JP4667241B2 - 細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株 - Google Patents

Description

本発明は、低分子化合物、特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を有効成分とする幹細胞分化抑制剤、それを用いる幹細胞培養方法、培養液およびそれを用いて作製された幹細胞株に関する。本発明はさらに、幹細胞の未分化維持作用を有する新規な２環化合物にも関する。

外傷や病気、さらには加齢などによって傷害を受けた臓器・組織は、再生を促進し、その機能を回復させる必要がある。特に、心臓・肝臓・腎臓・膵臓などの実質臓器は生命維持に必須であるためその機能低下・廃絶は死に直結することから、臓器移植により救命を図る移植医療が盛んに行われている。しかし、恒常的なドナー不足からその解決には新たなアプローチが必要になっている。
最近になり、胚、或いは成体に存在し、無制限に分裂して、ひとつ或いは複数の方向に分化する能力を有すると考えられる幹細胞を利用して組織・器官の作製を行い、欠損組織の補填を行う再生医療が、従来の臓器移植の欠点を凌駕する治療法として注目されている。
具体的には、幹細胞を増殖させた後、分化させ細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築を行い、それを生体内へ移植したり人工臓器として利用したりすることなどが考えられている。幹細胞を細胞移植治療や組織工学に利用できれば、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できると期待される。
幹細胞は、血管、神経、血液、軟骨、骨、肝臓、膵臓など数々の分野で同定されているが、そのなかでも特に全ての細胞型に分化する能力を有する全能性幹細胞は、上述の再生医療分野のほか、創薬、および遺伝子治療に用いるための細胞ならびに組織を容易に提供し得る細胞として特に注目されている。
全能性幹細胞の一例として、胚性幹（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍ、以下ＥＳ）細胞や、胚性生殖（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ、以下ＥＧ）細胞が知られている。ＥＳ細胞は、マウスの胚盤胞期の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｓｓ，ＩＣＭ）から分離された細胞株である（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，ｐ１５４，１９８１年）。個体を構成する細胞は胚盤胞期の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｓｓ，以下ＩＣＭ）あるいは原腸胚上層（ｅｐｉｂｌａｓｔ、以下エピブラスト）から派生した一次外胚葉に由来しており、ＩＣＭおよびエピブラストは全能性を持った幹細胞群であるといえる。ＥＳ細胞は各種個体形成組織への分化能を保持し、正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有している。また、試験管内の分化誘導条件によっても、血液細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、色素細胞、膵内分泌細胞など様々な細胞を生成させる能力をもっている（仲野徹、最新医学別冊−再生医学、ｐ８１−８９、２０００）。
ＥＧ細胞は始原生殖細胞をＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）とｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）存在下で培養することにより樹立された細胞であり（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ、７０、ｐ８４１、１９９２年、Ｒｅｓｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、３５９、ｐ５５０、１９９２年）、ＥＳ細胞と同様に各種組織への分化能を有している。
最近になって、マウス以外でもＥＳ細胞株の樹立が報告され、マウスＥＳ細胞と同様多分化能を有していることが示されている（ウシＥＳ細胞：Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３１，ｐ１５−１７，１９８９年、豚ＥＳ細胞：Ｓｔｒｏｊｅｋら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３：ｐ９０１，１９９０年、羊ＥＳ細胞：Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅ ｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：ｐ１８５，１９８７年、ハムスターＥＳ細胞：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７、ｐ２２４，１９８８年、アカゲザルＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、ｐ７８４４、１９９５年、マーモセットＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、５５、ｐ２５４、１９９６年、ヒトＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年、カニクイザルＥＳ細胞：Ｓｕｅｍｏｒｉら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２２、Ｐ２７３，２００１年）。
ＥＳ細胞の未分化を維持するには、通常胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することが必要である。霊長類のＥＳ細胞株の未分化維持においても同様の方法が用いられている（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐ７８４４，１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年）。
しかし、マウス初代線維芽細胞の調製は煩雑である。即ち、妊娠マウスから１３．５から１５．５日の胚を取り出し、酵素処理によって胚体を分解し、ディッシュ上に得られた線維芽細胞を回収する。初代細胞であるため、品質管理は複雑で、ＧＭＰ適応レベルの管理は困難であり、ＥＳ細胞の未分化維持能も、用いる胚体により異なる可能性が考えられる。この煩雑な調製作業を経由しないＥＳ細胞培養方法として、マウス胚線維芽細胞のセルラインであるＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ ５６−Ｘ）を用いる方法がある。しかし、ＳＴＯ細胞のＥＳ細胞未分化維持能は変化しやすく、ＥＳ細胞の安定的な培養にはマウス初代線維芽細胞の方が優れている。
また、最近になって異種動物間での内在性ウィルスの感染例が報告されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０７，ｐ９０，２０００年）。医療用途でのヒトＥＳ細胞の利用を目的とした培養方法においては異種動物細胞間での接触をでき得る限り回避した培養方法の開発が望まれている。従って、マウス由来細胞を用いる上記のＥＳ細胞未分化維持培養方法は、医療用途を目的としたＥＳ細胞の培養には適していない。
マウス由来フィーダー細胞を用いない霊長類ＥＳ細胞の培養方法として、マウス初代線維芽細胞の分泌成分を培養培地中に加える方法が報告されている（例えば、特開２００１−１７１６３号公報を参照）。 しかし、この場合においても培養中のＥＳ細胞がマウス細胞から分泌される未同定の因子に曝されることから、このような環境で培養されたＥＳ細胞は医療用途の使用には適していないうえに、内在性ウィルスの感染の危険性も残されている。従って、マウス初代線維芽細胞との共培養による欠点が全く解消されていない。
マウス由来フィーダー細胞並びにマウスフィーダー細胞由来分泌成分を用いないマウスＥＳ細胞の未分化維持培養方法として、ゼラチンをコートした培養皿を用いる培養方法が既に知られているが、この場合には、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）の培地への添加が必須である（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１，ｐ１，１９８７年を参照）。ＬＩＦはサイトカインであることから高コスト、保存性などの問題があり大量培養には適していない。加えて、ＬＩＦの効果は極めて特定のマウス系統（１２９／ｓｖ系やＣ５７ＢＬ／６系）由来のＥＳ細胞に限定的であり、他種動物において顕著な効果は見られない。特に霊長類のＥＳ細胞においては、培地中へのＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐ７８４４，１９９５年；及び、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年を参照）。
また、ＬＩＦによる胚性幹細胞の未分化維持作用を増幅させる低分子化合物としてＰＤ９８０５９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）が報告されているが、ＰＤ９８０５９の作用はＬＩＦ依存的であり、単独では効果が認められない（Ｂｕｒｄｏｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２１０，ｐ３０，１９９９年）ため前述の問題点を解決されない。
従って、全能性幹細胞を、低コストで安全かつ大量に培養することを可能にする分化抑制剤はこれまでなく、また、全能性幹細胞を、低コストで安全かつ大量に培養する方法も知られていなかった。本発明の分化抑制剤は、低分子化合物を有効成分として含有するが、低分子化合物が全能性幹細胞の未分化状態を維持することはこれまで知られていなかった。従って、本明細書に記載の一般式（１）〜（１０）で示される低分子化合物が有する全能性幹細胞の未分化維持作用は全く知られていなかった。

本発明の課題は、幹細胞或いは胚性幹細胞を、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに、未分化状態で培養させ得る分化抑制剤を提供することにある。また、本発明の課題は、このような分化抑制剤を用いて、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに幹細胞或いは胚性幹細胞を未分化の状態で培養する方法を提供すること、このような分化抑制剤を含む細胞培養液を提供すること、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株を提供することにある。本発明のさらに別の課題は、幹細胞或いは胚性幹細胞を、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに、未分化状態で培養させ得る新規な２環化合物を提供することである。
本発明は、上記課題を達成するためになされたものであって、幹細胞ならびに胚性幹細胞を未分化な状態で培養させ得る分化抑制剤、それを用いた幹細胞ならびに胚性幹細胞の培養方法、このような分化抑制剤を含む細胞培養液、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株に関する。
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
（１） 低分子化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
（２） 低分子化合物が、一般式（１）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。］
で表される化合物である、上記（１）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（３） Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環である、上記（２）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（４） Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である、上記（２）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（５） Ｘで表されるアルキレン基が、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している、上記（２）〜（４）の何れかに記載の幹細胞分化抑制剤。
（６） 低分子化合物が、一般式（２）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｘ及びＧは、前記（２）中の定義と同義である。Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］
で表される化合物である、上記（２）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（７） 低分子化合物が、一般式（３）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｘ及びＧは、前記（２）中の定義と同義である。Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］
で表される化合物である、上記（２）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（８） 低分子化合物が、一般式（４）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９は、前記（６）中の定義と同義である。Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。二重片側破線は単結合または二重結合を表す。二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］
で表される化合物である、上記（６）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（９） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、上記（８）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１０） 低分子化合物が、一般式（５）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９は、前記（６）中の定義と同義である。Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］
で表される化合物である、上記（６）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１１） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、上記（１０）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１２） 低分子化合物が、一般式（６）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６は前記（７）中の定義と同義である。Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］
で表される化合物である、上記（７）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１３） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９がそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、上記（１２）に記載の分化抑制剤。
（１４） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、Ｒ^１１が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１２が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基である、上記（８）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１５） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^８、及びＲ^９が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、Ｒ^１０が水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ^１１が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルコキシ基、または低級アルコキシカルボニル基であり、Ｒ^１２が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基である、上記（１０）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１６） Ｒ^１およびＲ^２が水素原子であり、Ｒ^３がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、Ｒ^４がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、又は水素原子であり、Ｒ^５が低級アルキル基、またはアリールアミノビニル基であり、Ｒ^６がニトロ基であり、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子である、上記（１２）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（１７） 一般式（９）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、低級アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｒ^５は水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基または環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、二級アミノカルボニル基または三級アミノカルボニル基を表す。波線部に関して幾何異性体が存在し、これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］
で表される化合物またはその塩。
（１８） 一般式（９）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、低級アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｒ^５は水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基または環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^１０及びＲ^１２が水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１１が低級アシル基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基を表す。波線部に関して幾何異性体が存在し、これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］
で表される化合物またはその塩。
（１９） 一般式（９）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、低級アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｒ^５は低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基または環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^１０、Ｒ^{１ １}及びＲ^１２は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３はヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基またはアミノカルボニル基を表す。波線部に関して幾何異性体が存在し、これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］
で表される化合物またはその塩。
（２０） 一般式（９）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、低級アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｒ^５は水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ同一または異なっていてもよく、低級アルキル基または環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^１０、Ｒ^{１ １}、及びＲ^１２は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３はニトリル基を表す。波線部に関して幾何異性体が存在し、これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］
で表される化合物またはその塩。
（２１） 一般式（１０）

［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、低級アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｒ^５は水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、低級アルキル基または環状構造を形成してもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８及びＲ^９は水素原子であり、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、又はニトリル基を表す。］
で表される化合物またはその塩。
（２２） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が同一であっても異なっていてもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^１１及びＲ^１２が、同一であっても異なっていてもよい水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、又はフェニルアミノカルボニル基である、前記（１７）記載の化合物またはその塩。
（２３） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が同一であっても異なっていてもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^１１が低級アシル基であり、Ｒ^１２が水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、又はフェニルアミノカルボニル基である、前記（１８）記載の化合物またはその塩。
（２４） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４が水素原子であり、Ｒ^５が低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が同一であっても異なっていてもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、又はフェニルアミノカルボニル基である、前記（１９）記載の化合物またはその塩。
（２５） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が同一であっても異なっていてもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がニトリル基である、前記（２０）記載の化合物またはその塩。
（２６） Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が同一であっても異なっていてもよい低級アルキル基であり、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ同一または異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３がヒドロキシカルボニル基、低級アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、又はニトリル基である、前記（２１）記載の化合物またはその塩。
（２７） （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸エチルエステル、（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−メチル−アセトアミド、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミド、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミドである、前記（１７）記載の化合物またはその塩。
（２８） ２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドである、前記（１８）記載の化合物またはその塩。
（２９） ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（２，３，３−トリメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド、２−（２−アセチル−３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−アセトアミドである、前記（１９）記載の化合物またはその塩。
（３０） （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトニトリルである前記（２０）記載の化合物またはその塩。
（３１） ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−１−イル）−アセトアミドである前記（２１）記載の化合物またはその塩。
（３２） 前記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
（３３） 低分子化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させる作用を有する化合物である、上記（１）〜（１６）又は（３２）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
（３４） 低分子化合物が、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｐｔｉｏｎ３）を活性化しない化合物である、上記（１）〜（１６）、（３２）又は（３３）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
（３５） 低分子化合物が、ＳＳＥＡ−１抗原発現量を増加させる作用を有する化合物である、上記（１）〜（１６）又は（３２）〜（３４）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
（３６） 低分子化合物が、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物である上記（１）〜（１６）又は（３２）〜（３５）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
（３７） 低分子化合物が、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する２環化合物である、上記（３６）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（３８） 低分子化合物が、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有するアゾ基を含有する２環化合物である、上記（３７）に記載の幹細胞分化抑制剤。
（３９） 上記（１）〜（１６）及び（３２）〜（３８）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を用いて幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする幹細胞培養方法。
（４０） 上記（１）〜（１６）及び（３２）〜（３８）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を用いて胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする胚性幹細胞培養方法。
（４１） 上記（１）〜（１６）及び（３２）〜（３８）のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
（４２） 上記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の化合物またはその塩を含有する培地。
（４３） 分化抑制剤、化合物またはその塩の濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする上記（４１）または（４２）に記載の培地。
（４４） 上記（１）〜（１６）及び（３２）〜（３８）のいずれかに記載の分化抑制剤を用いて未分化状態で培養された幹細胞。
（４５） 上記（１）〜（１６）及び（３２）〜（３８）のいずれかに記載の分化抑制剤を用いて未分化状態で培養された幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
（４６） 細胞または組織が生体内へ移植するためのものである上記（４４）または（４５）に記載の細胞または組織。
（４７） 上記（４４）〜（４６）のいずれかに記載の細胞または／および組織を生体内に移植する治療方法。
（４８） 上記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の化合物またはその塩のプロドラッグ。
（４９） 上記（１７）〜（３１）のいずれかに記載の化合物もしくはその塩またはそのプロドラッグを含有してなる医薬組成物。

図１は、本発明の化合物Ａの構造を示す。化合物Ａは、図１中の式（５）のＲ^１〜Ｒ^１２が下表に示す基または元素で表される化合物である。
図２は、本発明の化合物Ｂ〜Ｆの構造を示す。化合物Ｂ〜Ｆは、図２中の式（４）のＲ^１〜Ｒ^１３が下表に示す基または元素で表される化合物である。
図３は、アルカリホスファターゼ定量１の結果を表す。
図４は、アルカリホスファターゼ染色１の結果を表す。
図５は、ＳＴＡＴ３活性化アッセイ１の結果を示す。
図６は、Ｏｃｔ−３／４遺伝子発現量を示す。
図７は、ｎａｎｏｇ遺伝子発現量を示す。
図８は、ＳＳＥＡ−１抗原の発現量評価１における平均蛍光強度の結果を示す。
図９は、本発明の化合物ａ〜ｏの構造を示す。化合物ａ〜ｏは、図９中の式（６）のＲ^１〜Ｒ^９が下表に示す基または元素で表される。
図１０は、本発明の分化抑制剤を用いた場合のアルカリホスファターゼ定量２の結果を表す。
図１１は、ＳＳＥＡ−１抗原の発現量評価２における平均蛍光強度の結果を示す。
図１２は、ＳＴＡＴ３活性化アッセイ２の結果を示す。
図１３は、ＥＳ細胞継代培養の結果１を表す。
図１４は、ＥＳ細胞継代培養の結果２を表す。
図１５は、本発明の分化抑制剤の胚性幹細胞未分化維持効果を示す。
図１６は、本発明の分化抑制剤の胚性幹細胞未分化維持効果（染色図）を示す。
図１７は、本発明の化合物▲１▼の構造を示す。化合物▲１▼は、図１７中の式（１０）のＲ^１〜Ｒ^１３が下表に示す基または元素で表される。
図１８は、本発明の化合物▲２▼〜▲１０▼の構造を示す。化合物▲２▼〜▲１０▼は、図１８中の式（９）のＲ^１〜Ｒ^１３が下表に示す基または元素で表される。
図１９は、アルカリホスファターゼ染色の染色図を表す。

以下、本発明について詳細に説明する。
以下の用語は他で述べない限り、以下に提供されるように定義される。
本明細書で使用される他の全ての用語は、他に述べない限り、その用語に関する特定の分野でのその語法に関して定義される。
幹細胞：幹細胞とは、特異化された機能を有する他の細胞型、即ち、最終的に分化した細胞、もしくは、より狭い範囲の細胞型に分化可能な他の幹細胞型に分化し得る細胞を指す。
全能性幹細胞：全能性幹細胞とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る細胞のことを言う。
多能性幹細胞：多能性幹細胞とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る細胞をいう。多能性細胞の１つの例は、造血幹細胞であり、この細胞はリンパ球および赤血球のような種々の血液細胞型へと分化し得る。
胚性幹細胞：胚性幹細胞とは、幹細胞の中でも特に前着床段階の胚の、桑実胚または胚盤胞段階から得られた全能性の細胞をいい、ＥＳ細胞とも呼ばれる。また、胚性幹細胞には、精子あるいは卵子になると決まっている、胚または胎児（胎仔）の始原生殖細胞に由来する多能性の幹細胞のことをいう場合もある。ただし、この細胞は胚性生殖（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ、ＥＧ）細胞と呼ばれて胚性幹細胞と区別される場合もある。本明細書中で用いる胚性幹細胞は、いかなる動物種のものであってよく、例えばヒトを含む霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類などの胚性幹細胞が挙げられる。
全能性：全能性とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る状態を言う。
多能性：多能性とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る状態をいう。
未分化：未分化とは、１つの細胞、或いは複数の細胞からなる任意の細胞集団が、１つまたは複数の、さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有する状態である細胞、或いは該細胞を含む細胞集団である状態であることをいう。
フィーダー：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダーとは、全能性幹細胞がその上にプレートされ、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供するものをいう。
フィーダー細胞：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダー細胞とは、全能性幹細胞がその上にプレートされる非全能性幹細胞をいい、非全能性幹細胞は、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供する。
細胞由来成分：細胞から分泌される成分、内容物、および細胞膜成分など、細胞に由来する全ての成分をいう。
本発明は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を未分化の状態で、増殖および維持させ得る分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用いた培養液、それを用いて培養し作製された細胞株を提供する。本発明で提供する分化抑制剤、培養方法および培養液は、従来より簡便に、安全に、未分化の胚性幹細胞を増殖しそして維持する。本発明の分化抑制剤を含む細胞培養方法はまた、特定の分化誘導因子、および分化誘導因子の有用な組み合わせについてスクリーニングするために使用され得る。本発明の分化抑制剤、および培養方法を使用して、未分化な胚性幹細胞を増殖させる能力は、重要な治療適用を有する単一もしくは複数の遺伝的改変を有する胚性幹細胞系を産生する能力を含む重要な利益を提供する。
本発明の分化抑制剤は、化学的に安定な低分子化合物で、幹細胞を未分化な状態で維持する活性を有するものであればいずれも用いることができるが、好ましくは下記一般式（１）で表される低分子化合物があげられる。

式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。電子供与基とは、ベンゼン環へ電子を供与し得る置換基、電子吸引基とはベンゼン環上のπ電子を吸引する性質を有する置換基をいう。また、Ｈａｍｍｅｔｔの置換基定数σを用いてσ＜０を電子供与基、σ＞０を電子吸引基と定義することもできる（基礎有機反応論、橋本静信ら著、三共出版、１９９７年）。
Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。
Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。
Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。
このうち、Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環であることが望ましい。
また、Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である場合も同様に望ましい。この場合、５員環は不飽和であることが望ましく、６員環は飽和であることが望ましい。
さらに、Ｘで表されるアルキレン基は、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している場合が望ましい。
たとえば一般式（１）の例としては、式（２）で表されるようなテトラヒドロイソキノリン誘導体および一般式（３）で表されるようなインドール誘導体があげられる。

式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｘ及びＧは、前記と同義である。Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。

式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｘ及びＧは、前記と同義である。Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
一般式（２）で表されるテトラヒドロイソキノリン誘導体の具体例としては、式（４）若しくは式（５）で示される構造の化合物および塩があげられる。

式中、Ｒ^１〜Ｒ^１３は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
より好ましくは、Ｒ^１〜Ｒ^１３は、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。
また、一般式（４）の場合、さらに好ましくは、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、Ｒ^１１が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１２が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基があげられる。
Ｒで表される低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルプロピル、２−エチルブチルなどが挙げられる。好ましくは、メチルである。
Ｒで表される低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキシロキシ、ヘプチロキシ、オクチロキシなどが挙げられる。好ましくはメトキシである。
Ｒで表されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられるが、好ましくは塩素または臭素である。
Ｒで表される低級アシル基として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられるが、好ましくはアセチルである。
Ｒで表される環状構造を形成してもよい低級アルキル基としてシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられるが、好ましくはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルである。
Ｒで表される低級アルコキシカルボニルとして、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポオキシカルボニルなどが挙げられるが、好ましくはメトキシカルボニルもしくはエトキシカルボニルである。
Ｒで表されるアミノカルボニルとしては、例えば、−ＣＯＮＲ_２（Ｒは同一でも異なってもよい水素原子、先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
Ｒで表される二級アミノカルボニル基としては、例えば、−ＣＯＮＨＲ（先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。また、三級アミノカルボニル基としては、例えば、−ＣＯＮＲ_２（Ｒは同一でも異なってもよい先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
Ｒで表されるアミノアルキル基としては、例えば、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＲ_２（ｎは１〜８を示すが、好ましくは１である。またＲは同一でも異なっても良い水素原子、低級アルキル基、環状構造を形成しても良い低級アルキル基（環状構造中には窒素や酸素などのヘテロ原子を１〜３個含んでも良い）、置換基を有しても良いフェニル基を表す）などがあげられる。
Ｒで表されるアセトキシアルキルとしては、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＡｃ（ｎは１〜８を表す）があげられるが、好ましくはｎは１である。
また、式（４）における二重片側破線は単結合または二重結合を表す。さらに、式（４）で表される化合物において、二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部（２箇所）に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよく、本発明の化合物は、これらの幾何異性に基づく純粋な形態の幾何異性体の任意の混合物であってもよい。
一般式（５）の場合、さらに好ましくは、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ｒ^８及びＲ^９が水素原子であり、Ｒ^１０が水素原子または低級アルキル基であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、Ｒ^１１が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルコキシ基、または低級アルコキシカルボニル基であり、Ｒ^１２が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基があげられる。
一般式（４）の具体例として式（４）中、二重片側破線が二重結合であり、Ｒ^{１ ３}がアミノカルボニル基である、一般式（７）で表される化合物があげられる。

また、テトラヒドロイソンキノリン誘導体である前記一般式（４）に含まれるさらに具体的な化合物には、次のようなものが例示される。
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（４−ブロモ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−ブロモ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（４−クロロ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−クロロ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−ｍ−トリルアゾ−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−ｐ−トリルアゾ−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−ニトロ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−ニトロ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−スルファモイル−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−スルファモイル−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（４−アセチルアミノ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−アセチルアミノ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（２−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−フェニルアゾ−アセトアミド
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸エチルエステル
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−１−イル）−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−メチル−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（２，３，３−トリメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトニトリル
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミド
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸
２−（２−アセチル−３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−アセトアミド
また、一般式（５）の具体例として以下に示す一般式（８）で表される化合物があげられる。

式中、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ｒ^６〜Ｒ^１２としては、同一または異なった電子吸引基、または電子供与基または水素原子から選ばれる基または原子が挙げられる。好ましくは、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ｒ^６〜Ｒ^１２は、同一または異なった、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基、ナフチル基、フリル基、チエニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルカルボニル基、ベンゾイル基、ナフトイル基、フロイル基、テノイル基、ジアルキルカルバモイル基、アセチル基、ブタノイル基、メトキシカルボニル基、シクロアルキル基、ベンジルオキシ基、アダマンチルオキシ基、ニトロ基よりなる群から選ばれる基、あるいはハロゲン原子または水素原子が挙げられる。さらには、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ｒ^６〜Ｒ^１２はアルキル基、アセチル基、アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子もしくは水素原子よりなる群から選ばれる基または原子であることが望ましい。
また一般式（５）に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｐ−トリル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｍ−トリル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｏ−トリル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（４−メトキシ−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（３−メトキシ−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（４−ニトロ−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（３−ニトロ−フェニル）−アセトアミド
４−［２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセチルアミノ］−安息香酸エチルエステル
３−［２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセチルアミノ］−安息香酸エチルエステル
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（２，４−ジメチル−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
一般式（２）および（３）であらわされる化合物の塩としては、薬学的に許容しうる塩が望ましい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などを形成してもよい。
また、一般式（４）および（５）であらわされる化合物のエステル化合物も本発明の範囲であり、例えば、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、無機酸エステルなどがあげられる。
一般式（３）に表されるようなインドール誘導体としては、以下の式（６）で表される化合物があげられる。

式中、Ｒ^１〜Ｒ^９は同一または異なった電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。このうち、好ましくは、Ｒ^１〜Ｒ^９はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アセトキシ基、アミノアルキル基、アセトキシアルキル基、アミノビニル基、及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。さらには、Ｒ^１、及びＲ^２が水素原子であり、Ｒ^３がアセトキシ基またはヒドロキシル基であり、Ｒ^４が水素原子、ジアルキルアミノアルキル基、環状アルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、またはアセトキシアルキル基であり、Ｒ^５が低級アルキル基、アリールアミノビニル基であり、Ｒ^６がニトロ基、Ｒ^７〜Ｒ^９が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子であることが望ましい。
また、一般式（６）に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−［２−（４−メトキシ−フェニルアミノ）−ビニル］−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（２−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール塩酸塩
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−７−モルフォリン−４−イルメチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−［（３−ヒドロキシ−プロピルアミノ）−メチル］−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール塩酸塩
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジエチルアミノメチル−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸 ７−アセトキシメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−イルエステル
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
本発明の化合物は以下に述べる方法及びそれらに準ずる方法、または公知の方法を行うことにより製造することができる。式（９）で表される化合物の製造法を以下に示す。

等量のチオエーテル誘導体（Ｉ）とフェニルアゾアセトアミド誘導体（ＩＩ）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に溶解し、原料がなくなるまで還流することにより製造することができる。該誘導体（Ｉ）は公知の方法（例えば、Ｋｈｉｍ．Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌ．Ｓｏｅｄｉｎ．，Ｎｏ．７，ｐ９９５（１９９０）などに記載）により、もしくは、市販品から購入することができる。具体的には、下表１に示すとおりである。

フェニルアゾアセトアミド誘導体（ＩＩ）は、公知の手法（Ｍａｔｅｒｉａｌｙ Ｕｒａｌ’ｓｋ．Ｓｏｖｅｓｈｃｈ．ｐｏ Ｓｐｅｋｔｒｏｓｋｏｐｉｉ，４ｔｈ，Ｓｖｅｒｄｌｏｖｓｋ １９６３，ｐ２０５（１９６５），Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｄｅｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ Ｐｏｌｏｎａｉｓｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｒｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｈｉｍｉｑｕｅｓ，１４（１），ｐ２９（１９６６），Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄｉｖ．Ｏｒｇ．Ｃｏａｔｉｎｇｓ，Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｃｈｅｍ．Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，２３（２），ｐ４８６（１９６３），Ｚｈｕｒｎａｌ Ｏｂｓｈｃｈｅｉ Ｋｈｉｍｉｉ，３５（３），ｐ５５９（１９６５）、Ｚｈｕｒｎａｌ Ｏｂｓｈｃｈｅｉ Ｋｈｉｍｉｉ，３２，ｐ５２６（１９６２）など）により製造することができる。
式（９）で表される化合物は以下のスキームでも合成可能である。

ベンジルカルビノール誘導体と２−シアノアセトアミド誘導体とを硫酸存在下で反応することにより得られる化合物（ＩＶ）とジアゾニウム塩（Ｖ）とを反応に悪影響を及ぼさないアルコール水溶液中、塩酸存在下で反応させることにより得られる。ベンジルカルビノール誘導体は様々な誘導体が市販品から購入でき、さらに公知の方法（例えば、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ，Ｎｏ．６，ｐ１２６３（１９３６）により得る事が出来る。また、ジアゾニウム塩は市販のアミノベンゼン誘導体を塩酸、亜硝酸ナトリウム水溶液により公知の方法で誘導できる。
式（９）で表される化合物のうち、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ，ロシア）、２−（３−クロロ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ，ロシア）、２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ，ロシア）、２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−ニトロ−フェニルアゾ）−アセトアミド（ＰＨＡＲＭＥＫＳ，ロシア）、２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド（ＰＨＡＲＭＥＫＳ，ロシア）、２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−ｍ−トリルアゾ−アセトアミド（ＩＢＳ，ロシア）は市販品であり、サプライヤーから入手することが出来る。
式（９）で表される化合物の中で、Ｒ^５がメチル基である場合の製造法を以下に示す。反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、アセトニトリルのニトリル類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に式（４）で表される化合物（Ｒ５＝−Ｈ）及び炭酸ナトリウムを加えて溶解し、ヨウ化メチルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に溶解したものをゆっくり滴下し、還流することにより製造することができる。
式（９）で表される化合物の中で、Ｒ^５がアセチル基である場合の製造法を以下に示す。氷浴下、式（９）で表される化合物（Ｒ^５＝−Ｈ）及びジメチルアミノピリジンをピリジンに溶解し、無水酢酸を加え、攪拌することにより製造することができる。
式（１１）で表される化合物の製造法を以下に示す。

式（９）で表される化合物を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類）に溶解し、塩化チオニルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類）に溶解したものを氷浴下で滴下することにより製造できる。
式（１２）で表される化合物の製造法を以下に示す。

エタノールに水酸化カリウム及び式（９）で表される化合物を加え、還流することにより製造することができる。
式（１３）で表される化合物の製造法を以下に示す。

式（１２）で表される化合物をエタノールに懸濁し、冷却しながら塩化チオニルをゆっくり滴下し、室温で攪拌することにより製造することができる。
式（１４）で表される化合物の製造法を以下に示す。

式（１２）で表される化合物、該当する１級または２級アミン、ＨＯＢｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）及びトリエチルアミンを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類など）に溶解し、これにＨＢＴＵ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒など）に溶解したものを加えた。室温で攪拌することにより製造することができる。
式（１０）で表される化合物の製造法を以下に示す。

反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、アセトニトリルのニトリル類など）に式（９）及び（１１）〜（１４）で表される化合物を溶解し、トリフェニルすず水素化物（Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類）に溶解したものを前記溶媒に加え、還流することにより製造することができる。
一般式（４）で示される化合物は、適当な溶媒に溶解させることができるが、溶媒中においてはそのままで、或いは下記式（１５）で表される還元型で、あるいはその混合物として存在してもよい。

かくして得られる本発明の化合物またはその塩は、例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィーなどの通常の分離手段により単離、精製することができる。かくして本発明の化合物が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じた方法によって塩に変換することができる。逆に塩で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じた方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。化合物またはその塩が不斉炭素を有する場合もあるが、光学活性の混合物（ラセミ体）として得られた場合には、通常の光学分割手段によりそれぞれの光学活性に分離することができる。
本発明の分化抑制剤の濃度としては、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用することが望ましく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲で使用することである。
また、本発明の分化抑制剤はＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物、特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を含む。特定のマウス系統の胚性幹細胞は、マウス胎仔由来の線維芽細胞からなるフィーダー細胞の存在、非存在にかかわらず、ＬＩＦによって未分化が維持される。ＬＩＦはＳＴＡＴ３の活性化を介して下流にシグナルを伝えることが知られている（Ｍａｔｓｕｄａら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１８、１５、ｐ４２６１、１９９９年）。しかし、最近になってＳＴＡＴ３を活性化せずに胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制因子が存在することが報告されたことから（Ｄａｎｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０３、ｐ１４９、１９９８年）、ＳＴＡＴ３を介さない胚性幹細胞の未分化維持機構が存在すると考えられている。さらに、ＬＩＦが、霊長類胚性幹細胞の未分化維持に効果を示さないことから（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐ７８４４，１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年）、霊長類胚性幹細胞には、ＬＩＦおよびＳＴＡＴ３とは異なるシグナルによって未分化状態を維持する機構が存在することが示唆される。本発明の分化抑制剤にはＳＴＡＴ３の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物が含まれる。いいかえれば、ＬＩＦとは異なる作用により胚性幹細胞の未分化を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
最近、ＬＩＦおよびＳＴＡＴ３を介さずに胚性幹細胞の未分化を制御する分子のひとつとしてＮａｎｏｇ遺伝子が同定された（Ｍｉｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ、１１３、ｐ６３１、２００３年、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ、１１３、ｐ６４３、２００３年）。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、マウス、ヒトでその存在が確認され、遺伝子破壊により発現を抑制すると、胚性幹細胞の全能性は失われ、逆に、Ｎａｎｏｇ遺伝子を強発現させて発現量を増加させると、ＬＩＦ非存在下でも胚性幹細胞の未分化を維持することができる。従って、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させ得る物質、例えば低分子化合物は、胚性幹細胞の未分化維持、即ち、全能性の胚性幹細胞の培養に利用することができる。
また、Ｎａｎｏｇ遺伝子の強発現がＳＴＡＴ３を活性化しないことから、Ｎａｎｏｇ遺伝子はＬＩＦおよびＳＴＡＴ３非依存的に胚性幹細胞の未分化を維持する。即ち、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させ得る物質、例えば低分子化合物は、ＬＩＦによる未分化維持の効果が認められない胚性幹細胞においても、その培養に用い得ることが示唆される。
本発明の分化抑制剤にはＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる低分子化合物が含まれる。即ち、本発明の分化抑制剤にはＮａｎｏｇ遺伝子の発現量の増加を介して胚性幹細胞の未分化維持能を発揮する低分子化合物が含まれる。
また、最近の報告によれば、ある種の骨髄由来間葉系幹細胞においても胚性幹細胞と同様に、マウス由来の幹細胞の培養はＬＩＦ依存的であるが、ヒト由来の幹細胞はＬＩＦ非依存的であることが示されている（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８，ｐ４１，２００２年）。これは、多分化能を示す幹細胞は、胚性幹細胞と同様の未分化維持機構を有していることを示唆し、従って、霊長類幹細胞においても、胚性幹細胞と同様に、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３経路とは異なるシグナルによって未分化が維持されている可能性が示唆される。本発明の分化抑制剤には、ＳＴＡＴ３を介さずに細胞の未分化状態を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
本発明の分化抑制剤は、動物細胞培養用基礎培地である任意の哺乳類細胞培養基本培地に添加して使用することができる。動物細胞基本培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地：ＤＭＥＭ、ノックアウトＤＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ：ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ（以上 ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様としての細胞培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。さらにこれらの基礎培地に血清または血清代替物、各種増殖因子、サイトカインなど、細胞増殖や分化制御に関わる蛋白質を添加して用いることもできる。また、任意の化合物を添加しても良い。血清は、幹細胞ならびに胚性幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄養素を供給する任意の血清、または、血清ベースの溶液であり得る。このような血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清（ＣＳ）、馬血清（ＨＳ）などがあり、また、血清代替物としては当業者に周知のもの、蛋白質、アミノ酸、脂質、ビタミンなどを単独で、或いは組み合わせて用いることができる。蛋白質としてはインスリン、トランスフェリン、アルブミン、ペプトン、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ＥｐｉｔｈｅｒｉａｌＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）などが、アミノ酸としてはアルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどが、ビタミンとしては、パントテン酸、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸アミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシンなどが例示されるがこれらに限定されない。１つの実施態様において、血清はウシ胎仔血清である。より特定の実施態様において、ウシ胎仔血清は約２５％と約１％との間の濃度で提供される。さらにより特定の実施態様において、細胞培地でのウシ胎仔血清濃度は１５％である。また、他の実施態様において、血清代替物はノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）である。添加し得る細胞増殖因子としては、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｗｎｔなどが例示されるがこれらに限定されない。添加し得るサイトカインとしてはインターロイキン（ＩＬ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などが例示されるがこれらに限定されない。また、ＬＩＦ、ノッチリガンドなどの分化制御因子を添加することもできる。また、添加する化合物は特に限定されないが、任意の蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストであってよく、また、任意のリン酸化阻害剤であっても良い。１つの実施態様に於いて、ＰＤ９８０５９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）が提供される。また、他の実施態様に於いて６−ブロモインジルビン−３オキシムが提供される。
細胞培地は、抗酸化剤（還元剤）（例えば、β−メルカプトエタノール）も含む。ある好適な実施態様において、β−メルカプトエタノールは、約０．１ｍＭの濃度を有する。他の抗酸化剤（例えば、モノチオグリセロール、もしくは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の単独もしくは組み合わせ）が同様の効果のために使用され得る。さらに他の等価な物質は、細胞培養の分野の当業者に周知である。
本発明の分化抑制剤ならびにその有効成分は、任意の培養基材とともにあるいは培養基材に固定して使用することもできる。培養基材には多孔質体を使用することがでる。多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、その材質、厚さ、形状、寸法などは特に限定はない。多孔質体の材質は、有機材料、無機材料及び有機材料と無機材料からなる複合材料であっても良い。多孔質体の形状は平板状、球状、棒状、繊維状、中空状のいずれの形態であっても良く、例えば、フィルム、シート、膜、板、不織布、ろ紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。細胞を培養するにあたって、３次元的に培養できるように細胞を支持する孔の大きさを簡単に制御できることや、基材作製の容易さ及びコストなどを考慮すると不織布がより好ましい。多孔質体の孔の大きさについては、特に限定はないが、細胞を３次元的に支持できるようにすることを考慮すると、平均孔径が、０．１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５０μｍ以下がさらに好ましい。繊維径については特に限定はないが、０．０３デニール以下が好ましい。
上記の多孔質体は、細胞の接着性や分化維持機能、増殖能を向上させるために、高分子化合物により表面コーティング処理を施されていてもよい。高分子物質とは、１種以上の繰り返し構成単位の単量体が１次元、２次元、３次元的に連なった分子量数百以上の物質のことをいう。高分子物質は、大きく天然高分子物質、半合成高分子物質、合成高分子物質の３つに分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。
例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類及びゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲン等に代表されるタンパク質等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質やペプチド並びに有機合成高分子物質がさらに好ましい。一つの実施態様に於いて、培養基材はゼラチンである。また、他の実施態様においては、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）である。
本発明の分化抑制剤を固定した培養基材を細胞捕捉材として用いることにより、複数の異なる細胞からなる集団から、幹細胞或いは胚性幹細胞を分離し、かつ、培養を行える方法及び装置が提供され得る。即ち、幹細胞或いは胚性幹細胞と、除去対象細胞を含む細胞含有液を本発明の分化抑制剤を固定した、多孔質体などの培養基材からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、細胞捕捉材に幹細胞或いは胚性幹細胞を捕捉させ、除去対象細胞を容器外に導出した後に容器ごと培養することを特徴とする幹細胞或いは胚性幹細胞培養方法であり、また本発明の分化抑制剤を固定化した培養基材からなる細胞捕捉材を容器に充填した細胞培養装置であって、前記細胞捕捉材は細胞培養用担体として使用し得るものであり、前記容器は細胞培養に使用し得るものであることを特徴とする細胞培養装置である。除去対象細胞とは、幹細胞或いは胚性幹細胞以外の全ての細胞をいう。また、幹細胞或いは胚性幹細胞から分化して、多分化能を失った細胞もこれに含まれる。細胞捕捉材に導入する細胞含有液としては、幹細胞或いは胚性幹細胞を含有する細胞液であればいかなるものでもよく、一例として、血液、骨髄、砕片組織液、或いは、幹細胞、胚性幹細胞の培養液などがあげられる。
本発明は幹細胞ならびに胚性幹細胞を増殖するための方法に関する。本発明の分化抑制剤を用いて増殖させた幹細胞ならびに胚性幹細胞の培養物を提供することができる。
本発明の分化抑制剤を用いて培養される細胞には、公知の方法および材料を使用して入手し得る全ての幹細胞および胚性幹細胞が含まれる。幹細胞には以下の公知の方法によって入手し得る幹細胞が一例として挙げられる。骨髄細胞（「骨髄移植ガイド」Ｈ．Ｊ．ディーグ、Ｈ．Ｇ．クリンゲマン、Ｇ．Ｌ．フィリップス著／笠倉新平訳）、骨髄幹細胞（Ｏｓａｗａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３、ｐ２４２−２４５、１９９６年、Ｇｏｏｄｅｌｌら、Ｊ．Ｅ．Ｍｅｄ．１８３、ｐ１７９７−１８０６、１９９６年、Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８，ｐ４１，２００２年）、神経幹細胞（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｐ１７０７−１７１０、１９９２年）、組織幹細胞（Ｇｏｏｄｅｌｌら、Ｊ．Ｅ．Ｍｅｄ．１８３、ｐ１７９７−１８０６、１９９６年、松崎ら、実験医学、１９、ｐ３４５−３４９、２００１年、Ｂｌａｕら、Ｃｅｌｌ、１０５、ｐ８２９−８４１、２００１年）、間葉系幹細胞（Ｌｉｅｃｈｔｙら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、６、ｐ１２８２−１２８６、２０００年。Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４、ｐ１４３−１４７、１９９９年）。皮膚幹細胞・表皮幹細胞（室田誠逸編、「再生医学・再生治療」現代化学増刊４１、東京化学同人）。
また、培養されるべき胚性幹細胞としては、以下に示す、公知の方法および材料を使用して入手し得る。マウス胚性幹細胞：Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，ｐ１５４，１９８１年、ウシＥＳ細胞：Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３１，ｐ１５−１７，１９８９年、豚ＥＳ細胞：Ｓｔｒｏｊｅｋら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３：ｐ９０１，１９９０年、羊ＥＳ細胞：Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：ｐ１８５，１９８７年、ハムスターＥＳ細胞：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７、ｐ２２４，１９８８年、サルＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐ７８４４，１９９５年、カニクイザルＥＳ細胞：Ｓｕｅｍｏｒｉら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２２、Ｐ２７３，２００１年、ヒトＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ１１４５，１９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ，１８，ｐ３９９，２０００年、ヒトＥＧ細胞：Ｇｅａｒｈａｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，ｐ１３７２６，１９９８年。また、マウス胚性幹細胞（１２９ＳＶおよびＣ５７／ＢＬ６）は、大日本製薬より購入できる。
本発明により提供される分化抑制剤は、全ての幹細胞および胚性幹細胞に用いることができるが、哺乳類の幹細胞および胚性幹細胞に用いることが望ましく、霊長類の幹細胞および胚性幹細胞に用いることが好ましい。
細胞ならびに胚性幹細胞は、一旦単離されると、本発明の分化抑制剤を使用して未分化な状態で培養され得る。
本発明の分化抑制剤を用いて培養した幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の未分化程度は幹細胞の細胞膜上に存在するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することにより確認することができる。未分化な胚性幹細胞ではＡＬＰの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、ｐ６８４、１９８８年。Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２、ｐ１１４５，、１９９８年。）。不溶性基質を用いた染色法、あるいは水溶性基質を用いた分光学的測定法などによりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出する方法が挙げられる。
一つの実施態様において、分光学的測定法によりＡＬＰ活性を定量することができる。培養ディッシュ上の細胞にパラニトロフェニルホスフェイト（ｐＮＰＰ）のアルカリ性溶液を添加する。細胞膜上に存在するＡＬＰによってｐＮＰＰが加水分解され、パラニトロフェノールが生じる。生成した溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定することによって、アルカリホスファターゼ活性を定量することができる。実施例１（５）に記載の方法により、本発明の分化抑制剤を添加して培養した胚性幹細胞のＡＬＰ活性を測定すると、分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロールの胚性幹細胞にくらべ有意に高いＡＬＰ活性を有していることが示される。即ち本発明の分化抑制剤が、胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
他の実施態様において、ＡＬＰ染色法によりＡＬＰ活性を検出することもできる。培養ディッシュ上の細胞に、基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加する。細胞膜状に存在するアルカリホスファターゼによりリン酸エステル塩が加水分解され、次いでジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ＡＬＰ活性部位に色素が沈殿する。染色されたコロニー数を計測することにより細胞のＡＬＰ活性を定量化することが可能となり、即ち細胞の未分化度合いを定量することができる。実施例１（６）に記載の方法により、本発明の分化抑制剤を用いて培養した胚性幹細胞をＡＬＰ染色すると、分化抑制剤を用いないコントロール細胞に比べ有意にＡＬＰ活性が高いことが示され、即ち本発明の分化抑制剤が、胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
また、胚性幹細胞の未分化程度はＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。Ｏｃｔ−３／４遺伝子はＰＯＵファミリーに属する転写因子で、胚性幹細胞、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）で、未分化状態特異的に発現し（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、６０、ｐ４６１、１９９０年）、胚発生においても未分化細胞系譜においてのみ発現し（Ｓｃｈｏｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ、７、ｐ３２３、１９９１年）、さらに、Ｏｃｔ−３／４遺伝子破壊マウスのホモ個体は胚盤胞期で発生を停止することから未分化状態維持に重要な機能を有していることが明らかにされている（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ、９５、ｐ３７９、１９９８年）。また、一方、Ｏｃｔ−３／４遺伝子の過剰発現は胚性幹細胞の分化を促進することが最近明らかにされ（Ｎｉｗａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４、ｐ３７２、２０００年）、Ｏｃｔ−３／４の発現量をある一定の範囲に保つことが未分化状態の維持に重要である。Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現量を測定する一つの実施態様としては定量的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることができる。
一つの実施態様においてはリアルタイムＰＣＲ法が用いられ、幅広いダイナミックレンジをもち、簡便で信頼性のある定量測定が可能である。リアルタイムＰＣＲ技術には、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＴａｑ Ｍａｎプローブを用いる方法や、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いた方法がある。特に後者の場合はＰＣＲの温度サイクルが数十分で終了する高速反応サイクルのもとで、サイクルごとに合成されるＤＮＡの増幅量変化をリアルタイムに検出できる。リアルタイムＰＣＲ法のＤＮＡ検出法としては、ＤＮＡ結合色素（インターカレーター）、ハイブリダイゼーション・プローブ（キッシングプローブ）、ＴａｑＭａｎプローブおよびＳｕｎｒｉｓｅユニプライマー（モレキュラー・ビーコン）を利用する４種類の方法がある。また、ＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを利用してＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を解析することができる。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩはＤＮＡの二本鎖特異的に結合色素であり、二本鎖に結合することで本来の蛍光強度が増強される。ＰＣＲ反応時にＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを加え、伸張反応の各サイクルの終わりに蛍光強度を測定すれば、ＰＣＲ産物の増加が検出できる。Ｏｃｔ−３／４遺伝子を検出するには通常のＰＣＲと同様にＯｃｔ−３／４遺伝子の配列をもとに、市販の遺伝子解析ソフトウェアなどを用いてプライマーを設計する。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩは非特異的産物も検出してしまうため最適なプライマーの設定が必要となる。設計基準としては、オリゴマーの長さ、配列の塩基組成、ＧＣ含量、およびＴｍ値などに留意が必要である。
多くの場合、定量ＰＣＲにおいて明らかにすることを目的とするのは、サンプル一定量当たりの目的ＤＮＡ量である。このためには最初に反応系に加えたサンプル量の評価が必要である。この場合サンプル量を反映するような内部標準となる別のＤＮＡを目的ＤＮＡとは別に測定し、最初に反応系に加えたサンプル量を補正することができる。サンプル量を補正する目的で用いる内部標準には、通常、組織によって発現量に差がないと考えられているハウスキーピング遺伝子を用いることができる。例えば、解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、細胞骨格の構成成分であるβアクチンまたはγアクチン、リボゾームの構成蛋白質であるＳ２６などの遺伝子が挙げられる。
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現レベルは、本発明の分化抑制剤に暴露された細胞について決定することができる。分化抑制剤に暴露されていない、即ち、胚性幹細胞から分化誘導されたコントロール細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量にくらべ、有意にＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を維持させることができる活性を有する化合物が、胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制剤であるとみなされる。
最適化された胚性幹細胞の未分化維持培養基材をスクリーニングするさらに他の方法として、ステージ特異的胚抗原（Ｓｔａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）（以後ＳＳＥＡと記載）−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４などの未分化な細胞に特異的に発現する抗原を検出方法が挙げられる（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、ｐ６８８、１９８８年、Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、７５、ｐ５５６５、１９７８年、Ｋａｎｎａｇｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．２、ｐ２３５５、１９８３年）。
一つの実施態様において、ＳＳＥＡ−１などの表面抗原は、同抗原を認識する特異的抗体（一次抗体）とインキュベートし、さらに蛍光標識のようなレポーターと結合した第二の抗体（二次抗体）とインキュベートことにより、標識することができる。この操作により目的の抗原を発現する細胞が、蛍光性になる。次いで、標識された細胞を標準的な方法、例えばフローサイトメーターを用いて、計数、さらには分取され得る。次いで、標識および非標識細胞の数は、目的とする培養基材の効果を決定するために比較され得る。あるいは、非標識細胞表面マーカー抗体に曝露された後、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）形式において、その細胞は、抗細胞表面抗原抗体（例えば抗ＳＳＥＡ−１抗体）に対して特異的な第二の抗体に曝露され得、そこから、所望の表面抗原を発現する細胞の数が、比色定量的に、または蛍光を測定することにより定量され得る。表面抗原を発現する細胞を定量するさらに他の方法も、細胞培養の当業者に周知である。
本発明によって提供される、幹細胞、または胚性幹細胞の増殖に対する改善された分化抑制剤、培養方法および培養液は、幹細胞または胚性幹細胞が有用であるすべての技術に対して適用されることが予想される。
本発明の分化抑制剤、培養方法および培養液を用いて産生される細胞は、分化させ、細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築に使用され、生体内へ移植したり人工臓器として利用されうる。幹細胞の細胞移植治療や組織工学への利用は、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できる。移植のために培養された細胞や組織は、治療のため、採取した人と同一人に戻す場合と他人に移植する場合があるが、本発明の細胞等はいずれにも用いることができる。
本発明の分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを含む培養液により得られた、非改変および改変された幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の培養物は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞のモニタリングまたは幹細胞収集を改良する物質についてスクリーニングするために使用される。例えば、推定の幹細胞或いは胚性幹細胞分化誘導物質は、上記の方法を用いて増殖させた細胞培養物へ添加され得る。推定の幹細胞或いは胚性幹細胞分化誘導物質を欠損した対照細胞培養物と比較して、三胚葉系列への分化を誘導し得る物質は、胚性幹細胞分化誘導因子として同定される。
本発明の分化抑制剤および／または化合物、またはその塩は、優れた幹細胞未分化維持ならびに増殖能を有することから、病気または外傷などにより傷害を受けた組織または器官の治療剤として用いることができる。対象となる疾患としては、例えば皮膚関連では、熱傷、難治性皮膚潰瘍、じょくそう、肥厚性瘢痕、母斑、刺青など、骨関連では、骨折、骨粗しょう症など、軟骨関連では、変形性関節症、慢性リウマチ、椎間板ヘルニア、骨端症、スポーツ障害など、神経関連では、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、外傷による四肢の神経切断、頭頸部外科・胸部外科に伴う損傷、顔面神経麻痺、横隔膜神経損傷、骨盤内神経損傷など、歯関連では歯周病・歯槽膿漏による歯槽骨損傷、無歯症が、毛髪では男性型脱毛症が、角膜では先天性異常、内皮細胞代償不全、角膜感染による混濁、角膜変性症、角膜形状異常など、血管関連では高血圧、慢性動脈閉塞症、虚血性心疾患など、心筋では心筋梗塞、膵臓では糖尿病など、肝臓では肝炎、肝硬変、肝不全などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の分化抑制剤および／または化合物は、上記の疾患に対して予防および／または治療剤として、経口投与または非経口投与のいずれも可能であり、薬学的に許容される担体と混合し、通常、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など固形製剤として経口投与されるか、静脈内、皮下、筋肉内などに注射剤、坐薬若しくは舌下錠などとして非経口投与される。また、舌下錠、マイクロカプセルなどの徐放製剤として、舌下、皮下および筋肉内などに投与してもよい。一日の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重、感受性差；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、通常、哺乳動物１ｋｇ体重あたり約０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは約０．０２〜２０ｍｇ、更に好ましくは０．１〜１０ｍｇ、最も好ましくは０．５〜１０ｍｇを、通常１日１〜４回に分けて投与する。畜産または水産分野で使用する場合の投与量も上記に準ずるが、投与対象生物１ｋｇ体重あたり約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０ｍｇを、通常一日１〜３回に分けて投与する。本発明の化合物の医薬組成物中の含有量は、組成物全体の約０．０１ないし１００重量％である。
上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。上記賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。上記滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。上記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
上記崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。上記溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。上記懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
上記等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。上記緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。上記防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。上記抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
本発明の分化抑制剤および／または化合物に、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等脹化剤、保存剤などを添加し、公知の方法により静脈、皮下、筋肉内注射剤とすることができる。その際必要により公知の方法により凍結乾燥物とすることも可能である。本発明化合物を例えばヒトに投与する場合は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、医薬組成物として経口的または非経口的に安全に投与することができる。上記医薬組成物としては、経口剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤）、非経口剤〔例、注射剤、点滴１０剤、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）など〕が挙げられる。これらの製剤は、製剤工程において通常一般に用いられる自体公知の方法により製造することができる。
本発明の分化抑制剤および／または化合物は分散剤（例、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社製、米国、ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ製）ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性注射剤に、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコールなどに溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤に成形し、注射剤とすることができる。経口剤とするには、自体公知の方法に従い、本発明の分化抑制剤および／または化合物を例えば賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプンなど）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。そのコーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。腸溶性製剤とする場合、腸溶相と薬剤含有相との間に両相の分離を目的として、自体公知の方法により中間相を設けることもできる。
外用剤とするには、公知の方法に従い、本発明の分化抑制剤および／または化合物を固状、半固状または液状の外用投与剤とすることができる。例えば、上記固状のものとしては、本発明化合物をそのまま、あるいは賦形剤（例、グリコール、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体など）などを添加、混合して粉状の組成物とする。上記液状のものとしては、注射剤の場合とほとんど同様に油性または水性懸濁剤とする。半固状の場合は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらはいずれも、ｐＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを加えてもよい。例えば坐剤とするには、自体公知の方法に従い、本発明化合物を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の坐剤とすることができる。上記組成物に用いる油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド〔例、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製，ドイツ）など〕、中級脂肪酸〔例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製，ドイツ）など〕、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など）などが挙げられる。また、水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール、水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが挙げられる。
化合物（９）及び（１０）のプロドラッグとは、生体内において酵素や胃酸等による代謝反応により、幹細胞増殖作用を有する化合物（９）及び（１０）に変換される化合物をいう。化合物（９）及び（１０）のプロドラッグとしては、化合物（９）及び（１０）がアミノ基を有する場合、該アミノ基がアシル化、アルキル化、りん酸化された化合物（例、化合物（９）及び（１０）のアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、ｔｅｒｔ−ブチル化された化合物など）；化合物（９）及び（１０）がカルボキシルを有する場合該カルボキシルがエステル化、アミド化された化合物（例、化合物（９）及び（１０）のカルボキシルがエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、メチルアミド化された化合物など）；等が挙げられる。これらの化合物は公知の方法によって製造することができる。また、化合物（９）及び（１０）のプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような、生理的条件で化合物（９）及び（１０）に変化するものであってもよい。
化合物（９）及び（１０）のプロドラッグはそれ自身であっても、薬理学的に許容される塩であってもよい。このような塩としては、化合物（９）及び（１０）のプロドラッグがカルボキシル等の酸性基を有する場合、無機塩基（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、亜鉛、鉄、銅等の遷移金属等）や有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどの有機アミン類、アルギニン、リジン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸類等）などとの塩が挙げられる。化合物（９）及び（１０）のプロドラッグがアミノ基等の塩基性基を有する場合、無機酸や有機酸（例、塩酸、硝酸、硫酸、燐酸、炭酸、重炭酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等）、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸等との塩が挙げられる。また、化合物（９）及び（１０）のプロドラッグは水和物および非水和物のいずれであってもよい。化合物（９）及び（１０）は分子内に１もしくは２箇所幾何異性体（シス−トランス異性体）を生じる場合があるが、任意の比率でシス体、トランス体を有する化合物も本発明に包含される。化合物（１０）は分子内に１ないしそれより多い不斉炭素を有する場合があるが、これら不斉炭素に関しＲ配置、Ｓ配置のいずれも本発明に包含される。化合物（９）及び（１０）は同位元素（例、３Ｈ、１４Ｃ）などで標識されていてもよい。
化合物（９）及び（１０）のプロドラッグとしては、多糖（例：デキストラン、プルラン、マンナン、キチン、キトサンなど）に化合物（９）及び（１０）がアミノ基、カルボキシル基、水酸基などを反応点として結合したものでも良い。また、化合物（９）及び（１０）がシクロデキストリン（α体、β体、γ体などがあるが、好ましくはβ体またはγ体）などに包摂された複合体でもよい。

次に本発明を具体化した実施例を示す。この実施例は、本発明を実施する当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる様式においても、決して本発明の範囲を制限するものではない。また、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。以下の実施例に記載の「室温」は０ないし３０℃を示す。「％」は特記しない限り重量パーセントを意味する。
［実施例１］
（１）マウスＥＳ細胞培地の作製
ＥＳ細胞を増殖させる目的で、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 １１９９５）に、以下に示す最終濃度で因子を添加してＥＳ細胞培地を調製した。１５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）もしくは１５％ノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社製）、１×非必須アミノ酸ストック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 １１１４０−０５０）、２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 ２５０３０−０８１）、１０３ｕｎｉｔ／ｍｌ ＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，社製）。
ただし、ＥＳＧＲＯはマウスＬＩＦを有効成分として含有する。ＥＳ細胞分化抑制アッセイ用の培地として、上記のＥＳ細胞培地からＥＳＧＲＯを除いたアッセイ培地を作製した。
（２）マウスＥＳ細胞の培養
直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に０．１％の濃度でＧｅｌａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製 ＴｙｐｅＡ：ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎＥＳｋｉｎ、Ｇ２５００）を溶解し、滅菌した０．１％ゼラチン水溶液５ｍｌを添加し、３７℃で３０分以上静置した。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンＣ（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 ＹＥ９２８４４００）２×１０^６個を播種し、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ５ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養した。マウス胚性幹細胞株Ｄ３ＥＳ細胞（Ｒｏｌｆ Ｋｅｍｌｅｒ、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｉｍｍｕｎｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｓｔｕｈｅｗｅｇ５１、Ｄ−７９１０８Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、より入手可能）を、直径６ｃｍ繊維芽細胞フィーダー層上に播種し、５ｍｌのＥＳ培地で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養して増殖させた。
（３）マウスＥＳ細胞の調製
前記の（２）ＥＳ細胞の培養の方法に従って培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％トリプシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 １５０９０−０４６）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させた。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を２０ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、再度、０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。浮遊細胞を含む培地を５０ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁してＥＳ細胞を得た。
（４）ＥＳ細胞分化抑制剤アッセイ１
前記の（３）マウスＥＳ細胞の調製で得たＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした９６穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．３０７２、米国）に、１ウェルあたり３×１０^２〜１×１０^３個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞アッセイ培地が９０μｌになるように播種した。各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または水、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ：Ａ〜ＤはＡＳＩＮＥＸ社（ロシア）、Ｅ〜ＦはＰＨＡＲＭＥＫＳ社（ロシア）から購入）、あるいはＥＳＧＲＯを１０μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで７日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。またコントロールウェルには、ＤＭＳＯのみを最終濃度で０．１％となるように加えた。化合物Ａの構造を図１に、化合物Ｂ〜Ｆの構造を図２に示した。
（５）アルカリホスファターゼ定量１
ＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性を、ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬＰＨＯＳＰＨＡＴＥＳＯＬＵＴＩＯＮ（ＭＯＳＳ Ｉｎｃ．社製、ＰＲＯＤＵＣＴＮＯ．ＮＰＰＤ−１０００、米国、またはＳＩＧＭＡ社製、Ａ−３４６９、米国製）（以下、ｐ−ＮＰＰ）を用いて定量した。
前記の（４）ＥＳ細胞分化抑制剤アッセイ１に記載の方法で７日間培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、ｐ−ＮＰＰ１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間静置した。各ウェルに１２．５μｌの８Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。溶液の４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５）と６９０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．６９０）を吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、型式：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ１９０）により測定し、Ｏ．Ｄ．４０５−Ｏ．Ｄ．６９０で算出される値をアルカリホスファターゼ活性とした。定量結果をグラフ化したものを図３に示した。
本発明の分化抑制剤、化合物Ａ〜ＦはコントロールであるＤＭＳＯ（０．１％）に比べて有意にアルカリホスファターゼ活性を増幅させた。即ち、本発明の分化抑制剤は未分化なＥＳ細胞の培養を支持したことがわかる。
（６）アルカリホスファターゼ染色１
ＥＳ細胞をアルカリホスファターゼキット（ＳＩＧＭＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．８６−Ｒ）を用いて染色した。前記の（４）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ１に記載の方法で培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を２ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、２ｍｌの細胞固定液（２５ｍｌ クエン酸溶液（ＳＩＧＭＡ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．９１−５）、６５ｍｌ アセトン、８ｍｌ ３７％ホルムアルデヒド）を各穴に加え、室温で３０秒静置する。
固定液を吸引除去し、２ｍｌの脱イオン水を各穴に加えて４５秒室温で静置する。
脱イオン水を吸引除去し、ついでアルカリホスファターゼ染色液（１ｍｌ 亜硝酸ナトリウム溶液、１ｍｌ ファーストレッドバイオレットＬＢソルト溶液、１ｍｌ ナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液、４５ｍｌ 蒸留水）を１ウェルあたり２ｍｌ加え１５分間室温で静置後、染色液を吸引除去し、脱イオン水２ｍｌで洗浄した。ネガティブコントロールであるＥＳＧＲＯ非存在下で培養したＥＳ細胞、ポジティブコントロールである、ＥＳＧＲＯ（１０００ユニット／ｍｌ）存在下で培養したＥＳ細胞、そして、本発明の分化抑制剤である化合物Ｂ（４μｇ／ｍｌ）存在下で培養したＥＳ細胞の染色像を比較した（図４参照）。化合物Ｂ存在下で培養したＥＳ細胞は、ＥＳＧＲＯ非存在下で培養したＥＳ細胞に比べ、有意に濃く染色されており、高いアルカリホスファターゼ活性を有していることが示された。さらに、本発明の分化抑制剤は、ポジティブコントロールであるＥＳＧＲＯ存在下で培養したＥＳ細胞と同等の未分化コロニーを形成させることもできた。すなわち、本発明の分化抑制剤は、ＥＳ細胞の未分化状態での増殖を強く支持したことがわかる。
なお、化合物Ａ、Ｃ〜Ｆについても、化合物Ｂと同様に染色された。
（７）ＳＴＡＴ３活性化アッセイ１
実施例１の（３）マウスＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした２４穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４７、米国）に、１ウェルあたり１×１０^５個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞培地が５００μｌになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間〜２４時間培養した。次に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を用いて、添付のプロトコールに従って、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃ、またはｐＴＡ−Ｌｕｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を１ウェルあたり０．９μｇをＥＳ細胞にトランスフェクションした。また、内部コントロールとして、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）を各ウェル０．１μｇ、同時にトランスフェクションした。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４時間培養後、培地を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄したのち、ＥＳアッセイ培地を各ウェル５００μｌずつ加えた。次いで、各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）または水或いはその混合物に溶解した分化抑制剤、あるいは１０〜１０，０００ｕｎｉｔ／ｍｌとなるようにＥＳアッセイ培地で希釈したＥＳＧＲＯを５０μｌ添加し３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで６〜２４時間培養した。続いて、ピッカジーンデュアル・シーパンジー（東洋インキ製造社製、日本）を用いて、添付のプロトコールに従って、各細胞のルシフェラーゼ・レポーター酵素による発光シグナルを測定した。図５に示すように、ＥＳＧＲＯが容量依存的にｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃによるレポーター酵素の発現を亢進させたのに対し、本発明の化合物Ｂは、レポーター酵素の発現を誘導しなかった。
また、化合物Ａ、Ｃ〜Ｆについても同様の実験を行うことにより、レポーター酵素の発現の有無を確認することができる。
［実施例２］
（１）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ２
実施例１の（３）マウスＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに８×１０^４個の細胞を、ＥＳ細胞アッセイ培地が１０ｍｌになるように播種した。各ディッシュに４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（Ａ〜Ｆ）、あるいは１０^４ｕｎｉｔｓ／ｍｌに調製したＥＳＧＲＯを１ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで７日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。
（２）ＲＮＡの単離１
前記の（１）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ２に示す方法で培養したＥＳ細胞からＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン社製、日本）を用い、添付の方法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。即ち、培養後のディッシュから培地を除去し、ＰＢＳ １０ｍｌで二回洗浄し、ＩＳＯＧＥＮＥ １ｍｌに溶解した。室温で５分間静置した後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに回収した。クロロホルム（和光純薬）を０．２ｍｌ加え、１５秒間振とうし、２〜３分間室温で静置した。微量遠心機（トミー精工）で４℃、１００００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清４００μｌを新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、５００μｌのイソプロパノール（和光純薬）を加え、室温で１０分間静置後、微量遠心機にて４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去後、７０％エタノール水溶液を１ｍｌ加え、振とうした後、微量遠心機にて４℃、１００００ｒｐｍ、約５分間遠心した。上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、３０μｌの蒸留水に溶解させ、トータルＲＮＡ溶液を得た。
このようにして得られたトータルＲＮＡの２μｇを鋳型に、ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製１８４１８−０１２）、オムニスクリプトリバーストランスクリプターゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。即ち、トータルＲＮＡ２μｇに１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅＲ１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と蒸留水を加えて１０μｌとなるようにした反応液を作製し、室温で１０分間インキュベートした。２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μｌ加えて、６５℃で１０分間加熱した。室温に戻した後、２μｌの１０×Ｂｕｆｆｅｒ ＲＴ、２μｌの５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー、０．２５μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１０７７７−０１９）、１μｌのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え、ＲＮａｓｅフリー精製水で全量２０μｌに合わせ、３７℃で６０分間インキュベートして、ｃＤＮＡ溶液を得た。このようにして得た合成ｃＤＮＡの一部を蒸留水で５倍に希釈し、その２μｌを鋳型として、ライトサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行った。Ｏｃｔ−３／４遺伝子、並びに内部標準としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を測定した。Ｏｃｔ−３／４遺伝子の増幅には、センスプライマーＯＣＴ３ ｕｐ（配列表配列番号１）、およびアンチセンスプライマーＯｃｔ３ ｄｏｗｎ（配列表配列番号２）を用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、センスプライマーＧＡＰＤＨ ｕｐ（配列表配列番号３）、およびアンチセンスプライマーＧＡＰＤＨ ｄｏｗｎ（配列表配列番号４）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成と反応条件を以下にそれぞれ示す。

本発明の分化抑制剤（Ｂ，Ｄ，Ｆ）存在下で培養したＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現は、分化抑制剤を含まない培地にて培養したＥＳ細胞に比べ有意に亢進しており、ＥＳＧＲＯ１，０００ユニット／ｍｌと同等のＯｃｔ−３／４遺伝子発現維持効果が認められた（図６）。即ち、本発明の分化抑制剤（Ｂ，Ｄ，Ｆ）は、ＥＳ細胞の未分化を維持することがＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量から確認された。以上の結果から、本発明の分化抑制剤、化合物Ｂ，Ｄ，ＦがＥＳ細胞の未分化状態を維持することがＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量からも示された。
また、分化抑制剤Ａ，Ｃ，Ｅについても同様の検討を行ったところ、分化抑制剤（Ｂ，Ｄ，Ｆ）と同様にＯｃｔ−３／４遺伝子の発現を維持した。即ち、ＥＳ細胞の未分化を維持した。
（３）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ３
実施例１の（３）マウスＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに７．８５×１０^５個の細胞を、ＥＳ細胞アッセイ培地が１０ｍｌになるように播種した。各ディッシュには、本発明の分化抑制剤Ｂを最終濃度４μｇ／ｍｌで、或いは、ＥＳＧＲＯを最終濃度１×１０^３ｕｎｉｔ／ｍｌで培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１日培養した。
（４）ＲＮＡの単離２
前記（３）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ３に示す方法で培養したＥＳ細胞からＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン社製、日本）を用い、添付の方法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。即ち、細胞を１５ｍｌの滅菌チューブに回収し、卓上遠心機（トミー精工）で１，０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、ＰＢＳ １０ｍｌで２回洗浄後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。ＩＳＯＧＥＮＥ １ｍｌに溶解し、室温で５分間静置した後、クロロホルム（和光純薬）を０．２ｍｌ加え、１５秒間振とうし、２〜３分間室温で静置した。微量遠心機（トミー精工）で４℃、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清４００μｌを新しい１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、５００μｌのイソプロパノール（和光純薬）を加え、室温で１０分間静置後、微量遠心機にて４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去後、７０％エタノール水溶液を１ｍｌ加え、振とうした後、微量遠心機にて４℃、１０，０００ｒｐｍ、約５分間遠心した。上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、３０μｌの蒸留水に溶解させ、トータルＲＮＡ溶液を得た。
このようにして得られたトータルＲＮＡの２μｇを鋳型に、ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１８０８０−０５１）を用い添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。即ち、２μｇのトータルＲＮＡに１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、蒸留水で１０μｌとなるようにした反応液を作製し、室温で１０分間インキュベートした。１μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えて、６５℃で１０分間加熱し、室温に戻した後、反応液を８μｌとり、１μｌの５０ｍＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘを加え、６５℃で５分間インキュベートした。氷中に１分間置いた後、２μｌの１０×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、４μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、そして、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴを加えて５０℃で５０分間インキュベートした。続いて８５℃で５分間インキュベートした後、氷中に１分間置いた。１μｌのＲＮａｓｅＨを加え、３７℃で２０分間インキュベートしてｃＤＮＡを得た。このようにして得た合成ｃＤＮＡの一部を蒸留水で５倍に希釈し、その２μｌを鋳型として、ライトサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行った。Ｎａｎｏｇ遺伝子、並びに内部標準としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を測定した。Ｎａｎｏｇ遺伝子の増幅には、センスプライマーＮａｎｏｇ＿ｕｐ（配列表配列番号５）、およびアンチセンスプライマーＮａｎｏｇ＿ｄｏｗｎ（配列表配列番号６）を用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、センスプライマーＧＡＰＤＨ ｕｐ（配列表配列番号３）、およびアンチセンスプライマーＧＡＰＤＨ ｄｏｗｎ（配列表配列番号４）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成、及び反応条件を以下に示す。

本発明の分化抑制剤Ｂ存在下で培養したＥＳ細胞のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量は、分化抑制剤を含まない培地、ならびに、ＥＳＧＲＯ１，０００ユニット／ｍｌを含む培地にて培養したＥＳ細胞に比べ有意に増加していた（図７）。即ち、本発明の分化抑制剤Ｂは、ＥＳ細胞の未分化を維持する効果を有することがＮａｎｏｇ遺伝子の発現量から確認された。
また、分化抑制剤Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについても同様の検討を行ったところ、分化抑制剤Ｂと同様にＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させた。即ち、ＥＳ細胞の未分化を維持する活性を有することが明らかになった。
（５）ＳＳＥＡ−１抗原の発現量評価１
前記の（１）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ２で培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離した。細胞数が６×１０^５個になるように２％ＦＢＳを含むＨａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を３００μｌ加えた。ＨＢＳＳで５０倍希釈したＭＸ−ＳＳＥＡ−１抗体（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）を３０μｌ加え４０分間、氷上で静置した。ＨＢＳＳ（１ｍｌ）で２回洗浄後、ＨＢＳＳ（３００μｌ）に再分散し、ＨＢＳＳで２０倍に希釈したＦＩＴＣ−Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を３０μｌ加え３０分間、遮光して氷上で静置した。ＨＢＳＳ（１ｍｌ）で２回洗浄後、ＨＢＳＳ（１ｍｌ）に再分散し、２０μｇ／ｍｌ ＰＩ溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１００μｌ加え、フローサイトメーター測定に用いるサンプルを得た。またフローサイトメーター測定に用いるサンプルは、凝集塊を除く目的で孔径１００μｍのナイロン・メッシュに通した後に測定を行った。フローサイトメーターはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いた。結果を図８に示した。各分化抑制剤を添加して培養した細胞の、１細胞あたりの平均蛍光強度、即ち、１細胞あたりのＳＳＥＡ−１抗原発現強度は、分化抑制剤を含まない培地で培養した細胞に比べ、有意に亢進していた。また、化合物Ａ，Ｃ，Ｅについて同様の実験をしたところ、同様にＳＳＥＡ−１の発現レベルが有意に高いことを示した。即ち、本発明の分化抑制剤は、未分化なＥＳ細胞を維持することが明らかになった。
［実施例３］
インドール誘導体ａ〜ｏについても同様の実験をし、以下の結果を得た。
（１）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ４
実施例１の（３）マウスＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした９６穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．３０７２、米国）に、１ウェルあたり３２００個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞アッセイ培地が１００μｌになるように播種した。各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または水、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（ａ〜ｏ：ａ、ｊ〜ｍはＩＦ ＬＡＢ Ｌｔｄ．社、ウクライナ、ｂ、ｃ、ｆ、ｎはＰＨＡＲＭＥＫＳ社、ロシア、ｄ、ｅ、ｏはＳＰＥＣＳ社、オランダ、ｇ〜ｉはＣＨＥＭＢＲＩＤＧＥ社、米国から購入）、あるいはＥＳＧＲＯを１０μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。またコントロールウェルには、ＤＭＳＯのみを最終濃度で０．１％となるように加えた。分化抑制剤ａ〜ｏの構造を図９に示した。
（２）アルカリホスファターゼ定量２
ＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性を、ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬＰＨＯＳＰＨＡＴＥＳＯＬＵＴＩＯＮ（ＭＯＳＳ Ｉｎｃ．社製、ＰＲＯＤＵＣＴＮＯ．ＮＰＰＤ−１０００、米国、またはＳＩＧＭＡ社製、Ａ−３４６９、米国製）（以下、ｐ−ＮＰＰ）を用いて定量した。前記の（１）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ４に記載の方法で４日間培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、ｐ−ＮＰＰ１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間静置した。各ウェルに１２．５μｌの８Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。溶液の４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５）と６９０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．６９０）を吸光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製、型式：ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ１９０）により測定し、Ｏ．Ｄ．４０５−Ｏ．Ｄ．６９０で算出される値をアルカリホスファターゼ活性とした。定量結果をグラフしたものを図１０に示した。本発明の分化抑制剤、化合物ａ〜ｏはコントロールであるＤＭＳＯ（０．１％）に比べて有意にアルカリホスファターゼ活性を増幅させた。即ち、本発明の分化抑制剤は未分化なＥＳ細胞の培養を支持した。
（３）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ５
実施例１の（３）マウスＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに８×１０^４個の細胞を、ＥＳ細胞アッセイ培地が１０ｍｌになるように播種した。各ディッシュに４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（ａ〜ｏ）、あるいはＥＳＧＲＯを１ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。
（４）ＳＳＥＡ−１抗原の発現量評価２
前記の（３）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ５で培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離した。細胞数が６×１０^５個になるように２％ＦＢＳを含むＨａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を３００μｌ加えた。ＨＢＳＳで５０倍希釈したＭＸ−ＳＳＥＡ−１抗体（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）を３０μｌ加え４０分間、氷上で静置した。ＨＢＳＳ（１ｍｌ）で二回洗浄後、ＨＢＳＳ（３００μｌ）に再分散し、ＨＢＳＳで２０倍ＦＩＴＣ−Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を３０μｌ加え３０分間、遮光して氷上で静置した。ＨＢＳＳ（１ｍｌ）で二回洗浄後、ＨＢＳＳ（１ｍｌ）に再分散し、２０μｇ／ｍｌ ＰＩ溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１００μｌ加え、フローサイトメーター測定に用いるサンプルを得た。またフローサイトメーター測定に用いるサンプルは、凝集塊を除く目的で孔径１００μｍのナイロン・メッシュに通した後に測定を行った。フローサイトメーターはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製、米国）を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製、米国）を用いた。結果を図１１に示した。各分化抑制剤を添加して培養した細胞の、１細胞あたりの平均蛍光強度、即ち、１細胞あたりのＳＳＥＡ−１抗原発現強度は、分化抑制剤を含まない培地で培養した細胞に比べ、有意に亢進していた。また、化合物ｂ〜ｏについて同様の実験をしたところ、同様にＳＳＥＡ−１の発現レベルが有意に高いことを示した。即ち、本発明の分化抑制剤は、未分化なＥＳ細胞を維持することが明らかになった。
（５）ＳＴＡＴ３活性化アッセイ２
実施例１の（３）ＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＤ３ＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした２４穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４７、米国）に、１ウェルあたり１×１０^５個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞培地が５００μｌになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間〜２４時間培養した。次ぎに、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を用いて、添付のプロトコールに従って、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃ、またはｐＴＡ−Ｌｕｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を１ウェルあたり０．９μｇをＥＳ細胞にトランスフェクションした。また、内部コントロールとして、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）を各ウェル０．１μｇ、同時にトランスフェクションした。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４時間培養後、培地を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄したのち、ＥＳアッセイ培地を各ウェル５００μｌずつ加えた。次いで、各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）または水或いはその混合物に溶解した分化抑制剤、あるいは１０〜１０，０００ｕｎｉｔ／ｍｌとなるようにＥＳアッセイ培地で希釈したＥＳＧＲＯを５０μｌ添加し３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで６〜２４時間培養した。続いて、ピッカジーンデュアル・シーパンジー（東洋インキ製造社製、日本）を用いて、添付のプロトコールに従って、各細胞のルシフェラーゼ・レポーター酵素による発光シグナルを測定した。図１２に示すように、ＥＳＧＲＯがｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃによるレポーター酵素の発現を亢進させたのに対し、本発明の化合物ｂは、レポーター酵素の発現を誘導しなかった。
また、化合物ａ、ｃ〜ｏについても同様の実験を行うことにより、レポーター酵素の発現の有無を確認することができる。
［実施例４］：ＥＳ細胞の継代培養
実施例１の（３）マウスＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに３×１０^５個の細胞を、ＥＳ細胞アッセイ培地が４．５ｍｌになるように播種した。各ディッシュに１０〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（Ａ〜Ｆ、ａ〜ｏ）、あるいは１０^４ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＥＳＧＲＯを０．５ｍｌ添加した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。ＤＭＳＯのみのコントロールは培地で希釈した１％濃度液を０．５ｍｌ加えて最終濃度０．１％とした。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで７日〜３０日培養した。培地は毎日交換し、２〜３日毎に３×１０^５個／ディッシュとなるように継代した。
本発明の分化抑制剤を用いて７日、或いは３０日間培養したＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性をコロニーアッセイにより定量した。即ち、前記の方法で継代培養したＥＳ細胞を、予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした９６穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．３０７２、米国）に、１ウェルあたり１×１０^３個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞アッセイ培地が９０μｌになるように播種した。各ウェルに０〜１０^３ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるよう培地で希釈したＥＳＧＲＯを１０μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４日間培養した。各ウェルから培地を吸引除去し、細胞を１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、ｐ−ＮＰＰ１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間静置した。各ウェルに１２．５μｌの８Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。溶液の４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５）と６９０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．６９０）を吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、型式：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ１９０）により測定し、Ｏ．Ｄ．４０５−Ｏ．Ｄ．６９０で算出される値をアルカリホスファターゼ活性とした。化合物Ｂを添加して３０日間継代培養したＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ定量結果を図１３に、化合物ｆを添加して無血清培地で７日間継代培養したＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ定量結果を図１４に示した。
本発明の分化抑制剤、化合物Ｂおよびｆで継代培養したＥＳ細胞は、ＤＭＳＯ（０．１％）で培養したＥＳ細胞に比べて有意にアルカリホスファターゼ活性を増幅させた。即ち、本発明の分化抑制剤はＥＳ細胞の未分化状態を長期培養においても支持したことがわかる。
また、分化抑制剤Ａ，Ｃ〜Ｅ、ａ〜ｏについても同様の検討を行ったところ、分化抑制剤（Ｂ，ｆ）と同様にアルカリホスファターゼの活性を維持した。即ち、ＥＳ細胞の未分化を維持した。
［実施例５］
（１）カニクイザルＥＳ細胞の培養
カニクイザルＥＳ細胞培養培地として、ＤＭＥ／Ｆ−１２，１：１（ＳＩＧＭＡ Ｄ６４２１）に、以下に示す最終濃度で因子を添加してカニクイザルＥＳ細胞培地を調製した。２０％ノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 １０８２８−０２８）、１×非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ Ｍ７１４５）、２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｇ７５１３）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ Ｓ８６３６）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＳＩＧＭＡ Ｐ０７８１）。また、カニクイザルＥＳ細胞培養用のマウスフィーダー細胞用の培地として、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社製 １１９６０−０４４）に、以下に示す最終濃度で各因子を添加して調製した。１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｇ７５１３）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＳＩＧＭＡ Ｐ０７８１）。
直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に０．１％の濃度でＧｅｌａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製ＴｙｐｅＡ：ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎＥＳｋｉｎ、Ｇ２５００）を溶解し、滅菌して作製した０．１％ゼラチン水溶液５ｍｌを添加し、３７℃で３０分以上静置した。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンＣ（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 ＹＥ９２８４４００）２×１０^６個を播種し、前記のフィーダー細胞用培地を用いて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養した。カニクイザルＥＳ細胞（田辺製薬株式会社製）を、マウス胚性初代培養細胞に播種し、５ｍｌのカニクイザルＥＳ細胞培養培地で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３日間培養して増殖させた。
（２）カニクイザルＥＳ細胞の調製
前記の（１）カニクイザルＥＳ細胞の培養に記載の方法に従って培養したカニクイザルＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 １１９６０−０４４）に溶解した０．１％コラゲナーゼ溶液（Ｗａｋｏ社製 ０３２−１０５３４）もしくは、トリプシン溶液（２．５％トリプシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 １５０９０−０４６）を１０ｍｌ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製１０８２８−０２８）を２０ｍｌ、１００ｍＭ ＣａＣｌ_２水溶液を１ｍｌ、ＰＢＳを６９ｍｌ混合することにより調製）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。５ｍｌのカニクイザルＥＳ細胞培養培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを脱離後、分散させ、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を５ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、カニクイザルＥＳ細胞を得た。
（３）マトリゲルコートディッシュの作製
グロースファクターリデュースド（ＧＦＲ）ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、３５４２３０、日本）及びＢＤマトリゲル基底膜マトリックス（日本ベクトン・ディッキンソン社製、３５４２３４）を２〜８℃の冷蔵庫で一晩解凍し、冷やしたピペットを用いてゆっくりと混合した。冷却したＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１（Ｓｉｇｍａ社製、Ｄ６４２１、米国）でマトリゲルを２０倍希釈し、培養ディッシュに加え、室温で１時間インキュベートした。溶液を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１で洗浄し、マトリゲルコートディッシュを得た。
（４）ＥＳ細胞分化抑制剤アッセイ６
前記の（２）カニクイザルＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したカニクイザルＥＳ細胞を３〜５倍に培地で希釈し、予めマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製）でコートした直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュ１枚当たり４．５ｍｌを播種した。次いで、各ディッシュに８〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（Ａ〜Ｆ、ａ〜ｏ）及び６−ブロモインジルビン−３オキシムを０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。２〜４日毎に前記（２）カニクイザルＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って継代した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。以上の培養細胞を前記実施例１に記載のアルカリフォスファターゼ染色により評価を行った。
化合物Ｂもしくは化合物ｆを添加後、２日間培養した細胞のアルカリフォスファターゼ染色の結果を総コロニー数に対する染色されたコロニー数の割合として図１５に、６−ブロモインジルビン−３オキシム非存在下もしくは存在下、化合物ｆを添加し、３日間培養後継代し、３日後のアルカリフォスファターゼ染色写真を図１６に示した。
本発明の分化抑制剤、化合物Ｂ及びｆで培養したカニクイザルＥＳ細胞は、ＤＭＳＯ（０．１％）で培養したカニクイザルＥＳ細胞に比べて有意にアルカリフォスファターゼ染色されたコロニーの割合が多かった。また、化合物ｆ存在下で継代培養したカニクイザルＥＳ細胞は、ＤＭＳＯ存在下で継代培養したカニクイザルＥＳ細胞に比べ、有意に染色されていた。さらに、６−ブロモインジルビン−３オキシム存在下では、化合物ｆの効果は増強された。即ち、本発明の分化抑制剤は、カニクイザルＥＳ細胞の未分化状態を支持したことがわかる。なお、化合物Ａ，Ｃ〜Ｅ、ａ〜ｅ、ｇ〜ｏについても同様の検討を行ったところ、分化抑制剤（Ｂ，ｆ）と同様にアルカリフォスファターゼの活性を維持した。即ち、カニクイザルＥＳ細胞の未分化を維持した。
［実施例６］：化合物の製造方法
［１］ ３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニデン−１−アセトアミドの合成

ベンゼンに２−シアノアセトアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）を加え攪拌しながら、１０℃に上がらないようにゆっくりと濃硫酸を滴下する。室温に戻した後、ジメチルベンジルカルビノール（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ社、英国）を加える。約３０分間還流し、室温に放冷後、反応混合液を氷水に注ぐ。抽出した水相を中和し、生じた沈殿を濾別する。乾燥後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝２１７（Ｍ＋１）
［２］ ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドの合成

ｐ−アミノアセトフェノン（Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）をベンゼンに溶解し、塩酸ガスを通気し、得られた沈殿を濾別し、イソプロパノールにより再結晶することによりｐ−アミノアセトフェノン塩酸塩を得る。得られたｐ−アミノアセトフェノン塩酸塩を２０％エタノール水溶液に溶解し、氷浴下、濃塩酸で酸性にする。亜硝酸ナトリウム水溶液を滴下し、尿素で処理することにより、ジアゾニウム塩溶液を得る。
３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニデン−１−アセトアミドを２０％エタノール水溶液に溶解し、濃塩酸を加える。１０℃を越えないように温度を調整し、先のジアゾニウム塩溶液を加える。反応液が変化し、攪拌しながら飽和酢酸ナトリウム水溶液を加える。得られた沈殿を濾別後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３６３（Ｍ＋１）
［３］ ２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドの合成

ｍ−アミノアセトフェノン（Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）をベンゼンに溶解し、塩酸ガスを通気し、得られた沈殿を濾別し、イソプロパノールにより再結晶することによりｐ−アミノアセトフェノン塩酸塩を得る。得られたｐ−アミノアセトフェノン塩酸塩を２０％エタノール水溶液に溶解し、氷浴下、濃塩酸で酸性にする。亜硝酸ナトリウム水溶液を滴下し、尿素で処理することにより、ジアゾニウム塩溶液を得る。
３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニデン−１−アセトアミドを２０％エタノール水溶液に溶解し、濃塩酸を加える。１０℃を越えないように温度を調整し、先のジアゾニウム塩溶液を加える。反応液が変化し、攪拌しながら飽和酢酸ナトリウム水溶液を加える。得られた沈殿を濾別後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３６３（Ｍ＋１）
［４］ ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（２，３，３−トリメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドの合成

アセトニトリルに２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ社，ロシア）及び炭酸ナトリウムを加え、ヨウ化メチルのアセトニトリル溶液をゆっくり滴下し、還流する。還流物を室温まで放冷後、溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、蒸留水で洗浄する。その後無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３７７（Ｍ＋１）
［５］ ２−（２−アセチル−３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−アセトアミドの合成

氷浴下、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ社，ロシア）及びジメチルアミノピリジンをピリジンに溶解し、無水酢酸を加える。停止後、前記反応後の溶媒を氷水に注ぎ、ジクロロメタンにより反応生成物を抽出する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝４０５（Ｍ＋１）
［６］ （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトニトリルの合成

氷浴下、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ社，ロシア）、塩化チオニル及びＤＭＦを混合し、ゆっくり攪拌する。混合溶媒から過剰の塩化チオニルを減圧留去し、反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３４５（Ｍ＋１）
［７］ （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸の合成

エタノールに水酸化カリウム及び２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ社，ロシア）を加え、加熱還流する。還流物を室温まで放冷後、これに蒸留水を加え、さらに塩酸を加えて中性にした後、エーテルで反応生成物を抽出する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３６４（Ｍ＋１）
［８］ （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸エチルエステルの合成

（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸をエタノールに懸濁し、攪拌する。冷却しながら塩化チオニルをゆっくり滴下し、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒から溶媒を減圧留去し、水で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３９２（Ｍ＋１）
［９］ ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−メチル−アセトアミドの合成

（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸、メチルアミン、ＨＯＢｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）及びトリエチルアミンをＤＭＦに溶解し、ＨＢＴＵ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３７７（Ｍ＋１）
［１０］ ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミドの合成

（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸、ジメチルアミン、ＨＯＢｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）及びトリエチルアミンをＤＭＦに溶解し、ＨＢＴＵ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３９１（Ｍ＋１）
［１１］ ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミドの合成

（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸、フェニルアミン、ＨＯＢｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）及びトリエチルアミンをＤＭＦに溶解し、ＨＢＴＵ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝４３９（Ｍ＋１）
［１２］ ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−１−イル）−アセトアミドの合成

窒素気流下、アセトニトリルに２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（Ａｓｉｎｅｘ社，ロシア）を溶解したものに、トリフェニルすず水素化物（Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を溶解したキシレンを加え、還流する。還流物を室温まで放冷し、不溶物を濾別する。濾液から溶媒を減圧留去し、反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
ＭＳ（ｍ／ｚ）＝３６５（Ｍ＋１）
［実施例７］
（１）ＥＳ細胞分化抑制アッセイ７
実施例１の（２）マウスＥＳ細胞の培養に記載の方法を用いて培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．２５％トリプシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させた。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を５ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁する。予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした２４穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４７、米国）に、１ウェルあたり３×１０^２〜１×１０^３個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞アッセイ培地が５００μｌになるように播種した。各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または水、或いはその混合物に溶解した実施例６に記載の方法を用いて製造した化合物▲１▼〜▲１０▼、あるいはＥＳＧＲＯを５０μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで７日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。またコントロールウェルには、ＤＭＳＯのみを最終濃度で０．１％となるように加えた。化合物▲１▼の構造を図１７に、化合物▲２▼〜▲１０▼の構造を図１８に示した。
（２）アルカリホスファターゼ染色
ＥＳ細胞をアルカリホスファターゼキット（ＳＩＧＭＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．８６−Ｒ）を用いて染色した。前記「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ」に記載の方法で培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を０．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、０．５ｍｌの細胞固定液（２５ｍｌ クエン酸溶液（ＳＩＧＭＡ社製 Ｃａｔ．Ｎｏ．９１−５）、６５ｍｌアセトン、８ｍｌ ３７％ホルムアルデヒド）を各穴に加え、室温で３０秒静置する。固定液を吸引除去し、０．５ｍｌの脱イオン水を各穴に加えて４５秒室温で静置する。脱イオン水を吸引除去し、ついでアルカリホスファターゼ染色液（１ｍｌ 亜硝酸ナトリウム溶液、１ｍｌ ファーストレッドバイオレットＬＢソルト溶液、１ｍｌ ナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液、４５ｍｌ蒸留水）を１ウェルあたり０．５ｍｌ加え１５分間室温で静置後、染色液を吸引除去し、脱イオン水０．５ｍｌで洗浄した。ネガティブコントロールであるＥＳＧＲＯ非存在下で培養したＥＳ細胞、ポジティブコントロールである、ＥＳＧＲＯ（１０００ユニット／ｍｌ）存在下で培養したＥＳ細胞、そして、本発明の化合物▲４▼（４μｇ／ｍｌ）存在下で培養したＥＳ細胞の染色像を比較した（図１９参照）。化合物▲４▼存在下で培養したＥＳ細胞は、ＥＳＧＲＯ非存在下で培養したＥＳ細胞に比べ、有意に濃く染色されており、高いアルカリホスファターゼ活性を有していることが示された。さらに、本発明の化合物は、ポジティブコントロールであるＥＳＧＲＯ存在下で培養したＥＳ細胞と同等の未分化コロニーを形成させることもできた。すなわち、本発明の化合物は、ＥＳ細胞の未分化状態での増殖を強く支持したことがわかる。
なお、化合物▲１▼〜▲３▼、▲５▼〜▲１０▼についても、化合物４と同様に染色された。

本発明によれば、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を、未分化なまま、期間を延長してまたは無期限に、大量にかつ安全に増殖させることができる。本発明によって提供される分化抑制剤、それを用いた培養方法、培養液は、細胞移植用途で用いる細胞ソースとしての幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を産生するために適用され得る。幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を利用することにより得られる多くの恩恵に加え、本発明によって提供される分化抑制剤およびそれを用いた培養方法は、１つもしくは多数の遺伝的な改変を有する胚性幹細胞を産生するために適用され得る。このような適用の例は、疾患について細胞ベースでのモデルの開発、ならびに遺伝病を処置するために移植について特異化された組織の開発を含むが、これに限定されない。
上記の通り、本発明の分化抑制剤および／または２環化合物は、幹細胞を未分化状態で増殖させることができ、その結果培養された細胞や組織を再生医療分野で好適に利用できる。また、本化合物を医薬組成物に応用することができる。
本出願が主張する優先権の基礎となる２００３年６月２７日付の日本特許出願（特願２００３−１８５３９８）及び２００３年１０月１４日付の日本特許出願（特願２００３−３５３８７０）の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に参照として取り込まれる。

Claims (19)

1. 一般式（４）で表される化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
   

   

   ［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^８、Ｒ^９及びＲ^１０が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、Ｒ^１１が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１２が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、Ｒ^１３が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基である。］
2. 一般式（５）で表される化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
   

   

   ［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^８、及びＲ^９が水素原子であり、Ｒ^５が水素原子または低級アルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、Ｒ^１０が水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ^１１が、水素原子であり、Ｒ^１２が、水素原子、又は低級アルキル基である。］
3. 一般式（６）で表される化合物またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
   

   

   ［式中、Ｒ^１およびＲ^２が水素原子であり、Ｒ^３がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、Ｒ^４がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、又は水素原子であり、Ｒ^５が低級アルキル基、ジメチルアミノビニル基、またはアリールアミノビニル基であり、Ｒ^６がニトロ基であり、Ｒ^７、Ｒ^８、及びＲ^９が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子である。］
4. （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸エチルエステル、（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−メチル−アセトアミド、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミド、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミドまたはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
5. ２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミドまたはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
6. ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（２，３，３−トリメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド、２−（２−アセチル−３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−アセトアミドまたはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
7. （４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトニトリルまたはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
8. ２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−１−イル）−アセトアミドまたはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
9. 化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させる作用を有する化合物である、請求項１〜８のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
10. 化合物が、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｐｔｉｏｎ３）を活性化しない化合物である、請求項１〜９のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
11. 化合物が、ＳＳＥＡ−１抗原発現量を増加させる作用を有する化合物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
12. 化合物が、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物である請求項１〜１１のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤。
13. 化合物が、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する２環化合物である、請求項１２に記載の幹細胞分化抑制剤。
14. 化合物が、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有するアゾ基を含有する２環化合物である、請求項１３に記載の幹細胞分化抑制剤。
15. 請求項１〜１４のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を用いて幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする幹細胞培養方法。
16. 請求項１〜１４のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を用いて胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする胚性幹細胞培養方法。
17. 請求項１〜１４のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
18. 幹細胞分化抑制剤の濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１７に記載の培地。
19. 請求項１〜１４のいずれかに記載の幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養された幹細胞。

Images