生殖細胞集団における原発性欠損は引き起こさない。こ のことは、このレセプターが、体セルトリ細胞の増殖および分化に影響し得るこ とを示唆する（Matzukら、1995，Nature 374:356-359）。 他のTGF-βスーパーファミリーメンバーとは対照的に、本明細書中に示すデー タは、雄性生殖細胞におけるBmp8遺伝子の発現が、精子形成の進行に緊密に相関 することを確立する。精巣の生後発達の間に、生殖細胞は、２つの運命（成熟精 子を生じる分化、または壊死もしくはアポトーシスのいずれかを介しての変性） のうち１つを有し得る。約50％の初期生殖細胞は、優勢にアポトーシスにより、 その生涯の間に死滅する（Allanら、1987、Potten，C.S.(編)，Perspectives on mammalian cell death，Oxford University Press，London，229-258頁；Allan ら、1992，Cell Prolif．25:241-250）。以下に示すデータは、思春期前に、有 意な割合のマウス原生殖細胞がアポトーシスを介して変性することを確認する。 しかし、段階６〜８の円形精子細胞の出現とともに、Bmp8発現のレベルは増加し （3.5週齢以上）、そしてアポトーシス性生殖細胞の数は減少する。Bmp8aおよび Bmp8b発現のレベルと生殖細胞アポトーシスとの間の逆の関係は、生殖細胞変性 の阻害におけるBMP8の役割を裏付ける。さらに、ホモ接合型ヌルBmp8B変異体雄 において、生殖細胞の増加したアポトーシスは、精巣変性および不妊症に導き、 そして最終的にセルトリ細胞のみが精細管において残される。これらの観察は、 アポトーシスを阻害することによる生殖細胞の生存の生存におけるBMP8AおよびB PM8Bの非重複性の役割を示唆する。 ちょうど記載したばかりの実験を詳述し、次のセットの実験において、標的化 変異を各遺伝子に別々に導入することにより、分子遺伝学的アプローチを使用し て、Bmp8遺伝子のインビボ機能を研究した。本明細書中で論じたように、機能的 Bmp8b遺伝子の非存在下において、雄性生殖細胞増殖は、初期思春期の間に有意 に減少され、そして成体において雄性生殖細胞アポトーシスの顕著な増加もまた 存在する。最終的に、大多数のBmp8ホモ接合型変異体雄は、重篤な精細管変性を 示し、そして不妊になる。それゆえ、Bmp8bは、マウスにおける精子形成の開始 および維持の両方に必要とされる。精子形成および妊娠の間のBmp8aのインビボ における機能を同様に研究するために、マウス遺伝子を、胚幹（ES）細胞におけ る相同組換えにより不活化した。ここに記載するデータは、Bmp8a変異体マウス およびBmp8a/Bmp8b複合ヘテロ接合型マウスの詳細な表現型分析に関する。示す べき結果を要約ずると、マウスBmp8a遺伝子は脱落膜形成および胎盤発達のため に必須ではなく、そして精子形成の開始のために必要とされない。むしろ、マウ スBmp8a遺伝子は、雄性生殖の間の、正常精子形成および精巣上体の完全性の維 持における役割を担うようである。 次のセットの実験において使用される方法をここに記載する。 標的化ベクターの構築 Bmp8aゲノムDNAクローンを本明細書に記載のように単離した。エキソン２〜７ をカバーする２つの重複するBmp8aゲノムクローンを、図６Ａに示すように制限 酵素消化によりマッピングした。置換標的化ベクターを、示すように、1.2kb 5 'および4.5kb（第２のファージクローンの5'部分）3'相同性アームを使用して構 築した。本明細書に記載のように、PGK-TKA+（Rudnickiら、1992，Cell 71:383- 390）およびMCLDT-A（Yagiら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9918-992 2）カセットを、ネガティブ選択のために標的化ベクターの5'および3'末端に付 着した。標的化された対立遺伝子において、エキソン４〜６は欠失され、そして PGK-neo^rカセット（Rudnickiら、前出）で置換される。Bmp8a変異体対立遺伝子 を、標準的な命名法（Davisson 1995：Trends in Genetics Nomenclature Guide ，（編）Stewart、35-38頁，Elsevier Trends Journals，Kidlington，Oxford， UK）に従って、Bmp8a^atmlblhと命名した。 組換えES細胞クローンおよびマウスキメラの生成 継代数11および12のTL1 ES細胞を、20〜50μgの線状化した標的化ベクターを 用いて、エレクトロポレーションにより、本明細書中に記載のようにトランスフ ェクトした。ES細胞培養および薬剤選択を、本質的に記載のように実施した（Wi nnierら、1995，Genes Dev．9:2105-2116）。A5、H4、およびH9と命名された、1 00の薬剤耐性ESクローンのうち３つは、適正に組換えられたBmp8^atmlblh対立遺 伝子を示した。３つ全ての株を、C57BL/6胚盤胞中に注射して、キメラを生成し た（Hoganら，1994，Manipulating the mouse embryo:A Laboratory Manual．第 ２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY）。Bmp8^atmlblhを、A5および H4細胞から、雄性キメラをBlack Swiss雌（Taconic）と交配することにより伝達 した。アグーチ動物を、サザンブロッティングにより遺伝子型決定した。 サザンブロット分析 ゲノムDNAをEcoRIで消化し、そして0.8％アガロースゲルでサイズ分画した。 次いで、変性したDNAを正に荷電したナイロンメンブレンに移し、そして２つの 異なるプローブを用いてハイブリダイズした。エキソン２および３を含む5'外部 Bmp8a cDNAプローブは、それぞれ野生型Bmp8aおよびBmp8b対立遺伝子由来の9.0k bおよび8.0kbパンド、ならびにBmp8^atmlblh対立遺伝子由来の5.0kbバンドにハイ ブリダイズした（図６Ｂ）。エキソン４、５、６、および７を含む3'内部cDNAプ ローブは、野生型Bmp8a対立遺伝子については2.0kbおよび2.3kbバンドに、そし てBmp8^atmlblh対立遺伝子については2.0kbバンドのみにハイブリダイズした（図 ６Ｃ）。 組織学およびインサイチュハイブリダイゼーション 組織学については、新鮮に切除した精巣を計量し、そしてリン酸緩衝化生理食 塩水（PBS）中で洗浄し、次いでブワン固定液中または４％パラホルムアルデヒ ド−PBS中のいずれかで、サイズに依存して２〜24時間固定した。７μmの切片を 、スーパーフロストプラス（superfrost plus）スライド上にマウントし、そし てヘマトキシリン／エオシンまたは過ヨウ素酸−シッフ試薬／ヘマトキシリンの いずれかにより染色した。この研究におけるBmp8b変異体の組織学的分析およびB mp8a変異体の最初の調査（survey）は、重量が匹敵する場合、単一の動物由来の 精巣が通常類似の組織学を有することを確立した。それゆえ、各動物由来の１つ の精巣のみを、大部分の組織学的分析のために包埋および切片化した。異なる遺 伝子型の精巣を内部コントロールとして同一のブロック中で包埋切片化し、そし て同一のスライド上で染色した。顕微鏡検査のために３番目毎の対の切片をとる ことにより、全体の精巣の第３の切片を、マウントおよび染色した。なんらかの 異常が任意の所定の切片において観察された場合、隣接する切片を、さらなる検 査のためにマウントおよび染色した。生殖細胞を欠く、あるいは精子完成を有し ないまたは明らかに弱まった精子完成を有する精細管を、異常であるとした。10 の連続する切片において凝縮した核および好酸性細胞質を有する（これは、アポ トーシスに特徴的であるとした）50より多い生殖細胞を含んだ場合、精細管をま た、変性する細管として記録した。検査した精巣の中で、Bmp8aホモ接合型変異 体の47％（15/32）およびBmp8aヘテロ接合型変異体の17％（３/18）が異なる程 度の生殖細胞変性を示し、そして野生型動物は示さなかった（０/11）。 インサイチュハイブリダイゼーションを、以下の点に注意して、本明細書中に 記載のように実施した。簡潔に記載すると、プローブのより良好な浸透のために 、プロテイナーゼＫ処理を７分から８分に延長した。シグナル／バックグラウン ドの比を増大するために、ハイブリダイゼーション温度を60〜65℃に上昇させた 。高ストリンジェンシーの洗浄を63℃で実施した。スライドを、NBT2エマルジョ ン中に浸した後、10日間曝露した。 この実験のセットの結果をここに記載する。 マウスBmp8a遺伝子の標的化変異誘発 マウスBmp8a遺伝子は、７つのコードエキソンを含み、そして27キロベースを 超えるDNAにわたって延長する。エキソン１、２、３およびエキソン４の前半は 、前駆体タンパク質のシグナルペプチドおよびプロ領域をコードする。一方、エ キソン４の後半、ならびにエキソン５、６、および７は、成熟領域をコードする （Ozkaynakら、前出）。図６に示すように、Bmp8^atmlblh対立遺伝子においては 、エキソン４、５、および６を含む8kbのゲノムDNAフラグメントが欠失され、そ して反対の転写方向のPGK-neo^rカセット（Rudnickiら、前出）により置換されて いる。それゆえ、プロ領域、２塩基性切断部位RXXR、および成熟領域の大部分を コードするDNAが、マウスゲノムから除去されている。さらに、残りのエキソン ３および７は、PGK-neo^rカセットのオルタナティブスプライシングが生じるはず である場合、インフレームではない。それゆえ、BMP8Aタンパク質の機能的また はドミナントネガティブ形態が、Bmp8^atmlblh対立遺伝子から作製されないこと が予想される。Bmp8aの特異的3'非翻訳領域に対する³⁵S-標識リボプローブでの インサイチュハイブリダイゼーションは、ホモ接合型変異体精巣の段階６〜８の 円形精子細胞における転写物の検出を容易にする。 薬剤選択後、３つの組換えBmp8a変異体ES細胞株A5、H4、およびH9を得、そし てC57BL/6胚盤胞中に注射して、キメラを生成した。Bmp8^atmlblh対立遺伝子を、 株A5およびH4において、子孫に伝達した。ES細胞株由来の変異体マウスは、この 研究のための[129×Black Swiss]の混合した遺伝的背景上で維持した場合、類似 の表現型を示す。ここに報告する全てのデータは、これら２つの株の組み合わせ から生じた。 Bmp8a変異体の生殖性能 Bmp8aは、妊娠の間に脱落膜において、精子形成の開始の間に精原細胞および 一次精母細胞において、そして精子形成の維持の間に段階６〜８の円形精子細胞 において発現される。この発現パターンは、機能的Bmp8a遺伝子の非存在が雄性 および雌性両方の生殖性能を弱める可能性を提起する。ヘテロ接合型Bmp8^{atmlbl h} 変異体の最初の交配試験の間に、予想される比率の、野生型（ｎ＝45）、ヘテ ロ接合型（ｎ＝104）、およびホモ接合型変異体（ｎ＝52）子孫を得た。ホモ接 合型 変異体は、成体期まで正常に成長し、そして健康に見える。それゆえ、Bmp8aは 、胚発達および生後発達には必要とされない。ホモ接合型Bmp8^atmlblh動物の繁 殖能を、野生型およびヘテロ接合型動物と交配することによりさらに試験した。 表１に要約するように、全てのホモ接合型変異体雌は、正常な生殖性能を示した 。全ての変異体雄は、最初は正常な繁殖能を示した。しかし、加齢するにつれ、 いくつかの動物（16中２）は、最終的に不妊になった。それゆえ、Bmp8aは、雌 ではなく、特定の雄の繁殖能における役割を担う。 表１において、７〜10週齢の異なる遺伝子型のマウスを一緒のケージに９〜20 週間入れた。各々の雄を２〜４匹の雌とともに飼育し、そして妊娠した雌を分娩 前に分離した。子供の数を誕生後24時間以内に記録した。大部分の交配は、正常 な頻度およびサイズの同腹仔を生じた（野生型交配は、８〜8.5匹の子供の平均 同腹仔サイズを与える）。^*この群中の１匹の雄は、最初の交配期間の間に７〜 ８匹の子供の２つの同腹仔を有したが、おそらく精巣上体変性および肉芽腫形成 に起因して、その後不妊になった（図11Ｂ）。#この群中の１匹の雄は繁殖せず 、そして組織学により、重篤に弱まった精子完成が判明した。@CompはBmp8複合 ヘテロ接合型に対する。この群において、１匹の雄は繁殖せず、嚢腫が左精巣に おいて見出された。別の雄は、８〜９週間正常な生殖性能を有したが、最後の６ 週間は繁殖しなかった。組織学的検査は、精巣上体変性および肉芽腫形成を明ら か にした（図11Ｃ）。 Bmp8aは精子形成の開始には必要とされない 図７に示すように、誕生後１週目から若い成体期までヘテロ接合型またはホモ 接合型Bmp8^atmlblh変異体に比較して、野生型雄の精巣の平均重量における有意 な差異は存在しなかった。これはBmp8b変異体における知見とは対照的であった 。ここで、１〜３週齢の全てのヘテロ接合体の精巣は、野生型の精巣より有意に 小さい。２週齢において検査した30匹のBmp8aホモ接合型変異体中１匹のみが、 ７mgの重量の小さい精巣を有した。この精巣および14のさらなる精巣はBmp8a/Bm p8b複合ヘテロ接合型交配に由来し、そして図７に示す統計学的解析のためには 使用しない。２週齢正常マウス由来の精巣の平均重量は、12〜15mgである。７mg の精巣は、Bmp8bホモ接合型変異体と類似の組織学を有していた（図８Ｃおよび ８Ｄ）。２週齢における残りのBmp8aホモ接合型変異体の精巣は、野生型マウス の組織学と類似の組織学を示し、そして小さな精巣を有する他のマウスは、いか なる他の思春期前の週齢群（６週齢）においても見出されなかった。要約すると 、60より多いホモ接合型Bmp8a変異体動物（核週齢群について少なくとも10）の 精巣の組織学的検査は、１〜６週齢に明らかな異常を示さなかった（上記で列挙 したもの以外）。 図８に示すように、２週齢における野生型、Bmp8aおよびBmp8bホモ接合型変異 体、ならびにBmp8a/Bmp8b複合ヘテロ接合型精巣の組織学的比較は、Bmp8b変異体 精巣においてのみ明らかな生殖細胞欠損を示した。それゆえ、Bmp8aはマウスに おける精子形成の開始には必要とされないようである。 Bmp8aは精子形成の維持における役割を担う 精巣重量および組織学に基づくと、ホモ接合型Bmp8a変異体は、精子形成の開 始の間に、いかなる明らかな異常も示さない。しかし、17週齢以上のいくつかの Bmp8a変異体の精巣重量は、野生型およびヘテロ接合型マウスの精巣重量より小 さいようである（図７）。野生型およびホモ接合型変異体精巣の平均精巣重量の 差はスチューデントｔ検定によって統計的には有意ではないが（Ｐは0.05と0.1 との間である）、野生型（37中１）またはヘテロ接合型精巣（５/86）のいずれ かに比較して、Bmp8aホモ接合型変異体群における精巣のより大きな割合（57中1 3）は、90mgを下回った。 組織学的には、12〜30週齢雄由来のBmp8aホモ接合型変異体精巣の約47％（検 査した32精巣中15）は、変動する程度の生殖細胞変性を示す（図９および10）。 図９Ｃおよび図９Ｄに示すように、ホモ接合型Bmp8a変異体中で観察した限り最 も重篤な生殖細胞欠損は（検査した32中２）、ホモ接合型Bmp8b変異体において 見られるよりずっと穏やかである（図９Ｅおよび９Ｆ）。大部分の、そのような Bmp8a変異体精巣の精細管において、精子完成（精子細胞の成熟）は、重篤に弱 められるか、または存在しない。しかし、精子形成は（異常ではあるが）なお存 在する。増加する減数分裂性生殖細胞アポトーシスは、凝縮し、そして濃く染色 される核により示されるように、大部分の細管において同定され得る（図９Ｄ中 の矢印）。 より穏やかな形態の生殖細胞欠損において、所定の切片の特定の割合の精細管 （１つの細管から50％の細管）のみが精細管変性を示し、優勢に減数分裂性生殖 細胞アポトーシスを生じ、これは精子完成の非存在を生じた（図10Ｄ〜10Ｏ）。 これらの欠損は、Bmp8bホモ接合型変異体表現型に関連する異常の多くに類似し ている。アポトーシス性生殖細胞の特徴は、凝縮し、そして濃く染色される核ま たはクロマチンおよび強く好酸性の細胞質である。これらの細胞は、TUNELによ りポジティブに標識され得る（Zhaoら、1996，Genes and Dev．10:1657-1669；F uruchiら、1996，Development 122:1703-1709；Dixら、1996，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 93:3264-3268；Gavrieliら、1992，J．Cell．Biol．119:493-501） 。類似の異常はまた、17％のBmp8aヘテロ接合型変異体精巣において観察される （検査した18中３）。検査したBmp8a/Bmp8b複合ヘテロ接合型変異体成体雄性の うち、その約半数（11中５）は、類似の生殖細胞変性表現型を示す。 Bmp8aは精巣上体完全性の維持における役割を担う 表１に示すように、Bmp8aホモ接合型変異体雄の大部分は、正常な生殖性能を 示す。しかし、試験した16匹の雄のうち１匹は、最初の１ヶ月以内は繁殖可能で あったが、以降は子孫を生じなかった。この動物を４ヶ月齢で屠殺し、右精巣上 体に付着した２つの接着性凝集（一方は頭に、他方は尾に付着）が明らかとなっ た。左精巣および精巣上体においては、明らかな異常は見出されなかった。組織 学的検査は、右精巣上体の組織学における大きな異常を明らかにした。図11Ｂお よび11Ｅに示すように、中央に精子および壊死を有し、そして周縁に大きな白血 球浸潤を有する大きな肉芽腫様塊は、精巣上体尾をほとんど置換した。まばらに 分散した異常な精巣細管のみが、肉芽腫塊の外で観察された。後に、類似のしか しより穏やかな病理学的異常が、別の交配ホモ接合型Bmp8a変異体およびBmp8a/B mp8b複合ヘテロ接合体において観察された（図11Ｃ、11Ｄ、11Ｆ、および11Ｇ） 。 表現型の１つの解釈は、精巣上体細管を内層する上皮が変性し、そして精子が 崩壊した細管から押し出されたというものである。精子の抗原性に起因して、次 いで、大きな白血球浸潤が精巣上体細管の噴出に伴い、肉芽腫様塊を生じる。類 似の上皮の変性および白血球浸潤はまた、図11Ｂおよび11Ｃに示す同じ精巣上体 の遠位頭領域において見出された。しかし、交配群とは対照的に（Bmp8aホモ接 合型変異体については16中２、Bmp8a/Bmp8b複合ヘテロ接合型変異体については ６中１）、肉芽腫様病理学は、検査した60を超える非交配Bmp8aホモ接合型およ びBmp8複合ヘテロ接合型雄においては見出されなかった。上皮変性のみが、切片 化した40の精巣上体中２つにおいて遠位頭領域において見出され（図11Ｈ〜11J) 、そして明らかな精巣上体上皮変性は、同じ精巣上体の尾領域においては見出さ れなかった。それゆえ、交配が、Bmp8aホモ接合型およびBmp8a/Bmp8b複合ヘテロ 接合型変異体の精巣上体変性表現型を悪化させたようである。 Bmp8aおよびBmp7は精巣上体頭の初節において発現される Bmp8aホモ接合型およびBmp8a/Bmp8b複合ヘテロ接合型変異体における精巣上体 上皮の変性および肉芽腫形成の観点から、Bmpファミリーメンバーの発現を、交 配および非交配動物（14〜17週齢）の成体精巣上体において検査した。検査した 遺伝子の中で（Bmp2、4、5、6、7、8a、8b、およびVgr2）、Bmp8aおよびBmp7の みが有意な発現を示した。図12に示すように、Bmp8aおよびBmp7の両方は、精巣 上体の同じ領域、すなわち頭の初節において発現される。しかし、この領域にお けるBmp8aの発現レベルは、精巣の段階６〜８の円形精子細胞におけるより有意 に低い（図12A）。また、初節におけるBmp7発現のレベルは、Bmp8aのレベルより ずっと高い。 まさに記載したデータは、Bmp8aは精子形成の開始において主要な役割を担わ ないことを確立する。さらに、このデータは、Bmp8aが精子形成の維持における 役割を担うことを確立する。 本明細書中で引用する各々および全ての特許、特許出願、および刊行物の開示 はその全体が本明細書中に参考として援用される。 本発明を特定の実施態様を参照して開示したが、本発明の他の実施態様および 変形が本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により案出 され得ることは明らかである。添付の請求の範囲は、全てそのような実施態様お よび等価な変形を含むと解釈されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/14 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０７ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物精原幹細胞を増殖させる方法であって、精原幹細胞をBMP8、または 生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストの存在下で培養して、該 細胞の増殖をもたらす工程を包含する、方法。 ２．哺乳動物精原幹細胞を分化させる方法であって、精原幹細胞をBMP、または 生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストの存在下で培養して、該 細胞の分化をもたらす工程を包含する、方法。 ３．哺乳動物精原細胞集団の生存度を拡大する方法であって、該精原細胞集団を BMP8、または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストの存在下で 培養し、それにより該培養された精原細胞集団の生存度を拡大する工程を包含す る、方法。 ４．培養中に精母細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、該精母細胞をBM P8、または生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストの実質的非存 在下でインキュベートし、それにより精母細胞のアポトーシスを誘導する工程を 包含する、方法。 ５．培養中に精原幹細胞の増殖を阻害する方法であって、BMP8の実質的非存在下 で精子形成細胞の集団をインキュベートして該細胞の増殖の阻害をもたらす工程 を包含する、方法。 ６．哺乳動物精原幹細胞の増殖をインビボで哺乳動物においてもたらす方法であ って、該哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8、または 生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し、該哺乳動物に おいて該細胞の増殖をもたらす工程を包含する、方法。 ７．哺乳動物精原幹細胞の分化をインビボで哺乳動物においてもたらす方法であ って、該哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8、または 生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し、該哺乳動物に おいて該細胞の増殖をもたらす工程を包含する、方法。 ８．哺乳動物精原細胞集団の生存度をインビボで哺乳動物において拡大する方法 であって、該哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8、ま たは生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し、それによ り該哺乳動物において該哺乳動物精原細胞集団の生存度を拡大する工程を包含す る、方法。 ９．精母細胞のアポトーシスをインビボで哺乳動物において誘導する方法であっ て、該哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8、または生 物学的に活性なフラグメントもしくはそのアゴニストを投与し、それにより該哺 乳動物において精母細胞のアポトーシスを誘導する工程を包含する、方法。 １０．精原幹細胞の増殖をインビボで哺乳動物において阻害する方法であって、 該哺乳動物に、薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8のアンタゴニス トを投与して、該哺乳動物において該細胞の増殖の阻害をもたらす工程を包含す る、方法。 １１．培養中に精原幹細胞の増殖する集団を選択的に得る方法であって、該細胞 の集団にBMP8を添加し、それにより精原幹細胞の増殖する集団を選択的に得る工 程を包含する、方法。 １２．雄哺乳動物における不妊を処置する方法であって、該哺乳動物に、薬学的 に受容可能なキャリア中に懸濁されたBMP8、または生物学的に活性なフラグメン トもしくはそのアゴニストを投与する工程を包含する、方法。 １３．前記BMP8が前記哺乳動物の精巣に投与される、請求項１２に記載の方法。 １４．BMP8アンタゴニストを含む哺乳動物雄避妊薬。 １５．BMP8のアンタゴニストを同定する方法であって、試験化合物を精原細胞の 培養物中にBMP8の存在下または非存在下で添加し、そして該細胞の増殖または分 化のレベルを測定する工程を包含し、ここで該試験化合物の非存在下での該細胞 の増殖または分化のレベルと比較して、該試験化合物の存在下での該細胞の増殖 または分化のより低いレベルが、該試験化合物がBMP8アンタゴニストであること の指標である、方法。 １６．BMP8のアゴニストを同定する方法であって、試験化合物を精原細胞の培養 物中にBMP8の存在下または非存在下で添加し、そして該細胞の増殖または分化の レベルを測定する工程を包含し、ここで該試験化合物の非存在下での該細胞の増 殖または分化のレベルと比較して、該試験化合物の存在下での該細胞の増殖また は分化のより高いレベルが、該試験化合物がBMP8アゴニストであることの指標で ある、方法。 １７．哺乳動物において毛の成長を刺激する方法であって、毛の成長を刺激する 量のBMP8を該哺乳動物の毛包に投与する工程を包含する、方法。 １８．細胞上のBMP8レセプターを単離する方法であって、BMP8を細胞のBMP8応答 性集団に結合させる工程、および該BMP8が結合する該細胞上のタンパク質を単離 する工程を包含する、方法。 １９．精原幹細胞の精製された集団。 ２０．哺乳動物多能性胚幹細胞の集団を作製する方法であって、増殖を増強する 量の塩基性線維芽細胞増殖因子、白血病阻害因子、膜結合スチール因子、および 可溶性スチール因子を含む組成物中で精原細胞の集団をインキュベートし、それ により多能性胚幹細胞の集団を作製する工程を包含する、方法。 ２１．請求項２０に記載の方法により産生される、多能性胚幹細胞の集団。 ２２．BMP8、線維芽細胞増殖因子、白血病阻害因子、膜結合スチール因子、およ び可溶性スチール因子を、生殖細胞の増殖を増強し、そして生殖細胞の継続する 増殖および該生殖細胞由来の多能性胚幹細胞の形成を可能にする量で含む、組成 物。