KR20060056901A - 세포 분화 억제제, 이것을 이용하는 세포 배양 방법, 배양 배지 및 배양된 세포주 - Google Patents

세포 분화 억제제, 이것을 이용하는 세포 배양 방법, 배양 배지 및 배양된 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 줄기세포 또는 배아 줄기세포를, 피더 세포를 이용하지 않고 미분화인 상태로 배양시킬 수 있는 분화 억제제, 그것을 이용한 배양 방법, 그것을 이용한 배양액 및 이 분화 억제제를 이용해서 배양하여 제작된 세포를 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 저분자 화합물, 특히 테트라히드로이소퀴놀린 유도체를 유효 성분으로 하는 줄기세포 분화 억제제, 테트라히드로이소퀴놀린 유도체를 이용해서 줄기세포를 배양함으로써 피더 세포 비존재하에서 대량이면서도 안전하게 미분화로 줄기세포를 배양하는 방법, 테트라히드로이소퀴놀린 유도체를 포함하는 줄기세포의 배양액, 테트라히드로이소퀴놀린 유도체를 분화 억제제로서 이용해서 배양, 제작된 세포가 제공된다.
줄기세포, 배아 줄기세포, 피더 세포, 분화 억제제, 배양액, 배양 방법, 테트라히드로이소퀴놀린 유도체, 저분자 화합물

Description

세포 분화 억제제, 이것을 이용하는 세포 배양 방법, 배양액 및 배양된 세포주{CELL DIFFERENTIATION INHIBITOR, CELL CULTURE METHOD USING THE SAME, LIQUID CULTURE MEDIUM AND CULTURED CELL LINE}
본 발명은 저분자 화합물, 특히 테트라히드로이소퀴놀린 유도체를 유효 성분으로 하는 줄기세포 분화 억제제, 그것을 이용하는 줄기세포 배양 방법, 배양액 및 그것을 이용해서 제작된 줄기세포주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 줄기세포의 미분화 유지 작용을 가지는 신규의 2환 화합물에도 관한 것이다.
외상이나 병, 또 가령 등에 의해 상해를 받은 장기·조직은 재생을 촉진하여 그 기능을 회복시킬 필요가 있다. 특히 심장·간장·신장·췌장 등의 실질 장기는 생명 유지에 필수이기 때문에 그 기능 저하·폐절은 사망과 직결되므로 장기 이식에 의해 구명을 꾀하는 이식 의료가 활발히 행해지고 있다. 그러나, 항상적인 도너 부족 때문에 그 해결을 위해서는 새로운 어프로치가 필요시 되고 있다.
최근 들어 배아, 또는 성체에 존재하고, 무제한으로 분열하며, 하나 또는 복수의 방향으로 분화하는 능력을 가진다고 생각되는 줄기세포를 이용해서 조직·기관의 제작을 하여 결손 조직의 보충을 하는 재생 의료가 종래의 장기 이식의 결점을 능가하는 치료법으로서 주목받고 있다.
구체적으로는 줄기세포를 증식시킨 후, 분화시켜 세포이식에 이용하거나 인공 지지 조직의 이용과 아울러 인공적인 조직 구축을 하여 그것을 생체 내 이식하거나 인공 장기로서 이용하는 것 등이 생각되고 있다. 줄기세포를 세포 이식 치료나 조직 공학에 이용할 수 있으면, 도너에 있어서의 이식편 적출 후의 조직 결손이나 도너 부족 등, 종래의 자가이식을 포함한 이식 치료가 안고 있는 문제점을 해결할 수 있다고 기대된다.
줄기세포는 혈관, 신경, 혈액, 연골, 뼈, 간장, 췌장 등 수많은 분야에서 동정되어 있는데, 그 중에서도 특히 모든 세포형으로 분화하는 능력을 가지는 전능성 줄기세포는 전술한 재생 의료 분야 외에, 창약, 및 유전자 치료에 이용하기 위한 세포 및 조직을 용이하게 제공할 수 있는 세포로서 특히 주목받고 있다.
전능성 줄기세포의 일례로서 배아 줄기(Embryonic Stem, 이하 ES)세포나, 배아 생식(Embryonic Germ, 이하 EG) 세포가 알려져 있다. ES세포는 마우스의 배반포기의 내부 세포괴(Inner Cell Mass, ICM)로부터 분리된 세포주이다[Evan 등, Nature, 292, p154, 1981년]. 개체를 구성하는 세포는 배반포기의 내부 세포괴(Inner Cell Mass, 이하 ICM) 또는 원장배상층(epiblast, 이하 에피블라스트)로부터 파생한 일차 외배엽에 유래하고 있고, ICM 및 에피블라스트는 전능성을 가진 줄기세포군이라고 할 수 있다. ES세포는 각종 개체 형성 조직으로의 분화능을 유지하고, 정상적인 배아와 키메라 배아를 형성시킴으로써, 성체의 모든 성숙 세포로의 분화하는 능력을 보유하고 잇다. 시험관 내의 분화 유도 조건에 의해서도, 혈액 세포, 심근 세포, 혈관내피세포, 신경세포, 색소세포, 췌내 분비 세포 등 여러 가 지 세포를 생성시키는 능력을 가지고 있다[중야 철, 최신 의학 별책-재생 의학, p81-89, 2000].
EG세포는 시원 생식세포를 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)와 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor) 존재하에서 배양함으로써 수립된 세포이며[Matsui 등, Cell, 70, p841, 1992년, Resnic 등, Nature, 359, p550, 1992년], ES세포와 마찬가지로 각종 조직으로의 분화능을 가지고 있다.
최근 들어 마우스 이외에도 ES세포주의 수립이 보고되고, 마우스 ES세포와 같은 다분화능을 가지고 있는 것이 개시되어 있다[소 ES세포:Schellander 등, Theriogenology,, 31, p15-17, 1989년, 돼지 ES세포:Strojek 등, Theriogenology, 33:p901, 1990년, 양 ES세포:Handyside, Poux's Arch. Dev. Biol., 196:p185, 1987년, 햄스터 ES세포:Doetschman 등, Dev. Biol., 127, p224, 1988년, 벵골원숭이 ES세포:Thomson 등, Proc. Nakl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995년, 비단원숭이 ES세포:Thomon 등, Biology of Production, 55, p254, 1996년, 인간 ES세포:Thomon 등, Science, 282, p1145, 1988년, Reubinoff 등, Nature Biotech, 18, p399, 2000년, 카이쿠니자루 ES세포:Suemori 등, Dev. Dyn. 222, p273, 2001년].
ES세포의 미분화를 유지하기 위해는 통상 태아 유래의 섬유아세포를 피더 세포로서 이용해서 공배양하는 것이 필요하다. 영장류의 ES세포주의 미분화 유지에 있어서도 같은 방법이 이용되고 있다[Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995년, Thomson 등, Science, 282, p1145, 1998년, Reubinoff 등, Nature Biotech, 18, pP399, 2000년].
그러나, 마우스 초대 섬유아세포의 조제는 번잡하다. 즉, 임신 마우스로부터 13.5 내지 15.5일의 배아를 꺼내고, 효소 처리에 의해 배아체를 분해하여 접시 위에 얻어진 섬유아세포를 회수한다. 초대 세포이기 때문에, 품질관리가 복잡하고, GMP 적응 레벨의 관리가 곤란하고, ES세포의 미분화 유지능도 이용하는 배아체에 따라 다를 가능성을 생각할 수 있다. 이 번잡한 조제 작업을 경유하지 않는 ES세포 배양 방법으로서 마우스 배아 섬유아세포의 세포주인 STO세포(ATCC 56-X)를 이용하는 방법이 있다. 그러나, STO세포의 ES세포 미분화 유지능은 변화하기 쉬워, ES세포의 안정적인 배양에는 마우스 초대 섬유아세포 쪽이 우수하다.
또, 최근 들어 이종 동물 사이에서의 내재성 바이러스의 감염예가 보고되어 있다[van der Laan 등, Nature, 407, p90, 2000년]. 의료용도로의 인간 ES세포의 이용을 목적으로 한 배양 방법에 있어서는 이종 동물 세포간에서의 접촉을 할 수 있는 한 회피한 배양 방법의 개발이 요망되고 있다. 따라서, 마우스 유래 세포를 이용하는 상기의 ES세포 미분화 유지 배양 방법은 의료용도를 목적으로 한 ES세포의 배양에는 적합하지 않다.
마우스 유래 피더 세포를 이용하지 않는 영장류 ES세포의 배양 방법으로서 마우스 초대 섬유아세포의 분비 성분을 배양 배지 안에 가하는 방법이 보고되어 있다(예를 들면 일본 특허공개 2001-17163호 공보를 참조). 그러나, 이 경우에 있어서도 배양 중인 ES세포가 마우스 세포로부터 분비되는 미 동정의 인자에 노출되기 때문에, 이러한 환경에서 배양된 ES세포는 의료용도로의 사용에는 적합하지 않은데다가 내재성 바이러스 감염의 위험성도 남아 있다. 따라서, 마우스 초대 섬유아세 포와의 공배양에 의한 결점이 전혀 해소되지 않는다.
마우스 유래 피더 세포 및 마우스 피더 세포 유래 분비 성분을 이용하지 않는 마우스 ES세포의 미분화 유지 배양 방법으로서, 젤라틴을 코팅한 배양접시를 이용하는 배양 방법이 이미 알려져 있는데, 이 경우에는 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)의 배지에의 첨가가 필수이다(예를 들면, 문헌 [Smith 등, Dev. Biol., 121, p1, 1987년] 참조). LIF는 사이토카인이기 때문에 고비용, 보존성 등의 문제가 있어 대량 배양에는 적합하지 않다. 부가해서, LIF의 효과는 극히 특정의 마우스 계통(129/sv계나 C57BL/6계) 유래의 ES세포에 한정적이며, 타종 동물에 있어서 현저한 효과는 볼 수 없다. 특히 영장류의 ES세포에 있어서는 배지 중으로의 LIF의 첨가만으로는 미분화 상태를 유지할 수 없음이 밝혀졌다(예를 들면, 문헌 [Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995년; 및 Thomson 등, Science, 282, p1145, 1998년] 참조).
또, LIF에 의한 배아 줄기세포의 미분화 유지 작용을 증폭시키는 저분자 화합물로서 PD98059(Cell Signaling Technology사제)가 보고되어 있는데, PD98059의 작용은 LIF 의존적이고, 단독으로는 효과가 인지되지 않기 때문에[Burdon 등, Dev. Biol., 210, p30, 1999년] 전술의 문제점을 해결할 수 없다.
따라서, 전능성 줄기세포를 저비용으로 안전하면서도 대량으로 배양하는 것을 가능하게 하는 분화 억제제는 지금까지 없었고, 또한, 전능성 줄기세포를 저비용으로 안전하면서도 대량으로 배양하는 방법도 알려져 있지 않다. 본 발명의 분화 억제제는 저분자 화합물을 유효 성분으로서 함유하지만, 저분자 화합물이 전능 성 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 것은 지금까지 알려져 있지 않다. 따라서, 본 명세서에 기재된 화학식 (1) 내지 (10)으로 나타내어지는 저분자 화합물이 가지는 전능성 줄기세포의 미분화 유지 작용은 전혀 알려져 있지 않다.
<발명의 개시>
본 발명의 과제는 줄기세포 또는 배아 줄기세포를, 피더 세포 또는 피더 세포 유래 성분을 이용하지 않고, 미분화 상태로 배양시킬 수 있는 분화 억제제를 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 과제는 이러한 분화 억제제를 이용해서 피더 세포 또는 피더 세포 유래 성분을 이용하지 않고 줄기세포 또는 배아 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법을 제공하는 것, 이러한 분화 억제제를 포함하는 세포 배양액을 제공하는 것, 및 이러한 분화 억제제를 이용해서 배양하여 제작된 세포주를 제공하는 것에 있다. 본 발명의 또 다른 과제는 줄기세포 또는 배아 줄기세포를, 피더 세포 또는 피더 세포 유래 성분을 이용하지 않고, 미분화 상태로 배양시킬 수 있는 신규의 2환 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 달성하기 위해 이루어진 것으로, 줄기세포 및 배아 줄기세포를 미분화인 상태로 배양시킬 수 있는 분화 억제제, 그것을 이용한 줄기세포 및 배아 줄기세포의 배양 방법, 이러한 분화 억제제를 포함하는 세포 배양액, 및 이러한 분화 억제제를 이용해서 배양하여 제작된 세포주에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 이하와 같은 구성을 포함한다.
(1) 저분자 화합물 또는 그의 염을 유효 성분으로 하는 줄기세포 분화 억제제.
(2) 저분자 화합물이 화학식 (1)로 나타내어지는 화합물인, 상기 (1)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
Figure 112005076299484-PCT00001
식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타내고, A환은 1개 이상의 헤테로원자를 환 내에 포함하는 5 내지 8원환을 나타내고, X는 주쇄의 원자수가 0 내지 10인 알킬렌기를 나타내고, 원자수 0의 알킬렌기는 단일결합을 나타내고, 해당 알킬렌기를 구성하는 1개 이상의 에틸렌이 -C=C-기 및(또는) -N=N-기 및(또는) -CONH-기로 치환되어 있을 수 있고, 또한, 환 A와 결합하는 결합이 이중 결합이 되는 기일 수 있고, 또한 해당 알킬렌기는 치환기로서 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 1개 이상 가질 수 있고, G는 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 가질 수 있는 방향족기를 나타내고, 해당 A환은 -XG기 이외의 치환기로서 전자 흡인기 및(또는) 전자 공여기를 1개 이상 가질 수 있다.
(3) A환이나 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 헤테로원자를 환 내에 포함하는 5 또는 6원환인, 상기 (2)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(4) A환이 1개의 질소 원자를 환 내에 포함하는 5 또는 6원환인, 상기 (2)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(5) X로 나타내어지는 알킬렌기가 치환기로서 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 니트릴기 및 할로겐 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 및(또는) 원자를 1개 이상 가지고 있는, 상기 (2) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(6) 저분자 화합물이 화학식 (2)로 나타내어지는 화합물인, 상기 (2)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
Figure 112005076299484-PCT00002
식 중, R1, R2, R3, R4, X 및 G는 상기 (2)에서 정의한 바와 동일하고, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
(7) 저분자 화합물이 화학식 (3)으로 나타내어지는 화합물인, 상기 (2)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
Figure 112005076299484-PCT00003
식 중, R1, R2, R3, R4, X 및 G는 상기 (2)에서 정의한 바와 동일하고, R5 및 R6은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
(8) 저분자 화합물이 화학식 (4)로 나타내어지는 화합물인, 상기 (6)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
Figure 112005076299484-PCT00004
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 상기 (6)에서 정의한 바와 동일하고, R10, R11, R12, 및 R13은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타내고, 이중 편측 파선은 단일결합 또는 이중 결합을 나타내고, 이중 편측 파선이 이중 결합을 나타내는 경우, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
(9) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, 및 R13이 각각 독립적으로 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 할로겐 원자 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인, 상기 (8)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(10) 저분자 화합물이 화학식 (5)로 나타내어지는 화합물인, 상기 (6)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
Figure 112005076299484-PCT00005
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 상기 (6)에서 정의한 바와 동일하고, R10, R11, R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
(11) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12가 각각 독립적으로 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 할로겐 원자 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인, 상기 (10)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(12) 저분자 화합물이 화학식 (6)으로 나타내어지는 화합물인, 상기 (7)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
Figure 112005076299484-PCT00006
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 상기 (7)에서 정의한 바와 동일하고, R7, R8, 및 R9는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
(13) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9가 각각 독립적으로 알킬기, 알콕시기, 히드록실기, 니트로기, 니트릴기, 아세톡시기, 아세톡시알킬기, 산소원자를 포함할 수 있는 환상 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 디알킬아미노비닐기, 히드록시알킬아미노알킬기, 아릴아미노비닐기, 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인, 상기 (12)에 기재된 분화 억제제.
(14) R1, R2, R3, R4, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R11이 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 또는 저급 알콕시기이며, R12가 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 아미노카르보닐기, 또는 저급 알콕시카르보닐기인, 상기 (8)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(15) R1, R2, R3, R4, R8, 및 R9가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R10이 수소 원자 또는 저급 알킬기이며, R11이 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알콕시기, 또는 저급 알콕시카르보닐기이며, R12가 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기인, 상기 (10)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(16) R1 및 R2가 수소 원자이며, R3이 히드록실기 또는 아세톡시기이며, R4가 아세톡시알킬기, 산소 원자를 포함할 수 있는 환상 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 히드록시알킬아미노알킬기, 또는 수소 원자이며, R5가 저급 알킬기, 또는 아릴아미노비닐기이며, R6이 니트로기이며, R7, R8, 및 R9가 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 또는 수소 원자인, 상기 (12)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(17) 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
Figure 112005076299484-PCT00007
식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11, 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 2급 아미노카르보닐기 또는 3급 아미노카르보닐기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
(18) 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
<화학식 9>
Figure 112005076299484-PCT00008
식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10 및 R12는 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R11은 저급 아실기이며, R13은 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
(19) 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
<화학식 9>
Figure 112005076299484-PCT00009
식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13은 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기 또는 아미노카르보닐기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
(20) 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
<화학식 9>
Figure 112005076299484-PCT00010
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11, 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13은 니트릴기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
(21) 화학식 (10)으로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
Figure 112005076299484-PCT00011
식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11, 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13은 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 또는 니트릴기를 나타낸다.
(22) R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10은 수소 원자이며, R11 및 R12가 동일하거나 상이할 수 있는 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 또는 페닐아미노카르보닐기인, 상기 (17) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(23) R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11이 저급 아실기이며, R12가 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 또는 페닐아미노카르보닐기인, 상기 (18) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(24) R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐 기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 또는 페닐아미노카르보닐기인, 상기 (19) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(25) R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 니트릴기인, 상기 (20) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(26) R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 페닐아미노카르보닐기, 또는 니트릴기인, 상기 (21) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(27) (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산 에틸에스테르, (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로 -2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-메틸-아세트아미드, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N,N-디메틸-아세트아미드, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-페닐-아세트아미드인, 상기 (17) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(28) 2-(3-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드인, 상기 (18) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(29) 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(2,3,3-트리메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드, 2-(2-아세틸-3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-아세틸-페닐아조)-아세트아미드인, 상기 (19) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(30) (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세토니트릴인 상기 (20) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(31) 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-1-일)-아세트아미드인 상기 (21) 기재의 화합물 또는 그의 염.
(32) 상기 (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 염을 유효 성분으로 하는 줄기세포 분화 억제제.
(33) 저분자 화합물이 알칼리포스파타아제의 활성을 유지 또는 상승시키는 작용을 가지는 화합물인, 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(34) 저분자 화합물이 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3: 전사 3의 신호 전달자 및 활성자)을 활성화하지 않는 화합물인, 상기 (1) 내지 (16), (32) 및 (33) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(35) 저분자 화합물이 SSEA-1 항원 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 화합물인, 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (34) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(36) 저분자 화합물이 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 화합물인, 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (35) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(37) 저분자 화합물이 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 2환 화합물인, 상기 (36)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(38) 저분자 화합물이 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 아조기를 함유하는 2환 화합물인, 상기 (37)에 기재된 줄기세포 분화 억제제.
(39) 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제를 이용해서 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양 방법.
(40) 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제를 이용해서 배아 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포 배양 방법.
(41) 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 줄기세포 분화 억제제를 유효 성분으로서 함유하는 배지.
(42) 상기 (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하는 배지.
(43) 분화 억제제인 화합물 또는 그의 염의 농도가 10ng/㎖ 내지 100㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 상기 (41) 또는 (42)에 기재된 배지.
(44) 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 분화 억제제를 이용해서 미분화 상태로 배양된 줄기세포.
(45) 상기 (1) 내지 (16) 및 (32) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 분화 억제제를 이용해서 미분화 상태로 배양된 줄기세포를 분화시켜 수득된 세포 또는 조직.
(46) 세포 또는 조직이 생체 내에 이식하기 위한 것인, 상기 (44) 또는 (45)에 기재된 세포 또는 조직.
(47) 상기 (44) 내지 (46) 중 어느 하나에 기재된 세포 및(또는) 조직을 생체 내에 이식하는 치료 방법.
(48) 상기 (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 염의 프로드러그.
(49) 상기 (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 염 또는 그 프로드러그를 함유하는 의약 조성물.
도 1은 본 발명의 화합물 A의 구조를 나타낸다. 화합물 A는 도 1중의 화학 식 (5)의 R1 내지 R12가 하기 표에 나타내는 기 또는 원소로 나타내어지는 화합물이다.
도 2는 본 발명의 화합물 B 내지 F의 구조를 나타낸다. 화합물 B 내지 F는 도 2 중의 화학식 (4)의 R1 내지 R13이 하기 표에 나타내는 기 또는 원소로 나타내어지는 화합물이다.
도 3은 알칼리포스파타아제 정량 1의 결과를 나타낸다.
도 4는 알칼리포스파타아제 염색 1의 결과를 나타낸다.
도 5는 STAT3 활성화 어세이 1의 결과를 나타낸다.
도 6은 Oct-3/4 유전자 발현량을 나타낸다.
도 7은 nanog 유전자 발현량을 나타낸다.
도 8은 SSEA-1 항원의 발현량 평가 1에 있어서의 평균 형광 강도의 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 화합물 a 내지 o의 구조를 나타낸다. 화합물 a 내지 o는 도 9중의 화학식 (6)의 R1 내지 R9가 하기 표에 나타내는 기 또는 원소로 나타내어진다.
도 10은 본 발명의 분화 억제제를 이용했을 경우의 알칼리포스파타아제 정량 2의 결과를 나타낸다.
도 11은 SSEA-1 항원의 발현량 평가 2에 있어서의 평균 형광 강도의 결과를 나타낸다.
도 12는 STAT3 활성화 어세이 2의 결과를 나타낸다.
도 13은 ES세포 계대 배양의 결과 1을 나타낸다.
도 14는 ES세포 계대 배양의 결과 2를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 분화 억제제의 배아 줄기세포 미분화 유지 효과를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 분화 억제제의 배아 줄기세포 미분화 유지 효과(염색도)를 나타낸다.
도 17은 본 발명의 화합물 ①의 구조를 나타낸다. 화합물 ①은 도 17중의 화학식 (10)의 R1 내지 R13이 하기 표에 나타내는 기 또는 원소로 나타내어진다.
도 18은 본 발명의 화합물 ② 내지 ⑩의 구조를 나타낸다. 화합물 ② 내지 ⑩는 도 18중의 화학식 (9)의 R1 내지 R13이 하기 표에 나타내는 기 또는 원소로 나타내어진다.
도 19는 알칼리포스파타아제 염색의 염색도를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
이하의 용어는 별도로 기술하지 않는 이상 이하에 제공되는 바와 같이 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 다른 모든 용어는 별도로 기술하지 않는 이상 그 용어에 관한 특정 분야에서의 그 어법에 관해서 정의된다.
줄기세포: 줄기세포란, 특이화된 기능을 가지는 다른 세포형, 즉, 최종적으로 분화한 세포, 또는 보다 좁은 범위의 세포형으로 분화 가능한 다른 줄기세포형으로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다.
전능성 줄기세포: 전능성 줄기세포란, 다능성의 세포 및 완전하게 분화한 세포(즉, 여러 가지 세포로, 이제는 분화할 수 없는 세포)를 포함하는 임의의 세포형으로 분화할 수 있는 세포를 말한다.
다능성 줄기세포: 다능성 줄기세포란, 반드시 모든 형으로 되지는 않지만, 다른 다수의 세포형 중 하나로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 다능성 세포의 한 예는 조혈 줄기세포이며, 이 세포는 임파구 및 적혈구와 같은 여러 가지 혈액 세포형으로 분화할 수 있다.
배아 줄기세포: 배아 줄기세포란, 줄기세포 중에서도 특히 전착상 단계의 배아의, 상실배 또는 배반포 단계로부터 얻어진 전능성의 세포를 말하고, ES세포라고도 부른다. 또한, 배아 줄기세포에는 정자 또는 난자가 된다고 정해져 있는, 배아 또는 태아(태자)의 시원 생식세포에 유래하는 다능성의 줄기세포를 말하는 경우도 있다. 단, 이 세포는 배아 생식(Embryonic Germ, EG) 세포라고 불려 배아 줄기세포와 구별되는 경우도 있다. 본 명세서 중에서 이용하는 배아 줄기세포는 어떠한 동물종의 것이라도 괜찮고, 예를 들면 인간을 포함한 영장류, 영장류 이외의 포유류, 조류 등의 배아 줄기세포를 들 수 있다.
전능성: 전능성이란, 다능성의 세포 및 완전하게 분화한 세포(즉, 여러 가지 세포로, 이제는 분화할 수 없는 세포)를 포함하는 임의의 세포형으로 분화할 수 있는 상태를 말한다.
다능성: 다능성이란, 반드시 모든 형으로 되지는 않지만, 다른 다수의 세포형 중 하나로 분화할 수 있는 상태를 말한다.
미분화: 미분화란, 하나의 세포, 또는 복수의 세포를 포함하는 임의의 세포 집단이 하나 또는 복수의, 더욱 분화가 진행된 상태의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 상태인 세포, 또는 해당 세포를 포함하는 세포집단인 상태인 것을 말한다.
피더: 본 발명을 기재하는 목적을 위해서 이용되는 피더란, 전능성 줄기세포가 그 위에 플레이팅되고, 플레이팅된 전능성 줄기세포의 증식에 도움이 되는 환경을 제공하는 것을 말한다.
피더 세포: 본 발명을 기재하는 목적을 위해서 이용되는 피더 세포란, 전능성 줄기세포가 그 위에 플레이팅되는 비전능성 줄기세포를 말하고, 비전능성 줄기세포는 플레이팅된 전능성 줄기세포의 증식에 도움이 되는 환경을 제공한다.
세포 유래 성분: 세포로부터 분비되는 성분, 내용물, 및 세포막 성분 등, 세포에 유래하는 모든 성분을 말한다.
본 발명은 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포를 미분화 상태로, 증식 및 유지시킬 수 있는 분화 억제제, 그것을 이용한 배양 방법, 그것을 이용한 배양액, 그것을 이용해서 배양하여 제작된 세포주를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 분화 억제제, 배양 방법 및 배양액은 종래보다 간편하게, 안전하게, 미분화의 배아 줄기세포를 증식해서 유지한다. 본 발명의 분화 억제제를 포함한 세포 배양 방법은 또 특정의 분화 유도 인자, 및 분화 유도 인자의 유용한 조합에 대해서 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 분화 억제제, 및 배양 방법을 사용해서 미분화인 배아 줄기세포를 증식시키는 능력은 중요한 치료 적용을 가지는 단일 또는 복수의 유전적 개변을 가지는 배아 줄기세포계를 산생하는 능력을 포함하는 중요한 이익을 제공한다.
본 발명의 분화 억제제는 화학적으로 안정된 저분자 화합물로, 줄기세포를 미분화인 상태로 유지하는 활성을 가지는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있지만, 바람직하게는 하기 화학식 (1)로 나타내어지는 저분자 화합물을 들 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112005076299484-PCT00012
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다. 전자 공여기란, 벤젠환에 전자를 공여할 수 있는 치환기, 전자 흡인기란, 벤젠환 위의 π전자를 흡인하는 성질을 가지는 치환기를 말한다. 또한, 하메트(Hammett)의 치환기 정수 σ를 이용해서 σ＜0을 전자 공여기, σ＞0을 전자 흡인기라고 정의할 수도 있다[기초 유기 반응론, 교목 정신 등 저, 산쿄 출판, 1997].
A환은 1개 이상의 헤테로원자를 환 내에 포함하는 5 내지 8원환을 나타낸다.
X는 주쇄의 원자수가 0 내지 10인 알킬렌기를 나타낸다. 원자수 0의 알킬렌기는 단일결합을 나타낸다. 해당 알킬렌기를 구성하는 1개 이상의 에틸렌이 -C=C-기 및(또는) -N=N-기 및(또는) -CONH-기로 치환되어 있을 수 있다. 또한, 환 A와 결합하는 결합이 이중 결합이 되는 기일 수 있다. 또한 해당 알킬렌기는 치환기로서 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 1개 이상 가질 수 있다.
G는 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 가질 수 있는 방향족기를 나타낸다. 해당 A환은 -XG기 이외의 치환기로서 전자 흡인기 및(또는) 전자 공여기를 1개 이상 가질 수 있다.
이 중, A환이 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 헤테로원자를 환 내에 포함하는 5 또는 6원환인 것이 바람직하다.
또, A환이 1개의 질소 원자를 환 내에 포함하는 5 또는 6원환인 경우도 마찬가지로 바람직하다. 이 경우, 5원환은 불포화인 것이 바람직하고, 6원환은 포화인 것이 바람직하다.
또한 X로 나타내어지는 알킬렌기는 치환기로서 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 니트릴기 및 할로겐 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 및(또는) 원자를 1개 이상 가지고 있는 경우가 바람직하다.
화학식 (1)의 예로서는 화학식 (2)로 나타내어지는 것 같은 테트라히드로이소퀴놀린 유도체 및 화학식 (3)으로 나타내어지는 것 같은 인돌 유도체를 들 수 있다.
<화학식 2>
Figure 112005076299484-PCT00013
식 중, R1, R2, R3, R4, X 및 G는 상기와 동의이다. R5, R6, R7, R8, 및 R9는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
<화학식 3>
Figure 112005076299484-PCT00014
식 중, R1, R2, R3, R4, X 및 G는 상기와 동의이다. R5 및 R6은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
화학식 (2)로 나타내어지는 테트라히드로이소퀴놀린 유도체의 구체적인 예로서는 화학식 (4) 또는 화학식 (5)로 나타내어지는 구조의 화합물 및 염을 들 수 있다.
<화학식 4>
Figure 112005076299484-PCT00015
<화학식 5>
Figure 112005076299484-PCT00016
식 중, R1 내지 R13은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
보다 바람직하게는 R1 내지 R13은 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 할로겐 원자 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자를 들 수 있다.
또, 화학식 (4)의 경우, 더욱 바람직하게는 R1 내지 R4, R8, R9 및 R10은 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R11이 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 또는 저급 알콕시기이며, R12가 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 아미노카르보닐기, 또는 저급 알콕시카르보닐기를 들 수 있다.
R로 나타내어지는 저급 알킬기로서는 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 1-메틸프로필, n-헥실, 이소헥실, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸프로필, 2-에틸부틸 등을 들 수 있다. 바람직하게는 메틸이다.
R로 나타내어지는 저급 알콕시기로서는 예를 들면 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 헥실옥시, 헵틸옥시, 옥틸옥시 등을 들 수 있다. 바람직하게는 메톡시이다.
R로 나타내어지는 할로겐 원자로서는 불소, 염소, 브롬, 요오드 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 염소 또는 브롬이다.
R로 나타내어지는 저급 아실기로서 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 아세틸이다.
R로 나타내어지는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기로서 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸이다.
R로 나타내어지는 저급 알콕시카르보닐로서 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 메톡시카르보닐 또는 에톡시카르보닐이다.
R로 나타내어지는 아미노카르보닐로서는 예를 들면 -CONR2(R은 동일하거나 상이할 수 있는 수소 원자, 앞서 예시한 저급 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 페닐기를 나타냄) 등을 들 수 있다.
R로 나타내어지는 2급 아미노카르보닐기로서는 예를 들면 -CONHR(앞서 예시한 저급 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 페닐기를 나타냄) 등을 들 수 있다. 또한, 3급 아미노카르보닐기로서는 예를 들면 -CONR2(R은 동일하거나 상이할 수 있는 앞서 예시한 저급 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 페닐기를 나타냄) 등을 들 수 있다.
R로 나타내어지는 아미노알킬기로서는 예를 들면 -(CH2)n-NR2(n은 1 내지 8을 나타내지만, 바람직하게는 1이고, 또 R은 동일하거나 상이할 수 있는 수소 원자, 저급 알킬기, 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기(환상 구조중에는 질소나 산소 등의 헤테로원자를 1개 내지 3개 포함할 수 있음), 치환기를 가질 수 있는 페닐기를 나타냄) 등을 들 수 있다.
R로 나타내어지는 아세톡시알킬로서는 -(CH2)n-OAc(n은 1 내지 8을 나타냄)를 들 수 있지만, 바람직하게는 n은 1이다.
또, 화학식 (4)에 있어서의 이중 편측 파선은 단일결합 또는 이중 결합을 나타낸다. 또한 화학식 (4)로 나타내어지는 화합물에 있어서, 이중 편측 파선이 이중 결합을 나타내는 경우, 파선부(2개소)에 관해서 기하 이성질체가 존재한다. 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있고, 본 발명의 화합물은 이들 기하 이성에 근거하는 순수한 형태의 기하 이성질체의 임의의 혼합물일 수 있다.
화학식 (5)의 경우, 더욱 바람직하게는 R1 내지 R4, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10은 수소 원자 또는 저급 알킬기이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R11이 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알콕시기, 또는 저급 알콕시카르보닐기이며, R12가 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기를 들 수 있다.
화학식 (4)의 구체적인 예로서 화학식 (4) 중, 이중 편측 파선이 이중 결합이며, R13이 아미노카르보닐기인, 화학식 (7)로 나타내어지는 화합물을 들 수 있다.
<화학식 7>
Figure 112005076299484-PCT00017
또, 테트라히드로이소퀴놀린 유도체인 상기 화학식 (4)에 포함되는 더욱 구체적인 화합물에는 다음과 같은 것을 예시할 수 있다.
2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(3-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(4-브로모-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(3-브로모-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(4-클로로-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(3-클로로-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-m-톨릴아조-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-p-톨릴아조-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-메톡시-페닐아조)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(3-메톡시-페닐아조)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-니트로-페닐아조)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(3-니트로-페닐아조)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-술파모일-페닐아조)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(3-술파모일-페닐아조)-아세트아미드
2-(4-아세틸아미노-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(3-아세틸아미노-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(2-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-페닐아조-아세트아미드
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산 에틸에스테르
2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-1-일)-아세트아미드
2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-메틸-아세트아미드
2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-페닐-아세트아미드
2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(2,3,3-트리메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세토니트릴
2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N,N-디메틸-아세트아미드
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산
2-(2-아세틸-3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-아세틸-페닐아조)-아세트아미드
또, 화학식 (5)의 구체적인 예로서 이하에 나타내는 화학식 (8)로 나타내어지는 화합물을 들 수 있다.
Figure 112005076299484-PCT00018
식 중, R1 내지 R4, R6 내지 R12로서는 동일하거나 상이한 전자 흡인기, 또는 전자 공여기 또는 수소 원자로부터 선택되는 기 또는 원자를 들 수 있다. 바람직하게는 R1 내지 R4, R6 내지 R12는 동일하거나 상이한, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 페닐기, 나프틸기, 푸릴기, 티에닐기, 알콕시기, 알킬아미노기, 알킬카르보닐기, 벤조일기, 나프토일기, 푸로일기, 테노일기, 디알킬카르바모일기, 아세틸기, 부타노일기, 메톡시카르보닐기, 시클로알킬기, 벤질옥시기, 아다만틸옥시기, 니트로기를 포함하는 군으로부터 선택되는 기, 또는 할로겐 원자 또는 수소 원자를 들 수 있다. 나아가서는, R1 내지 R4, R6 내지 R12는 알킬기, 아세틸기, 알콕시기, 니트로기, 할로겐 원자 또는 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인 것이 바람직하다.
또 화학식 (5)에 포함되는 화합물에는 다음과 같은 것을 예시할 수 있다.
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-p-톨릴-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-m-톨릴-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-o-톨릴-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-(4-메톡시-페닐)-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-(3-메톡시-페닐)-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-(4-니트로-페닐)-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-(3-니트로-페닐)-아세트아미드
4-[2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세틸아미노]-벤조산에틸에스테르
3-[2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세틸아미노]-벤조산에틸에스테르
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-페닐-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-이리텐)-N-(2,4-디메틸-페닐)-아세트아미드
2-시아노-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드
화학식 (2) 및 (3)으로 나타내어지는 화합물의 염으로서는 약학적으로 허용할 수 있는 염이 바람직하다. 예를 들면 염산염, 황산염, 인산염, 브롬화 수소산염, 아세트산염, 말레산염, 푸마르산염, 숙신산염, 메탄술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 시트르산염, 타르타르산염 등을 형성할 수 있다.
또, 화학식 (4) 및 (5)로 나타내어지는 화합물의 에스테르 화합물도 본 발명의 범위이며, 예를 들면 카르복실산 에스테르, 술폰산 에스테르, 무기산 에스테르 등을 들 수 있다.
화학식 (3)에 나타내어지는 것 같은 인돌 유도체로서는 이하의 화학식 (6)으로 나타내어지는 화합물을 들 수 있다.
<화학식 6>
Figure 112005076299484-PCT00019
식 중, R1 내지 R9는 동일하거나 상이한 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다. 이 중, 바람직하게는 R1 내지 R9는 알킬기, 알콕시기, 히드록실기, 니트로기, 아세톡시기, 아미노알킬기, 아세톡시알킬기, 아미노비닐기, 및 수 소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자를 들 수 있다. 나아가서는, R1, 및 R2가 수소 원자이며, R3이 아세톡시기 또는 히드록실기이며, R4가 수소 원자, 디알킬아미노알킬기, 환상 알킬아미노알킬기, 히드록시알킬아미노알킬기, 또는 아세톡시알킬기이며, R5가 저급 알킬기, 아릴아미노비닐기이며, R6이 니트로기, R7 내지 R9는 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 또는 수소 원자인 것이 바람직하다.
또, 화학식 (6)에 포함되는 화합물에는 다음과 같은 것을 예시할 수 있다.
2-메틸-3-니트로-1-페닐-1H-인돌-6-올
1-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로-1H-인돌-6-올
2-메틸-3-니트로-1-p-톨릴-1H-인돌-6-올
2-[2-(4-메톡시-페닐아미노)-비닐]3-니트로-1-p-톨릴-1H-인돌-6-올
1-(2-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로-1H-인돌-6-올
7-디메틸아미노메틸-2-(2-디메틸아미노-비닐)-3-니트로-1-p-톨릴-1H-인돌-6-올
1-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로-7-피페리딘-1-일메틸-1H-인돌-6-올염산염
2-(2-디메틸아미노-비닐)-1-(4-메톡시-페닐)-7-모르폴린-4-일메틸-3-니트로-1H-인돌-6-올
7-[(3-히드록시-프로필아미노)-메틸]-1-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로- 1H-인돌-6-올염산염
7-디메틸아미노메틸-2-(2-디메틸아미노-비닐)-1-(4-메톡시-페닐)-3-니트로-1H-인돌-6-올
7-디에틸아미노메틸-1-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로-1H-인돌-6-올
7-디메틸아미노메틸-2-메틸-3-니트로-1-p-톨릴-1H-인돌-6-올
1-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로-7-피페리딘-1-일메틸-1H-인돌-6-올
아세트산 7-아세톡시메틸-2-메틸-3-니트로-1-p-톨릴-1H-인돌-6-일에스테르
2-(2-디메틸아미노-비닐)-1-(4-메톡시-페닐)-3-니트로-7-피페리딘-1-일메틸-1H-인돌-6-올
7-디메틸아미노메틸-2-메틸-3-니트로-1-페닐-1H-인돌-6-올
7-디메틸아미노메틸-1-(4-메톡시-페닐)-2-메틸-3-니트로-1H-인돌-6-올
본 발명의 화합물은 이하에 기술하는 방법 및 그것들에 준하는 방법, 또는 공지의 방법을 행함으로써 제조할 수 있다. 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물의 제조법을 이하에 나타낸다.
<화학식 9>
Figure 112005076299484-PCT00020
Figure 112005076299484-PCT00021
등량의 티오에테르 유도체 (I)과 페닐아조아세트아미드 유도체 (II)를 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류)에 용해시키고, 원료가 없어질 때까지 환류함으로써 제조할 수 있다. 해당 유도체 (I)은 공지의 방법(예를 들면, 문헌 [Khim. Geterotsikl. Soedin., No.7, p995(1990)] 등에 기재됨)에 의해, 또는 시판품으로 구입할 수 있다. 구체적으로는 하기 식 1에 나타내는 바와 같다.
Figure 112005076299484-PCT00022
페닐아조아세트아미드 유도체 (II)는 공지의 수법[Materialy Ural'sk. Soveshch. po Spektroskopii 4th, Sverdlovsk 1963, p205(1965), Bulletin del'Academie Polonaise des Sciences, Serie des Scienses chimiques, 14(1), p29(1966), Am, Chem., Div. Org. Coatings, Plastics Chem. Preprints, 23(2), p486(1963), Zhurnal Obschei Khimii, 35(3), p559(1965), Zhurnal Obshchei Khimii, 32, p526(1962) 등]에 의해 제조할 수 있다.
화학식 (9)로 나타내어지는 화합물은 이하의 반응식으로도 합성 가능하다.
Figure 112005076299484-PCT00023
Figure 112005076299484-PCT00024
벤질카르비놀 유도체와 2-시아노아세트아미드 유도체를 황산 존재하에서 반응시킴으로써 얻어지는 화합물 (IV)과 다아조늄염 (V)을 반응에 악영향을 미치지 않는 알코올 수용액 중, 염산존재하에서 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 벤질카르비놀 유도체는 여러 가지 유도체를 시판품으로 구입할 수 있고, 또한 공지의 방법(예를 들면, 문헌 [J. Gen. Chem. USSR, No.6, p1263(1936)])에 의해 얻을 수 있다. 또한, 디아조늄염은 시판되는 아미노벤젠 유도체를 염산, 아질산 나트륨 수용액에 의해 공지의 방법으로 유도할 수 있다.
화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 중, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드(아시넥스, 러시아), 2-(3-클로로-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아 미드(아시넥스, 러시아), 2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(3-메톡시-페닐아조)-아세트아미드(아시넥스, 러시아), 2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(3-니트로-페닐아조)-아세트아미드(PHARMEKS, 러시아), 2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-메톡시-페닐아조)-아세트아미드(PHARMEKS, 러시아), 2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-m-톨릴아조-아세트아미드(IBS, 러시아)는 시판품이며, 제조자로부터 입수할 수 있다.
화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 중에서, R5가 메틸기인 경우의 제조법을 이하에 나타낸다. 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 아세토니트릴의 니트릴류, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류)에 화학식 (4)로 나타내어지는 화합물 (R5=-H) 및 탄산나트륨을 가해 용해시키고, 요오드화메틸을 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류)에 용해시킨 것을 천천히 적하하고 환류함으로써 제조할 수 있다.
화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 중에서, R5가 아세틸기인 경우의 제조법을 이하에 나타낸다. 빙욕하, 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 (R5=-H) 및 디메틸아미노피리딘을 피리딘에 용해시키고, 무수 아세트산을 가해 교반함으로써 제조 할 수 있다.
화학식 (11)로 나타내어지는 화합물의 제조법을 이하에 나타낸다.
Figure 112005076299484-PCT00025
화학식 (9)로 나타내어지는 화합물을 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류)에 용해시키고, 염화티오닐을 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류)에 용해시킨 것을 빙욕하에서 적하함으로써 제조할 수 있다.
화학식 (12)로 나타내어지는 화합물의 제조법을 이하에 나타낸다.
Figure 112005076299484-PCT00026
에탄올에 수산화 칼륨 및 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물을 가해 환류함 으로써 제조할 수 있다.
화학식 (13)로 나타내어지는 화합물의 제조법을 이하에 나타낸다.
Figure 112005076299484-PCT00027
화학식 (12)로 나타내어지는 화합물을 에탄올에 현탁하여 냉각하면서 염화티오닐을 천천히 적하하고, 실온에서 교반함으로써 제조할 수 있다.
화학식 (14)로 나타내어지는 화합물의 제조법을 이하에 나타낸다.
Figure 112005076299484-PCT00028
화학식 (12)로 나타내어지는 화합물, 해당하는 1급 또는 2급 아민, HOBt(Advanced ChemTech사, 미국) 및 트리에틸아민을 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류 등)에 용해시키고, 이것에 HBTU(Advanced ChemTech사, 미국)를 반응에 악영향을 미치 지 않는 적당한 용매(예를 들면 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류, 디클로로메탄 등의 할로겐계 용매 등)에 용해시킨 것을 가했다. 실온에서 교반함으로써 제조할 수 있다.
화학식 (10)으로 나타내어지는 화합물의 제조법을 이하에 나타낸다.
<화학식 10>
Figure 112005076299484-PCT00029
반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 아세토니트릴의 니트릴류 등)에 화학식 (9) 및 (11) 내지 (14)로 나타내어지는 화합물을 용해시키고, 트리페닐주석 수소화물(Aldrich, 미국)을 반응에 악영향을 미치지 않는 적당한 용매(예를 들면 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소류)에 용해시킨 것을 상기 용매에 가해서 환류함으로써 제조할 수 있다.
화학식 (4)로 나타내어지는 화합물은 적당한 용매에 용해시킬 수 있는데, 용매 중에 있어서는 그대로, 또는 하기 화학식 (15)로 나타내어지는 환원형으로, 또는 그 혼합물로서 존재할 수 있다.
Figure 112005076299484-PCT00030
이렇게 해서 얻어지는 본 발명의 화합물 또는 그의 염은 예를 들면 재결정, 증류, 크로마토그래피 등의 통상의 분리 수단에 의해 단리, 정제할 수 있다. 이렇게 해서 본 발명의 화합물이 유리체로 얻어진 경우에는 공지의 방법 또는 거기에 준한 방법에 의해 염으로 변환시킬 수 있다. 반대로 염으로 얻어진 경우에는 공지의 방법 또는 거기에 준한 방법에 의해, 유리체 또는 다른 염으로 변환시킬 수 있다. 화합물 또는 그의 염이 부제 탄소를 가지는 경우도 있지만, 광학 활성의 혼합물(라세미체)로서 얻어진 경우에는 통상의 광학 분할 수단에 의해 각각의 광학 활성으로 분리할 수 있다.
본 발명의 분화 억제제의 농도로서는 0.1ng/㎖ 내지 1㎎/㎖의 범위에서 사용하는 것이 바람직하고, 바람직하게는 10ng/㎖ 내지 100㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 100ng/㎖ 내지 10㎍/㎖의 범위에서 사용하는 것이다.
또, 본 발명의 분화 억제제는 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성화를 개입시키지 않고 배아 줄기세포의 미분화를 유지하는 저분자 화합물, 특히 테트라히드로이소퀴놀린 유도체를 포함한다. 특정의 마우스 계통의 배아 줄기세포는 마우스 태아 유래의 섬유아세포를 포함하는 피더 세포의 존재, 비존재에 관계없이 LIF에 의해 미분화가 유지된다. LIF는 STAT3의 활성화를 통해 하류에 시그널을 전하는 것이 알려져 있다[Matsuda 등, EMB0 Journal, 18, 15, p4261, 1999년]. 그러나, 최근 들어 STAT3을 활성화시키지 않고 배아 줄기세포의 미분화를 유지하는 분화 억제 인자가 존재하는 것이 보고되었기 때문에[Dani 등, Developmental Biology, 203, p149, 1998년], STAT3을 개입시키지 않는 배아 줄기세포의 미분화 유지 기구가 존재한다고 생각되고 있다. 또한 LIF가 영장류 배아 줄기세포의 미분화 유지에 효과를 나타내지 않기 때문에[Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995년, Thomson 등, Science, 282, p1145, 1998년, Reubinoff 등, Nature Biotech, 18, p399, 2000년], 영장류 배아 줄기세포에는 LIF 및 STAT3과는 다른 시그널에 의해 미분화 상태를 유지하는 기구가 존재하는 것이 시사된다. 본 발명의 분화 억제제에는 STAT3의 활성화를 개입시키지 않고 배아 줄기세포의 미분화를 유지하는 저분자 화합물이 포함된다. 바꿔 말하면, LIF와는 다른 작용에 의해 배아 줄기세포의 미분화를 유지하는 활성을 가지는 저분자 화합물이 포함된다.
최근, LIF 및 STAT3을 개입시키지 않고 배아 줄기세포의 미분화를 제어하는 분자의 하나로서 Nanog 유전자가 동정되었다[Mitsui 등, Cell, 113, p631, 2003년, Chambers 등, Cell, 113, p643, 2003년]. Nanog 유전자는 마우스, 인간에서 그 존재가 확인되고, 유전자 파괴에 의해 발현을 억제하면, 배아 줄기세포의 전능성은 없어지고, 반대로, Nanog 유전자를 강발현시켜 발현량을 증가시키면, LIF 비존재하 에서도 배아 줄기세포의 미분화를 유지할 수 있다. 따라서, Nanog 유전자의 발현량을 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들면 저분자 화합물은 배아 줄기세포의 미분화 유지, 즉, 전능성의 배아 줄기세포의 배양에 이용할 수 있다.
또, Nanog 유전자의 강발현이 STAT3을 활성화하지 않기 때문에, Nanog 유전자는 LIF 및 STAT3 비의존적으로 배아 줄기세포의 미분화를 유지한다. 즉, Nanog 유전자의 발현량을 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들면 저분자 화합물은 LIF에 의한 미분화 유지의 효과가 인지되지 않는 배아 줄기세포에 있어서도, 그 배양에 이용할 수 있는 것이 시사된다.
본 발명의 분화 억제제에는 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 저분자 화합물이 포함된다. 즉, 본 발명의 분화 억제제에는 Nanog 유전자의 발현량의 증가를 통해 배아 줄기세포의 미분화 유지능을 발휘하는 저분자 화합물이 포함된다.
또, 최근의 보고에 따르면, 어떤 종류의 골수 유래 간엽계 줄기세포에 있어서도 배아 줄기세포와 마찬가지로, 마우스 유래의 줄기세포의 배양은 LIF 의존적이지만, 인간 유래의 줄기세포는 LIF 비의존적이라고 하는 것이 개시되어 있다[Verfaillie 등, Nature, 418, p41, 2002년]. 이것은 다분화능을 나타내는 줄기세포는 배아 줄기세포와 같은 미분화 유지 기구를 가지고 있는 것을 시사하고, 따라서, 영장류 줄기세포에 있어서도, 배아 줄기세포와 마찬가지로, LIF-STAT3 경로와는 다른 시그널에 의해 미분화가 유지되고 있을 가능성이 시사된다. 본 발명의 분화 억제제에는 STAT3을 개입시키지 않고 세포의 미분화 상태를 유지하는 활성을 가지는 저분자 화합물이 포함된다.
본 발명의 분화 억제제는 동물 세포 배양용 기초 배지인 임의의 포유류 세포 배양 기본 배지에 첨가해서 사용할 수 있다. 동물 세포 기본 배지의 예로서는 다르베코 개변 이글 배지:DMEM, 녹아웃 DMEM, 글래스고 MEM:GMEM, RPMI1640, IMDM(이상 Invitrogen사제, 미국) 등을 들 수 있는데 이것들로 한정되지 않는다. 하나의 실시양태로서의 세포 배지는 다르베코 개변 이글 배지(DMEM)이다. 또한 이들 기초 배지에 혈청 또는 혈청 대체물, 각종 증식인자, 사이토카인 등, 세포 증식이나 분화 제어에 관계되는 단백질을 첨가해서 이용할 수도 있다. 또한, 임의의 화합물을 첨가할 수 있다. 혈청은 줄기세포 및 배아 줄기세포의 증식 및 생존성의 유지에 효과적인 영양소를 공급하는 임의의 혈청, 또는 혈청 기재 용액일 수 있다. 이와 같은 혈청의 예에는 소 태아 혈청(FCS), 소 혈청(CS), 말 혈청(HS) 등이 있고, 또한, 혈청 대체물로서는 당업자에게 주지인 것, 단백질, 아미노산, 지질, 비타민 등을 단독으로, 또는 조합해서 이용할 수 있다. 단백질로서는 인슐린, 트랜스페린, 알부민, 펩톤, FGF(Fibroblast Growth Factor), EGF(Epitherial Growth Factor) 등이, 아미노산으로서는 아르기닌, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 바린 등이, 비타민으로서는 판토텐산, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산 아미드, 리보플라빈, 티아민, 피리독신 등이 예시되지만 이것들로 한정되지 않는다. 하나의 실시양태에 있어서, 혈청은 소 태아 혈청이다. 보다 특정의 실시양태에 있어서, 소 태아 혈청은 약 25%와 약 1% 사이의 농도로 제공된다. 또한 보다 특정의 실시양태에 있어서, 세포 배지에서의 소 태아 혈청 농도는 15%이다. 또한, 다른 실시양태에 있어서, 혈청 대체물은 녹아웃 혈청 리플레이스먼트:KSR(Invitrogen사제, 미국)이다. 첨가할 수 있는 세포 증식인자로서는 줄기세포 성장인자(HGF), 상피 세포 증식인자(EGF), 섬유아세포 증식인자(FGF), 인슐린양 증식인자(IGF), 신경 성장인자(NGF), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 혈관 내피 증식인자(VEGF), 트랜스포밍 증식인자(TGF), 뼈 형성인자(BMP), 줄기세포 인자(SCF), Wnt 등이 예시되지만 이것들로 한정되지 않는다. 첨가할 수 있는 사이토카인으로서는 인터루킨(IL), 과립구-매크로퍼지콜로니 자극인자(GM-CSF) 등이 예시되지만 이것들로 한정되지 않는다. 또한, LIF, 노치리간드 등의 분화 제어 인자를 첨가할 수도 있다. 또한, 첨가하는 화합물은 특별히 한정되지 않지만, 임의의 단백질에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트일 수 있고, 또한, 임의의 인산화 저해제일 수 있다. 하나의 실시양태에 있어서, PD98059(Cell Signaling Technology사제)가 제공된다. 또한, 다른 실시양태에 있어서 6-브로모인디루빈-3옥심이 제공된다.
세포 배지는 항산화제(환원제)(예를 들면 β-메르캅토에탄올)도 포함한다. 어떤 적합한 실시양태에 있어서, β-메르캅토에탄올은 약 0.1mM의 농도를 가진다. 다른 항산화제(예를 들면 모노티오글리세롤, 또는 디티오트레이톨(DTT)의 단독 또는 조합)가 같은 효과를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 등가인 물질은 세포 배양 분야의 당업자에게 주지이다.
본 발명의 분화 억제제 및 그 유효 성분은 임의의 배양 기재와 함께 또는 배양 기재에 고정해서 사용할 수도 있다. 배양 기재에는 다공질체를 사용할 수 있다. 다공질체란, 미세한 구멍을 다수 가지는 기재를 말하고, 그 재질, 두께, 형 상, 치수 등은 특별히 한정은 없다. 다공질체의 재질은 유기 재료, 무기 재료 및 유기 재료와 무기 재료를 포함하는 복합재료일 수 있다. 다공질체의 형상은 평판상, 구상, 막대상, 섬유상, 중공상 중 어느 형태일 수 있고, 예를 들면 필름, 시트, 막, 판, 부직포, 여과지, 스펀지, 직물, 편물, 덩어리, 실, 중공사, 입자 등을 들 수 있다. 세포를 배양함에 있어서, 3차원적으로 배양할 수 있도록 세포를 지지하는 구멍의 크기를 간단하게 제어할 수 있는 것이나, 기재 제작의 용이함 및 비용 등을 고려하면 부직포가 보다 바람직하다. 다공질체의 구멍의 크기에 대해서는 특별히 한정은 없지만, 세포를 3차원적으로 지지할 수 있도록 하는 것을 고려하면, 평균 공경이 0.1㎛이상 100㎛이하인 것이 바람직하고, 1㎛이상 50㎛이하가 더욱 바람직하다. 섬유경에 대해서는 특별히 한정은 없지만, 0.03 데니어 이하가 바람직하다.
상기의 다공질체는 세포의 접착성이나 분화 유지 기능, 증식능을 향상시키기 위해서, 고분자 화합물에 의해 표면 코팅 처리가 되어 있을 수 있다. 고분자 물질이란, 1종 이상의 반복 구성 단위의 단량체가 1차원, 2차원, 3차원적으로 연결된 분자량 수백 이상의 물질을 말한다. 고분자 물질은 크게 천연 고분자 물질, 반합성 고분자 물질, 합성 고분자 물질 3가지로 분류할 수 있고, 본 발명에 있어서 어느 고분자 물질도 사용할 수 있다.
예를 들면 천연 고분자 물질로서는 마이카(운모), 아스베스토(석면), 그라파이트(흑연), 다이아몬드, 전분, 셀룰로오스, 알긴산 등으로 대표되는 당류 및 젤라틴, 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐 등으로 대표되는 단백질 등을 들 수 있다. 반합성 고분자 물질로서는 유리, 질산 셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 염산고무, 카르복시메틸셀룰로오스 등을 들 수 있다. 합성 고분자 물질로서는 폴리포스포니트릴클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리염화 비닐, 폴리아미드, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리술폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐알코올, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리디메틸아미노에틸메타크릴레이트 및 히드록시에틸메타크릴레이트와 디메틸아미노에틸메타크릴레이트의 공중합체로 대표되는 것 같은 2종류 이상의 합성 단량체를 포함하는 공중합체 등을 들 수 있다.
코팅 처리의 용이함을 고려하면, 유기 고분자 물질이 바람직하고, 단백질이나 펩티드 및 유기 합성 고분자 물질이 더욱 바람직하다. 하나의 실시양태에 있어서, 배양 기재는 젤라틴이다. 또한, 다른 실시양태에 있어서는 마트리겔(BD Biosciences사)이다.
본 발명의 분화 억제제를 고정한 배양 기재를 세포 포착재로서 이용함으로써, 복수의 다른 세포를 포함하는 집단으로부터, 줄기세포 또는 배아 줄기세포를 분리하고, 또한, 배양을 할 수 있는 방법 및 장치가 제공될 수 있다. 즉, 줄기세포 또는 배아 줄기세포와, 제거 대상 세포를 포함하는 세포함유액을 본 발명의 분화 억제제를 고정한, 다공질체 등의 배양 기재를 포함하는 세포 포착재가 충전되어 있는 용기에 도입하고, 세포 포착재에 줄기세포 또는 배아 줄기세포를 포착시켜, 제거 대상 세포를 용기 밖으로 도출한 후에 용기마다 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 또는 배아 줄기세포 배양 방법이며, 또 본 발명의 분화 억제제를 고정화한 배양 기재를 포함하는 세포 포착재를 용기에 충전한 세포 배양 장치로서, 상기 세포 포착재는 세포 배양용 담체로서 사용할 수 있는 것이며, 상기 용기는 세포 배양에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치이다. 제거 대상 세포란 줄기세포 또는 배아 줄기세포 이외의 모든 세포를 말한다. 또한, 줄기세포 또는 배아 줄기세포로부터 분화하여 다분화능을 잃은 세포도 여기에 포함된다. 세포 포착재에 도입하는 세포 함유액으로서는 줄기세포 또는 배아 줄기세포를 함유하는 세포액이면 어떠한 것이라도 괜찮고, 일례로서 혈액, 골수, 쇄편 조직액, 또는 줄기세포, 배아 줄기세포의 배양액 등을 들 수 있다.
본 발명은 줄기세포 및 배아 줄기세포를 증식하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분화 억제제를 이용해서 증식시킨 줄기세포 및 배아 줄기세포의 배양물을 제공할 수 있다.
본 발명의 분화 억제제를 이용해서 배양되는 세포에는 공지의 방법 및 재료를 사용해서 입수할 수 있는 모든 줄기세포 및 배아 줄기세포가 포함된다. 줄기세포에는 이하의 공지의 방법에 의해 입수할 수 있는 줄기세포를 일례로서 들 수 있다. 골수 세포[「골수이식가이드」 H.J. 디그, H.G. 크린게만, G.L. 필립스저/입창 신평 역], 골수 줄기세포[0sawa 등, Science, 273, p242-245, 1996년, Goodell 등, J.E.Med. 183, p1797-1806, 1996년, Verfaillie 등, Nature, 418, p41, 2002년], 신경줄기세포[Reynolds 등, Science, p1707-1710, 1992], 조직줄기세포[Goodell 등, J.E.Med. 183, p1797-1806, 1996년, 마츠자키 등, 실험 의학, 19, p345-349, 2001년, Blau 등, Cell, 105, p829-841, 2001년], 간엽계 줄기세포[Liechty 등, Nature Medicine, 6, p1282-1286, 2000년. Pittenger 등, Science, 284, p143-147, 1999년], 피부줄기세포·표피줄기세포[실전 성일 편, 「재생 의학·재생 치료」 현대 화학 증간 41, 동경 화학 동인].
또, 배양되어야 할 배아 줄기세포로서는 이하에 나타내는, 공지의 방법 및 재료를 사용해서 입수할 수 있다. 마우스 배아 줄기세포: [Evans 등, Nature, 292, p154, 1981년], 소 ES세포: [Schellander 등, Theriogenology, 31, p15-17, 1989년], 돼지 ES세포: [Strojek 등, Theriogenology, 33:p901, 1990년], 양 ES세포: [Handyside, Roux's Arch. Dev. Biol., 196:p185, 1987년], 햄스터 ES세포: [Doetschman 등, Dev. Biol., 127, p224, 1988년], 원숭이 ES 세포: [Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995년], 카니쿠이자루 ES세포: [Suemori 등, Dev. Dyn.222, p273, 2001년], 인간 ES 세포: [Thomson 등, Science, 82, p1145, 1998년, Reubinoff 등, Nature Biotech, 18, p399, 2000년], 인간 EG세포: [Gearhart 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, p13726, 1998년]. 또한, 마우스 배아 줄기세포(129SV 및 C57/BL6)는 대일본제약에서 구입할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 분화 억제제는 모든 줄기세포 및 배아 줄기세포에 이용할 수 있지만, 포유류의 줄기세포 및 배아 줄기세포에 이용하는 것이 바람직하고, 영장류 줄기세포 및 배아 줄기세포에 이용하는 것이 바람직하다.
세포 및 배아 줄기세포는 일단 단리되면 본 발명의 분화 억제제를 사용해서 미분화인 상태로 배양될 수 있다.
본 발명의 분화 억제제를 이용해서 배양한 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포의 미분화 정도는 줄기세포의 세포막 위에 존재하는 알칼리포스파타아제 (ALP) 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 미분화인 배아성 줄기세포에서는 ALP의 활성이 유지되어 분화하면 감소하는 것이 알려져 있다[Williams 등, Nature, 336, p684, 1988년. Thomson 등, Science, 282, p1145, 1998년.]. 불용성 기질을 이용한 염색법, 또는 수용성 기질을 이용한 분광학적 측정법 등에 의해 알칼리포스파타아제(ALP) 활성을 검출하는 방법을 들 수 있다.
한 실시양태에 있어서, 분광학적 측정법에 의해 ALP 활성을 정량할 수 있다. 배양 접시 위의 세포에 파라니트로페닐포스페이트(pNPP)의 알칼리성 용액을 첨가한다. 세포막 위에 존재하는 ALP에 의해 pNPP가 가수분해되어 파라니트로페놀이 생긴다. 생성한 용액의 405㎚의 흡광도를 측정함으로써 알칼리포스파타아제 활성을 정량할 수 있다. 실시예 1(5)에 기재된 방법에 의해, 본 발명의 분화 억제제를 첨가해서 배양한 배아 줄기세포의 ALP 활성을 측정하면, 분화 억제제를 포함하지 않는 배지에서 배양한 컨트롤의 배아 줄기세포에 비해서 의미 있게 높은 ALP 활성을 가지고 있는 것이 나타난다. 즉 본 발명의 분화 억제제가 배아 줄기세포의 미분화 상태를 유지해서 증식시킬 수 있는 것이 확인된다.
다른 실시양태에 있어서, ALP 염색법에 의해 ALP 활성을 검출할 수도 있다. 배양 접시 위의 세포에, 기질로서 인산 에스테르염과 다아조늄염을 포함한 반응 용액을 첨가한다. 세포막상으로 존재하는 알칼리포스파타아제에 의해 인산 에스테르염이 가수분해되고, 그 다음에 다아조늄염과 커플링 반응시킴으로써 아조 색소가 생겨 ALP 활성 부위에 색소가 침전된다. 염색된 콜로니수를 계측함으로써 세포의 ALP 활성을 정량화하는 것이 가능해져, 즉 세포의 미분화 정도를 정량할 수 있다. 실시예 1(6)에 기재된 방법에 의해, 본 발명의 분화 억제제를 이용해서 배양한 배아 줄기세포를 ALP 염색하면, 분화 억제제를 이용하지 않는 컨트롤 세포에 비해 의미 있게 ALP 활성이 높은 것이 나타나고, 즉 본 발명의 분화 억제제가 배아 줄기세포의 미분화 상태를 유지해서 증식시킬 수 있는 것이 확인된다.
또, 배아 줄기세포의 미분화 정도는 Oct-3/4 유전자의 발현량을 측정하는 것에 의해 확인할 수 있다. Oct-3/4 유전자는 POU 패밀리에 속하는 전사 인자로, 배아 줄기세포, 배아 암세포(EC세포)로, 미분화 상태 특이적으로 발현되고[0kamoto 등,. Cell, 60, p461, 1990년], 배아 발생에 있어서도 미분화 세포 계보에 있어서만 발현되고[scholer, Trends Genet, 7, p323, 1991년], 또한 Oct-3/4 유전자 파괴 마우스의 호모 개체는 배반포기에서 발생을 정지시키는 점에서 미분화 상태 유지에 중요한 기능을 가지고 있는 것이 밝혀졌다[Nichols 등, Cell, 95, p379, 1998년]. 또한, 한편, Oct-3/4 유전자의 과잉 발현은 배아 줄기세포의 분화를 촉진하는 것이 최근 밝혀지고[Niwa 등, Nat. Genet. 24, p372, 2000년], Oct-3/4의 발현량을 어느 일정한 범위로 유지하는 것이 미분화 상태의 유지에 중요하다. Oct-3/4 유전자의 발현량을 측정하는 하나의 실시양태로서는 정량적 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)법을 이용할 수 있다.
한 실시양태에 있어서는 리얼타임 PCR법이 이용되고, 폭넓은 다이나믹 레인지를 갖고, 간편하고 신뢰성이 있는 정량 측정이 가능하다. 리얼타임 PCR 기술에는 ABIPRISM7700TM(Applied Biosystems)을 사용한 Taq Man 프로브를 이용하는 방법이나, LightCyclerTM(로슈·다이아그노스틱)을 이용한 방법이 있다. 특히 후자의 경우는 PCR의 온도 사이클이 수십분으로 종료하는 고속반응 사이클 하에서, 사이클마다 합성되는 DNA의 증폭량 변화를 리얼타임으로 검출할 수 있다. 리얼타임 PCR법의 DNA 검출법으로서는 DNA 결합 색소(인터카레이터), 하이브리다이제이션·프로브(키싱프로브), Taq Man 프로브 및 Sunrise 유니프라이머(모레큘러·비콘)를 이용하는 4종류의 방법이 있다. 또한, DNA 결합 색소, 예를 들면 SYBR GreenI를 이용해서 Oct-3/4 유전자의 발현량을 해석할 수 있다. SYBR GreenI는 DNA의 2개쇄 특이적으로 결합 색소이며, 2개쇄에 결합함으로써 본래의 형광 강도가 증강된다. PCR 반응시에 SYBR GreenI를 가하고, 신장 반응의 각 사이클의 마지막에 형광 강도를 측정하면 PCR 산물의 증가를 검출할 수 있다. Oct-3/4 유전자를 검출하기 위해는 통상의 PCR과 마찬가지로 Oct-3/4 유전자의 서열을 기초로, 시판되는 유전자 해석 소프트웨어 등을 이용해서 프라이머를 설계한다. SYBR GreenI는 비특이적 산물도 검출해 버리기 때문에 최적의 프라이머의 설정이 필요해진다. 설계 기준으로서는 올리고머의 길이, 서열의 염기조성, GC함량, 및 Tm치 등에 유의가 필요하다.
대부분의 경우, 정량 PCR에 있어서 분명히 하는 것을 목적으로 하는 것은 샘플 일정량당의 목적 DNA량이다. 이것을 위해서는 최초로 반응계에 가한 샘플량의 평가가 필요하다. 이 경우 샘플량을 반영하는 것 같은 내부 표준이 되는 다른 DNA를 목적 DNA와는 별도로 측정하고, 최초로 반응계에 가한 샘플량을 보정할 수 있다. 샘플량을 보정할 목적으로 이용하는 내부 표준에는 통상, 조직에 의해 발현량에 차이가 없다고 생각되고 있는 하우스키핑 유전자를 이용할 수 있다. 예를 들면 해당계의 주요 효소인 글리세로알데히드인산 탈수소효소(GAPDH), 세포 골격의 구성 성분인 β액틴 또는 γ액틴, 리보좀의 구성 단백질인 S26 등의 유전자를 들 수 있다.
Oct-3/4 유전자의 발현 레벨은 본 발명의 분화 억제제에 폭로된 세포에 대해서 결정할 수 있다. 분화 억제제에 폭로되어 있지 않은, 즉, 배아 줄기세포로부터 분화 유도된 컨트롤 세포의 Oct-3/4 유전자 발현량에 비해서, 의미 있게 Oct-3/4 유전자의 발현량을 유지시킬 수 있는 활성을 가지는 화합물이 배아 줄기세포의 미분화를 유지하는 분화 억제제라고 간주된다.
최적화된 배아 줄기세포의 미분화 유지 배양 기재를 스크리닝하는 또 다른 방법으로서 스테이지 특이적 배항원(Stage Specific Embryonic Antigen)(이후 SSEA라고 기재)-1, SSEA-3, SSEA-4 등의 미분화한 세포에 특이적으로 발현하는 항원을 검출하는 방법을 들 수 있다[Smith 등, Nature, 336, p688, 1988년, Solter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 75, p5565, 1978년, Kannagi 등, EMBO J.2, p2355, 1983년].
한 실시양태에 있어서, SSEA-1 등의 표면 항원은 동 항원을 인식하는 특이적 항체(1차 항체)와 인큐베이션하고, 또한 형광 표식와 같은 리포터와 결합한 제2의 항체(2차 항체)와 인큐베이션함으로써 표식할 수 있다. 이 조작에 의해 목적의 항원을 발현하는 세포가 형광성이 된다. 그 다음에, 표식된 세포를 표준적 방법, 예를 들면 플로사이트미터를 이용해서 계수, 나아가서는 분취될 수 있다. 그 다음에, 표식 및 비표식 세포의 수는 목적으로 하는 배양 기재의 효과를 결정하기 위해 비교될 수 있다. 또는 비표식 세포 표면 마커 항체에 폭로된 후, ELISA(효소 결합 면역 흡착 어세이) 형식에 있어서, 그 세포는 항세포 표면 항원 항체(예를 들면 항SSEA-1 항체)에 대해서 특이적인 제2의 항체에 폭로될 수 있고, 그것으로부터, 원하는 표면 항원을 발현하는 세포의 수가, 비색 정량적으로, 또는 형광을 측정함으로써 정량될 수 있다. 표면 항원을 발현하는 세포를 정량하는 또 다른 방법도 세포 배양의 당업자에게 주지이다.
본 발명에 의해 제공되는 줄기세포, 또는 배아 줄기세포의 증식에 대한 개선된 분화 억제제, 배양 방법 및 배양액은 줄기세포 또는 배아 줄기세포가 유용한 모든 기술에 대해서 적용되는 것이 예상된다.
본 발명의 분화 억제제, 배양 방법 및 배양액을 이용해서 산생되는 세포는 분화시켜, 세포 이식에 이용하거나 인공 지지조직의 이용과 아울러 인공적인 조직 구축에 사용되어 생체 내에 이식하거나 인공 장기로서 이용될 수 있다. 줄기세포의 세포 이식 치료나 조직 공학에의 이용은 도너에 있어서의 이식편 적출 후의 조직 결손이나 도너 부족 등, 종래의 자가 이식을 포함하는 이식 치료가 안고 있는 문제점을 해결할 수 있다. 이식을 위해서 배양된 세포나 조직은 치료를 위해 채취한 인간과 동일인에게 되돌리는 경우와 타인에게 이식하는 경우가 있는데, 본 발명의 세포 등은 어느 것에도 이용할 수 있다.
본 발명의 분화 억제제, 그것을 이용한 배양 방법, 그것을 포함하는 배양액에 의해서 얻어진, 비개변 및 개변된 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포의 배양물은 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포의 모니터링 또는 줄기세포 수집을 개량하는 물질에 대해서 스크리닝하기 위해 사용된다. 예를 들면 추정의 줄기세포 또는 배아 줄기세포 분화 유도 물질은 상기의 방법을 이용해서 증식시킨 세포 배양물에 첨가될 수 있다. 추정의 줄기세포 또는 배아 줄기세포 분화 유도 물질을 결손한 대조 세포 배양물과 비교해서 3배엽 계열에의 분화를 유도할 수 있는 물질은 배아 줄기세포 분화 유도 인자로서 분류된다.
본 발명의 분화 억제제 및(또는) 화합물, 또는 그의 염은 뛰어난 줄기세포 미분화 유지 및 증식능을 가지는 점에서, 병 또는 외상 등에 의해 상해를 받은 조직 또는 기관의 치료제로서 이용할 수 있다. 대상이 되는 질환으로서는 예를 들면 피부 관련에서는 화상, 난치성 피부 궤양, 욕창, 비후성 반흔, 모반, 문신 등, 뼈관련에서는 골절, 골조소증 등, 연골 관련에서는 변형성 관절증, 만성 류머티즘, 추간판 헤르니아, 골단증, 스포츠 장애 등, 신경 관련에서는 파킨슨병, 한틴톤병, 알츠하이머병, 외상에 의한 사지의 신경 절단, 두경부 외과·흉부외과에 수반하는 손상, 안면 신경마비, 횡격막 신경 손상, 골반 내 신경 손상 등, 이 관련에서는 치주병·치조농루에 의한 치조골 손상, 무치증이, 모발에서는 남성형 탈모증이, 각막에서는 선천성 이상, 내피세포 대상 부전, 각막 감염에 의한 혼탁, 각막 변성증, 각막 형상 이상 등, 혈관 관련에서는 고혈압, 만성 동맥 폐색증, 허혈성 심질환 등, 심근에서는 심근경색, 췌장에서는 당뇨병 등, 간장에서는 간염, 간경변, 간부전등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다.
본 발명의 분화 억제제 및(또는) 화합물은 상기의 질환에 대해서 예방 및(또는) 치료제로서 경구투여 또는 비경구투여 모두 가능하고, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여, 통상, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 등 고형 제재로서 경구투여되거 나, 정맥 내, 피하, 근육 내 등에 주사제, 좌약 또는 설하정 등으로서 비경구투여된다. 또한, 설하정, 마이크로 캡슐 등의 서방제재로서 설하, 피하 및 근육 내 등에 투여할 수 있다. 1일 투여량은 증상의 정도;투여 대상의 연령, 성별, 체중, 감수성차이;투여의 시기, 간격, 의약 제재의 성질, 조제, 종류;유효 성분의 종류 등에 따라 다르고, 특별히 한정되지 않지만, 통상, 포유동물 1kg체중당 약 0.01 내지 100㎎, 바람직하게는 약 0.02 내지 20㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10㎎, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10㎎을, 통상 1일 1 내지 4회로 나누어 투여한다. 축산 또는 수산 분야에서 사용하는 경우의 투여량도 상기에 준하지만, 투여 대상 생물 1 kg체중당 약 0.01 내지 30㎎, 바람직하게는 약 0.1 내지 10㎎을, 통상 1일 1 내지 3회로 나누어 투여한다. 본 발명의 화합물의 의약 조성물 중의 함유량은 조성물 전체의 약 0.01 내지 100중량%이다.
상기 약학적으로 허용되는 담체로서는 제재 소재로서 관용의 각종 유기 또는 무기 담체 물질이 이용되고, 고형 제재에 있어서의 부형제, 활택제, 결합제, 붕괴제;액상 제재에 있어서의 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 무통화제 등으로서 배합된다. 또 필요에 따라 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제 등의 제재 첨가물을 이용할 수도 있다. 상기 부형제의 적합한 예로서는 예를 들면 유당, 자당, D-만니톨, 전분, 결정 셀룰로오스, 경질 무수 규산 등을 들 수 있다. 상기 활택제의 적합한 예로서는 예를 들면 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 탈크, 콜로이드실리카 등을 들 수 있다. 상기 결합제의 적합한 예로서는 예를 들면 결정 셀룰로오스, 백당, D-만니톨, 덱스트린, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드 록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
상기 붕괴제의 적합한 예로서는 예를 들면 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 크로스칼메로오스나트륨, 카르복시메틸스타티나트륨 등을 들 수 있다. 상기 용제의 적합한 예로서는 예를 들면 주사용수, 알코올, 프로필렌글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수유 등을 들 수 있다. 상기 용해 보조제의 적합한 예로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 만니톨, 벤조산벤질, 에탄올, 트리스아미노메탄, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 시트르산나트륨 등을 들 수 있다. 상기 현탁화제의 적합한 예로서는 예를 들면 스테아릴트리에탄올아민, 라우릴황산나트륨, 라우릴아미노프로피온산, 레시틴, 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 모노스테아르산글리세린 등의 계면활성제;예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 친수성 고분자 등을 들 수 있다.
상기 등장화제의 적합한 예로서는 예를 들면 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 들 수 있다. 상기 완충제의 적합한 예로서는 예를 들면 인산염, 아세트산염, 탄산염, 시트르산염 등의 완충액 등을 들 수 있다. 무통화제의 적합한 예로서는 예를 들면 벤질알코올 등을 들 수 있다. 상기 방부제의 적합한 예로서는 예를 들면 파라옥시벤조산 에스테르류, 클로로부탄올, 벤질알코올, 페네틸알코올, 디히드로아세트산, 소르빈산 등을 들 수 있다. 상기 항산화제의 적합한 예로서는 예를 들면 아황산염, 아스코르브산 등을 들 수 있다.
본 발명의 분화 억제제 및(또는) 화합물에 현탁화제, 용해 보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제 등을 첨가하여 공지의 방법에 의해 정맥, 피하, 근육 내 주사제로 만들 수 있다. 그 때 필요에 따라 공지의 방법에 의해 동결건조물로 만드는 것도 가능하다. 본 발명 화합물을 예를 들면 인간에 투여하는 경우는 그것 자체 또는 적당한 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제와 혼합하여, 의약 조성물로서 경구적 또는 비경구적으로 안전하게 투여할 수 있다. 상기 의약 조성물로서는 경구제(예, 산제, 과립제, 캡슐제, 정제), 비경구제〔예, 주사제, 점적 10제, 외용제(예, 경비 투여 제재, 경피 제제 등), 좌제(예, 직장 좌제, 질 좌제 등) 등〕를 들 수 있다. 이들 제재는 제재 공정에 있어서 통상 일반적으로 이용되는 자체 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 분화 억제제 및(또는) 화합물은 분산제(예, 트윈(Tween) 80(아트라스파우더사제, 미국, HC060(일광 케미컬즈제) 폴리에틸렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨 등), 보존제(예, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질알코올 등), 등장화제(예, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨, 포도당 등) 등과 함께 수성 주사제로, 또는 올리브유, 참기름, 면실유, 옥수수유 등의 식물유, 프로필렌글리콜 등에 용해, 현탁 또는 유화해서 유성 주사제로 성형하여 주사제로 만들 수 있다. 경구제로 만들기 위해서는 자체 공지의 방법에 따라, 본 발명의 분화 억제제 및(또는) 화합물을 예를 들면 부형제(예, 유당, 백당, 전분 등), 붕괴제(예, 전분, 탄산칼슘 등), 결합제(예, 전분, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등) 또는 활택제(예, 탈크, 스테아르산마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜 6000 등) 등을 첨가해서 압축 성형하고, 그 다음에 필요에 따라, 맛의 마스킹, 장용성 또는 지속성의 목적을 위해 자체 공지의 방법으로 코팅함으로써 경구투여 제재로 만들 수 있다. 그 코팅제로서는 예를 들면 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌글리콜, 트윈 80, 플루로닉 F68, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시메틸셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 오이드라기트(롬사제, 독일, 메타아크릴산·아크릴산 공중합) 및 색소(예, 산화철, 이산화티탄 등) 등이 이용된다. 장용성 제재로 만드는 경우, 장용상과 약제 함유상 사이에 양상의 분리를 목적으로 해서 자체 공지의 방법에 의해 중간상을 만들 수도 있다.
외용제로 만들기 위해서는 공지의 방법에 따라, 본 발명의 분화 억제제 및(또는) 화합물을 고상, 반고상 또는 액상의 외용 투여제로 만들 수 있다. 예를 들면 상기 고상의 것으로서는 본 발명 화합물을 그대로, 또는 부형제(예, 글리콜, 만니톨, 전분, 미결정 셀룰로오스 등), 증점제(예, 천연 검류, 셀룰로오스 유도체, 아크릴산 중합체 등) 등을 첨가, 혼합하여 분상의 조성물로 만든다. 상기 액상의 것으로서는 주사제의 경우와 거의 같이 유성 또는 수성 현탁제로 만든다. 반고상의 경우는 수성 또는 유성의 겔제, 또는 연고상의 것이 좋다. 또한, 이것들은 모두 pH조절제(예, 탄산, 인산, 시트르산, 염산, 수산화나트륨 등), 방부제(예, 파라옥시벤조산 에스테르류, 클로로부탄올, 염화 벤잘코늄 등) 등을 가할 수 있다. 예를 들면 좌제로 만들기 위해서는 자체 공지의 방법에 따라, 본 발명 화합물을 유성 또는 수성의 고상, 반고상 또는 액상의 좌제로 만들 수 있다. 상기 조성물에 이용하는 유성 기제로서는 예를 들면 고급 지방산의 글리세리드〔예, 카카오지방, 비테프졸류(다이나마이트 노벨사제, 독일) 등〕, 중급 지방산〔예, 미그리올류(다이너마이트 노벨사제, 독일) 등〕, 또는 식물유(예, 참기름, 대두유, 면실유 등) 등을 들 수 있다. 또한, 수성 기제로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜류, 프로필렌글리콜, 수성 겔 기제로서는 예를 들면 천연 검류, 셀룰로오스 유도체, 비닐 중합체, 아크릴산 중합체 등을 들 수 있다.
화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그란, 생체 내에 있어서 효소나 위산 등에 의한 대사 반응에 의해, 줄기세포 증식 작용을 가지는 화합물 (9) 및 (10)으로 변환되는 화합물을 말한다. 화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그로서는 화합물 (9) 및 (10)이 아미노기를 가지는 경우, 해당 아미노기가 아실화, 알킬화, 인산화된 화합물 (예, 화합물 (9) 및 (10)의 아미노기가 에이코사노일화, 알라닐화, 펜틸아미노카르보닐화, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)메톡시카르보닐화, 테트라히드로푸라닐화, 피롤리딜메틸화, 피발로일옥시메틸화, tert-부틸화된 화합물 등);화합물 (9) 및 (10)이 카르복실을 가지는 경우 해당 카르복실이 에스테르화, 아미드화된 화합물 (예, 화합물 (9) 및 (10)의 카르복실이 에틸에스테르화, 페닐에스테르화, 카르복시메틸에스테르화, 디메틸아미노메틸에스테르화, 피발로일옥시메틸에스테르화, 에톡시카르보닐옥시에틸에스테르화, 프탈리딜에스테르화, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)메틸에스테르화, 시클로헥실옥시카르보닐에틸에스테르화, 메틸아미드화된 화합물 등) 등을 들 수 있다. 이들 화합물은 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그는 히로카와 서점 1990 연간 「의약품의 개발」 제7권 분자 설계 163페이지 내지 198페이지에 기재되어 있는 것 같은, 생리적 조건으로 화합물 (9) 및 (10)으로 변화하는 것일 수 있다.
화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그는 그것 자체로도 약리학적으로 허용되는 염일 수 있다. 이러한 염으로서는 화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그가 카르복실 등의 산성기를 가지는 경우, 무기염기(예, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리 토류 금속, 아연, 철, 구리 등의 천이 금속 등)나 유기염기(예, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 등의 유기 아민류, 아르기닌, 리신, 오르니틴 등의 염기성 아미노산류 등) 등과의 염을 들 수 있다. 화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그가 아미노기 등의 염기성기를 가지는 경우, 무기산이나 유기산(예, 염산, 질산, 황산, 인산, 탄산, 중탄산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등), 아스파르트산, 글루탐산 등의 산성 아미노산 등과의 염을 들 수 있다. 또한, 화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그는 수화물 및 비수화물 중 어느 것이라도 괜찮다. 화합물 (9) 및 (10)은 분자 내에 1 또는 2개소 기하 이성질체(시스-트랜스 이성질체)를 일으키는 경우가 있지만, 임의의 비율로 시스체, 트랜스체를 가지는 화합물도 본 발명에 포함된다. 화합물 (10)은 분자 내에 하나 내지 그것보다 많은 부제 탄소를 가지는 경우가 있지만, 이들 부제 탄소에 관해서 R배치, S배치 모두 본 발명에 포함된다. 화 합물 (9) 및 (10)은 동위 원소(예, 3H, 14C) 등으로 표식되어 있을 수 있다.
화합물 (9) 및 (10)의 프로드러그로서는 다당(예:덱스트란, 플루란, 만난, 키틴, 키토산 등)에 화합물 (9) 및 (10)이 아미노기, 카르복실기, 수산기 등을 반응점으로 해서 결합한 것일 수 있다. 또한, 화합물 (9) 및 (10)이 시클로덱스트린(α체, β체, γ체 등이 있지만, 바람직하게는 β체 또는 γ체) 등에 포섭된 복합체일 수 있다.
다음에 본 발명을 구체화한 실시예를 나타낸다. 이 실시예는 본 발명을 실시하는 당업자를 보조하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떠한 양식에 있어서도 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위에서 변화시킬 수 있다. 이하의 실시예에 기재된 「실온」은 0 내지 30℃를 나타낸다. 「%」는 특기하지 않는 한 중량 퍼센트를 의미한다.
실시예 1
(1) 마우스 ES세포 배지의 제작
ES세포를 증식시킬 목적으로, 둘베코 개질 이글 배지(Dulbe㏄o's Modified Eagle Medium)(이하 DMEM)(Invitrogen사제 11995)에, 이하에 나타내는 최종농도로 인자를 첨가해서 ES세포 배지를 조제했다. 15% 소 태아 혈청(Invitrogen사제) 또는 15% 녹아웃 혈청 리플레이스먼트:KSR(Invitrogen사제), 0.1mM β-메르캅토에탄올(SIGMA사제), 1×비필수 아미노산 스톡(Invitrogen사제 11140-050), 2mM L-글루타민(Invitrogen사제 25030-081), 103유닛/㎖ ESGRO(CHEMICON International Inc., 사제).
단, ESGRO는 마우스 LIF를 유효 성분으로서 함유한다. ES세포 분화 억제 어세이용의 배지로서 상기의 ES세포 배지로부터 ESGRO를 제거한 어세이 배지를 제작했다.
(2) 마우스 ES세포의 배양
직경 6㎝의 세포 배양용 접시에, 증류수에 0.1%의 농도로 젤라틴(SIGMA사제 TypeA;porcinESkin, G2500)을 용해시키고, 멸균한 0.1% 젤라틴 수용액 5㎖를 첨가하고, 37℃에서 30분 이상 정치했다. 젤라틴 수용액을 제거하고, 마이토마이신 C(쿄와 발효사제) 처리한 마우스 배아 초대 배양 세포(Invitrogen사제 YE9284400) 2×106개를 파종하고, 1O% 소 태아 혈청(Invitrogen사제)을 포함하는 DMEM 5㎖로, 37℃, 5% C02 인큐베이터(타바이에스펙사제)에서 5시간 이상 배양했다. 마우스 배아 줄기세포주 D3 ES세포(Rolf Kemler (Max Planck Institut fur Immunbiologie, Stuheweg 51, D-79108 Freiburg, Germany)로부터 입수 가능)를, 직경 6㎝ 섬유아세포 피더층 위에 파종하고, 5㎖의 ES배지에서 37℃, 5% C02 인큐베이터에서 2일간 배양해서 증식시켰다.
(3) 마우스 ES세포의 조제
상기의 (2) ES세포의 배양의 방법에 따라 배양한 D3 ES세포를 PBS로 2회 세정 후, 0.25% 트립신 용액(Invitrogen사제 15090-046)을 가해 37℃로 5분간 인큐베이션하고, 미분화의 D3 ES세포의 콜로니를 피더로부터 탈리시켰다. 5㎖의 ES세포 배지를 첨가하고, 소경 피펫을 사용해서 세포 콜로니를 분산시켜 50㎖의 멸균 튜브로 옮기고, 탁상 원심기(토미정공)로 1000rpm, 약 5분간 원심해서 펠렛화했다. 상청을 제거하고, 세포를 20㎖의 신선한 ES세포 배지에 재현탁하고, 0.1%의 젤라틴 수용액으로 미리 코팅한 직경 15㎝의 세포 배양용 접시에 파종하고, 37℃로 20분간 인큐베이션했다. 20분 후, 부유 세포를 포함하는 배지를 피펫으로 회수하고, 재차, 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 직경 15㎝의 세포 배양용 접시에 파종하고, 37℃로 20분간 인큐베이션했다. 부유 세포를 포함하는 배지를 50㎖의 멸균 튜브로 옮기고, 탁상 원심기로 1000rpm, 약 5분간 원심 후, 상청을 제거하고, 5㎖의 ES세포 어세이 배지에 재현탁하여 ES세포를 얻었다.
(4) ES세포 분화 억제제 어세이 1
상기의 (3) 마우스 ES세포의 조제로 얻은 D3 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 96구멍 세포 배양용 접시(FALCON사제 Cat.No.3072, 미국)에, 1웰당 3×102 내지 1×103개의 세포를, 1웰당의 ES세포 어세이 배지가 90㎕가 되도록 파종했다. 각 웰에 0.4 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 물, 또는 그 혼합물에 용해한 본 발명의 분화 억제제(A, B, C, D, E, F:A 내지 D는 아시넥스사(러시아), E 내지 F는 PHARMEKS사(러시아)로부터 구입), 또는 ESGRO를 10㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7일간 배양했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다. 또 컨트롤 웰에는 DMSO만을 최종 농도로 0.1%가 되도록 가했다. 화합물 A의 구조를 도 1에, 화합물 B 내지 F의 구조 를 도 2에 나타냈다.
(5) 알칼리포스파타아제 정량 1
ES세포의 알칼리포스파타아제 활성을, p-니트로페닐포스페이트 용액(MOSS Inn.사제, PRODUCTN0.NPPD-1000, 미국, 또는 SIGMA사제, A-3469, 미국제)(이하, p-NPP)를 이용해서 정량했다.
상기의 (4) ES세포 분화 억제제 어세이 1에 기재된 방법으로 7일간 배양한 ES세포의 각 웰로부터 배지를 흡인 제거하고, 그 세포를 100㎕의 인산 완충화 생리식염수(PBS)로 1회 세정 후, p-NPP 100㎕를 각 웰에 가해서 실온에서 10분간 정치했다. 각 웰에 12.5㎕의 8M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 용액의 405nm의 흡광도(0.D.405)와 690nm의 흡광도(O.D.690)를 흡광도계(Molecular Devices사제, 형식:SPECTRA MAX190)에 의해 측정하고, O.D.405-O.D.690으로 산출되는 값을 알칼리포스파타아제 활성으로 했다. 정량 결과를 그래프화한 것을 도 3에 나타냈다.
본 발명의 분화 억제제, 화합물 A 내지 F는 컨트롤인 DMSO(0.1%)에 비해 의미 있게 알칼리포스파타아제 활성을 증폭시켰다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 미분화인 ES세포의 배양을 지지한 것을 알 수 있다.
(6) 알칼리포스파타아제 염색 1
ES세포를 알칼리포스파타아제 키트(SIGMADiagnostic사제 Cat.No.86-R)를 이용해서 염색했다. 상기의 (4) ES세포 분화 억제 어세이 1에 기재된 방법으로 배양한 ES세포의 각 웰로부터 배지를 흡인 제거하고, 그 세포를 2㎖의 인산 완충화 생 리식염수(PBS)로 1회 세정 후, 2㎖의 세포 고정액(25㎖ 시트르산 용액(SIGMA사제 Cat, No.91-5), 65㎖ 아세톤, 8㎖ 37% 포름알데히드)을 각 구멍에 가해서 실온에서 30초 정치한다.
고정액을 흡인 제거하고, 2㎖의 탈 이온수를 각 구멍에 가해서 45초 실온에서 정치한다.
탈 이온수를 흡인 제거하고, 이어서 알칼리포스파타아제 염색액(1㎖ 아질산 나트륨 용액, 1㎖ 퍼스트 레드 바이올렛 LB 솔트 용액, 1㎖ 나프톨 AS-BI 알칼리 용액, 45㎖ 증류수)을 1웰당 2㎖ 가하고 15분간 실온에서 정치 후, 염색액을 흡인 제거하고, 탈 이온수 2㎖로 세정했다. 음성 컨트롤인 ESGRO 비존재하에서 배양한 ES세포, 양성 컨트롤인 ESGRO(1000유닛/㎖) 존재하에서 배양한 ES세포, 그리고, 본 발명의 분화 억제제인 화합물 B(4㎍/㎖) 존재하에서 배양한 ES세포의 염색상을 비교했다(도 4 참조). 화합물 B 존재하에서 배양한 ES세포는 ESGRO 비존재하에서 배양한 ES세포에 비해, 의미 있게 진하게 염색되어 있어 높은 알칼리포스파타아제 활성을 가지고 있는 것이 나타났다. 또한 본 발명의 분화 억제제는 양성 컨트롤인 ESGR0 존재하에서 배양한 ES세포와 동등한 미분화 콜로니를 형성시킬 수도 있었다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 ES세포의 미분화 상태에서의 증식을 강하게 지지한 것을 알 수 있다.
또한 화합물 A, C 내지 F에 대해서도 화합물 B와 같이 염색되었다.
(7) STAT3 활성화 어세이 1
실시예 1의 (3) 마우스 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 D3 ES세 포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 24구멍 세포 배양용 접시(FALCON Cat.No.3047, 미국)에, 1웰당 1×105개의 세포를, 1웰당의 ES세포 배지가 500㎕가 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 12시간 내지 24시간 배양했다. 다음에, LipofectAMINE 2000(Invitrogen사제, 미국)을 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라, pSTAT3-TA-Luc, 또는 pTA-Luc 벡터(Clontech사제, 미국)를 1웰당 0.9㎍을 ES세포에 트랜스펙션했다. 또한, 내부 컨트롤로서 pRL-TK벡터(Promega사제, 미국)를 각 웰 0.1㎍, 동시에 트랜스펙션했다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 배양 후, 배지를 흡인하고, PBS로 2회 세정한 후, ES어세이 배지를 각 웰 500㎕씩 가했다. 그 다음에, 각 웰에 0.4 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO) 또는 물 또는 그 혼합물에 용해한 분화 억제제, 또는 10 내지 10,000유닛/㎖가 되도록 ES어세이 배지에서 희석한 ESGRO를 50㎕ 첨가해서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6 내지 24시간 배양했다. 계속해서 픽카진듀얼·시판지(토요 잉크 제조사제, 일본)를 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라 각 세포의 루시페라아제·리포터 효소에 의한 발광 시그널을 측정했다. 도 5에 나타내는 바와 같이, ESGRO가 용량 의존적으로 pSTAT3-TA-Luc에 의한 리포터 효소의 발현을 항진시킨 것에 반해, 본 발명의 화합물 B는 리포터 효소의 발현을 유도하지 않았다.
또, 화합물 A, C 내지 F에 대해서도 같은 실험을 함으로써 리포터 효소의 발현의 유무를 확인할 수 있다.
실시예 2
(1) ES 세포분화 억제 어세이 2
실시예 1의 (3) 마우스 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 D3 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 직경 10㎝의 세포 배양용 접시에 8×104개의 세포를, ES세포 어세이 배지가 10㎖가 되도록 파종했다. 각 접시에 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 배지, 또는 그 혼합물에 용해한 본 발명의 분화 억제제(A 내지 F), 또는 104유닛/㎖에 조제한 ESGRO를 1㎖ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7일간 배양했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다.
(2) RNA의 단리 1
상기의 (1) ES세포분화 억제 어세이 2에 나타내는 방법으로 배양한 ES세포로부터 ISOGEN(주식회사 닛폰진사제, 일본)을 이용해서 첨부의 방법에 따라 토탈 RNA를 추출했다. 즉, 배양 후의 접시로부터 배지를 제거하고, PBS 10㎖로 2회 세정하여 ISOGENE 1㎖에 용해했다. 실온에서 5분간 정치한 후, 1.5㎖의 에펜도르프 튜브에 회수했다. 클로로포름(와코우순약)을 0.2㎖ 가해 15초간 진탕하고, 2 내지 3분간 실온에서 정치했다. 미량 원심기(토미정공)로 4℃, 10000rpm으로 15분간 원심했다. 상청 400㎕를 새로운 1.5㎖의 에펜도르프 튜브에 옮기고, 500㎕의 이소프로판올(와코우순약)을 가해 실온에서 10분간 정치 후, 미량 원심기로 4℃, 10000rpm으로 10분간 원심했다. 상청을 제거 후, 70% 에탄올 수용액을 1㎖ 가해 진탕한 후, 미량 원심기로 4℃, 10000rpm, 약 5분간 원심했다. 상청액을 제거하고 침전을 건조시킨 후, 30㎕의 증류수에 용해시켜 토탈 RNA용액을 얻었다.
이렇게 해서 얻어진 토탈 RNA 2㎍을 주형에, DeoxyribonucleaseI(Amplification Grade)(Invitrogen사제), Oligo(dT)12-18 프라이머(Invitrogen사제 18418-012), 옴니스크립트리버스트랜스크립타아제(QIAGEN사제)를 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 즉, 토탈 RNA 2㎍에 1㎕의 10×DNaseI 반응 완충액 1㎕의 10×DNaseI(이상 Invitrogen사제)와 증류수를 가해 10㎕가 되도록 한 반응액을 제작하고, 실온에서 10분간 인큐베이션했다. 25mM EDTA 용액을 1㎕ 가하고, 65℃로 10분간 가열했다. 실온으로 되돌린 후, 2㎕의 10×RT 완충액, 2㎕의 5mM dNTP Mix, 2㎕의 Oligo(dT)12-18 프라이머, 0.25㎕의 RNaseOUT(Invitrogen사제, 10777-019), 1㎕의 옴니스크립트(Omniscript) 역전사효소를 가하고, RNase 무함유 정제수로 전량 20㎕에 맞추어 37℃로 60분간 인큐베이션하여 cDNA 용액을 얻었다. 이렇게 해서 얻은 합성 cDNA의 일부를 증류수로 5배로 희석하고, 그 2㎕를 주형으로 해서 라이트사이클러퍼스트스타트 DNA 마스터 SYBR 그린I 키트(로슈·다이아그노스틱사제)를 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라 PCR을 했다. Oct-3/4 유전자, 및 내부 표준으로서 글리세로알데히드3인산데히드로게나아제(GAPDH) 유전자의 발현량을 측정했다. Oct-3/4 유전자의 증폭에는 센스 프라이머 OCT3 up(서열표 서열 1), 및 안티센스 프라이머 0ct3 down(서열표 서열 2)를 이용하고, GAPDH 유전자의 증폭에는 센스 프라이머 GAPDH up(서열표 서열 3), 및 안티센스 프라이머 GAPDH down(서열표 서열 4)을 이용했다. PCR 반응액의 조성과 반응 조건을 이하에 각각 나타낸다.
Oct-3/4 유전자 정량 PCR 반응액 조성
25mM Mgcl2 5μM 센스 프라이머 5μM 안티센스 프라이머 cDNA(5배 희석) 라이트사이클러-퍼스트스타트 DNA 마스터 H2O 1.6㎕ 1.0㎕ 1.0㎕ 2.0㎕ 2.0㎕ 12.4㎕
계 20.0㎕
Oct-3/4 유전자 정량 PCR 반응 조건
스텝 프로그램 사이클수 구분 온도(℃) 시간(sec) 온도 변화 속도 (℃/sec)
1 2 3 변성 증폭 융해곡선 해석 1 45 1 1 1 2 3 1 2 3 95 95 55 72 95 65 96 600 15 10 20 0 10 0 20 20 20 20 20 1 0.1
본 발명의 분화 억제제(B, D, F) 존재하에서 배양한 ES세포의 Oct-3/4 유전자의 발현은 분화 억제제를 포함하지 않는 배지에서 배양한 ES세포에 비해 의미 있게 항진되어 있고, ESGRO 1,000유닛/㎖와 동등한 Oct-3/4 유전자 발현 유지 효과가 인지되었다(도 6). 즉, 본 발명의 분화 억제제(B, D, F)는 ES세포의 미분화를 유지하는 것이 Oct-3/4 유전자의 발현량으로부터 확인되었다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 분화 억제제, 화합물 B, D, F가 ES세포의 미분화 상태를 유지하는 것이 Oct-3/4 유전자의 발현량으로부터도 나타났다.
또, 분화 억제제 A, C, E에 대해서도 같은 검토를 한 바, 분화 억제제(B, D, F)와 마찬가지로 Oct-3/4 유전자의 발현을 유지했다. 즉, ES세포의 미분화를 유지했다.
(3) ES세포 분화 억제 어세이 3
실시예 1의 (3) 마우스 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 D3 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 직경 10㎝의 세포 배양용 접시에 7.85×105개의 세포를, ES세포 어세이 배지가 10㎖가 되도록 파종했다. 각 접시에는 본 발명의 분화 억제제 B를 최종 농도 4㎍/㎖로, 또는 ESGRO를 최종 농도 1×103유닛/㎖로 배지에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 배양했다.
(4) RNA의 단리 2
상기 (3) ES세포 분화 억제 어세이 3에 나타내는 방법으로 배양한 ES세포로부터 ISOGEN(주식회사 닛폰진사제, 일본)을 이용해서 첨부의 방법에 따라 토탈 RNA를 추출했다. 즉, 세포를 15㎖의 멸균 튜브에 회수하고, 탁상 원심기(토미정공)로 1,000rpm, 약 5분간 원심해서 펠렛화했다. 상청을 제거하고, PBS 10㎖로 2회 세정 후, 1.5㎖의 에펜도르프 튜브에 옮겼다. ISOGENE 1㎖에 용해시키고, 실온에서 5분간 정치한 후, 클로로포름(와코우순약)을 0.2㎖ 가해 15초간 진탕하고, 2 내지 3분간 실온에서 정치했다. 미량 원심기(토미정공)로 4℃, 10,000rpm으로 15분간 원심했다. 상청 400㎕를 새로운 1.5㎖의 에펜도르프 튜브에 옮기고, 500㎕의 이소프로판올(와꼬순약)을 가해 실온에서 10분간 정치 후, 미량 원심기로 4℃, 10,000rpm으로 10분간 원심했다. 상청을 제거 후, 70% 에탄올 수용액을 1㎖ 가해 진탕한 후, 미량 원심기로 4℃, 10,000rpm, 약 5분간 원심했다. 상청액을 제거하고 침전을 건조시킨 후, 30㎕의 증류수에 용해시켜 토탈 RNA용액을 얻었다.
이렇게 해서 얻어진 토탈 RNA의 2㎍을 주형에, 데옥시리보뉴클레아제I(DeoxyribonucleaseI)(증폭 등급)(Invitrogen사제), RT-PCR용 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen사제, 18080-051)을 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 즉, 2㎍의 토탈 RNA에 1㎕의 10×DNaseI 반응 완충액, 1㎕의 10×DNaseI(이상 Invitrogen사)을 가해서 증류수로 10㎕가 되도록 한 반응액을 제작하고, 실온에서 10분간 인큐베이션했다. 1㎕의 25mM EDTA 용액을 가해 65℃로 10분간 가열하고, 실온으로 되돌린 후, 반응액을 8㎕ 취해, 1㎕의 50mM Oligo(dT) 20프라이머, 1㎕의 10mM dNTP Mix를 가해 65℃로 5분간 인큐베이션했다. 얼음 중에 1분간 둔 후, 2㎕의 10×RT 완충액, 4㎕의 25mM MgCl2, 2㎕의 0.1M DTT, 1㎕의 RNaseOUT(Invitrogen사제), 그리고, 1㎕의 SuperScriptIIIRT를 가해 50℃로 50분간 인큐베이션했다. 계속해서 85℃로 5분간 인큐베이션 한 후, 얼음 중에 1분간 두었다. 1㎕의 RNaseH를 가하고, 37℃로 20분간 인큐베이션해서 cDNA를 얻었다. 이렇게 해서 얻은 합성 cDNA의 일부를 증류수로 5배로 희석하고, 그 2㎕를 주형으로 해서 라이트 사이클러 퍼스트 스타트 DNA 마스터 SYBR 그린I 키트(로슈·다이아그노스틱사제)를 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라 PCR을 했다. Nanog 유전자, 및 내부 표준으로서 글리세로알데히드3인산데히드로게나아제(GAPDH) 유전자의 발현량을 측정했다. Nanog 유전자의 증폭에는 센스 프라이머 Nanog_up(서열표 서열 5), 및 안티센스 프라이머 Nanog_down(서열표 서열 6)을 이용하고, GAPDH 유전자의 증폭에는 센스 프라이머 GAPDH up(서열표 서열 3), 및 안티센스 프라이머 GAPDH down(서열표 서열 4)을 이용했다. PCR 반응액의 조성 및 반응 조건을 이하에 나타낸다.
Nanog 유전자 정량 PCR 반응액 조성
25mM Mgcl2 5μM 센스 프라이머 5μM 안티센스 프라이머 cDNA(5배 희석) 라이트사이클러-퍼스트스타트 DNA 마스터 H2O 2.4㎕ 1.0㎕ 1.0㎕ 2.0㎕ 2.0㎕ 11.6㎕
계 20.0㎕
Nanog 유전자 정량 PCR 반응 조건
스텝 프로그램 사이클수 구분 온도(℃) 시간(sec) 온도 변화 속도 (℃/초)
1 2 3 변성 증폭 융해곡선 해석 1 45 1 1 1 2 3 1 2 3 95 95 58 72 95 65 96 600 15 10 20 0 10 0 20 20 20 20 20 1 0.1
본 발명의 분화 억제제 B 존재하에서 배양한 ES세포의 Nanog 유전자의 발현량은 분화 억제제를 포함하지 않는 배지, 및, ESGR0 1,000유닛/㎖를 포함하는 배지에서 배양한 ES세포에 비해 의미 있게 증가되어 있었다(도 7). 즉, 본 발명의 분화 억제제 B는 ES세포의 미분화를 유지하는 효과를 가지는 것이 Nanog 유전자의 발현량으로부터 확인되었다.
또, 분화 억제제 A, C, D, E, F에 대해서도 같은 검토를 한 바, 분화 억제제 B와 마찬가지로 Nanog 유전자의 발현량을 증가시켰다. 즉, ES세포의 미분화를 유지하는 활성을 가지는 것이 밝혀졌다.
(5) SSEA-1 항원의 발현량 평가 1
상기의 (1) ES세포 분화 억제 어세이 2로 배양한 세포를 PBS로 2회 세정하여 셀 스크레이퍼로 세포를 접시로부터 탈리시켰다. 세포수가 6×105개가 되도록 2% FBS를 포함하는 한크스 균형 염 용액(Hanks balanced salt solution)(HBSS, Invitrogen사제)를 300㎕ 가했다. HBSS로 50배 희석한 MX-SSEA-1 항체(Kyowa Medex사제)를 30㎕ 가하고 40분간, 얼음 위에서 정치했다. HBSS(1㎖)로 2회 세정 후, HBSS(300㎕)에 재분산하고, HBSS로 20배로 희석한 FITC-염소 항 마우스 IgM 항체(ZYMED사제)를 30㎕ 가하고 30분간, 차광하고 얼음 위에서 정치했다. HBSS(1㎖)로 2회 세정 후, HBSS(1㎖)에 재분산하고, 20㎍/㎖ PI 용액(Dojindo사제)을 100㎕ 가하여 플로사이트미터 측정에 이용하는 샘플을 얻었다. 또 플로사이트미터 측정에 이용하는 샘플은 응집덩어리를 제거할 목적으로 공경 100㎛의 나일론·메쉬에 통과시킨 후에 측정을 했다. 플로사이트미터는 FACSCalibur(BECTON DICKINSON사제)를 이용해서 측정 조건 데이터 수집 해석 소프트웨어는 CELLQuest(BECTON DICKINSON사제)를 이용했다. 결과를 도 8에 나타냈다. 각 분화 억제제를 첨가해서 배양한 세포의, 1세포당의 평균 형광 강도, 즉, 1세포당의 SSEA-1 항원 발현 강도는 분화 억제제를 포함하지 않는 배지에서 배양한 세포에 비해 의미 있게 항진되어 있었다. 또한, 화합물 A, C, E에 대해서 같은 실험을 한 바, 마찬가지로 SSEA-1의 발현 레벨이 의미 있게 높은 것을 나타냈다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 미분화인 ES세포를 유지하는 것이 밝혀졌다.
실시예 3
인돌 유도체 a 내지 o에 대해서도 같은 실험을 해서 이하의 결과를 얻었다.
(1) ES 세포분화 억제 어세이 4
실시예 1의 (3) 마우스 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 D3 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 96구멍 세포 배양용 접시(FALCON사제 Cat.No.3072, 미국)에, 1웰당 3200개의 세포를, 1웰당의 ES세포 어세이 배지가 100㎕가 되도록 파종했다. 각 웰에 0.4 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 물, 또는 그 혼합물에 용해한 본 발명의 분화 억제제(a 내지 o:a, j 내지 m은 IF LAB Ltd.사, 우크라이나, b, c, f, n은 PHARMEKS사, 러시아, d, e, o는 SPECS사, 네델란드, g 내지 i는 CHEMBRIDGE사, 미국으로부터 구입), 또는 ESGRO를 10㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4일간 배양했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다. 또 컨트롤 웰에는 DMSO만을 최종 농도로 0.1%가 되도록 가했다. 분화 억제제 a 내지 o의 구조를 도 9에 나타냈다.
(2) 알칼리포스파타아제 정량 2
ES세포의 알칼리포스파타아제 활성을, p-니트로페닐포스페이트 용액(M0SS Inc.사제, PRODUCTNO.NPPD-1000, 미국, 또는 SIGMA사제, A-3469, 미국제)(이하, p-NPP)을 이용해서 정량했다. 상기의 (1) ES세포 분화 억제 어세이 4에 기재된 방법으로 4일간 배양한 ES세포의 각 웰로부터 배지를 흡인 제거하고, 그 세포를 100㎕의 인산 완충화 생리식염수(PBS)로 1회 세정 후, p-NPP 100㎕를 각 웰에 가해서 실온에서 10분간 정치했다. 각 웰에 12.5㎕의 8M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 용액의 405nm의 흡광도(O.D.405)와 690nm의 흡광도(O.D.690)를 흡광도계(Molecular Devices사제, 형식:SPECTRAMAX190)에 의해 측정하고, O.D.405-O.D.690으로 산출되는 값을 알칼리포스파타아제 활성으로 했다. 정량결과를 그래프한 것을 도 10에 나타냈다. 본 발명의 분화 억제제, 화합물 a 내지 o는 컨트롤인 DMSO(0.1%)에 비해 의미 있게 알칼리포스파타아제 활성을 증폭시켰다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 미분화인 ES세포의 배양을 지지했다.
(3) ES세포 분화 억제 어세이 5
실시예 1의 (3) 마우스 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 D3 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 직경 10㎝의 세포 배양용 접시에 8×104개의 세포를, ES세포 어세이 배지가 10㎖가 되도록 파종했다. 각 접시에 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 배지, 또는 그 혼합물에 용해한 본 발명의 분화 억제제(a 내지 o), 또는 ESGRO를 1㎖ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4일간 배양했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다.
(4) SSEA-1 항원의 발현량 평가 2
상기의 (3) ES세포 분화 억제 어세이 5로 배양한 세포를 PBS로 2회 세정하고, 셀 스크레이퍼로 세포를 접시로부터 탈리시켰다. 세포수가 6×105개가 되도록 2% FBS를 포함하는 한크스 균형 염 용액(HBSS, Invitrogen사제)를 300㎕ 가했다. HBSS로 50배 희석한 MX-SSEA-1 항체(Kyowa Medex사제)를 30㎕ 가하고 40분간, 얼음 위에서 정치했다. HBSS(1㎖)로 2회 세정 후, HBSS(300㎕)에 재분산하고, HBSS로 20배 FITC-염소 항 마우스 IgM 항체(ZYMED사제)를 30㎕ 가하고 30분간, 차광하여 얼음 위에서 정치했다. HBSS(1㎖)로 2회 세정 후, HBSS(1㎖)에 재분산하고, 20㎍/㎖ PI용액(Dojindo사제)을 100㎕ 가하여 플로사이트미터 측정에 이용하는 샘플을 얻었다. 또 플로사이트미터 측정에 이용하는 샘플은 응집덩어리를 제거할 목적으로 공경 100㎛의 나일론·메쉬에 통과시킨 후에 측정을 했다. 플로사이트미터는 FACSCalibur(BECTON DIKINSON사제, 미국)를 이용해서 측정 조건 데이터 수집 해석 소프트웨어는 CELLQuest(BECTON DICKINSON사제, 미국)를 이용했다. 결과를 도 11에 나타냈다. 각 분화 억제제를 첨가해서 배양한 세포의, 1세포당의 평균 형광 강도, 즉, 1세포당의 SSEA-1 항원 발현 강도는 분화 억제제를 포함하지 않는 배지에서 배양한 세포에 비해 의미 있게 항진되어 있었다. 또한, 화합물 b 내지 o에 대해서 같은 실험을 한 바, 마찬가지로 SSEA-1의 발현 레벨이 의미 있게 높은 것을 나타냈다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 미분화인 ES세포를 유지하는 것이 밝혀졌다.
(5) STAT3 활성화 어세이 2
실시예 1의 (3) ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 D3 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 24구멍 세포 배양용 접시(FALCON Cat.No.3047, 미국)에, 1웰당 1×105개의 세포를, 1웰당의 ES세포 배지가 500㎕가 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 12시간 내지 24시간 배양했다. 다음에, LipofectAMINE 2000(Invitrogen사제, 미국)을 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라, pSTAT3-TA-Luc, 또는 pTA-Luc 벡터(Clontech사제, 미국)를 1웰당 0.9㎍을 ES세포에 트랜스펙션했다. 또한, 내부 컨트롤로서 pRL-TK벡터(Promega사제, 미국)를 각 웰 0.1㎍, 동시에 트랜스펙션했다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 배양 후, 배지를 흡인하고, PBS로 2회 세정한 후, ES어세이 배지를 각 웰 500㎕씩 가했다. 그 다음에, 각 웰에 0.4 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO) 또는 물 또는 그 혼합물에 용해한 분화 억제제, 또는 10 내지 10,000유닛/㎖가 되도록 ES어세이 배지에서 희석한 ESGRO를 50㎕ 첨가해서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6 내지 24시간 배양했다. 계속해서 피카진듀얼·시판지(토요 잉크 제조사제, 일본)를 이용해서 첨부의 프로토콜에 따라, 각 세포의 루시페라아제·리포터 효소에 의한 발광 시그널을 측정했다. 도 12에 나타내는 바와 같이, ESGRO가 pSTAT3-TA-Luc에 의한 리포터 효소의 발현을 항진시킨 것에 반해, 본 발명의 화합물 b는 리포터 효소의 발현을 유도하지 않았다.
또, 화합물 a, c 내지 o에 대해서도 같은 실험을 함으로써 리포터 효소의 발현의 유무를 확인할 수 있다.
실시예 4:ES세포의 계대 배양
실시예 1의 (3) 마우스 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 ES 세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 직경 6㎝의 세포 배양용 접시에 3×105개의 세포를, ES 세포 어세이 배지가 4.5㎖가 되도록 파종했다. 각 접시에 10 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 배지, 또는 그 혼합물에 용해한 본 발명의 분화 억제제(A 내지 F, a 내지 o), 또는 104유닛/㎖의 ESGRO를 0.5㎖ 첨가했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다. DMSO만의 컨트롤은 배지에서 희석한 1% 농도액을 0.5㎖ 가해 최종 농도 0.1%로 했다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7일 내지 30일 배양했다. 배지는 매일 교환하고, 2 내지 3일마다 3×105개/접시가 되도록 계대했다.
본 발명의 분화 억제제를 이용해서 7일, 또는 30일간 배양한 ES세포의 알칼리포스파타아제 활성을 콜로니 어세이에 의해 정량했다. 즉, 상기의 방법으로 계대 배양한 ES세포를, 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 96구멍 세포 배양용 접시(FALCON사제 Cat.No.3072, 미국)에, 1웰당 1×103개의 세포를, 1웰당의 ES세포 어세이 배지가 90㎕가 되도록 파종했다. 각 웰에 0 내지 103유닛/㎖가 되도록 배지에서 희석한 ESGRO를 10㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4일간 배양했다. 각 웰로부터 배지를 흡인 제거하고, 세포를 100㎕의 인산 완충화 생리식염수(PBS)로 1회 세정 후, p-NPP 100㎕를 각 웰에 가해서 실온에서 10분간 정치했다. 각 웰에 12.5㎕의 8M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 용액의 405nm의 흡광도(O.D.405)와 690nm의 흡광도(O.D.690)를 흡광도계(Molecular Devices사제, 형식:SPECTRA MAX190)에 의해 측정하고, O.D.405-O.D.690으로 산출되는 값을 알칼리포스파타아제 활성으로 했다. 화합물 B를 첨가해서 30일간 계대 배양한 ES세포의 알칼리포스파타아제 정량 결과를 도 13에, 화합물 f를 첨가해서 무혈청 배지에서 7일간 계대 배양한 ES세포의 알칼리포스파타아제 정량 결과를 도 14에 나타냈다.
본 발명의 분화 억제제, 화합물 B 및 f로 계대 배양한 ES세포는 DMSO(0.1%)로 배양한 ES세포에 비해 의미 있게 알칼리포스파타아제 활성을 증폭시켰다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 ES 세포의 미분화 상태를 장기 배양에 있어서도 지지한 것을 알 수 있다.
또, 분화 억제제 A, C 내지 E, a 내지 o에 대해서도 같은 검토를 한 바, 분화 억제제(B, f)와 마찬가지로 알칼리포스파타아제의 활성을 유지했다. 즉, ES세포의 미분화를 유지했다.
실시예 5
(1) 카니쿠이자루 ES세포의 배양
카니쿠이자루 ES세포 배양 배지로서 DME/F-12, 1:1(SIGMA D6421)에, 이하에 나타내는 최종 농도로 인자를 첨가해서 카니쿠이자루 ES세포 배지를 조제했다. 20% 녹아웃 혈청 리플레이스먼트:KSR(Invitrogen사제 10828-028), 1×비필수 아미노산(SIGMA M7145), 2mM L-글루타민(SIGMA G7513), 1mM 피루브산나트륨(SIGMA S8636), 1×페니실린/스트렙토마이신 용액(SIGMA P0781). 또한, 카니쿠이자루 ES세포 배양용의 마우스 피더 세포용의 배지로서 DMEM(Invitrogen사제 11960-044)에, 이하에 나타내는 최종 농도로 각 인자를 첨가해서 조제했다. 10% 소 태아 혈청(Invitrogen사제), 2mM L-글루타민(SIGMA G7513), 1×페니실린/스트렙토마이신 용액(SIGMA P0781).
직경 6㎝의 세포 배양용 접시에, 증류수에 0.1%의 농도로 젤라틴(SIGMA사제 TypeA: porcinESkin, G2500)을 용해시키고, 멸균해서 제작한 0.1% 젤라틴 수용액 5㎖를 첨가해서 37℃에서 30분 이상 정치했다. 젤라틴 수용액을 제거하고, 마이토마이신 C(쿄와 발효사제) 처리한 마우스 배아 초대 배양 세포(Invitrogen사제 YE9284400) 2×106개를 파종하고, 상기의 피더 세포용 배지를 이용해서 37℃, 5% CO2 인큐베이터(타바이에스펙사제)로 5시간 이상 배양했다. 카니쿠이자루 ES세포(타나베 제약 주식회사제)를, 마우스 배아 초대 배양 세포에 파종하고, 5㎖의 카니쿠이자루 ES세포 배양 배지에서, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3일간 배양해서 증식시켰다.
(2) 카니쿠이자루 ES세포의 조제
상기의 (1) 카니쿠이자루 ES세포의 배양에 기재된 방법에 따라 배양한 카니쿠이자루 ES세포를 PBS로 세정 후, DMEM(Invitrogen사제 11960-044)에 용해한 0.1%콜라게나아제 용액(Wako사제 032-10534) 또는 트립신 용액(2.5% 트립신 용액(Invitrogen사제 15090-046)을 10㎖, 녹아웃 혈청 리플레이스먼트(Knockout Serum Replacement)(Invitrogen사제 10828-028)를 20㎖, 100mM CaCl2 수용액을 1㎖, PBS를 69㎖ 혼합함으로써 조제)을 가해 37℃로 5분간 인큐베이션했다. 5㎖의 카니쿠이자루 ES세포 배양 배지를 첨가하고, 소경 피펫을 사용해서 세포 콜로니를 탈리 후, 분산시켜 15㎖의 멸균 튜브로 옮기고, 탁상 원심기(토미정공)로 1000rpm, 약 5분간 원심해서 펠렛화했다. 상청을 제거하고, 세포를 5㎖의 신선한 ES세포 배지에 재현탁하여 카니쿠이자루 ES세포를 얻었다.
(3) 마트리겔 코팅 접시의 제작
그로스팩터리듀스드(GFR) BD 마트리겔(일본 벡톤·디킨슨사제, 354230, 일본) 및 BD 마트리겔 기저막 매트릭스(일본 벡톤·디킨슨사제, 354234)를 2 내지 8℃의 냉장고에서 하룻밤 해동하고, 차게 한 피펫을 이용해서 천천히 혼합했다. 냉각한 DMEM/F12 1:1(Sigma사제, D6421, 미국)로 마트리겔을 20배 희석하고, 배양 접시에 가해서 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 용액을 제거하고 DMEM/F12 1:1로 세정하여 마트리겔 코팅 접시를 얻었다.
(4) ES세포 분화 억제제 어세이 6
상기의 (2) 카니쿠이자루 ES세포의 조제에 기재된 방법에 따라 조제한 카니쿠이자루 ES세포를 3 내지 5배로 배지에서 희석하고, 미리 마트리겔(일본 벡톤·디킨슨사제)로 코팅한 직경 6㎝의 세포 배양용 접시 1매당 4.5㎖를 파종했다. 그 다음에, 각 접시에 8 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 배지, 또는 그 혼합물에 용해한 본 발명의 분화 억제제(A 내지 F, a 내지 o) 및 6-브로모인디루빈-3옥심을 0.5㎖ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 2 내지 4일 마다 상기 (2) 카니쿠이자루 ES 세포의 조제에 기재된 방법에 따라 계대했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다. 이상의 배양 세포를 상기 실시예 1에 기재된 알칼리포스파타아제 염색에 의해 평가를 했다.
화합물 B 또는 화합물 f를 첨가 후, 2일간 배양한 세포의 알칼리포스파타아제 염색의 결과를 총 콜로니수에 대한 염색된 콜로니수의 비율로서 도 15에, 6-브로모인디루빈-3옥심 비존재하 또는 존재하, 화합물 f를 첨가하고, 3일간 배양 후 계대하여, 3일 후의 알칼리포스파타아제 염색 사진을 도 16에 나타냈다.
본 발명의 분화 억제제, 화합물 B 및 f로 배양한 카니쿠이자루 ES세포는 DMSO(0.1%)로 배양한 카니쿠이자루 ES세포에 비해 의미 있게 알칼리포스파타아제 염색된 콜로니의 비율이 많았다. 또한, 화합물 f 존재하에서 계대 배양한 카니쿠이자루 ES세포는 DMSO 존재하에서 계대 배양한 카니쿠이자루 ES세포에 비해, 의미 있게 염색되어 있었다. 또한 6-브로모인디루빈-3옥심 존재하에서는 화합물 f의 효과는 증강되었다. 즉, 본 발명의 분화 억제제는 카니쿠이자루 ES세포의 미분화 상태를 지지한 것이 알 수 있다. 또한 화합물 A, C 내지 E, a 내지 e, g 내지 o에 대해서도 같은 검토를 한 바, 분화 억제제(B, f)와 마찬가지로 알칼리포스파타아제의 활성을 유지했다. 즉, 카니쿠이자루 ES세포의 미분화를 유지했다.
실시예 6:화합물의 제조 방법
[1] 3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니덴-1-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00031
벤젠에 2-시아노아세트아미드(Aldrich사, 미국)를 가하여 교반하면서, 10℃로 올라가지 않도록 천천히 농황산을 적하하였다. 실온으로 되돌린 후, 디메틸벤질카르비놀(Lancaster사, 영국)을 가하였다. 약 30분간 환류하여 실온에 방랭 후, 반응 혼합액을 빙수에 따랐다. 추출한 수상을 중화하여 생긴 침전을 여별하였다. 건조 후, 이소프로판올로 재결정함으로써 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=217(M+1)
[2] 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00032
p-아미노아세토페논(Aldrich사, 미국)을 벤젠에 용해시켜 염산가스를 통기시키고, 얻어진 침전을 여별하여 이소프로판올에 의해 재결정함으로써 p-아미노아세토페논염산염을 얻었다. 얻어진 p-아미노아세토페논염산염을 20% 에탄올 수용액에 용해시키고, 빙욕하, 농염산으로 산성으로 하였다. 아질산 나트륨 수용액을 적하하고, 요소로 처리함으로써 디아조늄염 용액을 얻었다.
3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니덴-1-아세트아미드를 20% 에탄올 수용액에 용해시키고, 농염산을 가하였다. 10℃를 넘지 않도록 온도를 조정하고, 이전의 다아조늄염 용액을 가하였다. 반응액이 변화하고, 교반하면서 포화 아세트산 나트륨 수용액을 가하였다. 얻어진 침전을 여별 후, 이소프로판올로 재결정함으로써 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=363(M+1)
[3] 2-(3-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00033
m-아미노아세토페논(Aldrich사, 미국)을 벤젠에 용해시켜 염산가스를 통기시키고, 얻어진 침전을 여별하여 이소프로판올에 의해 재결정함으로써 p-아미노아세토페논염산염을 얻었다. 얻어진 p-아미노아세토페논염산염을 20% 에탄올 수용액에 용해시키고, 빙욕하, 농염산으로 산성으로 하였다. 아질산 나트륨 수용액을 적하하고, 요소로 처리함으로써 다아조늄염 용액을 얻었다.
3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니덴-1-아세트아미드를 20% 에탄올 수용액에 용해시키고, 농염산을 가하였다. 10℃를 넘지 않도록 온도를 조정하고, 이전의 다아조늄염 용액을 가하였다. 반응액이 변화하고, 교반하면서 포화 아세트산 나트륨 수용액을 가하였다. 얻어진 침전을 여별 후, 이소프로판올로 재결정함으로써 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=363(M+1)
[4] 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(2,3,3-트리메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00034
아세토니트릴에 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드(아시넥스사, 러시아) 및 탄산나트륨을 가하고, 요오드화메틸의 아세토니트릴 용액을 천천히 적하하여 환류하였다. 환류물을 실온까지 방랭 후, 용매를 감압류거하고, 잔사를 디클로로메탄에 용해시켜 증류수로 세정하였다. 그 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=377(M+1)
[5] 2-(2-아세틸-3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-아세틸-페닐아조)-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00035
빙욕하, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드(아시넥스사, 러시아) 및 디메틸아미노피리딘을 피리딘에 용해시키고, 무수 아세트산을 가하였다. 정지 후, 상기 반응 후의 용매를 빙수에 따르고, 디클로로메탄에 의해 반응 생성물을 추출하였다. 반응 생성물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=405(M+1)
[6] (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세토니트릴의 합성
Figure 112005076299484-PCT00036
빙욕하, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드(아시넥스사, 러시아), 염화티오닐 및 DMF를 혼합하여 천천히 교반하였다. 혼합 용매로부터 과잉의 염화티오닐을 감압류거하고, 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=345(M+1)
[7] (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산의 합성
Figure 112005076299484-PCT00037
에탄올에 수산화 칼륨 및 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드(아시넥스사, 러시아)를 가해 가열 환류하였다. 환류물을 실온까지 방랭 후, 여기에 증류수를 가하고, 다시 염산을 가해 중성으로 한 후, 에테르로 반응 생성물을 추출하였다. 반응 생성물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=364(M+1)
[8] (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산 에틸에스테르의 합성
Figure 112005076299484-PCT00038
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산을 에탄올에 현탁하여 교반하였다. 냉각하면서 염화티오닐을 천천히 적하하고, 그 후, 실온에서 교반하였다. 혼합 용매로부터 용매를 감압류거하고, 물로 세정하였다. 반응 생성물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=392(M+1)
[9] 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-메틸-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00039
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산, 메틸아민, HOBt(Advanced ChemTech사, 미국) 및 트리에틸아민을 DMF에 용해시키고, HBTU(Advanced ChemTech사, 미국)의 디클로로메탄 용액을 가하고, 그 후, 실온에서 교반하였다. 교반 혼합 용매를 포화 염화나트륨 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 반응 생성물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=377(M+1)
[10] 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N,N-디메틸-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00040
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산, 메틸아민, HOBt(Advanced ChemTech사, 미국) 및 트리에틸아민을 DMF에 용해시키고, HBTU(Advanced ChemTech사, 미국)의 디클로로메탄 용액을 가하고, 그 후, 실온에서 교반하였다. 교반 혼합 용매를 포화 염화나트륨 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 반응 생성물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=391(M+1)
[11] 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-페닐-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00041
(4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산, 페닐아민, HOBt(Advanced ChemTech사, 미국) 및 트리에틸아민을 DMF에 용해시키고, HBTU(Advanced ChemTech사, 미국)의 디클로로메탄 용액을 가하고, 그 후, 실온에서 교반하였다. 교반 혼합 용매를 포화 염화나트륨 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 반응 생성물을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 여별한 후, 용매를 감압류거하였다. 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=439(M+1)
[12] 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-1,2,3,4-테트로히드로-이소퀴놀린-1-일)-아세트아미드의 합성
Figure 112005076299484-PCT00042
질소 기류하, 아세토니트릴에 2-(4-아세틸-페틸아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드(아시넥스사, 러시아)를 용해한 것에, 트리페닐주석 수소화물(Aldrich, 미국)을 용해한 크실렌을 가해 환류하였다. 환류물을 실온까지 방랭하고, 불용물을 여별하였다. 여과액으로부터 용매를 감압류거하고, 반응 생성물을 포함하는 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
MS(m/z)=365(M+1)
실시예 7
(1) ES세포 분화 억제 어세이 7
실시예 1의 (2) 마우스 ES세포의 배양에 기재된 방법을 이용해서 배양한 D3 ES세포를 PBSP로 2회 세정하였다. 0.25% 트립신 용액(Invitrogen사제)를 가해 37℃로 5분간 인큐베이션하고, 미분화의 D3 ES세포의 콜로니를 피더로부터 탈리시켰다. 5㎖의 ES세포 배지를 첨가하고, 소경 피펫을 사용해서 세포 콜로니를 분산시켜 15㎖의 멸균 튜브로 옮기고, 탁상 원심기(토미정공)로 800rpm, 약 5분간 원심해서 펠렛화했다. 상청을 제거하고, 세포를 5㎖의 신선한 ES세포 배지에 재현탁하고, 0.1%의 젤라틴 수용액으로 미리 코팅한 직경 10㎝의 세포 배양용 접시에 파종하고, 37℃로 20분간 인큐베이션했다. 20분 후, 부유 세포를 포함하는 배지를 피펫으로 회수하여 15㎖의 멸균 튜브로 옮기고, 탁상 원심기로 1000rpm, 약 5분간 원심시켜 펠렛화한 후, 상청을 제거하고 5㎖의 ES세포 어세이 배지에 재현탁한다. 미리 0.1%의 젤라틴 수용액으로 코팅한 24구멍 세포 배양용 접시(FALCON사제 Cat.No.3047, 미국)에, 1웰당 3×102 내지 1×103개의 세포를, 1웰당의 ES세포 어세이 배지가 500㎕가 되도록 파종했다. 각 웰에 0.4 내지 40㎍/㎖가 되도록 디메틸술폭시드(DMSO), 또는 물, 또는 그 혼합물에 용해시킨 실시예 6에 기재된 방법을 이용해서 제조한 화합물 ① 내지 ⑩, 또는 ESGRO를 50㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7일간 배양했다. DMSO의 배지 안으로의 반입은 최종 농도 0.1% 이하가 되도록 했다. 또 컨트롤 웰에는 DMSO만을 최종 농도로 0.1%가 되도록 가했다. 화합물 ①의 구조를 도 17에, 화합물 ② 내지 ⑩의 구조를 도 18에 나타냈다.
(2) 알칼리포스파타아제 염색
ES세포를 알칼리포스파타아제 키트(SIGMADiagnostic사제 Cat.No.86-R)를 이용해서 염색했다. 상기 「ES세포 분화 억제 어세이」에 기재된 방법으로 배양한 ES세포의 각 웰로부터 배지를 흡인 제거하고, 그 세포를 0.5㎖의 인산 완충화 생리식염수(PBS)로 1회 세정 후, 0.5㎖의 세포 고정액(25㎖ 시트르산 용액(SIGMA사제 Cat.No.91-5), 65㎖ 아세톤, 8㎖ 37% 포름알데히드)를 각 구멍에 가하고 실온에서 30초 정치한다. 고정액을 흡인 제거하고, 0.5㎖의 탈 이온수를 각 구멍에 가하여 45초 실온에서 정치한다. 탈 이온수를 흡인 제거하고, 이어서 알칼리포스파타아제 염색액(1㎖ 아질산 나트륨 용액, 1㎖ 퍼스트 레드 바이올렛 LB 솔트 용액, 1㎖ 나프톨 AS-BI 알칼리 용액, 45㎖ 증류수)을 1웰당 0.5㎖ 가하여 15분간 실온에서 정치 후, 염색액을 흡인 제거하고, 탈 이온수 0.5㎖로 세정했다. 음성 컨트롤인 ESGRO 비존재하에서 배양한 ES세포, 양성 컨트롤인, ESGRO(1000유닛/㎖) 존재하에서 배양한 ES세포, 그리고, 본 발명의 화합물 ④(4㎍/㎖) 존재하에서 배양한 ES세포의 염색상을 비교했다(도 19 참조). 화합물 ④ 존재하에서 배양한 ES세포는 ESGRO 비존재하에서 배양한 ES세포에 비해 의미 있게 진하게 염색되어 있어 높은 알칼리포스파타아제 활성을 가지고 있는 것이 나타났다. 또한 본 발명의 화합물은 양성 컨트롤인 ESGRO 존재하에서 배양한 ES세포와 동등한 미분화 콜로니를 형성시킬 수도 있었다. 즉, 본 발명의 화합물은 ES세포의 미분화 상태에서의 증식을 강하게 지지한 것을 알 수 있다.
또한 화합물 ① 내지 ③, ⑤ 내지 ⑩에 대해서도 화합물 ④와 같이 염색되었다.
본 발명에 의하면, 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포를, 미분화인 채로, 기간을 연장해서 또는 무기한으로, 대량이면서도 안전하게 증식시킬 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 분화 억제제, 그것을 이용한 배양 방법, 배양액은 세포 이식 용도로 이용하는 세포 공급원으로서의 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포를 산생하기 위해 적용될 수 있다. 줄기세포, 바람직하게는 배아 줄기세포를 이용함으로써 얻을 수 있는 많은 혜택에 부가해서 본 발명에 의해 제공되는 분화 억제제 및 그것을 이용한 배양 방법은 하나 또는 다수의 유전적인 개변을 가지는 배아 줄기세포를 산생하기 위해 적용될 수 있다. 이러한 적용의 예는 질환에 대해서 세포 베이스에서의 모델의 개발, 및 유전병을 처치하기 위해 이식에 대해서 특이화된 조직의 개발을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
상기한 바와 같이 본 발명의 분화 억제제 및(또는) 2환 화합물은 줄기세포를 미분화 상태로 증식시킬 수 있고, 그 결과 배양된 세포나 조직을 재생 의료 분야에서 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 본 화합물을 의약 조성물에 응용할 수 있다.
본 출원이 주장하는 우선권의 기초가 되는 2003년 6월 27일자의 일본 특허출원(특원 2003-185398) 및 2003년 10월 14일자의 일본 특허출원(특원 2003-353870)의 내용은 모두 본 명세서 개시의 일부로서 본 명세서 중에 참조로서 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> ASAHI KASEI KABUSHIKI KAISHA <120> Cell differentiation supressing agent, method of culturing cells using the same, culture solution, and cultured cells <130> A41363A <160> 6 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <223> The forward primer used for amplifing murine Oct-3/4 gene by PCR <400> 1 ggcgttctct ttggaaaggt gttc　　　　　　　　　　　 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <223> The reverse primer used for amplifing murine Oct-3/4 gene by PCR <400> 2 ctcgaaccac atccttctct 　　　　　　　　　　　　　20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <223> The forward primer used for amplifing murine GAPDH gene by PCR <400> 3 ggtgaaggtc ggtgtgaacg ga　　　　　　　　　　　 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <223> The reverse primer used for amplifing murine GAPDH gene by PCR <400> 4 tgttagtggg gtctcgctcc tg　　　　　　　　　　　　22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <223> The forward primer used for amplifing murine Nanog gene by PCR <400> 5 agggtctgct actgagatgc tctg　　　　　　　　　　　　24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <223> The reverse primer used for amplifing murine Nanog gene by PCR <400> 6 caaccactgg tttttctgcc accg　　　　　　　　　　　24

Claims (49)

  1. 저분자 화합물 또는 그의 염을 유효 성분으로 하는 줄기세포 분화 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 저분자 화합물이 화학식 (1)로 나타내어지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
    <화학식 1>
    Figure 112005076299484-PCT00043
    식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타내고, A환은 1개 이상의 헤테로원자를 환 내에 포함하는 5 내지 8원환을 나타내고, X는 주쇄의 원자수가 0 내지 10인 알킬렌기를 나타내고, 원자수 0의 알킬렌기는 단일결합을 나타내고, 해당 알킬렌기를 구성하는 1개 이상의 에틸렌이 -C=C-기 및(또는) -N=N-기 및(또는) -CONH-기로 치환되어 있을 수 있고, 또한, 환 A와 결합하는 결합이 이중 결합이 되는 기일 수 있고, 또한 해당 알킬렌기는 치환기로서 전자흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 1개 이상 가질 수 있고, G는 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 가질 수 있는 방향족기를 나타내고, 해당 A환은 -XG기 이외의 치환기로서 전자 흡인기 및(또는) 전자 공여기를 1개 이상 가질 수 있다.
  3. 제2항에 있어서, A환이 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 헤테로원자를 환 내에 포함하는 5 또는 6원환인 줄기세포 분화 억제제.
  4. 제2항에 있어서, A환이 1개의 질소 원자를 환 내에 포함하는 5 또는 6원환인 줄기세포 분화 억제제.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X로 나타내어지는 알킬렌기가 치환기로서 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 니트릴기 및 할로겐 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 및(또는) 원자를 1개 이상 가지고 있는 것인 줄기세포 분화 억제제.
  6. 제2항에 있어서, 저분자 화합물이 화학식 (2)로 나타내어지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
    <화학식 2>
    Figure 112005076299484-PCT00044
    식 중, R1, R2, R3, R4, X 및 G는 상기 제2항에서 정의한 바와 동일하고, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
  7. 제2항에 있어서, 저분자 화합물이 화학식 (3)으로 나타내어지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
    <화학식 3>
    Figure 112005076299484-PCT00045
    식 중, R1, R2, R3, R4, X 및 G는 상기 제2항에서 정의한 바와 동일하고, R5 및 R6은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
  8. 제6항에 있어서, 저분자 화합물이 화학식 (4)로 나타내어지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
    <화학식 4>
    Figure 112005076299484-PCT00046
    식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 상기 제6항에서 정의한 바와 동일하고, R10, R11, R12, 및 R13은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타내고, 이중 편측 파선은 단일결합 또는 이중 결합을 나타내고, 이중 편측 파선이 이중 결합을 나타내는 경우, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
  9. 제8항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, 및 R13이 각각 독립적으로 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 할로겐 원자 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인 줄기세포 분화 억제제.
  10. 제6항에 있어서, 저분자 화합물이 화학식 (5)로 나타내어지는 화합물인 줄기 세포 분화 억제제.
    <화학식 5>
    Figure 112005076299484-PCT00047
    식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 상기 제6항에서 정의한 바와 동일하고, R10, R11, R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12가 각각 독립적으로 알킬기, 아실기, 알콕시기, 니트로기, 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 할로겐 원자 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인 줄기세포 분화 억제제.
  12. 제7항에 있어서, 저분자 화합물이 화학식 (6)으로 나타내어지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
    <화학식 6>
    Figure 112005076299484-PCT00048
    식 중, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 상기 제7항에서 정의한 바와 동일하고, R7, R8, 및 R9는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 전자 흡인기, 전자 공여기 또는 수소 원자를 나타낸다.
  13. 제12항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9가 각각 독립적으로 알킬기, 알콕시기, 히드록실기, 니트로기, 니트릴기, 아세톡시기, 아세톡시알킬기, 산소 원자를 포함할 수 있는 환상 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 디알킬아미노비닐기, 히드록시알킬아미노알킬기, 아릴아미노비닐기, 및 수소 원자를 포함하는 군으로부터 선택되는 기 또는 원자인 줄기세포 분화 억제제.
  14. 제8항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R11이 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 또는 저급 알콕시기이 며, R12가 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 니트릴기, 아미노카르보닐기, 또는 저급 알콕시카르보닐기인 줄기세포 분화 억제제.
  15. 제10항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R8, 및 R9가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R10이 수소 원자 또는 저급 알킬기이며, R11이 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알콕시기, 또는 저급 알콕시카르보닐기이며, R12가 수소 원자, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기인 줄기세포 분화 억제제.
  16. 제12항에 있어서, R1 및 R2가 수소 원자이며, R3이 히드록실기 또는 아세톡시기이며, R4가 아세톡시알킬기, 산소 원자를 포함할 수 있는 환상 알킬아미노알킬기, 디알킬아미노알킬기, 히드록시알킬아미노알킬기, 또는 수소 원자이며, R5가 저급 알킬기, 또는 아릴아미노비닐기이며, R6이 니트로기이며, R7, R8, 및 R9가 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 또는 수소 원자인 줄기세포 분화 억제제.
  17. 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
    <화학식 9>
    Figure 112005076299484-PCT00049
    식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11, 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 2급 아미노카르보닐기 또는 3급 아미노카르보닐기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
  18. 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
    <화학식 9>
    Figure 112005076299484-PCT00050
    식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10 및 R12는 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R11은 저급 아실기이며, R13은 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
  19. 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
    <화학식 9>
    Figure 112005076299484-PCT00051
    식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13은 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기 또는 아미노카르보닐기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
  20. 화학식 (9)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
    <화학식 9>
    Figure 112005076299484-PCT00052
    식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11, 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13은 니트릴기를 나타내고, 파선부에 관해서 기하 이성질체가 존재하고, 이들 기하 이성질체의 배치는 특별히 한정되지 않고, 각각 독립적으로 E체 또는 Z체 중 어느 하나일 수 있다.
  21. 화학식 (10)으로 나타내어지는 화합물 또는 그의 염.
    <화학식 10>
    Figure 112005076299484-PCT00053
    식 중, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기, 히드록실기, 저급 알콕시기, 또는 할로겐 원자이며, R5는 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7은 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 저급 알킬기 또는 환상 구조를 형성할 수 있는 저급 알킬기이며, R8 및 R9는 수소 원자이며, R10, R11, 및 R12는 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13은 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 아미노카르보닐기, 또는 니트릴기를 나타낸다.
  22. 제17항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기 이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 동일하거나 상이할 수 있는 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 또는 페닐아미노카르보닐기인 화합물 또는 그의 염.
  23. 제18항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11이 저급 아실기이며, R12가 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기, 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 또는 페닐아미노카르보닐기인 화합물 또는 그의 염.
  24. 제19항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 또는 페닐아미노카르보닐기인 화합물 또는 그의 염.
  25. 제20항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕시기이며, R13이 니트릴기인 화합물 또는 그의 염.
  26. 제21항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4가 수소 원자이며, R5가 수소 원자, 저급 아실기, 또는 저급 알킬기이며, R6 및 R7이 동일하거나 상이할 수 있는 저급 알킬기이며, R8, R9 및 R10이 수소 원자이며, R11 및 R12가 각각 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로기, 저급 알킬기, 저급 아실기 또는 저급 알콕 시기이며, R13이 히드록시카르보닐기, 저급 알콕시카르보닐기, 카르바모일기, 모노-저급 알킬아미노카르보닐기, 디-저급 알킬아미노카르보닐기, 페닐아미노카르보닐기, 또는 니트릴기인 화합물 또는 그의 염.
  27. 제17항에 있어서, (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산 에틸에스테르, (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트산, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-메틸-아세트아미드, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N,N-디메틸-아세트아미드, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-N-페닐-아세트아미드인 화합물 또는 그의 염.
  28. 제18항에 있어서, 2-(3-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드인 화합물 또는 그의 염.
  29. 제19항에 있어서, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(2,3,3-트리메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세트아미드, 2-(2-아세틸-3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-2-(4-아세틸-페닐아조)-아세트아미드인 화합물 또는 그의 염.
  30. 제20항에 있어서, (4-아세틸-페닐아조)-(3,3-디메틸-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-일리덴)-아세토니트릴인 화합물 또는 그의 염.
  31. 제21항에 있어서, 2-(4-아세틸-페닐아조)-2-(3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-1-일)-아세트아미드인 화합물 또는 그의 염.
  32. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 유효 성분으로 하는 줄기세포 분화 억제제.
  33. 제1항 내지 제16항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 저분자 화합물이 알칼리포스파타아제의 활성을 유지 또는 상승시키는 작용을 가지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
  34. 제1항 내지 제16항, 제32항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 저분자 화합물이 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3: 전사 3의 신호 전달자 및 활성자)을 활성화하지 않는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
  35. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 저분자 화합물이 SSEA-1 항원 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
  36. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 저분자 화합물이 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
  37. 제36항에 있어서, 저분자 화합물이 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 2환 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
  38. 제37항에 있어서, 저분자 화합물이 Nanog 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 가지는 아조기를 함유하는 2환 화합물인 줄기세포 분화 억제제.
  39. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 줄기세포 분화 억제제를 이용해서 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양 방법.
  40. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 줄기세포 분화 억제제를 이용해서 배아 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포 배양 방법.
  41. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 줄기세포 분화 억제제를 유효 성분으로서 함유하는 배지.
  42. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하는 배지.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 분화 억제제인 화합물 또는 그의 염의 농도가 10ng/㎖ 내지 100㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 배지.
  44. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 분화 억제제를 이용해서 미분화 상태로 배양된 줄기세포.
  45. 제1항 내지 제16항 및 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 분화 억제제를 이용해서 미분화 상태로 배양된 줄기세포를 분화시켜 수득된 세포 또는 조직.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 세포 또는 조직이 생체 내에 이식하기 위한 것인 세포 또는 조직.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 기재된 세포 및(또는) 조직을 생체 내 에 이식하는 치료 방법.
  48. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염의 프로드러그.
  49. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염 또는 그 프로드러그를 함유하는 의약 조성물.
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