JP4406601B2 - 組織幹細胞増殖剤 - Google Patents
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Description
(1) 低分子化合物またはその塩を有効成分として含有する組織幹細胞増殖剤。
(2) 低分子化合物が、一般式(1)
で表される化合物である、(1)に記載の組織幹細胞増殖剤。
(4) A環が、1つの窒素原子を環内に含む5または6員環である、(2)に記載の組織幹細胞増殖剤。
(5) Xで表されるアルキレン基が、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び/又は原子を1つ以上有している、(2)〜(4)の何れかに記載の組織幹細胞増殖剤。
で表される化合物である、(2)に記載の組織幹細胞増殖剤。
で表される化合物である、(2)に記載の組織幹細胞増殖剤。
で表される化合物である、(6)に記載の組織幹細胞増殖剤。
[式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記(6)中の定義と同義である。R10、R11、R12は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。]
で表される化合物である、(6)に記載の組織幹細胞増殖剤。
で表される化合物である、(7)に記載の組織幹細胞増殖剤。
(18) 組織幹細胞がヒト組織幹細胞である、(1)〜(17)のいずれかに記載の組織幹細胞増殖剤。
(20) (1)〜(18)のいずれかに記載の組織幹細胞増殖剤を有効成分として含有する培地。
(21) 組織幹細胞増殖剤の濃度が10ng/ml〜100μg/mlであることを特徴とする(20)に記載の培地。
(23) (1)〜(18)のいずれかに記載の組織幹細胞増殖剤を用いて培養された組織幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
(24) 細胞または組織が生体内へ移植するためのものである(22)または(23)に記載の細胞または組織。
(25) (22)〜(24)のいずれかに記載の細胞または/および組織を生体内に移植する治療方法。
以下の用語は他で述べない限り、以下に提供されるように定義される。
本明細書で使用される他の全ての用語は、他に述べない限り、その用語に関する特定の分野でのその語法に関して定義される。
組織幹細胞:組織幹細胞とは、体内に存在する多能性幹細胞のことをいい、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚表皮幹細胞、毛包幹細胞、角膜幹細胞、消化管上皮幹細胞、肝臓幹細胞、骨格筋幹細胞、及び間葉系幹細胞などが例として挙げられる。
多能性幹細胞:多能性幹細胞とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの1つへと分化し得る細胞をいう。多能性幹細胞の1つの例は、造血幹細胞であり、この細胞はリンパ球および赤血球のような種々の血液細胞型へと分化し得る。
未分化:未分化とは、1つの細胞、或いは複数の細胞からなる任意の細胞集団が、1つまたは複数の、さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有する状態である細胞、或いは該細胞を含む細胞集団である状態であることをいう。
Xは、主鎖の原子数が0〜10のアルキレン基を表す。原子数0のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する1つ以上のエチレンが、−C=C−基及び/又は−N=N−基及び/又は−CONH−基で置き換わっていてもよい。また、環Aと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を1つ以上有してもよい。
また、A環が、1つの窒素原子を環内に含む5または6員環である場合も同様に望ましい。この場合、5員環は不飽和であることが望ましく、6員環は飽和であることが望ましい。
より好ましくは、R1〜R13は、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(4-ブロモ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-ブロモ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(4-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-p-トリルアゾ-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-スルファモイル-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-スルファモイル-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(4-アセチルアミノ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-アセチルアミノ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(2-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-フェニルアゾ-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸エチルエステル
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-1-イル)-アセトアミド
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)- N-フェニル-アセトアミド
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(2,3,3-トリメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトニトリル
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)- N,N-ジメチル-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸
2-(2-アセチル-3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-アセチル-フェニルアゾ)- アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-m-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-o-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(4-メトキシ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(3-メトキシ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(4-ニトロ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(3-ニトロ-フェニル)-アセトアミド
4-[2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセチルアミノ]-安息香酸エチルエステル
3-[2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセチルアミノ]-安息香酸エチルエステル
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-フェニル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(2,4-ジメチル-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール塩酸塩
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルフォリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール塩酸塩
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イルエステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
7-[[ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)-アミノ]-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-[[ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)-アミノ]-メチル]-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
2-(6-ヒドロキシ-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-2-イルメチル)-イソチオウレア
酢酸 2-(N,N'-ジフェニル-カーバムイミドイルスルファニルメチル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-イル エステル
酢酸 6-アセトキシ-1-(4-アセトキシ-フェニル)-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
5-ブロモ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-イル エステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
7-ジエチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
2-(2-ジメチルアミノ-5-ヒドロキシ-ベンゾフラン-3-イル)-6-メトキシ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-メトキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-メトキシ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
5-ブロモ-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
1H-フロ[2,3-g]インドール-3-酢酸, 5-ヒドロキシ-1-(4-メトキシフェニル)-2,8-ジメチル-, エチルエステル
5-ブロモ-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸
5-ブロモ-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5-ブロモ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5-ブロモ-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-2-ブロモメチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
ピロロ[2,3-f][1,3]ベンゾキサジン-3-酢酸, 8-エチル-1,7,8,9-テトラヒドロ-2-メチル-1-(4-ニトロフェニル)-, エチルエステル
6-アセトキシ-2-メチル-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2,4-ジメトキシ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-エトキシカルボニル-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-シアノ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-ブロモ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-フルオロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-5,7-ビス-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5,7-ビス-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-5,7-ジニトロ-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-5,7-ジニトロ-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5,7-ジブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5-ブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5-ブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸
1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
Rで表される低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキシロキシ、へプチロキシ、オクチロキシなどが挙げられる。好ましくはメトキシである。
Rで表される低級アシル基として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられるが、好ましくはアセチルである。
Rで表される環状構造を形成してもよい低級アルキル基としてシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられるが、好ましくはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルである。
Rで表されるアミノカルボニルとしては、例えば、-CONR2(Rは同一でも異なってもよい水素原子、先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す)などが挙げられる。
Rで表されるアセトキシアルキルとしては、−(CH2)n−OAc(nは1〜8を表す)があげられるが、好ましくはnは1である。
本発明において記載されている化合物名は、IUPAC命名法、或いは市販のソフト(例えばChemDraw Ultra, CambridgeSoft社、米国)を用いて変換される名称を用いる。
式(9)で表される化合物は以下のスキームでも合成可能である。
MS(m/z)=217(M+1)
MS(m/z)=363(M+1)
MS(m/z)=363(M+1)
MS(m/z)=377(M+1)
MS(m/z)=405(M+1)
MS(m/z)=345(M+1)
MS(m/z)=364(M+1)
MS(m/z)=392(M+1)
MS(m/z)=377(M+1)
MS(m/z)=391(M+1)
MS(m/z)=439(M+1)
MS(m/z)=365(M+1)
(1)ヒト間葉系幹細胞の培養
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)(CAMBREX社製)に、添付のプロトコールに従ってMesenchymal Cell Growth Supplement(MCGS)、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン(以上、CAMBREX社製)を添加してヒト間葉系幹細胞培養培地を調製した。
前記(1)の「ヒト間葉系幹細胞の培養」に記載の方法に従って培養したヒト間葉系幹細胞を、CaおよびMgを含まないPBSを用いて洗浄後、トリプシン−EDTA溶液(コスモバイオ社製)を加え、37℃で5分間インキュベートし、5mlの間葉系幹細胞培地を添加し、ピペットを使用して細胞を分散させ、15mlの滅菌チューブに移し、卓上遠心機(トミー精工)で1000rpm、約5分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を5mlの新鮮な間葉系幹細胞培地を加えて細胞懸濁液を得た。
前記の(2)ヒト間葉系幹細胞の調製に記載の方法に従って調製したヒト間葉系幹細胞を6cm2細胞培養用ディッシュ(FALCON社製、米国)に、3×104〜1×105個の細胞を、5.5mlの培地に懸濁して播種した。ジメチルスルフォキシド(DMSO)、または水、或いはその混合物に溶解した以下に記載の本発明の組織幹細胞増殖剤を、ヒト間葉系幹細胞培地で0.4〜100μg/mlとなるように希釈したサンプルを、0.5mlずつヒト間葉系幹細胞培養皿に添加し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。DMSOの培地中への持ち込は最終濃度0.1%以下となるようにした。またコントロールには、DMSOのみを最終濃度で0.1%となるように加えた。7日〜14日間培養後の間葉系幹細胞を、前記(2)の「ヒト間葉系幹細胞の調製」に記載の方法に従って回収し、血球計算盤を用いて細胞数を計測したところ、本発明の組織幹細胞増殖剤を添加して培養した間葉系幹細胞は、該増殖剤を含まない培地で培養した細胞に比べ有意に増殖していた(図1)。
A: 2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
B: 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
C: 2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
D: 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
E: 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
F: 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-トリルアゾ-フェニルアゾ)-アセトアミド
G: 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
H: 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
a: 2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
b: 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
c: 2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
d: 2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
e: 1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
f: 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
g: 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
h: 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルホリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
i: 7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
j: 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
k: 7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
l: 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
m: 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
n: 酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イル エステル
o: 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
p: 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
q: 7-ジメチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
r: 酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
s: 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
t: 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
u: 酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
v: 1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
w: 酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
x: 5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
前記(3)の「ヒト間葉系幹細胞増殖アッセイ」に記載の方法に従って培養して得られるヒト間葉系幹細胞のヒト間葉系幹細胞マーカー蛋白の発現を確認した。即ち、ヒト間葉系幹細胞を培養したディッシュを、PBSを用いて洗浄後、0.05%トリプシン−EDTA溶液(コスモバイオ社製)を加え、37℃で5分間インキュベートした。5mlの間葉系幹細胞培地を添加し、ピペットを使用して細胞を分散させ、15mlの滅菌チューブに移し、卓上遠心機(トミー精工)で1000rpm、約5分間遠心してペレット化した。2%FBSを含むHanks balanced salt solution(HBSS、Invitrogen社製)で洗浄後、細胞数が1〜6×105個になるように2%FBSを含むHBSSを添加した。ヒト間葉系幹細胞表面抗原、CD105、CD29、CD44、CD14、及びCD34に対する抗体、即ち、抗CD105-PE抗体(Ancell Corporation)、抗CD-29-PE抗体(Coulter Corporation)、抗CD-44-FITC抗体(IMMUNOTECH)、抗CD-14-PE抗体(Coulter Corporation)、及び抗CD-34-PE抗体(Coulter Corporation)を添付のプロトコールに従ってHBSSでそれぞれ希釈して加え、30〜50分間氷上で静置した。HBSS(1ml)で二回洗浄後、HBSS (1ml)に再分散し、フローサイトメーター測定に用いるサンプルを得た。またフローサイトメーター測定に用いるサンプルは、凝集塊を除く目的で孔径100μmのナイロン・メッシュに通した後に測定を行った。フローサイトメーターはFACSCalibur(BECTON DICKINSON社製、米国)を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアはCELLQuest(BECTON DICKINSON社製、米国)を用いる。本発明の組織幹細胞増殖剤を添加して培養したヒト間葉系幹細胞は、CD105、CD29及びCD44陽性であり、かつCD14、及びCD34陰性であることから、ヒト間葉系幹細胞が有する性質を有していることが確認できた(図2)。即ち、本発明の組織幹細胞増殖剤は、ヒト間葉系幹細胞を増殖可能であることが確認できた。
上記の通り、本発明の組織幹細胞増殖剤は、組織幹細胞を未分化状態で増殖させることができ、再生医療分野等で好適に利用できる。
Claims (5)
- 間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項1に記載の間葉系幹細胞増殖剤。
- 請求項1又は2に記載の間葉系幹細胞増殖剤を用いて間葉系幹細胞を増殖させることを特徴とする間葉系幹細胞培養方法。
- 請求項1又は2に記載の間葉系幹細胞増殖剤を有効成分として含有する培地。
- 間葉系幹細胞増殖剤の濃度が10ng/ml〜100μg/mlであることを特徴とする請求項4に記載の培地。
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