ES2840076T3

ES2840076T3 - Aislamiento de células progenitoras pancreáticas bona fide

Info

Publication number: ES2840076T3
Application number: ES16721712T
Authority: ES
Inventors: Jacqueline Ameri; Henrik Semb
Original assignee: Kobenhavns Universitet
Current assignee: Kobenhavns Universitet
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2036-04-21
Also published as: CA2983764A1; US20180127724A1; EP3819372A2; EP3286300A1; US20230227788A1; EP3819372A3; CN107787363B; CN107787363A; EP3286300B1; WO2016170069A1; US11613736B2; US20200080062A1; PL3286300T3; CY1123677T1; DK3286300T3; JP2018512886A; HK1248277A1; JP6954711B2; US10494608B2; PT3286300T

Abstract

Un método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicho método: exponer una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1 a: a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular en células PDX1 +; y/o b) un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1+ y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+; y/o c) un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1+ y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+; en donde la población celular se expone al menos al tercer ligando y opcionalmente al primer y/o segundo ligando, y en donde el tercer marcador es GP2; obteniendo así una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide.

Description

DESCRIPCIÓN

Aislamiento de células progenitoras pancreáticas bona fide

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para aislar células progenitoras pancreáticas bona fide.

Antecedentes

El tratamiento con terapia celular de la diabetes dependiente de insulina se ve facilitado por la producción de un número ilimitado de células pancreáticas que pueden y podrán funcionar de manera similar a los islotes humanos. Por consiguiente, existe la necesidad de producir estos tipos de células pancreáticas derivadas de células madre embrionarias humanas (hES), así como métodos fiables para purificar dichas células. Por ejemplo, el uso de células p productoras de insulina derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC) ofrecería una gran mejora con respecto a los procedimientos de terapia celular actuales que utilizan células de páncreas de donantes. Actualmente, los tratamientos con terapia celular para la diabetes mellitus, tal como la diabetes tipo 1 o tipo 2, que utilizan células de páncreas de donantes, están limitados por la escasez de células de los islotes de alta calidad necesarias para el trasplante. Por ejemplo, la terapia celular para un único paciente diabético tipo 1 requiere un trasplante de aproximadamente 8 x 108 células de los islotes pancreáticos (Shapiro et al, 2000, N Engl J Med 343:230-238; Shapiro et al, 2001a, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15:241-264; Shapiro et al, 2001b, British Medical Journal 322:861). Como tal, se requieren al menos dos órganos donantes sanos para obtener suficientes células de los islotes para un trasplante exitoso.

Por tanto, las células madre embrionarias (ES) representan un poderoso sistema modelo para la investigación de los mecanismos subyacentes a la biología y la diferenciación de las células pluripotentes dentro del embrión temprano, así como para proporcionar oportunidades para la manipulación genética de mamíferos y las aplicaciones comerciales, médicas y agrícolas resultantes. Además, la proliferación y diferenciación apropiadas de células ES pueden usarse potencialmente para generar una fuente ilimitada de células adecuadas para el trasplante para el tratamiento de enfermedades que son el resultado de daño o disfunción celular. También pueden usarse otras células pluripotentes y líneas celulares, incluyendo las células similares al ectodermo primitivo temprano (EPL), ICM/epiblasto derivado in vivo o in vitro, ectodermo primitivo derivado in vivo o in vitro, células germinales primordiales (células EG), células de teratocarcinoma (células EC) y células pluripotentes derivadas por desdiferenciación o por transferencia nuclear.

Por consiguiente, existe la necesidad de métodos para el aislamiento de células progenitoras pancreáticas bona fide.

WO 2012/070014 describe un método para identificar células progenitoras pancreáticas que implica la determinación de marcadores asociados negativamente con la diferenciación pancreática seleccionados de 113 marcadores y/o asociados positivamente con la diferenciación pancreática seleccionados de 192 marcadores.

Rezania et al., 2013 (Stem cells vol. 31, no. 11, p. 2432-2442) describe un protocolo de diferenciación de células progenitoras pancreáticas, en donde se añaden diferentes factores de crecimiento en los diferentes estadios de diferenciación.

WO 2014/201167 describe que las células beta humanas se pueden generar directamente a partir de hP-SC y hiPSC in vitro.

WO 2007/130474 describe la diferenciación de hESC a células beta o células similares a beta.

US 2009/263896 describe un método de purificación de células pancreáticas a partir de una población de células que comprende células del endodermo pancreático, exponiendo las células a un ligando no expresado en las células del endodermo pancreático.

D'amour KA et al., 2006 (Nature biotechnology vol. 24, no. 11, p. 1392-1401) describe un protocolo para diferenciar las células ES en células productoras de insulina.

Resumen

La presente descripción proporciona métodos para aislar células progenitoras pancreáticas bona fide que expresan PDX1 y NKX6.1. Los presentes métodos se basan en el uso de marcadores específicos para células que expresan PDX1 y/o NKX6.1, o en el uso de marcadores específicos para células que no expresan PDX1. También se proporcionan poblaciones celulares que pueden obtenerse mediante dichos métodos, así como su uso para tratar trastornos metabólicos.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Direccionamiento de eGFP en el locus de PDX1 humano. A) El gen que codifica la proteína verde fluorescente (eGFP) se insertó en la región no traducida (UTR) 5' del gen PDX1 en la línea celular de hPS HUES-4. Los cebadores BD amplifican el alelo WT, los cebadores AC amplifican todos los clones transgénicos y los cebadores AD amplifican el alelo diana (3'HA). B) Se muestra un cribado por PCR representativo de 4 eventos de direccionamiento para 4 clones individuales (carril 1 y 4: clones positivos para el direccionamiento de genes; carril 2) con cebadores Neo/F y Ex3/R (tamaño de fragmento 5,1 kb). El BAC PDX1eGFP que contiene el casete informador integrado en el locus PDX1 se usó como control positivo (BAC). C) Una tabla que muestra la eficiencia relativa de direccionamiento que se obtuvo en 3 líneas celulares de hPS diferentes. D) Se muestran las imágenes de fluorescencia y contraste de fase correspondientes de la línea celular de hES PDX1-eGFP diana en el día 13. Barra de escala = 100 |jm. E) Imágenes de inmunofluorescencia de la línea celular diana PDX1-GFP que muestran la colocalización de la expresión de PDX1 endógena (rojo) con GFP (verde) el día 16. Barra de escala = 50 jm . F) Análisis de inmunofluorescencia de la población de células PDX1-eGFP en el día 17. Un número significativo de células GFP+/PDX1+ coexpresaron NKX6-1 y SOX9. La mayoría de las células PDX1 también expresaron ECAD y HES1 (datos no mostrados). Barras de escala = 50 jm.

Figura 2. Análisis de hPSC PDX1-eGFP diferenciadas in vitro. A) Las hPSC se diferenciaron de acuerdo con dos protocolos de diferenciación diferentes para obtener progenitores pancreáticos que coexpresan PDX1 y NKX6-1 (protocolo A (PE)) o células del intestino proximal posterior que expresan PDX1 pero que carecen de NKX6-1 (protocolo B (PFG)). B) Esquema que representa el protocolo de diferenciación denominado "protocolo A", que genera endodermo pancreático (PE). C) Aislamiento por FACS de las fracciones de eGFP+ y eGFP- en el día 17 en las hPSC tratadas según el protocolo A. D) El análisis de la expresión génica de las células eGFP+ y eGFP- separadas mostró un enriquecimiento significativo de los marcadores del endodermo pancreático (principalmente PDX1 y NKX6-1) en las células eGFP+ obtenidas con el protocolo A. Los datos se muestran como expresión media ± SEM (n = 5). Los gráficos representan las veces de aumento en comparación con lo detectado en las muestras de control (células eGFP-) el día diecisiete. La muestra de control se fijó arbitrariamente en un valor de uno. E) Esquema que representa el protocolo de diferenciación denominado "protocolo B", que genera células del intestino proximal posterior. F) Aislamiento por FACS de células eGFP+ y eGFP-(desde el día 17) diferenciadas según el protocolo B. G) El análisis de la expresión génica de las células eGFP+ y eGFP- separadas mostró que, mientras que los marcadores del intestino proximal posterior tales como PDX1, ECAD, HNF6 y SOX9 estaban enriquecidos en las células eGFP+, ni NKX6-1 ni MNX1 estaban regulados al alza significativamente en las células eGFP+ obtenidas por el protocolo B. Los datos se muestran como expresión media ± SEM (n = 2-4). Los gráficos representan las veces de aumento en comparación con lo detectado en las muestras de control (células eGFP-) el día diecisiete. La muestra de control se fijó arbitrariamente en un valor de uno.

Figura 3. Se realizó un análisis de micromatriz para comparar los perfiles de expresión génica de células progenitoras pancreáticas (PPC) PDX1+/NKX6-1+ derivadas in vitro frente a células PDX1+/NKX6-1-(PFG). A) Agrupación jerárquica de genes expresados diferencialmente en los progenitores pancreáticos (PDX1+/NKX6-1+), células del intestino proximal posterior (PDX1+/NKX6-1-), y células GFP-. B) Diagramas de Venn que muestran la distribución de genes regulados al alza en PPC frente a GFP-, PPC frente a PFG y PFG frente a células GFP- en el día 17. C) Agrupación jerárquica de los genes expresados diferencialmente en el análisis de 3 comparaciones representado en A (se muestran los niveles de expresión promedio). Las barras indican subgrupos con genes relevantes; se crearon nueve subgrupos diferentes en total. El subgrupo 3a muestra genes enriquecidos en la población de células GFP-, incluyendo el nuevo marcador de la superficie celular CD49d (ITGA4), mientras que el subgrupo 5 muestra genes enriquecidos en las células progenitoras pancreáticas (fracción celular GFP+), que también incluye el nuevo marcador de la superficie celular GP2. El subgrupo 6 indica genes enriquecidos en células PDX1+ independientemente de la expresión de NKX6-1 (células F2 GFP+ y GFP+), tales como CDH1 (ECAD), EPCAM, F3 (CD142) y el nuevo marcador de la superficie celular FOLR1. D) Análisis de ontología génica (GO) que muestra el enriquecimiento de genes en el las células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6-1+. Las categorías de GO representativas se muestran y se representan frente a -log (valor p).

Figura 4. Nuevos marcadores de la superficie celular expresados en el endodermo pancreático PDX1+ derivado de hPSC. A) Mapa de calor que muestra el enriquecimiento de genes localizados en la membrana plasmática o la región extracelular en las fracciones GFP+ y GFP-. Las flechas indican marcadores de la superficie celular seleccionados enriquecidos en las diferentes poblaciones celulares. B) El análisis por citometría de flujo de los marcadores de la superficie celular seleccionados GP2 y CD49d (ITGA4) realizado en hPSC diferenciadas cultivadas en MEF (d17), confirmó que GP2 se expresaba altamente en las células GFP+, mientras que CD49d estaba enriquecido en las células GFP-. Más específicamente, la mayoría de las células GFP- (70-72 %) en d17 expresaba CD49d mientras que el 64-76 % de las células GFP+ coexpresaban GP2. De forma importante, solo una pequeña fracción de las células GFP-(3-7 %) expresaba GP2 y básicamente ninguna (1-2 %) de las células GFP+ expresaba CD49d. C) El análisis de la expresión génica de las poblaciones de células separadas mostró que los marcadores del endodermo pancreático y los nuevos marcadores de la superficie celular estaban altamente enriquecidos en la población de células separadas GP2+/CD49d-. D) La expresión de GP2 y CD49d, se analizó por citometría de flujo en una línea celular no etiquetada genéticamente, HUES-4, cultivada en un sistema sin alimentador. E) Las fracciones de células GP2+CD49d-, CD49d+GP2-, y GP2-CD49d- se separaron y se analizaron los patrones de expresión génica. Los marcadores de endodermo pancreático tales como PDX1, SOX9, MNX1 y NKX6-1 y los nuevos marcadores de la superficie celular GP2 y FOLR1 se enriquecieron significativamente en las fracciones de células GP2+CD49d-. El resto de las células PDX1+ en las fracciones de células GP2-CD49d- expresan solo niveles bajos de NKX6-1, lo que confirma que GP2 se enriquece específicamente para células PDX1+/NKX6-1+. F) Análisis por citometría de flujo de la expresión de GP2 y CD49d en páncreas fetal humano (9,1WD) con separación de células no hematopoyéticas y no endoteliales (CD45-CD31-). G) El análisis por qPCR de la expresión de PDX1 y NKX6-1 en poblaciones de células GP2+ y CD49d+ separadas por FACS (separadas por CD45-CD31-), mostró un enriquecimiento significativo de PDX1 y NKX6- en las células GP2+ frente a las CD49d+. Los resultados se presentan en unidades arbitrarias (AU) en relación con la expresión del gen control Hprt o Gapdh. *P= 0,023 y **P=0,010. ND= No Detectado. H) Análisis por citometría de flujo de la expresión de PDX1 y NKX6-1 en células GP2+ (CD45-/CD31-) y CD45+/CD31+ a 8,7WD. El 91 % de las células GP2+(PDX1+) coexpresaban NKX6.1. Las células CD45+CD31+ se usaron como un control negativo para la expresión de PDX1 y NKX6-1. Los gráficos de FACS son representativos de 3 experimentos independientes. Este resultado corrobora nuestros hallazgos previos que indican que GP2 marca específicamente a los progenitores pancreáticos que coexpresan PDX1 y NKX6.1.

Figura 5. Caracterización de la expresión de FOLR1 en hPSC diferenciadas. A) Análisis por FACS de los marcadores FOLR1 en combinación con CD49d en la línea celular PDXeG cultivada en MEF. B) Las fracciones de células FOLR1-/+CD49d+, CD49d-/FOLR1+, y GFP+/FOLR1- se separaron y se analizó el patrón de expresión génica. C) Análisis por FACS de FOLR1 y CD49d en la línea celular HUES4 no etiquetada genéticamente, cultivada en un sistema sin alimentador. D) El análisis de qPCR también se realizó en células FOLR1-Cd49d+, FOLR1-Cd49d- y FOLR1+Cd49d-. Los marcadores de endodermo pancreático tales como PDX1, SOX9, MNX1 y NKX6-1 y los nuevos marcadores de la superficie celular GP2 y FOLR1 estaban enriquecidos significativamente en las fracciones de células FOLR1+CD49d-. Los datos se muestran como expresión media ± SEM. Los gráficos representan las veces de incremento en comparación con lo detectado en las muestras de control (células eGFP-) en el día diecisiete. Como FOLR1 se expresa tanto en células PDX1+/NKX6-1+ como PDX1/NKX6-1- no es tan específico/eficiente como GP2 para marcar PPC, por consiguiente, la fracción de células FOLR1-CD49d- todavía contiene células que expresan PDX1, NKX6-1.

Figura 6. Validación de GP2 usando un protocolo de diferenciación independiente y previamente publicado. A) Esquema para inducir progenitores pancreáticos derivados de hPSC según una versión ligeramente modificada del protocolo de diferenciación publicado por Rezania et al., 2013. B) Usando la línea celular PDXeG, se separaron las hPSC diferenciadas tomando como base la expresión de GFP y GP2 y se analizaron mediante qPCR. C) Análisis de qPCR de las poblaciones separadas: las células GP2-GFP-, GP2-GFP+, y GP2+GFP+ mostraron que las células que expresan PDX1 y NKX6-1 están significativamente enriquecidas en la fracción de células GP2+GFP+ en comparación con la fracción de células GP2-GFP+. Estos datos confirman que GP2 se puede usar para aislar progenitores pancreáticos humanos que coexpresan PDX1 y NKX6-1 a partir de cultivos celulares heterogéneos.

Figura 7. Caracterización de marcadores de la superficie celular previamente publicados para la purificación de células progenitoras pancreáticas. A) Análisis por citometría de flujo de los marcadores de la superficie celular CD142 y CD200 previamente identificados en la línea celular informadora PDXeG cultivada en MEF. La mayoría de las células GFP+ y GFP- se tiñen con CD142 y CD200, lo que muestra que estos marcadores no son lo suficientemente específicos como para reconocer las células PDX1+/NKX6-1+ en un cultivo celular heterogéneo. B) Una línea celular no etiquetada genéticamente (HUES4) se diferenció según una versión ligeramente modificada del protocolo de diferenciación publicado por Rezania et al 2013) en un sistema de cultivo sin alimentador y se tiñó con GP2 en combinación con CD49d, CD142 y CD200. C) El análisis por qPCR de las diferentes poblaciones separadas (GP2-, GP2+, CD142+, y CD200+) confirmó un enriquecimiento significativo de PDX1 y NKX6-1 en las células GP2+. Estos resultados ilustran que GP2 es superior en el marcaje de progenitores pancreáticos PDX1+/NKX6-1+ en comparación con los marcadores CD142 y CD200 previamente publicados.

Figura 8. Diferenciación de PPC GP2+/CD49d- purificadas en células que expresan insulina que responden a la glucosa. A) Esquema que ilustra la diferenciación de hPSC en progenitores pancreáticos que se disocian y tiñen con los marcadores de la superficie celular CD49d y GP2. B) Una tabla que muestra el protocolo de diferenciación que se aplicó para diferenciar las células progenitoras pancreáticas GP2+/CD49d- separadas por FACS qe se volvieron a sembrar en células que expresan insulina. For: Forskolina (10uM), Alki: Inhibidor de Alk5 (4,5uM), Nic: Nicotinamida (10mM), Rocki: Inhibidor de Rock (10-15uM)), DF12: DMEM/F-12, b27: Suplemento de B27. C). Gráfico de FACS que presenta tinción con GP2 y CD49d de hPCS diferenciada en el d18. D) Las PPC GP2+ (CD49d-) diferenciadas y las células GP2bajo (CD49d-) aisladas de la línea celular HUES4 no etiquetada genéticamente presentan un enriquecimiento significativo de células péptido C-en las células GP2+(CD49d-). E) Análisis de inmunofluorescencia de células progenitoras pancreáticas GP2+ (CD49d-) purificadas y que se volvieron a sembrar (aisladas de la línea celular HUES4 no etiquetada genéticamente) diferenciadas en células que expresan insulina. F). Porcentaje de células que expresan CPEP en células de Gp2 bajo frente a células GP2+ en el d18. G) La liberación de péptido C humano se midió en las células GP2+ (CD49d-) diferenciadas mediante un ensayo estático de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). Los resultados mostraron que la estimulación con una alta concentración de glucosa da como resultado un incremento estadísticamente significativo del péptido C, lo que indica que la ruta de activación principal (dependiente del canal de K-ATP) es funcional en las células beta derivadas de PPC GP2+.

Figura 9. La inactivación de CDKNIa da como resultado un incremento significativo de PPC GP2+ proliferantes. A) Un esquema que muestra los distintos estadios del ciclo celular. B) Las hPSC diferenciadas del día 11 se transfectaron con ARNsi control y CDKN1. 72 h después de la transfección, se tomaron muestras y se analizaron mediante análisis de transferencia Western. La inactivación de CDKN1a en hPSC que consisten en progenitores pancreáticos GP2+ prematuros, da como resultado un incremento significativo en el número de células en la fase G2/M sobre el d14 (C-E). Este incremento se correlaciona con una reducción en el número de células en G0/G1, lo que sugiere que la reducción de los niveles de p21 promueve la transición de las células de G0/G1 a un estado proliferativo (G2/M). Sin embargo, si p21 se inactiva en un punto de tiempo posterior (d17), cuando están presentes progenitores pancreáticos GP2+ más maduros en el cultivo de hPSC, el efecto proliferativo desaparece (F-H). I) El análisis por inmunofluorescencia de hPSC tratadas con ARNsi desde el día 14 revela una regulación al alza significativa de las células Ki67+ después de 72 h de inactivación de CDKN1a. Estos datos proporcionan evidencia de que la inactivación de CDKN1a en el progenitor pancreático temprano se puede utilizar para expandir el conjunto de hPPC GP2+ durante el cultivo in vitro.

Figura 10. Esquema que muestra los estadios intermedios de la diferenciación de hESC hacia células productoras de insulina. Los nuevos marcadores de la superficie celular GP2, FOLR1 y CD49d se pueden usar para aislar células progenitoras pancreáticas en el estadio PE. Estas células progenitoras pancreáticas tienen la capacidad de diferenciarse en células acinares, ductales y también endocrinas que componen el páncreas.

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Los presentes inventores han identificado nuevos marcadores útiles para el aislamiento de células progenitoras pancreáticas verdaderas.

El éxito más reciente en la generación de células productoras de insulina que responden a la glucosa derivadas de hPSC que comparten propiedades funcionales con las células beta normales (Pagliuca et al., 2014, Rezania et al., 2014), ha hecho que la implementación de una terapia basada en células para el tratamiento de la diabetes tipo I sea una realidad palpable. El éxito terapéutico de este enfoque dependerá de la capacidad de aumentar de escala la producción de derivados de hPSC. Las estimaciones sitúan el número de células funcionales requeridas para la reparación de órganos y la recuperación de la enfermedad en el orden de 109 por paciente (Pagliuca et al., 2014, Kempf et al., 2016). Por lo tanto, las estrategias de diferenciación deberán adaptarse para la producción en masa a escala industrial. Actualmente, la generación de células productoras de insulina que responden a la glucosa requiere protocolos de múltiples etapas tediosos y complicados, en los que se usan hPSC indiferenciadas con propensión tumorígena como población de células de partida. Al establecer estrategias en las que se usan células más maduras para generar células beta, se podría prevenir la contaminación potencial con células causantes de tumores en la preparación celular final que se usará para la terapia celular y se podrían lograr procedimientos de fabricación más seguros y reproducibles. Sin embargo, faltan marcadores de superficie específicos del estadio que puedan usarse para purificar poblaciones de células en un estadio tardío durante la diferenciación pancreática.

Durante el desarrollo embrionario normal, los progenitores pancreáticos humanos y de ratón altamente proliferativos, reconocidos por su coexpresión de los factores de transcripción, caja homeótica 1 duodenal pancreática (PDX1) y caja homeótica 1 de NK6 (NKX6-1), son responsables del crecimiento adecuado del epitelio pancreático y dan lugar a todos los tipos de células pancreáticas, incluyendo las células exocrinas, ductales y endocrinas. Por consiguiente, las células progenitoras pancreáticas podrían servir como una población de partida ideal para la generación de células endocrinas productoras de hormonas, tales como las células beta. Además, las publicaciones previas apoyan la idea de que el enriquecimiento de los progenitores pancreáticos reduciría el riesgo de formación de teratomas después del trasplante. El aislamiento de hPPC se podría obtener usando moléculas de la superficie celular específicas de tejido y, de hecho, se han reportado marcadores para poblaciones de células pancreáticas derivadas de hPSC (CD142 para progenitores pancreáticos y CD200/CD318 para células endocrinas) (Kelly 2011). Sin embargo, la especificidad del marcador del progenitor pancreático CD142 era cuestionable, ya que las poblaciones enriquecidas con esta molécula no estaban compuestas exclusivamente por células progenitoras pancreáticas como señalan los autores. Por lo tanto, queda por satisfacer la necesidad de marcadores nuevos y más específicos para enriquecer una población progenitora.

La generación de líneas celulares informadoras específicas de tejido podría ayudar en el proceso de identificación de marcadores de la superficie celular específicos del páncreas. Por lo tanto, establecimos una línea celular informadora de PDX1-eGFP (PDXeG) mediante el direccionamiento génico para permitir el aislamiento de células progenitoras pancreáticas PDX1+ puras a partir de hPSC. Al usar la línea celular informadora PDXeG como una herramienta genética, pudimos aislar diferentes subpoblaciones de células PDX1+ y realizar un análisis de expresión de todo el genoma que nos permitió identificar nuevos marcadores de la superficie celular para el aislamiento de hPPC. Específicamente, identificamos tres nuevos marcadores de la superficie celular que nos permiten separar los verdaderos progenitores pancreáticos de las células del endodermo del intestino proximal posterior: la glicoproteína 2 (membrana de gránulos de zimógeno) (GP2) como un marcador para el aislamiento de hPPC PDX1+/NKX6-1+, Integrina Alfa-4 (ITGA4 o CD49d) como un marcador de selección negativa que marca la fracción de células PDX1- y, finalmente, un tercer marcador, el receptor de folato 1 (adulto) (FOLR1) que reconoce las células PDX1+/NKX6-1-.

La especificidad de estos marcadores se demostró mediante el uso de tejido de páncreas fetal humano. Además, usando una estrategia de diferenciación simplificada y definida, mostramos que los progenitores pancreáticos GP2+/CD49dretienen la capacidad de madurar en células endocrinas y de diferenciarse en células productoras de insulina que responden a la glucosa. Finalmente, realizamos un cribado de ARNsi, dirigido a genes candidatos identificados por micromatrices y encontramos un nuevo gen implicado en la expansión de las hPPC. En conjunto, los inventores proporcionan I) nuevos marcadores de la superficie celular para el aislamiento de hPPC, II) una estrategia de diferenciación simplificada y definida para obtener células productoras de insulina que responden a la glucosa a partir de hPPC aisladas, III) y una nueva visión de cómo las hPPC pueden expandirse in vitro, lo que permite no solo una caracterización más profunda de las hPPC, sino que también estimula el desarrollo de nuevas estrategias para expandir estos progenitores para la futura terapia de reemplazo celular de la diabetes.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para aislar una población enriquecida en células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicho método las etapas de:

i) proporcionar una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática boa fide expresa PDX1 y NKX6-1; y

ii) exponer dicha población celular a:

a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+;

y/o

b) un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1 y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+;

y/o

c) un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1 y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+;

obteniendo así una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide.

En un aspecto adicional de la presente descripción, se proporciona un método para producir una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicha población celular enriquecida al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

En un aspecto adicional más de la presente descripción, se proporciona una población celular que comprende al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

En un aspecto adicional más de la presente descripción, se proporciona una población celular que comprende células progenitoras pancreáticas bona fide, que se pueden obtener por el método descrito en la presente memoria.

En un aspecto adicional más de la presente descripción, se proporciona una población celular que comprende células progenitoras pancreáticas bona fide, que se pueden obtener por el método descrito en la presente memoria para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite.

En un aspecto adicional más de la presente descripción, se proporciona una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide como se describe en la presente memoria para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite.

En un aspecto adicional más de la presente descripción, se proporciona un método de tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita, en donde el método comprende una etapa de proporcionar una población celular como se describe en la presente memoria.

Definiciones

Anticuerpo. El término "anticuerpo" describe un componente funcional del suero y a menudo se refiere como una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulina) o como una molécula (la molécula de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina). Una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a o reaccionar con un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico), que a su vez puede conducir a la inducción de mecanismos efectores inmunológicos. Una molécula de anticuerpo individual generalmente se considera monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclonal (es decir, que consiste en moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonal (es decir, que consiste en moléculas de anticuerpo diferentes que reaccionan con el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno o en antígenos distintos, diferentes). Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que le permite unirse específicamente a su antígeno correspondiente, y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulinas. El término anticuerpo o anticuerpos, tal y como se usa en la presente memoria, se usa en el sentido más amplio y abarca anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y de cadena simple, así como fragmentos de unión de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, F (ab')², Fv o fragmentos scFv, así como formas multiméricas tales como moléculas de IgA diméricas o IgM pentavalentes.

Antígeno. Un antígeno es una molécula que comprende al menos un epítopo. El antígeno puede ser, por ejemplo, un polipéptido, polisacárido, proteína, lipoproteína o glicoproteína.

Célula progenitora pancreática bona fide. El término "célula progenitora pancreática bona fide" o "progenitor pancreático verdadero" se refiere en la presente memoria a una célula, que es capaz de diferenciarse en todos los linajes pancreáticos, incluyendo acinar, ductal y endocrino, tales como las células productoras de insulina.

Endodermo definitivo. Tal y como se usa en la presente memoria, "endodermo definitivo" o "DE" se refiere a una célula multipotente que puede diferenciarse en células del tubo intestinal u órganos derivados del tubo intestinal. Según determinadas realizaciones de la presente descripción, las células del endodermo definitivo y las células derivadas de las mismas son células de mamífero y, en una realización preferida de la presente descripción, las células del endodermo definitivo son células humanas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del endodermo definitivo expresan o no expresan significativamente determinados marcadores. En algunas realizaciones de la presente descripción, en las células del endodermo definitivo se expresan uno o más marcadores seleccionados de SOX17, CXCR4, MIXLI, GATA4, FOXA2, GSC, FGF 17, VWF, CALCR, FOXQI, CMKORI, CER y CRIPI. En otras realizaciones de la presente descripción, en las células del endodermo definitivo no se expresan significativamente uno o más marcadores seleccionados de OCT4, HNF4A, alfa-fetoproteína (AFP), trombomodulina (TM), SPARC y SOX7. Las células del endodermo definitivo no expresan PDX-1.

Célula diferenciable o diferenciada. Tal y como se usa en la presente memoria, "célula diferenciable" o "célula diferenciada" o "célula derivada de hES" puede referirse a células pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o incluso unipotentes, como se define con detalle a continuación. En determinadas realizaciones de la presente descripción, las células diferenciables son células diferenciables pluripotentes. En realizaciones más específicas de la presente descripción, las células diferenciables pluripotentes se seleccionan del grupo que consiste en células madre embrionarias, células de ectodermo primitivo, células germinales primordiales y células de teratocarcinoma. En una realización particular de la presente descripción, las células diferenciables son células madre embrionarias de mamífero. En una realización más particular de la presente descripción, las células diferenciables son células madre embrionarias humanas. Determinadas realizaciones de la presente descripción también contemplan células diferenciables de cualquier fuente dentro de un animal, siempre que las células sean diferenciables como se define en la presente memoria. Por ejemplo, las células diferenciables se pueden recoger de embriones no humanos o de cualquier capa germinal primordial en los mismos, de tejido placentario o coriónico, o de tejido más maduro tales como células madre adultas incluyendo, pero no limitado a, tejido adiposo, médula ósea, tejido nervioso, tejido mamario, tejido hepático, páncreas, tejido epitelial, respiratorio, gonadal y muscular. En realizaciones específicas de la presente descripción, las células diferenciables son células madre embrionarias obtenidas sin la destrucción de embriones. En otras realizaciones específicas de la presente descripción, las células diferenciables son células madre adultas. En otras realizaciones específicas más de la presente descripción, las células madre son células madre derivadas de la placenta o coriónicas.

Diferenciación. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "diferenciación" se refiere a la producción de un tipo de célula que es más diferenciado que el tipo de célula del que se deriva. Por lo tanto, el término engloba tipos de células que están parcial y terminalmente diferenciadas. De forma similar, "producido a partir de hESC", "derivado de hESC", "diferenciado de hESC", "célula derivada de hES" y expresiones equivalentes se refieren a la producción de un tipo celular diferenciado a partir de hESC in vitro e in vivo.

Embrionario. Tal y como se usa en la presente memoria, "embrionario" se refiere a un rango de estadios de desarrollo de un organismo que comienza con un solo cigoto y termina con una estructura multicelular que ya no comprende células pluripotentes o totipotentes distintas de las células gaméticas desarrolladas.

Nivel de expresión. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "nivel de expresión" puede referirse al nivel de transcrito (ARNm) o al nivel de proteína para un gen o proteína en particular, respectivamente. Por lo tanto, los niveles de expresión pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, determinando el nivel de transcripción o el nivel de proteína. Los niveles de transcripción se pueden medir cuantificando la cantidad de transcrito mediante métodos tales como, pero no limitados a, transferencia Northern, RT-PCR o métodos basados en micromatrices. Los niveles de proteína se pueden medir mediante métodos tales como, pero no limitados a, transferencia Western e inmunotinción.

Células madre embrionarias humanas. Las células madre embrionarias humanas son pluripotentes y pueden diferenciarse en todos los derivados de las tres capas germinales primarias, a saber: ectodermo, endodermo y mesodermo (Thomson et al., 1998). Tal y como se usa en la presente memoria, el término "células madre pluripotentes humanas" (hPS) se refiere a células que son capaces, en condiciones apropiadas, de producir progenie humana de diferentes tipos de células que son derivados de las 3 capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células hPS pueden tener la capacidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad y/o la capacidad de formar células identificables de las tres capas germinales en cultivo de tejidos. En la definición de células madre pluripotentes humanas se incluyen las células embrionarias de varios tipos, así como las células madre pluripotentes inducidas (véase, p. ej., Yu et al. (2007) Science 318:5858; Takahashi et al. (2007) Cell 131 (5):861). Los diversos métodos y otras realizaciones de la presente descripción pueden requerir o utilizar células hPS (hPSC) de una variedad de fuentes. Pueden obtenerse células hPS adecuadas a partir de líneas celulares establecidas y/o células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS) mediante métodos que no requieren la destrucción de embriones (Chung et al. 2008).

Tal y como se usa en la presente memoria, "células hiPS" se refiere a células madre pluripotentes inducidas humanas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "célula madre derivada de blastocisto" se indica como célula BS, y la forma humana se denomina "células hBS".

Se considera además que cualquier célula madre pluripotente humana puede usarse en la presente descripción, incluyendo las células adultas diferenciadas que se reprograman a células pluripotentes, p. ej., tratando las células adultas con determinados factores de transcripción, tales como OCT4, SOX2, NANOG y LIN28 como se describe en Yu, et al., 2007, Takahashi et al. 2007 y Yu et al 2009.

Inactivación: El término 'inactivación' se usa en la presente memoria en conexión con la inactivación de la función de una proteína dada en una célula y se refiere a manipulaciones de la célula con el fin de obtener una pérdida de función. La inactivación se puede lograr como se conoce en la técnica, p. ej., usando un inhibidor capaz de inhibir la función de la proteína. La inactivación también puede lograrse mediante mutación o deleción del gen que codifica la proteína. El silenciamiento, por ejemplo, mediante el uso de ARNsi, también puede usarse para lograr la inactivación, como es conocido por el experto en la técnica. La inactivación puede ser transitoria o permanente. La inactivación también puede ser reversible o irreversible. Por ejemplo, la incubación de una población de células con un inhibidor dará como resultado típicamente una inactivación transitoria mientras el inhibidor sea efectivo o esté presente. La eliminación del inhibidor del entorno generalmente dará como resultado el alivio de la inactivación. Asimismo, los ARNsi típicamente solo tendrán un efecto silenciador mientras se expresen o estén presentes. Por otro lado, la deleción o mutación de un gen dará como resultado típicamente la inactivación permanente, aunque el experto en la técnica sabrá cómo revertir los efectos de la deleción o mutación, por ejemplo, mediante métodos de edición de genes.

Célula madre pluripotente inducida. Las células madre pluripotentes inducidas (o iPSC) pueden derivarse directamente de células adultas mediante reprogramación (Takashashi et al., 2006). Las iPSC pueden ser inducidas por proteínas y se denominan entonces células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPSC).

Ligando. Tal y como se usa en la presente memoria, "ligando" se refiere a un resto o pareja de unión que se une específicamente a o reacciona de forma cruzada con el marcador o la diana o el receptor o la proteína de membrana en la célula o con el analito soluble en una muestra o disolución. La diana en la célula incluye, pero no está limitada a, un marcador. Los ejemplos de dichos ligandos incluyen, pero no están limitados a, un anticuerpo que se une a un antígeno celular, un anticuerpo que se une a un antígeno soluble, un antígeno que se une a un anticuerpo ya unido al antígeno celular o soluble; una lectina que se une a un carbohidrato soluble o a un resto de carbohidrato que es parte de una glicoproteína o glicolípido; o fragmentos funcionales de dichos anticuerpos y antígenos que son capaces de unirse; una secuencia de ácido nucleico suficientemente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de la diana celular o analito soluble para unir la secuencia diana o analito, una secuencia de ácido nucleico suficientemente complementaria a una secuencia de ácido nucleico ligando ya unida al marcador celular o diana o analito soluble, o un compuesto químico o proteico, tal como biotina o avidina. Los ligandos pueden ser solubles o pueden inmovilizarse en el medio de captura (es decir, unidos sintéticamente covalentemente a una perla), como se indica en el formato del ensayo, p. ej., cromatografía de afinidad de anticuerpos. Tal y como se define en la presente memoria, los ligandos incluyen, pero no están limitados a, varios agentes que detectan y reaccionan con uno o más marcadores o dianas celulares específicos o analitos solubles.

Marcador. Tal y como se usa en la presente memoria, "marcador", "epítopo", "diana", "receptor" o equivalentes de los mismos pueden referirse a cualquier molécula que se pueda observar o detectar. Por ejemplo, un marcador puede incluir, pero no está limitado a, un ácido nucleico, tal como un transcrito de un gen específico, un producto polipeptídico de un gen, tal como una proteína de membrana, un polipéptido que no es producto de un gen, una glicoproteína, un carbohidrato, un glicolípido, un lípido, una lipoproteína o una molécula pequeña (por ejemplo, moléculas que tienen un peso molecular menor de 10.000 amu). Un "marcador de la superficie celular" es un marcador presente en la superficie celular.

Célula multipotente. Tal y como se usa en la presente memoria, "multipotente" o "célula multipotente" se refiere a un tipo de célula que puede dar lugar a un número limitado de otros tipos de células particulares. Las células multipotentes están comprometidas con uno o más destinos de células embrionarias y, por lo tanto, a diferencia de las células pluripotentes, no pueden dar lugar a cada uno de los tres linajes de la capa germinal, así como a las células extraembrionarias.

Célula madre naíf y célula madre estimulada. Las células madre naíf tienen el potencial de desarrollarse en cualquier tipo de célula, a diferencia de las células madre estimuladas, que pueden diferenciarse en varios tipos de células, pero que ya están predeterminadas hasta cierto punto. Se sabe que existen células madre naíf en ratones, pero las células madre naíf humanas solo se han descrito recientemente (Takashima et al., 2014). Las células madre naíf pueden autorrenovarse continuamente sin señalización de ERK, son fenotípicamente estables y están cariotípicamente intactas. Se diferencian in vitro y forman teratomas in vivo. El metabolismo se reprograma con la activación de la respiración mitocondrial como en la ESC. El estado pluripotente de las células humanas se puede restablecer mediante la expresión a corto plazo de dos componentes, NANOG y KLF2, como se describe en Takashima et al., 2014. Las PSC naíf comparten muchas propiedades con la masa celular interna del blastocisto, mientras que las PSC estimuladas se asemejan a las células de epiblastos de un embrión en un estadio pregastrulante más avanzado. En el ratón, el estado naíf está representado por células madre embrionarias (mESC) y el estado estimulado por células madre del epiblasto (EpiSC). En los seres humanos, las ESC derivadas de blastocistos se han considerado hasta hace poco como el equivalente humano de las mESC. Sin embargo, sin pretender la vinculación a ninguna teoría, sobre la base de múltiples características tales como morfología plana, dependencia de factores de crecimiento o inactivación del cromosoma X, las hESC (y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)) están más cerca de las EpiSC de ratón que de las mESC y, como tales, es más probable que correspondan al estado de pluripotencia estimulado en lugar del naíf (Tesar et al. 2007; Stadtfeld y Hochedlinger 2010).

Anticuerpo natural. El término “anticuerpo natural” se refiere a glicoproteínas heterotetraméricas capaces de reconocer y unirse a un antígeno y que comprenden dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como V^h) y una región constante de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como C^h). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como V^l) y una región constante de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como C^l). Las regiones V^hy V^lse pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Los anticuerpos pueden comprender diversos heterotetrámeros idénticos.

Célula progenitora pancreática o célula progenitora pancreática multipotente. Una célula progenitora es una célula que está comprometida a diferenciarse en un determinado tipo de célula. Por lo tanto, las células progenitoras pancreáticas son multipotentes y pueden diferenciarse y dar lugar a todos los tipos de células del páncreas.

Célula parcialmente madura. Tal y como se usa en la presente memoria, "células parcialmente maduras" se refiere a células que presentan al menos una característica del fenotipo, tal como morfología o expresión de proteínas, de una célula madura del mismo órgano o tejido. Algunas realizaciones de la presente descripción contemplan el uso de células diferenciables de cualquier animal capaz de generar células diferenciables, p. ej., células de tipo pancreático tales como células beta. Los animales de los que se recogen las células diferenciables pueden ser vertebrados o invertebrados, mamíferos o no mamíferos, humanos o no humanos. Los ejemplos de fuentes animales incluyen, pero están limitadas a, primates, roedores, caninos, felinos, equinos, bovinos y porcinos.

Célula pluripotente. Por "pluripotente" se entiende que la célula puede dar lugar a cada uno de los tres linajes de la capa germinal. Sin embargo, es posible que las células pluripotentes no sean capaces de producir un organismo completo. En determinadas realizaciones de la presente descripción, las células pluripotentes usadas como material de partida son células madre, incluyendo células madre embrionarias humanas. Las PSC (células madre pluripotentes) se pueden clasificar en dos estados distintos, naíf y estimulado, dependiendo de en qué estadio se encuentren durante el desarrollo embrionario.

Célula madre. Una célula madre es una célula indiferenciada que puede diferenciarse en células especializadas y puede dividirse para producir más células madre. El término célula madre comprende células madre embrionarias, células madre adultas, células madre naíf, así como células madre pluripotentes inducidas. Las células madre se definen por su capacidad a nivel de una sola célula para autorrenovarse y diferenciarse para producir células de progenie, incluyendo las progenitoras autorrenovables, las progenitoras no renovables y las células diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no todos, los tejidos después de la inyección en blastocistos. Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo en: (1) totipotente, que significa capaz de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotente, que significa capaz de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotente, que significa capaz de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovables), progenitores oligopotentes restringidos a células sanguíneas y todos los tipos y elementos celulares (p. ej., plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotente, que significa capaz de dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotente, que significa capaz de dar lugar a un solo linaje celular (p. ej., células madre espermatogénicas).

Célula madre totipotente: el término se refiere a una célula que tiene el potencial de dar lugar a todos y cada uno de los tipos de células humanas, tales como los tres linajes de la capa germinal y los linajes extraembrionarios. Puede dar lugar a un organismo funcional completo.

En la presente descripción, cualquier nombre de gen o proteína puede hacer referencia al gen o la proteína en cualquier especie. Por ejemplo, PDX1 o Pdx1 se usan indistintamente y pueden referirse a Pdx1 murino o PDX1 humano o a Pdx1 en otra especie.

En la presente descripción, un signo "-" después del nombre de un gen o proteína significa que el gen o la proteína no se expresa, mientras que un signo "+" después del nombre de un gen o proteína significa que el gen o la proteína se expresa. Por lo tanto, PDX1- o células PDX1- son células que no expresan PDX1, mientras que PDX1+ o células PDX1+ son células que expresan PDX1.

Método para aislar células progenitoras pancreáticas bona fide

Es un objeto de la presente descripción proporcionar un método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicho método las etapas de:

i) proporcionar una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1; y

ii) exponer dicha población celular a:

y/o

Células progenitoras pancreáticas bona fide

En el páncreas, se pueden encontrar varios tipos diferentes de células pancreáticas. Las células pancreáticas incluyen, por ejemplo, células progenitoras pancreáticas multipotentes, células progenitoras ductales/acinares, células acinares/exocrinas completamente diferenciadas, células progenitoras ductales/endocrinas, células progenitoras endocrinas, células endocrinas tempranas, y/o células endocrinas completamente diferenciadas. Los diferentes estadios de las hPSC hacia las células endocrinas se representan en la figura 10. Las células progenitoras del endodermo pancreático que expresan PDX1 y NKX6-1 tienen la capacidad de diferenciarse en células acinares, células ductales o células endocrinas. El término "célula progenitora pancreática bona fide" o "progenitor pancreático verdadero" se refiere en la presente memoria a una célula, que es capaz de diferenciarse en todos los linajes pancreáticos, incluyendo acinar, ductal y endocrino, tales como las células productoras de insulina.

Las células endocrinas pancreáticas tempranas son células que han iniciado la expresión de una de las hormonas endocrinas pancreáticas (insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático) pero no comparten todas las características de las células endocrinas pancreáticas completamente maduras que se encuentran en el Islote de Langerhans en el páncreas adulto. Estas células pueden ser células endocrinas que han desactivado Ngn3, pero no comparten todas las características de las células endocrinas pancreáticas completamente diferenciadas que se encuentran en el Islote de Langerhans en el páncreas adulto, tales como la capacidad de respuesta a la glucosa, y son positivas para una de las hormonas endocrinas pancreáticas (insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina).

Las células endocrinas pancreáticas, o células productoras de hormonas pancreáticas, son células capaces de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina.

Las "células endocrinas pancreáticas completamente diferenciadas" (también denominadas "células endocrinas completamente diferenciadas", "células endocrinas pancreáticas maduras", "células endocrinas pancreáticas" o "células endocrinas pancreáticas adultas") son células que comparten todas las características de las células endocrinas pancreáticas completamente diferenciadas que se encuentran en el Islote de Langerhans en el páncreas adulto.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para aislar células progenitoras pancreáticas en el estadio del endodermo pancreático. Estas células pueden tener el potencial de diferenciarse más, por ejemplo, en células productoras de hormonas pancreáticas tales como las células p y/o las células productoras de insulina. Las células productoras de insulina pueden responder a la glucosa. Sin embargo, las células obtenidas mediante los presentes métodos pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula pancreática.

Marcadores y ligandos

PDX1 (caja homeótica 1 pancreática y duodenal), también conocido como factor promotor de insulina 1, es un factor de transcripción necesario para el desarrollo pancreático y la maduración de las células p. En el desarrollo embrionario, PDX1 se expresa por una población de células en la región del intestino proximal posterior del endodermo definitivo, y las células epiteliales PDX1+ dan lugar a las yemas pancreáticas en desarrollo y, eventualmente, a todo el páncreas-sus poblaciones de células exocrinas, endocrinas y ductales (figura 11). Pdx1 también es necesario para la maduración de las células p: las células p en desarrollo coexpresan PDX1, NKX6-1 e insulina, un proceso que da como resultado el silenciamiento de MafB y la expresión de MafA, un cambio necesario en la maduración de las células p. Las células progenitoras pancreáticas PDX1 también coexpresan Hlxb9, Hnf6, Ptf1a y Nkx6-1 (proteína de caja homeótica Nkx-6.1), y estas células progenitoras forman las yemas pancreáticas iniciales, que pueden proliferar más. Las células endocrinas pancreáticas expresan PDX1 y NKX6-1 (células PDX1+ NKX6-1+).

El presente método se basa en la identificación de marcadores de la superficie específicos para células que no expresan PDX1 (células PDX1-), mientras que otros marcadores se identificaron como específicos para células que expresan PDX1 (PDX1+), y otros más como específicos para células que expresan PDX1 y NKX6-1. Las moléculas capaces de unirse a dichos marcadores se denominarán en la presente memoria "ligandos" y se pueden usar para aislar células progenitoras pancreáticas verdaderas.

Por consiguiente, el presente método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende las etapas de:

ii) exponer dicha población celular a:

y/o

b) un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1+ y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+;

y/o

Se entenderá que la población celular puede estar expuesta a cualquiera del primer y/o segundo y/o tercer ligando en etapas simultáneas o en etapas posteriores y que las etapas pueden realizarse en cualquier orden. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta solo a solo uno del primer, segundo o tercer ligando. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta a dos o tres del primer, segundo o tercer ligando. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta al primer, al segundo y al tercer ligando simultáneamente. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta al primer ligando y al segundo ligando en etapas separadas. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta al primer ligando y al tercer ligando en etapas separadas. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta al primer ligando y al segundo o tercer ligando simultáneamente. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta al primer ligando y en una etapa separada está expuesta al segundo y tercer ligando simultáneamente. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta simultáneamente al primer y segundo o tercer ligando. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta simultáneamente al primer y segundo ligando, y está expuesta al tercer ligando en una etapa separada. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular está expuesta simultáneamente al primer y tercer ligando, y está expuesta al segundo ligando en una etapa separada.

Población celular de partida

En una primera etapa, se proporciona una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida comprende al menos un 5 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 10 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 15 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 20 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 25 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 30 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 35 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 40 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 45 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 50 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 55 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 60 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 65 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

Con el fin de determinar la fracción de células progenitoras bona fide comprendidas en la población enriquecida, se pueden emplear métodos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitados a, métodos de inmunotinción o citometría de flujo.

Sin pretender la vinculación a ninguna teoría, el porcentaje de células progenitoras pancreáticas bona fide en la población celular de partida puede estimarse mediante la expresión de GP2. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida comprende al menos un 5 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 10 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 15 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 20 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 25 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 30 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 35 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 40 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 45 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 50 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 55 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 60 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 65 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 70 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 75

células que expresan GP2, tal como al menos un 80 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 85 % de células que expresan GP2. La expresión de GP2 se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como métodos de inmunotinción, métodos de citometría de flujo o mediciones cuantitativas de los niveles de transcripción.

Asimismo, sin pretender la vinculación a ninguna teoría, el porcentaje de células PDX1+NKX6-1+ de la población celular de partida se puede estimar mediante la expresión de GP2. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida comprende al menos un 5 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 10 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 15 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 20 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 25 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 30 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 35 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 40 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 45 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 50 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 55 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 60 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 65

células que expresan GP2, tal como al menos un 70 % de células que expresan GP2, tal como al menos un 75

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular puede derivarse o aislarse de un individuo, tal como, pero no limitado a, un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se derivan de células capaces de diferenciarse, tales como células madre pluripotentes, por ejemplo, células madre pluripotentes humanas (hPSC). Las hPSC incluyen células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre humanas naíf (NhSC).

En una realización de la presente descripción, la población celular que comprende células pancreáticas se obtiene de un páncreas, incluyendo un páncreas fetal. En algunos aspectos de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide que expresa PDX1 y NKX6-1 se obtiene de un páncreas, incluyendo un páncreas fetal o un páncreas adulto. En un aspecto de la presente descripción, el páncreas es de un mamífero, tal como un ser humano.

En otra realización de la presente descripción, la población celular que comprende células pancreáticas es una población de células somáticas. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide que expresa PDX1 y NKX6-1 se obtiene a partir de una población de células somáticas. En un aspecto adicional de la presente descripción, la población de células somáticas ha sido inducida para desdiferenciarse en una célula madre de tipo embrionario (ESC, p. ej., una célula pluripotente, o hESC para ESC humanas). Dichas células desdiferenciadas también se denominan células madre pluripotentes inducidas (IPSC, o hIPSC para IPSC humanas).

En otra realización más de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide es ESC o hESC. En una realización de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide se obtiene a partir de ESC o hESC. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide es una población de células pluripotentes tales como células similares a ESC.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la diferenciación de la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide se induce mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la diferenciación puede inducirse en cuerpos embrioides y/o en cultivos de células en monocapa o una combinación de los mismos.

En un aspecto de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide es de origen mamífero. En un aspecto de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide es de origen humano. En algunos aspectos de la presente descripción, la población celular se ha diferenciado al linaje endocrino pancreático.

En un aspecto de la presente descripción, la población celular que comprende células pancreáticas se obtiene de uno o más páncreas donados. Los métodos descritos en la presente memoria no dependen de la edad del páncreas donado.

Una vez que se extrae un páncreas de un donante, se procesa típicamente para rendir células individuales o pequeños grupos de células para su cultivo usando una variedad de métodos. Uno de dichos métodos requiere que el tejido pancreático recogido se limpie y prepare para la digestión enzimática. El procesamiento enzimático se usa para digerir el tejido conectivo de modo que el parénquima del tejido recogido se disocie en unidades más pequeñas de material celular pancreático. El tejido pancreático recogido se trata con una o más enzimas para separar el material celular pancreático, las subestructuras y las células pancreáticas individuales de la estructura general del órgano recogido. Se contemplan preparaciones de colagenasa, ADNasa, lipasa y otras enzimas para su uso con los métodos descritos en la presente memoria.

El material de origen aislado puede procesarse adicionalmente para enriquecerlo con una o más poblaciones celulares deseadas antes de realizar los presentes métodos. En algunos aspectos de la presente descripción, el tejido pancreático no fraccionado, una vez disociado para cultivo, también puede usarse directamente en los métodos de cultivo de la presente descripción sin separación adicional. Sin embargo, el tejido pancreático no fraccionado, una vez disociado para cultivo, también puede usarse directamente en los métodos de cultivo de la presente descripción sin separación adicional, y rendirá la población celular intermedia. En una realización de la presente descripción, el material celular pancreático aislado se purifica mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad (p. ej., Nycodenz, Ficoll o Percoll). La mezcla de células recogida de la fuente donante será típicamente heterogénea y, por lo tanto, contendrá células alfa, células beta, células delta, células ductales, células acinares, células progenitoras facultativas y otros tipos de células pancreáticas.

Un procedimiento de purificación típico da como resultado la separación del material celular aislado en varias capas o interfaces. Típicamente, se forman dos interfaces. La interfaz superior está enriquecida con islotes y contiene típicamente del 10 al 100 % de células de los islotes en suspensión.

La segunda interfaz es típicamente una población mixta de células que contiene células de los islotes, acinares y ductales. La capa inferior es el sedimento, que se forma en la parte inferior del gradiente. Esta capa contiene típicamente principalmente células acinares, algunos islotes atrapados y algunas células ductales. Los componentes del árbol ductal se pueden recoger por separado para una manipulación adicional.

La constitución celular de las fracciones seleccionadas para una manipulación adicional variará dependiendo de la fracción del gradiente que se seleccione y los resultados finales de cada aislamiento. Cuando las células de los islotes son el tipo de célula deseado, una población adecuadamente enriquecida con células de los islotes dentro de una fracción aislada contendrá al menos del 10 % al 100 % de células de los islotes. También se pueden recoger otros tipos y concentraciones de células pancreáticas después del enriquecimiento. Por ejemplo, los métodos de cultivo descritos en la presente memoria se pueden usar con células aisladas de la segunda interfaz, del sedimento o de otras fracciones, dependiendo del gradiente de purificación usado.

En una realización de la presente descripción, los cultivos de células pancreáticas intermedias se generan a partir de la fracción (superior) enriquecida con islotes. Además, sin embargo, también se puede usar en cultivo la segunda interfaz más heterogénea y las fracciones de la capa inferior que típicamente contienen poblaciones de células mixtas de células de islotes, acinares y ductales o componentes del árbol ductal, células acinares y algunas células de islotes atrapadas, respectivamente. Si bien ambas capas contienen células capaces de dar lugar a la población de células progenitoras pancreáticas bona fide enriquecida descrita en la presente memoria, cada capa puede tener ventajas particulares para su uso con los métodos descritos.

En una realización de la presente descripción, la población celular es una población de células madre. En otra realización de la presente descripción, la población celular es una población de células madre diferenciadas al linaje endocrino pancreático. En una realización de la presente descripción, la población celular es una población de células madre que se obtiene sin la destrucción de un embrión. Se conocen en la técnica métodos para obtener células madre sin destruir embriones (Chung et al., 2008).

Un protocolo para obtener células pancreáticas a partir de células madre se ejemplifica en, pero no está limitado a, los protocolos descritos en D'Amour, K. A. et al. (2006); Jiang, J. et al. (2007); y Kroon, E. et al. (2008), Rezania et al (2012, 2014), Felicia W. Pagliuca et al (2014).

Un protocolo para obtener células pancreáticas a partir de células somáticas o células somáticas inducidas para desdiferenciarse en células pluripotentes tales como células similares a ES se ejemplifica en, pero no está limitado a, los protocolos descritos en Aoi, T. et al. (2008), Jiang, J. et al. (2007), Takahashi, K. et al. (2007), Takahashi y Yamanaka (2006), y Wernig, M. et al. (2007). Otros protocolos han sido descritos por D'Amour, K.A et al. (2006) o Kroon, E. et al. (2008).

La diferenciación es el proceso por el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida para diferenciarse es aquella que ha asumido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometida", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la ruta de diferenciación hasta un punto en el que, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula o subconjunto de tipos de células específicos y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente o revertir a un tipo de célula menos diferenciado. La desdiferenciación se refiere al proceso por el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Tal y como se usa en la presente memoria, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula coloca a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico de linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida al linaje de interés.

En algunos aspectos de la presente descripción, "diferenciar" o "diferenciación", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso en el que las células progresan desde un estado inmaduro a un estado menos inmaduro. En otro aspecto de la presente descripción, "diferenciar" o "diferenciación", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso en el que las células progresan desde un estado indiferenciado a un estado diferenciado o desde un estado inmaduro a un estado maduro. Por ejemplo, las células pancreáticas indiferenciadas pueden proliferar y expresar marcadores característicos, como PDX1. Las células pancreáticas embrionarias indiferenciadas tempranas pueden proliferar y expresar marcadores característicos, como PDX1. En una realización de la presente descripción, las células pancreáticas maduras o diferenciadas no proliferan y secretan niveles altos de hormonas endocrinas pancreáticas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células pancreáticas maduras o diferenciadas no proliferan y secretan niveles altos de hormonas endocrinas pancreáticas o enzimas digestivas. En una realización de la presente descripción, p. ej., las células beta maduras secretan insulina a niveles altos. En algunas realizaciones de la presente descripción, p. ej., las células beta maduras secretan insulina a niveles altos en respuesta a la glucosa. Los cambios en la interacción y maduración celular ocurren cuando las células pierden marcadores de células indiferenciadas o ganan marcadores de células diferenciadas. En una realización de la presente descripción, la pérdida o ganancia de un único marcador puede indicar que una célula ha "madurado o se ha diferenciado". En algunas realizaciones de la presente descripción, la pérdida o ganancia de un único marcador puede indicar que una célula ha "madurado o se ha diferenciado completamente". El término "factores de diferenciación" se refiere a un compuesto añadido a las células pancreáticas para aumentar su diferenciación a células endocrinas maduras que también contienen células beta productoras de insulina. Los factores de diferenciación ejemplares incluyen factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de queratinocitos, exendina-4, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento semejante a insulina I, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, y péptido 1 similar a glucagón. En una realización de la presente descripción, la diferenciación de las células comprende cultivar las células en un medio que comprende uno o más factores de diferenciación.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide se analiza para identificar si al menos una de las células de la población de partida expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático y seleccionados del grupo que consiste en NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, MAFA, MAFB, ARX, BRN4, PAX4 y PAX6, GLUT2, INS, GCG, SST, polipéptido pancreático (PP). En algunas realizaciones de la presente descripción, los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1 y NKX6-1. En una realización de la presente descripción, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y PP. En algunas realizaciones de la presente descripción, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, PP y grelina. Una célula adecuada para su uso en la presente descripción es una que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente descripción, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que exprese hormonas pancreáticas. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormonas pancreáticas.

En una realización de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células beta. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células beta expresa PDX1 y puede expresar además al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN3, NKX2-2, NKX6-1, NEUROD, ISL1, FOXA2, MAFA, PAX4 y PAX6. En una realización de la presente descripción, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células beta es una célula beta. En una realización de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa el marcador NKX6-1. En otro aspecto de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa el marcador PDX1. En un aspecto adicional de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa los marcadores NKX6-1 y PDX1.

PDX1 es un factor de transcripción con dominio homeótico implicado en el desarrollo del páncreas. Pax-4 es un factor específico de células beta y Pax-6 es un factor de transcripción (específico) de células de islotes pancreáticos; ambos están implicados en el desarrollo de los islotes. Hnf-3 beta (también conocido como FoxA2) pertenece a la familia de factores de transcripción del factor nuclear hepático, que se caracteriza por un dominio de unión al ADN altamente conservado y dos dominios carboxi-terminales cortos. NeuroD es un factor de transcripción básico de hélice-bucle-hélice (bHLH) implicado en la neurogénesis. Ngn3 es un miembro de la familia de neurogeninas de factores de transcripción básicos de bucle-hélice-bude. NKX2-2 y NKX6-1, tal y como se usan en la presente memoria, son miembros de la familia de factores de transcripción Nkx. Islet-1 o ISL-1 es miembro de la familia de factores de transcripción LIM/dominio homeótico, y se expresa en el páncreas en desarrollo. MAFA es un factor de transcripción expresado en el páncreas y controla la expresión de genes implicados en la biosíntesis y secreción de insulina. NKX6-1 y PDX1 se coexpresan con PTF1a en la célula multipotente pancreática temprana que puede desarrollarse en todos los tipos de células que se encuentran en el páncreas adulto (p. ej., células acinares, ductales y endocrinas). Dentro de esta población celular, se encuentran células que también expresan transitoriamente NGN3. Una vez que una célula expresa o ha expresado NGN3, formará parte del linaje endocrino, dando lugar a células endocrinas (siendo un tipo la célula beta productora de insulina) que luego formarán los Islotes de Langerhans. En ausencia de NGN3, no se forman células endocrinas durante el desarrollo del páncreas. A medida que avanza el desarrollo, NKX6-1 y PDX1 se coexpresan en el dominio más central del páncreas, que ahora queda desprovisto de expresión de PTF1a y las células positivas para NKX6-1 y PDX1 ya no pueden dar lugar a células acinares. Dentro de esta población de células positivas para NKX6-1 y PDX1, un número significativo de células coexpresan transitoriamente NGN3, marcándolas para el linaje endocrino como antes en el desarrollo.

En una realización de la presente descripción, las células progenitoras pancreáticas bona fide se derivan de células capaces de diferenciarse. En una realización específica de la presente descripción, las células capaces de diferenciarse son células madre pluripotentes humanas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células capaces de diferenciarse se seleccionan del grupo que consiste en células iPS humanas (hIPSC), células ES humanas (hESC) y células madre humanas naíf (NhSC).

Las células capaces de diferenciarse pueden derivar de células aisladas de un individuo.

CDKN1a, también denominado P21, y CDKN2a, también P16, son genes específicos del ciclo celular. CDKN1a (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1 o proteína 1 que interacciona con CDK), es un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina que inhibe los complejos de CDK2 y CDK1. Por lo tanto, CDKN1 funciona como un regulador de la progresión del ciclo celular en la fase G1 y S. CDKN2a (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A, supresor de tumores múltiples 1) es una proteína supresora de tumores. Desempeña un papel importante en la regulación del ciclo celular al desacelerar la progresión de las células de la fase G1 a la fase S y, por lo tanto, actúa como un supresor de tumores que está implicado en la prevención de cánceres.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que la inactivación de CDKN1a o CDKN2a en la población celular de partida facilita la entrada de la población celular en un estado de replicación correspondiente a la fase G2/M, en particular cuando la población celular de partida son células progenitoras pancreáticas que expresan PDX1. La inactivación de CDKN1a o CDKN2a en la población celular de partida también puede facilitar la entrada de la población celular en la fase S. Por lo tanto, la inactivación de CDKN1a o CDKN2a puede ser útil para obtener células beta maduras a partir de células progenitoras pancreáticas expandidas.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión de CDKN1a y/o CDKN2a en la población celular de partida está inactivada. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida es una población de células progenitoras pancreáticas que expresan PDX1. La población celular de partida también puede ser cualquiera de las poblaciones descritas anteriormente. El experto en la técnica sabe cómo inactivar la expresión de CDKN1a y/o CDKN2a. Esto se puede hacer, por ejemplo, mutando o delecionando los genes correspondientes, mediante métodos conocidos de edición de genes. Alternativamente, se pueden emplear medios de silenciamiento tales como ARNsi con el fin de prevenir la expresión de CDKN1a y/o CDKN2a. Alternativamente, se pueden usar inhibidores que impiden el funcionamiento correcto de CDKN1a y/o CDKN2a.

Ligandos

Después de que se ha proporcionado una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, dicha población se expone a un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y se seleccionan las células que no se unen a dicho primer ligando. Esta separación negativa da como resultado una población celular enriquecida con células PDX1 . La población celular se expone a un segundo ligando que se une a un marcador específico para las células PDX1+ y/o a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1+ y se seleccionan las células que se unen al segundo y/o tercer ligando. Se entenderá que la exposición a cada uno del primer y segundo y/o tercer ligando se puede realizar simultáneamente o en etapas separadas.

Por consiguiente, en una realización de la presente descripción, la población celular se expone a un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1-. Una vez seleccionadas las células que no se unen al primer ligando, la población celular, ahora enriquecida con células PDX1+, se expone a un segundo ligando que se une a un marcador específico para células PDX1+ y/o a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1 y se seleccionan las células que se unen al segundo y/o tercer ligando.

En otra realización de la presente descripción, la población celular se expone al primer ligando, al segundo ligando y/o al tercer ligando simultáneamente, y se seleccionan las células que no se unen al primer ligando pero que se unen al segundo y/o tercer ligando

Cada uno de los ligandos descritos en la presente memoria es un resto que se une específicamente a o reacciona de forma cruzada con un marcador, es decir, un marcador específico para las células PDX1+, células PDX1- o células PDX1 NKX6-1+. El término "ligando" o "ligandos" se usará como un término genérico para hacer referencia a cualquiera del primer, segundo o tercer ligando.

El ligando puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de reconocer y unirse a un marcador específico para un determinado tipo de células. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, al menos uno del primer, segundo y tercer ligandos es un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo. En otras realizaciones de la presente descripción, al menos dos del primer, segundo y tercer ligandos son anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de los mismos. En otras realizaciones de la presente descripción, el primer, segundo y tercer ligandos son anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de los mismos.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el marcador al que se une el ligando es un marcador de la superficie celular.

Los ligandos y/o los anticuerpos empleados en las realizaciones de la presente descripción pueden, en algunas realizaciones de la presente descripción, estar asociados con marcadores detectables. Por lo tanto, tal y como se usa en la presente memoria, el término "marcador" o "marcador detectable" se refiere, por ejemplo, a etiquetas o marcadores radiactivos, fluorescentes, luminiscentes, quimioluminiscentes, biológicos o enzimáticos de uso estándar en la técnica. Los marcadores detectables para la unión a componentes útiles en determinadas realizaciones de la presente descripción pueden seleccionarse fácilmente entre numerosas composiciones conocidas y fácilmente disponibles para un experto en la técnica de los ensayos de diagnóstico. En algunas realizaciones de la presente descripción, el marcador puede ser una molécula química pequeña que es capaz, actuando sola o junto con otras moléculas o proteínas, de proporcionar una señal, que es detectable directa o indirectamente. En realizaciones preferidas de la presente descripción, el marcador o diana está asociado con los diversos ligandos o analitos competidores usados en los ensayos. Los reactivos, ligandos, analitos competidores o medio de captura descritos en la presente memoria no están limitados por el marcador o sistema de marcador detectable particular empleado. En algunos casos, el marcador detectable puede incluir el índice de refracción de una superficie celular o una perla. Un marcador detectable puede conjugarse, o unirse de otro modo, a ácidos nucleicos, polipéptidos, tales como anticuerpos o moléculas pequeñas. Por ejemplo, los oligonucleótidos descritos en la presente memoria pueden marcarse después de la síntesis, incorporando dNTP o rNTP biotinilados, o algunos medios similares (p. ej., foto-reticulación de un derivado proteico de biotina a ARN), seguido de la adición de estreptavidina marcada (p. ej., estreptavidina conjugada con ficoeritrina) o el equivalente. Alternativamente, cuando se usan sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia, se pueden unir a los ácidos nucleicos fluoresceína, lisamina, ficoeritirina, rodamina, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX y otros. Los ejemplos no limitantes de marcadores detectables que se pueden conjugar con polipéptidos tales como anticuerpos incluyen, pero no están limitados a marcadores radiactivos, tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32p, 35S, 64Cu, 76Br, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 125I o 177Lu, enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fluoróforos, cromóforos, agentes quimioluminiscentes, complejos quelantes, tintes, oro coloidal o partículas de látex.

En una realización de la presente descripción, los marcadores particulares permiten la detección emitiendo una señal detectable de una longitud de onda particular tras la excitación por un láser. Las ficobiliproteínas, los colorantes en tándem, determinadas proteínas fluorescentes, moléculas químicas pequeñas y determinadas moléculas detectables por otros medios pueden considerarse marcadores para los análisis de citometría de flujo. Véanse, p. ej., los marcadores enumerados en Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6a Ed., R. P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. (1996). Un ligando, tal como una molécula de anticuerpo, por ejemplo, marcado directamente por conjugación con una biliproteína puede tener hasta 34 cromóforos asociados, cada uno con una absorbancia y un rendimiento cuántico aproximadamente comparables a los de la fluoresceína. Los ejemplos de biliproteínas útiles en determinadas realizaciones de la presente descripción son ficocianina, aloficocianina (APC), aloficocianina B, ficoeritrina y preferiblemente R-ficoeritrina. La ficoeritrina (PE) se encuentra entre los tintes fluorescentes más brillantes disponibles actualmente.

Aún otros marcadores que pueden conjugarse directamente con los componentes de determinados métodos descritos en la presente memoria o usarse con las biliproteínas o tintes en tándem para añadir números adicionales de ligandos marcados al método incluyen moléculas pequeñas que después de la excitación emiten longitudes de onda de menos de 550 nm. Por lo tanto, tal y como se usa en la presente memoria, un marcador que es una "molécula pequeña" o equivalentes del mismo se refiere a que dichas moléculas no se solapan con las emisiones de las biliproteínas. Un ejemplo de dicho marcador es el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Aún otros marcadores que se pueden emplear en este método para proporcionar colores adicionales son las proteínas conocidas como proteínas fluorescentes verdes (GFP) y proteínas fluorescentes azules (BFP); también, en determinadas realizaciones de la presente descripción, son útiles los marcadores que emiten después de la excitación por luz ultravioleta.

Un marcador detectable también puede ser una enzima que interacciona con un sustrato para producir la señal detectable; o una proteína que es detectable mediante la unión de un anticuerpo o mediante la unión a un ligando marcado adecuadamente. Una variedad de sistemas enzimáticos opera para revelar una señal colorimétrica en un ensayo, por ejemplo, glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano picante (FIRP) o fosfatasa alcalina (AP), y hexoquinasa junto con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que reacciona con ATP, glucosa. y NAD+ para rendir NADH que se detecta como una absorbancia incrementada a una longitud de onda de 340 nm. Otros marcadores adicionales, tales como micropartículas de látex coloreadas, en las que se incluye un tinte y forma conjugados con una secuencia inhibidora o ligando y proporcionan una señal visual indicativa de la presencia del complejo resultante, pueden ser aplicables para algunos ensayos descritos en determinadas realizaciones de la presente descripción. Otros sistemas de marcadores que se pueden usar incluyen nanopartículas o puntos cuánticos. Por lo tanto, cualquier número de sistemas de marcaje adicionales y empleados convencionalmente se puede adaptar a los métodos descritos en la presente memoria. Un experto en la técnica comprende que la selección y/o la implementación de un sistema de marcaje implica solo una experimentación de rutina. Los marcajes y marcadores discutidos anteriormente se pueden obtener comercialmente de fuentes conocidas.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "matriz sólida" o un "medio de captura en fase sólida" se refiere a cualquier matriz o medio que permite su separación de la muestra de población celular, por ejemplo, una perla fisiológicamente compatible. Las características de dicha matriz o medio incluyen índice de refracción, tamaño, intensidad de dispersión de luz o portar un tinte detector fluorescente para proporcionar una firma fluorescente única. Dichas perlas están disponibles convencionalmente en la técnica. Por ejemplo, un subconjunto de medio de captura en fase sólida incluye partículas coloidales estables, tales como perlas de poliestireno cuyo tamaño varía de entre aproximadamente 0,2 a aproximadamente 5,0 |jm de diámetro (es decir, de tamaño coloidal). Dichos sustratos o perlas de poliestireno pueden contener grupos funcionales aldehído y/o sulfato, tales como las perlas disponibles comercialmente.

Primer ligando

El presente método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende las etapas de:

ii) exponer dicha población celular a:

a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular con células PDX1 ;

y/o

Por consiguiente, después de proporcionar una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1, la población celular se expone a un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1-. y se seleccionan las células que no se unen a dicho primer ligando, enriqueciéndose así con células que expresan PDX1- (PDX1+).

El primer ligando puede ser un ligando como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones de la presente descripción, el primer ligando es un ligando capaz de reconocer y unirse a un marcador de la superficie celular. En algunas realizaciones de la presente descripción, el marcador de la superficie celular es CD49d. En algunas realizaciones de la presente descripción, el primer ligando es un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo dirigido frente a CD49d. El primer ligando puede conjugarse con un marcador, por ejemplo, con el fin de facilitar la selección de las células que no se unen al primer ligando, como se ha detallado anteriormente.

La selección de las células que no se unen al primer ligando se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica tales como citometría de flujo. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión del primer marcador puede detectarse mediante citometría de flujo.

Segundo ligando

El método comprende además la etapa de exponer la población de partida (o las células que no expresan PDX1 después de la selección con un primer ligando como se ha descrito anteriormente) a un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1+ y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, obteniendo así una población celular enriquecida con células PDX1+. Como resultado, se obtiene una población enriquecida con progenitores pancreáticos bona fide. La población enriquecida puede enriquecerse en particular con células PDX1+ del intestino proximal posterior.

El segundo ligando puede ser un ligando como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones de la presente descripción, el segundo ligando es un ligando capaz de reconocer y unirse a un marcador de la superficie celular. En algunas realizaciones de la presente descripción, el segundo ligando puede reconocer y unirse a una segunda diana seleccionada del grupo que consiste en FOLR1, CDH1/ECAD, F3/CD142, PDX1, FOXA2, EPCAM, HES1 y GATA4. En algunas realizaciones de la presente descripción, el segundo ligando es un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo dirigido frente a una segunda diana seleccionada del grupo que consiste en FOLR1, CDH1/ECAD, F3/CD142, PDX1, FOXA2, EPCAM, HES1 y GATA4. El segundo ligando puede conjugarse con un marcador, por ejemplo, con el fin de facilitar la selección de las células que se unen al segundo ligando, como se ha detallado anteriormente. En una realización preferida de la presente descripción, el segundo ligando es capaz de reconocer y unirse a FOLR1.

La selección de las células que se unen al segundo ligando se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica tales como citometría de flujo. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión del segundo marcador puede detectarse mediante citometría de flujo.

La exposición de la población celular al segundo ligando puede ocurrir al mismo tiempo que la exposición al primer ligando y opcionalmente al tercer ligando, o puede ocurrir en una etapa separada.

Tercer ligando

El método puede comprender la etapa de exponer la población celular a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1+ y se seleccionan las células que se unen a dicho tercer ligando, con el fin de obtener una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide que expresan tanto PDX1 como NKX6-1. La exposición al tercer ligando se puede realizar en lugar de la exposición al segundo ligando. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se expone al primer y tercer ligando, donde la exposición a los ligandos puede ocurrir simultáneamente o en etapas separadas. En otra realización de la presente descripción, la población celular se expone al primer, al segundo y al tercer ligando, donde la exposición a los ligandos puede ocurrir simultáneamente o en etapas separadas. Como resultado, se obtiene una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide.

El tercer ligando puede reconocer y unirse a una tercera diana, donde la tercera diana es GP2. En algunas realizaciones de la presente descripción, el tercer ligando es un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo dirigido frente a GP2. El tercer ligando puede conjugarse con un marcador, por ejemplo, con el fin de facilitar la selección de las células que se unen al tercer ligando, como se ha detallado anteriormente.

La selección de las células que se unen al tercer ligando se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica tales como la citometría de flujo. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión del tercer marcador puede detectarse mediante citometría de flujo.

Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, el presente método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende las etapas de:

ii) exponer dicha población celular a:

y/o

en donde

- el primer ligando reconoce y se une a CD49d,

- el segundo ligando reconoce y se une a un segundo marcador seleccionado del grupo que consiste en FOLR1, CDH1/ECAD, F3/CD142, PDX1, FOXA2, EPCAM, HES1 y GATA4, y

- el tercer ligando reconoce y se une a un tercer marcador que es GP2.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el presente método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende las etapas de:

ii) exponer dicha población celular a:

a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+; y

b) un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1+ y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+;

en donde

- el primer ligando reconoce y se une a CD49d, y

- el tercer ligando reconoce y se une a GP2.

Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, el presente método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende las etapas de:

ii) exponer dicha población celular a:

a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+; b) un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1 y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+;

y

en donde

- el primer ligando reconoce y se une a CD49d,

- el segundo ligando reconoce y se une a FOLR1, y

- el tercer ligando reconoce y se une a GP2,

ii) un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1+ y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+;

en donde

- el tercer ligando reconoce y se une a GP2,

ii) exponer dicha población celular a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1 NKX6-1+ y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+;

en donde el tercer ligando reconoce y se une a GP2,

ii) exponer dicha población celular a:

a) un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1+ y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+;

y

en donde

- el segundo ligando reconoce y se une a FOLR1,

- el tercer ligando reconoce y se une a GP2,

Se entenderá que los métodos para generar células beta productoras de hormonas, tales como células beta productoras de insulina, incluyen separar las células positivas para GP2 aisladas por citometría de flujo u otros métodos similares y tratadas con forskolina, inhibidor de Alk5, Nogina, Nicotinamida. El inhibidor de Rock se puede añadir durante 24-48 h después de la separación.

Población de células progenitoras pancreáticas bona fide

Los presentes métodos proporcionan una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide.

En una realización de la presente descripción, al menos una célula de la población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide tiene la capacidad de diferenciarse más. La al menos una célula de la población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide puede tener la capacidad de diferenciarse más en células productoras de hormonas pancreáticas. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas es una célula productora de insulina. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas responde a la glucosa. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas es una célula productora de insulina, que también responde a la glucosa. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una célula de la población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide puede producir células de los islotes productoras de insulina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas tiene una expresión incrementada de al menos una de insulina, péptido C, Insm-1, Isl-1, MafA y MafB en comparación con una población celular que se ha incubado en ausencia del inhibidor de Yap1. En una realización de la presente descripción, la célula productora de hormonas pancreáticas es una célula p madura.

Otro método para obtener células p productoras de hormonas, tales como células p productoras de insulina, comprende la etapa de tratar las células aisladas mediante los presentes métodos con un inhibidor de Yap1, tal como verteporfina. Dichos métodos se describen en la solicitud de patente en tramitación con la presente titulada "Method for production of insulin-producing cells" (inventores Anant Mamidi y Henrik Semb, solicitante: Universidad de Copenhague) presentada en la misma fecha.

YAP1 (proteína 1 asociada a Yes) es un efector nuclear aguas abajo de la ruta de señalización Hippo, que está implicada en el desarrollo, crecimiento, reparación y homeostasis. La verteporfina es una molécula pequeña, que es capaz de inhibir la actividad de Yap1.

Después de que se haya proporcionado una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse como se ha descrito anteriormente, la población celular se puede incubar en presencia de un inhibidor de Yap1. En algunas realizaciones de la presente descripción, el inhibidor de Yap1 es verteporfina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de verteporfina a una concentración de entre 0,1 y 10 |jg/mL, tal como entre 0,2 y 9 |jg/mL, tal como entre 0,3 y 8 |jg/mL, tal como entre 0,4 y 7 jig/mL, tal como entre 0,5 y 6 jig/mL, tal como entre 0,6 y 5 jig/mL, tal como entre 0,7 y 4 jig/mL, tal como entre 0,8 y 3 jig/mL, tal como entre 0,9 y 2 jig/mL, tal como 1 jig/mL. En una realización de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de 1 jig/mL de verteporfina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de verteporfina durante una duración de al menos 3 días, tal como al menos 4 días, tal como al menos 5 días, tal como al menos al menos 6 días, tal como al menos 7 días, tal como al menos 8 días, tal como al menos 9 días, tal como al menos 10 días. En algunas realizaciones de la presente descripción, la incubación en presencia de verteporfina se realiza durante una duración de 5 días.

En algunas realizaciones de la presente descripción, CDKN1a y/o CDKN2a se inactiva en la población celular de partida. En una realización de la presente descripción, CDKN1a está inactivado. En otra realización de la presente descripción, CDKN2a está inactivado. En otra realización de la presente descripción, tanto CDKN1a como CDKN2a están inactivados. En otra realización de la presente descripción, CDKN1a y CDKN2 se inactivan secuencialmente, es decir, uno de CDKN1a y CDKN2a se inactiva en una primera etapa, y el otro de CDKN1a y CDKN2a se inactiva en una segunda etapa; la primera y segunda etapas pueden superponerse en el tiempo o ser independientes.

Método para producir una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide

También se describe en la presente memoria un método para producir una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicha población celular enriquecida al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide. En una realización de la presente descripción, el método es como se ha descrito anteriormente.

Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, el método es para producir una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide que comprende al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 71 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 72 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 73 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 74 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 76 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 77 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 78 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 79 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 81 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 82 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 83 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 84 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 86 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 87 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 88 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 89 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

Con el fin de determinar la fracción de células progenitoras bona fide comprendidas en la población enriquecida, se pueden emplear métodos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitado a, métodos de inmunotinción y/o de citometría de flujo.

Población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide

También se describe en la presente memoria una población celular que comprende al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se puede obtener mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

Así, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 71 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 72 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 73 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 74 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 76 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 77 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 78 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 79 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 81 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 82 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 83 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 84 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 86 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 87 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 88 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 89 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

Con el fin de determinar la fracción de células progenitoras bona fide comprendida en la población enriquecida, se pueden emplear métodos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitado a, métodos de inmunotinción y/o de citometría de flujo.

Tratamiento de trastorno metabólico

También se describe en la presente memoria una población celular que comprende células progenitoras pancreáticas bona fide, que se pueden obtener mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite.

Las poblaciones celulares descritas en la presente memoria pueden usarse para el tratamiento de trastornos metabólicos. Dichas poblaciones celulares que comprenden células progenitoras pancreáticas bona fide pueden enriquecerse con progenitores bona fide como se describe, de modo que se pueda aislar una población celular enriquecida, p. ej., con progenitores de células p. Esto se puede hacer como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante el uso de marcadores de unión de ligandos como se ha detallado anteriormente y aislamiento mediante citometría de flujo. Estas células aisladas pueden almacenarse antes de su uso o pueden usarse inmediatamente. Las células se pueden diferenciar más. Una vez que se obtiene una población celular con las características deseadas, las células se trasplantan a un individuo que lo necesite. Como ejemplo, dicha terapia basada en células es útil para trasplantar células p productoras de insulina en individuos que padecen diabetes, mediante lo cual puede restablecerse la producción de insulina in vivo. Si la población celular de partida deriva del propio paciente, pueden reducirse los riesgos de reacciones inmunes adversas, tales como el rechazo de las células trasplantadas. Como alternativa al trasplante de células p productoras de insulina en un paciente, también se pueden trasplantar células progenitoras pancreáticas bona fide, tales como las células que pueden obtenerse mediante los métodos descritos en la presente memoria.

El término "trastorno metabólico", tal y como se usa en la presente memoria, debe considerarse que se refiere a enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas. Preferiblemente, el trastorno está relacionado con un trastorno pancreático. Los ejemplos de trastornos metabólicos son: diabetes mellitus, incluyendo la diabetes tipo 1 y tipo 2.

La diabetes mellitus, comúnmente conocida como diabetes, es un grupo de enfermedades metabólicas en las que hay niveles altos de azúcar en sangre durante un período prolongado. Existen varios tipos de diabetes, incluyendo la diabetes tipo 1, la diabetes tipo 2 y la diabetes gestacional. La diabetes tipo 1 se caracteriza por la pérdida de las células p productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que conduce a una deficiencia de insulina. La diabetes tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina, que puede combinarse con una secreción de insulina relativamente reducida. Se cree que la respuesta defectuosa de los tejidos corporales a la insulina implica al receptor de la insulina. La diabetes gestacional, que se asemeja a la diabetes tipo 2, ocurre en aproximadamente el 2-10 % de todos los embarazos. El tipo de diabetes también se puede clasificar como diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no dependiente de insulina, diabetes mellitus relacionada con la malnutrición o diabetes mellitus no especificada.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para obtener una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción se proporciona aquí una población celular para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones de la presente descripción, el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste en diabetes mellitus tal como diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no dependiente de insulina, diabetes mellitus relacionada con la malnutrición o diabetes mellitus no especificada.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular para el tratamiento de un trastorno metabólico se obtiene mediante los métodos descritos anteriormente, a saber:

• exponer una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1, a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1+ y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+; en donde el tercer ligando reconoce y se une a GP2; o

• exponer una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1, a un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1+ y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1 y a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1 y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+, en donde el segundo ligando reconoce y se une a FOLR1, y el tercer ligando reconoce y se une a GP2; o

• exponer una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1, a un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+; y a un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para las células PDX1+ y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+; y a un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para las células PDX1+ NKX6-1 y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo así la población celular con células PDX1+ NKX6-1+, en donde el primer ligando reconoce y se une a CD49d, el segundo ligando reconoce y se une a FOLR1, y el tercer ligando reconoce y se une a GP2;

• o cualquiera de los métodos descritos en otra parte de la presente memoria.

En un aspecto de la presente descripción, se proporciona un método de tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita, en donde el método comprende una etapa de proporcionar una población celular enriquecida en células progenitoras pancreáticas bona fide que se pueden obtener mediante los métodos descritos en la presente memoria.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los presentes métodos comprenden una etapa de trasplante de al menos parte de dicha población celular enriquecida en el individuo que padece un trastorno metabólico.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida puede diferenciarse más antes del trasplante. Por lo tanto, las células progenitoras pancreáticas bona fide pueden diferenciarse más en células productoras de insulina o en células p productoras de insulina maduras antes del trasplante, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente en tramitación con la presente titulada "Method for production of insulin-producing cells" (inventores Anant Mamidi y Henrik Semb, solicitante: Universidad de Copenhague) presentada en la misma fecha. En otras realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida se diferencia más en células endocrinas que se encuentran en los islotes pancreáticos. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida se diferencia más en células p productoras de insulina que tienen una expresión incrementada de MafA. Preferiblemente, las células p productoras de insulina son maduras y/o responden a la insulina.

El experto dispone de métodos para diferenciar más la población celular enriquecida (Rezania et al., 2014). En una realización de la presente descripción, el método comprende las etapas de proporcionar una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse; e incubar dicha población celular en presencia de un inhibidor de Yap1;

obteniendo así una población celular enriquecida con células p productoras de insulina. En una realización de la presente descripción, el inhibidor de Yap1 es verteporfina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de verteporfina durante una duración de al menos 3 días, tal como al menos 4 días, tal como al menos 5 días, tal como al menos 6 días, tal como al menos 7 días, tal como al menos 8 días, tal como al menos 9 días, tal como al menos 10 días. En algunas realizaciones de la presente descripción, la incubación en presencia de verteporfina se realiza durante una duración de 5 días.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células que se han diferenciado más de esta manera pueden aislarse. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células aisladas o una población celular que comprende las células que se han diferenciado más se trasplantan en el individuo que padece un trastorno metabólico.

Ejemplos

Ejemplo 1

Introducción

La cura de la diabetes requeriría la prevención de la destrucción autoinmune de las células beta junto con la restauración de la masa de células beta ya destruida. El tratamiento sería la regeneración o el trasplante de las células productoras de insulina. Debido a su pluripotencia inherente y a un suministro teóricamente ilimitado, las células madre embrionarias humanas (hESC) se han convertido en una fuente atractiva para las terapias de reemplazo de células beta. Esta estrategia se basa en superar el riesgo de la formación de teratomas después del trasplante. El injerto de derivados de hESC purificados podría minimizar el riesgo de tumorigenicidad. En este estudio, realizamos un análisis en profundidad de progenitores pancreáticos PDX1+ derivados de hESC mediante el desarrollo de una línea celular informadora dirigida a PDX1-eGFP. Identificamos nuevos marcadores de la superficie celular para el aislamiento de progenitores de células beta PDX1+ derivadas de hESC. Específicamente, mostramos el enriquecimiento de GP2 y FOLR1 en la fracción GFP+ correspondiente a los progenitores pancreáticos y CD49d en la fracción GFP-. Combinando estos nuevos marcadores de la superficie celular o usándolos individualmente, los verdaderos progenitores de células beta pueden aislarse de poblaciones celulares heterogéneas derivadas durante la diferenciación in vitro. Estos nuevos anticuerpos no solo facilitan la generación de células productoras de insulina a partir de células progenitoras pancreáticas purificadas, así como un mayor cultivo y trasplante de poblaciones de células progenitoras pancreáticas puras para la terapia de reemplazo celular de la diabetes, sino que también permiten estudios adicionales del desarrollo del páncreas humano. Aunque hasta ahora no se han obtenido células secretoras de insulina funcionales que respondan a la glucosa mediante estrategias de diferenciación in vitro, se han obtenido pruebas de principio a través del trasplante de células progenitoras pancreáticas y células que expresan insulina derivadas in vitro en modelos de ratones diabéticos, donde las células precursoras/células inmaduras insulina+ se diferencian y maduran en células productoras de insulina que responden a la glucosa con la capacidad de revertir la diabetes en ratones (Kroon et al. 2008, Rezania et al. 2014). Este concepto se ha convertido en un modelo atractivo para el tratamiento de pacientes que padecen diabetes, ya que ofrece una fuente ilimitada de células beta derivadas de células madre. Sin embargo, antes de que esta visión pueda realizarse, tienen que eliminarse dos preocupaciones/obstáculos importantes; (1) la formación de teratomas causada por el trasplante de poblaciones de células heterogéneas y (2) las células implantadas deben protegerse para evitar el posterior rechazo inmune. Se muestra/establece que la purificación de las células progenitoras pancreáticas antes del trasplante podría reducir el riesgo de formación de teratomas. Este enriquecimiento puede obtenerse mediante el uso de líneas celulares informadoras específicas de tejido o marcadores de la superficie celular. La falta de líneas celulares informadoras humanas disponibles para el aislamiento de progenitores pancreáticos ha dificultado la identificación de marcadores de la superficie celular específicos del páncreas. Las pocas publicaciones relacionadas con la identificación de marcadores de la superficie de células humanas han usado fracciones primarias de páncreas o islotes humanos como fuente de material. En 2011, Kelly et al informaron sobre tres marcadores de la superficie celular para la identificación de progenitores pancreáticos y células endocrinas mediante la realización de un cribado basado en citometría de flujo de anticuerpos comerciales. Se identificó CD142 como un marcador de la superficie para las células PDX1+/NKX6-1+ y CD200 o CD318 como marcadores de la superficie para células endocrinas. Otro grupo (Jiang et al 2011) informó que un marcador adicional, CD24, es un nuevo marcador para los progenitores PDX1+. Sin embargo, posteriormente se mostró que CD24 no era un marcador adecuado para los progenitores de PDX1+, ya que su expresión se detectó en hESC indiferenciadas y durante el proceso de diferenciación del endodermo temprano al endodermo pancreático (Naujok y Lenzen, 2012). También se observó un patrón de expresión generalizado para CD24 en el cribado de anticuerpos realizado por Kelly et al. De hecho, examinamos el patrón de expresión de estos marcadores de la superficie celular publicados en nuestro cribado y no pudimos observar ningún cambio significativo en la expresión entre las fracciones de células GFP+ y GFP- para los marcadores CD24, CD200. Además, CD318 se enriqueció en cambio significativamente en las células GFP-. Mientras CD142/F3 se enriqueció comparativamente en las células GFP+ (en relación con las células GFP-) a nivel de transcrito, las tinciones con anticuerpo de CD142 mostraron expresión de CD142 en poblaciones celulares tanto GFP+ como GFP-. Estas observaciones resaltan/ilustran las dificultades para identificar marcadores de la superficie celular específicos sin el uso de líneas celulares informadoras específicas de tejido.

Para permitir el aislamiento de células progenitoras pancreáticas PDX1+ puras a partir de hESC, establecimos una línea celular informadora PDX1 mediante direccionamiento génico. Si bien esto se ha logrado en células ES de ratón (Holland et al., 2006), hasta ahora no se ha publicado en hESC. Además, esta línea celular informadora no solo permite el aislamiento y la caracterización adicional de progenitores pancreáticos derivados de hESC, sino que también representa una nueva herramienta para estudiar el desarrollo de progenitores pancreáticos humanos.

En el presente estudio, identificamos a GP2 como un nuevo marcador de la superficie celular para el aislamiento de progenitores pancreáticos PDX1+/NKX6-1+ y a CD49d como un marcador de la superficie celular para fracciones de células PDX1-, lo que permite la selección negativa. También se identificó un marcador de la superficie celular adicional, FOLR1. A diferencia de GP2, este marcador tiene un patrón de tinción más amplio, ya que también marca a los progenitores PDX1+/NKX6-1-.

Estos marcadores, a diferencia de los marcadores publicados previamente, permiten el enriquecimiento de progenitores pancreáticos de cultivos celulares heterogéneos y son extremadamente valiosos para el desarrollo de terapias para la diabetes, ya que permiten el aislamiento de progenitores de células beta PDX1+ de otras líneas de células ES humanas no etiquetadas genéticamente.

Ejemplo de referencia 2 - Direccionamiento de eGFP en el locus PDX1 humano.

Para monitorizar la formación del endodermo pancreático en hESC, el factor de transcripción pancreático duodenal de caja homeótica 1 (PDX1), esencial para el desarrollo del páncreas y la función de las células beta, fue dirigido mediante el uso de recombinación de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) (Fig. 1A). Se identificó un BAC que contenía el gen PDX1 humano usando el navegador del genoma en http://genome.ucsc.edu. Se insertó un casete informador eGFP-loxp-Sv40Neo-loxp directamente aguas arriba del codón de inicio de PDX1. El vector de direccionamiento se recuperó en un plásmido bacteriano y el casete de neomicina se escindió por recombinasa CRE para producir el vector de direccionamiento final que contenía brazos de homología de 12,5kb y 3,5kb. En particular, la escisión del casete Neo fue crucial para obtener la expresión de eGFP. La línea celular HUES-4 se sometió a electroporación con el vector de direccionamiento linealizado y se trató con G418 durante dos semanas hasta que aparecieron colonias resistentes al fármaco. El cribado de 353 clones dio como resultado 4 clones dirigidos correctamente (Fig. 1B y 1C). Para confirmar la expresión de PDX1-eGFP en el clon diana, usamos una versión modificada de nuestro protocolo de diferenciación previamente publicado (Ameri et al., 2010) (Fig. 1C). Las hESC se expusieron a Activina A y Wnt3a (usadas en hESC cultivadas en MEF) o Chir (usado en hESC cultivadas en medio ""DEF-CSTM ", células madre Cellectis, Cellartis AB") para inducir la inducción del endodermo definitivo (Estadio 1). A este estadio le siguió la adición de ácido retinoide (RA) durante tres días (Estadio 2) y luego FGF2 (ocasionalmente con Nogina) durante los días restantes para inducir progenitores pancreáticos y del intestino proximal posterior (Estadio 3). Las imágenes de fluorescencia y de contraste de fase correspondientes de la línea celular de hES PDX1-eGFP diana en el día 13 se muestran en la Fig. 1D. El día 17, el 50-70 % de las células expresan regularmente PDX1-eGFP. La inmunotinción del clon PDXeG1 mostró que eGFP estaba altamente colocalizada con PDX1 (Fig. 1E). Estos resultados confirman que la línea celular informadora PDX1-eGFP se puede usar para monitorizar la expresión de PDX1 durante la diferenciación de hESC. Las inmunotinciones de las células en estadio 3 (d17) confirmaron la expresión de NKX6-1, ECAD, HES1 y SOX9 en los progenitores pancreáticos a nivel de proteína (Fig. 2F).

Ejemplo de referencia 3 - Análisis de hESC PDX1-eGFP diferenciadas in vitro.

Al modificar nuestro protocolo de diferenciación previamente publicado (Ameri et al., 2010) y combinarlo con la línea celular informadora PDX1-eGFP descrita en el ejemplo 2, pudimos separar por FACS diferentes subpoblaciones que bien coexpresaban PDX1 y NKX6-1 (protocolo A (PE)) o solo expresaban PDX1 mientras carecían de NKX6-1 (protocolo B (PFG)) (Fig. 2A, 2B y 2D). Para evaluar los perfiles de expresión génica de las poblaciones de células eGFP+ y eGFP-separadas por FACS, se cuantificaron los niveles de ARNm de varios genes asociados al páncreas mediante qPCR (Fig. 2C y 2F). La expresión de PDX1, NKX6-1, ECAD, MNX1, HNF6 y SOX9 estaban todas reguladas al alza significativamente en las células eGFP+ frente a las células eGFP- obtenidas con el protocolo A (PE) (Fig. 2D). Sin embargo, ni MNX1 ni, lo que es más importante, NKX6-1 estaban regulados al alza significativamente en las células eGFP+ obtenidas con el protocolo B (PFG) (Fig. 2G). Estos resultados sugieren que las células eGFP+ obtenidas con el protocolo A (PE) son células progenitoras pancreáticas mientras que las células eGFP+ obtenidas con el protocolo B (PFG) son células del intestino proximal posterior (endodermo). Las inmunotinciones de las células en estadio 3 (d17) confirmaron la expresión de NKX6-1, ECAD, HES1 y SOX9 en los progenitores pancreáticos a nivel de proteína (Fig. 2F).

Ejemplo 4 - Se realizó un análisis con micromatrices para comparar los perfiles de expresión génica de progenitores pancreáticos PDX1+/NKX6-1+ derivados in vitro frente a células PDX1+/NKX6-1-.

Con el fin de identificar marcadores de la superficie celular específicos que servirían para enriquecer con progenitores pancreáticos, realizamos un análisis con micromatrices comparando los patrones de expresión génica de las dos subpoblaciones distintas PDX1+ correspondientes al endodermo del intestino proximal (PFG) PDX1+ y el endodermo pancreático (PPC) PDX1+/NKX6-1+. Específicamente, las células PDX1+/NKX6-1 (denominadas PFG+), se compararon con las células PDX1+/NKX6-1+ (denominadas PPC) y las células GFP- correspondientes (Fig. 3A). T ambién comparamos los patrones de expresión génica de las células PDX1+/NKX6-1-(F2 GFP+), células PDX1+/NKX6-1+ (RFN Gf P+), y las células correspondientes PDX1-/GFP- (RFN GFP-). Para simplificar el análisis, solo se seleccionaron para un análisis adicional los genes con valores de p inferiores a 0,005 y unas veces de cambio superiores a 1,4. Estos valores de corte se determinaron sobre la base de los valores de expresión para PDX1 y NKX6-1. La agrupación jerárquica de estos genes reveló el enriquecimiento de diferentes genes en cada grupo. Específicamente, 382 genes estaban regulados al alza/enriquecidos en las células PPC frente a las células PFG, 698 genes estaban regulados al alza en las células PPC+ frente a las células GFP-. Más interesante aún, 115 genes estaban específicamente regulados al alza en las células PPC (las células progenitoras pancreáticas caracterizadas por la expresión de PDX1 y NKX6-1), pero regulados a la baja en las células PFG y GFP-(Fig. 3B). Aplicando el agrupamiento jerárquico a la expresión promedio de todas las réplicas en cada grupo, se crearon nueve subgrupos diferentes (Fig. 3C).

Ejemplo de referencia 5 - Nuevos marcadores de la superficie celular expresados en endodermo pancreático PDX1 derivado de hESC.

Entre los genes enumerados en los subgrupos 3a, 5 y 6 identificamos los nuevos marcadores de la superficie celular Integrina alfa 4 (ITGA4 o CD49d) enriquecida en las células GFP-(Subgrupo 3a), receptor fólico 1 (FOLR1) que reconoce las células PDX1+ independientemente de la expresión de NKX6-1 (Subgrupo 6) y la glicoproteína 2 (membrana de gránulos de zimógeno) (GP2) que está específicamente enriquecida en los progenitores pancreáticos PDX1+/NKX6-1 (Subgrupo 5). GP2, FOLR1 y CD49d se validaron mediante citometría de flujo para la purificación de PPC derivadas de células PDXeG (Fig. 4A). Los genes candidatos se validaron mediante citometría de flujo para identificar marcadores de la superficie celular para la purificación de células progenitoras pancreáticas derivadas de hESC. Sobre la base de la disponibilidad de anticuerpos comerciales, se seleccionaron y analizaron mediante citometría de flujo la glicoproteína 2 (membrana de gránulos de zimógeno) (GP2), el receptor de folato 1 (adulto) (FOLR1) y CD49d (ITGA4). La Fig.4A muestra el enriquecimiento de genes localizados en la membrana plasmática o la región extracelular en las fracciones GFP+ y GFP-. La fig. 4B y fig. 5A muestran un análisis de citometría de flujo de los marcadores de la superficie celular seleccionados GP2, CD49d (ITGA4) y FOLR1 realizado en hESC diferenciadas cultivadas en MEF (día 17), que confirma que GP2 y FOLR1 estaban altamente expresados en las células GFP+ mientras que CD49d se enriqueció en las células GFP-. Más específicamente, la mayoría de las células GFP-(70-72 %, aproximadamente el 71 %) en el día 17 expresó CD49d mientras que el 64-76 % (aproximadamente el 76 %) de las células GFP+ coexpresaban GP2. De forma importante, solo una pequeña fracción de las células GFP-(3-7 %, aproximadamente el 3 %) expresaba GP2 y básicamente ninguna (1-2 %, aproximadamente el 1 %) de las células GFP+ expresaban CD49d. Las cotinciones con FOLR1 y CD49d mostraron el mismo patrón de tinción para CD49d, el 70-73 % (aproximadamente el 70 %) de las células GFP- en el día 17 expresaban CD49d mientras que el 41-62 % (aproximadamente el 62 %) de las células GFP+ expresaban FOLR1 (fig. 5A).

El análisis de expresión génica de las poblaciones celulares separadas mostró que los marcadores del endodermo pancreático y los nuevos marcadores de la superficie celular estaban altamente enriquecidos en la población celular separada GP2+/CD49d- y FOLR1+/CD49d-(Fig. 4C y D).

Los valores relativos para la expresión génica en poblaciones celulares dependientes de la expresión de GP2 (Fig. 4C) se muestran en la tabla 1.

Tabla 1.

Gen CD49d+/GP2- CD49d-/GP2+ GFP+/GP2-PDX1 1 79,43925234 64,43679292

NKX6-1 1 28,07471796 6,916959497

FOXA2 1 70,28477547 57,69989047

HNF6 1 95,92198582 94,5035461

MNX1 1 107,1615812 41,10307224

SOX9 1 6,819672131 5,498360656

GP2 1 396,9765153 18,2205972

FOLR1 1 96,72 41,208

CD49d 1 0,02622449 0,033469388

CALB1 1 371,1526237 81,40750918

Los valores relativos para la expresión génica en poblaciones celulares dependientes de la expresión de FOLR1 (Fig. 4D) se muestran en la tabla 2.

Tabla 2.

Gen FOLR1-/CD49d+ FOLR1+/CD49d- GFP+/FOLR1-PDX1 1 259,502924 246,1622807

NKX6-1 1 44,37113647 13,96219686

FOXA2 1 71,78849145 74,47900467

HNF6 1 119,2727273 117,4825175

MNX1 1 537,2883727 123,8701553

SOX9 1 4,657337639 4,562970936

GP2 1 104,4978435 55,05853358

Gen FOLR1-/CD49d+ FOLR1+/CD49d- GFP+/FOLR1-FOLR1 1 108,1436464 27,90055249

CD49d 1 0,032021491 0,013566152

CALB1 1 140,7758767 78,90902931

En conjunto, estos datos indican que CD49d se expresa exclusivamente en las células GFP- y que GP2 marca la mayoría de las células GFP+. Sin embargo, FOLR1, en contraste con GP2, marca una porción menor de las células GFP+, lo que hace que GP2 sea un marcador más específico para reconocer las células progenitoras pancreáticas PDX1+.

Ejemplo de referencia 6 - Caracterización de nuevos marcadores de la superficie celular en una línea celular no etiquetada genéticamente cultivada en un sistema sin alimentador.

Para investigar si nuestros marcadores de la superficie celular identificados también podrían usarse en una línea celular no modificada genéticamente y para verificar nuestros marcadores recientemente identificados, usamos una línea celular no modificada genéticamente, células HUES4 cultivadas en condiciones sin alimentador, para caracterizar la expresión de CD49d, GP2 y FOLR1 mediante citometría de flujo. La línea celular HUES-4 también se usó para generar la línea celular PDX1-eGFP (Fig. 4C y 5C). En general, nuestro protocolo de diferenciación funciona con mayor eficiencia en el sistema de cultivo sin alimentador definido en comparación con el cultivo en MEF y, como consecuencia, se observan muy pocas células CD49d+.

Las siguientes subpoblaciones se separaron y caracterizaron mediante qPCR en hESC diferenciadas desde el día 17; CD49d+/GP2, GP2-/CD49d-, y GP2+/CD49d- (Fig. 4D). Los marcadores pancreáticos PDX1, NKX6-1, SOX9, HNF6, FOXA2, MNX1 estaban todos significativamente enriquecidos en las células GP2+/CD49d- en comparación con las células CD49d+/GP2- y GP2-/CD49d-. De forma importante, aunque todavía se detectó PDX1 en las células GP2-CD49d-, estas células tenían una expresión baja de NKX6-1 y GP2, lo que indica que estas células son células del intestino proximal posterior PDX1 . Además, la falta de expresión de GP2 junto con la observación de que FOLR1 todavía se expresa en las células GP2-/CD49d- indica que GP2 marca específicamente las células progenitoras pancreáticas mientras que FOLR1 se expresa de manera más amplia. El análisis de expresión génica de las subpoblaciones CD49d+/FOLR1-, FOLR1-/CD49d-, y FOLR1+CD49d- (Fig. 5D) mostró que si bien todos los marcadores pancreáticos estaban enriquecidos de hecho en las células FOLR1+/CD49d-, las células FOLR1-CD49d- todavía contenían células que expresaban PDX1, NKX6-1, lo que indica que FOLR1 tiene una especificidad algo menor que GP2 en el reconocimiento/marcaje de células progenitoras pancreáticas.

Por lo tanto, estos datos muestran que GP2 y FOLR1 marcan específicamente las células PDX1+/NKX6-1+ derivadas de hESC independientemente de si derivan en un sistema de cultivo sin alimentador definido o en MEF. Globalmente, nuestros datos indican que GP2 marca específicamente PPC PDX1+/NKX6-1+ derivadas de hPSC, mientras que FOLR1 reconoce tanto las hPPC como las hPFC que carecen de expresión de NKX6-1.

Los valores relativos para la expresión génica en poblaciones celulares dependientes de la expresión de FOLR1 (Fig. 5D) se muestran en la tabla 3. pág

Tabla 3

Gen GP2-/CD49d+ GP2-/CD49d- GP2+/CD49d-PDX1 1 48,03965133 142,8871763

NKX6-1 1 4,573916565 94,66585662

MNX1 1 36,98737595 128,0495962

FOXA2 1 48,34355828 92,22903885

SOX9 1 3,643922719 7,90576343

HNF6 1 62,28685822 138,5492228

GP2 1 31,15015974 849,8402556

FOLR1 1 37,03353803 74,16154936

Gen GP2-/CD49d+ GP2-/CD49d- GP2+/CD49d-CD49d 1 0,040230358 0,010665158

CALB1 1 62,13936973 424,7669774

Los valores relativos para la expresión génica en poblaciones celulares dependientes de la expresión de GP2 (Fig. 5C) se muestran en la tabla 4.

Tabla 4

Gen FOLR1-/CD49d+ FOLR1-/CD49d- FOLR1+/CD49d-PDX1 1 44,41087613 102,7190332

NKX6-1 1 40,03599712 94,81641469

MNX1 1 35,98580841 70,19766853

FOXA2 1 6,020408163 12,31292517

SOX9 1 4,4509827 8,450041191

HNF6 1 81,54761905 124,702381

GP2 1 79,02097902 204,1958042

FOLR1 1 8,366533865 46,61354582

CD49d 1 0,105603448 0,006073276

CALB1 1 53,98601399 159,4405594

Ejemplo 7 - Validación de los nuevos marcadores de la superficie celular GP2 y CD49d en páncreas fetal humano. Con el fin de validar los marcadores GP2 y CD49d y con el fin de validar si GP2 también desempeña un papel in vivo, usamos páncreas fetal humano de 9,1WD para examinar la expresión de GP2 y CD49d. Realizamos análisis de citometría de flujo del páncreas fetal humano. De forma comparable con las hPSC, no hay superposición entre la expresión de GP2 y CD49d en el páncreas fetal humano (Fig. 4E). La expresión de PDX1 y NKX6-1 se analizó en poblaciones de células GP2+ y CD49d+ separadas por FACS. PDX1 y NKX6-1 estaban significativamente enriquecidos en las células GP2+, sin que se detectara expresión en las células hematopoyéticas y endoteliales CD45+/CD31+ usadas como control (Fig. 4G). En conjunto, estos resultados muestran que las células GP2+ tanto en hESC como en páncreas fetal humano marcan progenitores pancreáticos caracterizados por la expresión de PDX1 y NKX6-1 y que GP2 se puede usar para aislar PPC tanto de hPSC in vitro como de páncreas fetal humano in vivo.

Ejemplo 8 - Validación de GP2 usando un protocolo de diferenciación independiente y previamente publicado.

Para corroborar nuestros descubrimientos, la línea celular PDXeG se diferenció según una versión ligeramente modificada de un protocolo de diferenciación previo publicado por Rezania et al. 2013 (Fig. 6A) y se separaron diferentes subpoblaciones en función de la expresión de GP2 y GFP (Fig. 6B). En contraste con lo que observamos con nuestro protocolo, el protocolo de Rezania da lugar a una población celular heterogénea que consiste en células GFP+/GP2- y GFP+/GP2+ (Fig. 6B). El análisis de la expresión génica reveló que las células GP2+GFP+ estaban significativamente enriquecidas con los genes PDX1, NKX6-1, SOX9, GP2 y PTF1a asociados a PPC, mientras que las células GP2-GFP-expresaban niveles altos de CD49d (Fig. 6C). El nivel más alto de FOLR1 se observó en las células GP2-GFP+, sin embargo, FOLR1 también se expresó en las células GP2+/GFP+ y GP2-/GFP- (Figura 6C). En conjunto, estos descubrimientos, junto con los datos mostrados anteriormente, muestran que GP2 se puede usar para el aislamiento de hPPC PDX1+/NKX6-1+ de cultivos de diferenciación heterogéneos independientemente del sistema de cultivo o protocolo de diferenciación.

Ejemplo de referencia 9 - Caracterización de marcadores de la superficie celular actualmente disponibles para la purificación de células progenitoras pancreáticas.

Por último, examinamos el patrón de expresión de los marcadores de la superficie celular previamente reportados CD142, CD200 (Kelly et al., 2011) usando la línea celular informadora PDXeG cultivada en MEF y diferenciada según el "protocolo PE" (Fig. 7A). La mayoría de las células GFP+ y GFP- se tiñen con CD142 y CD200, lo que indica que estos marcadores de la superficie no marcan fielmente la población progenitora pancreática. Mediante la aplicación de un protocolo de diferenciación independiente y sin alimentador publicado por Rezania et al. 2013 en combinación con la línea celular HUES4 no modificada genéticamente, evaluamos la especificidad de nuestros nuevos marcadores de la superficie celular en paralelo a los CD142 y CD200 publicados previamente. Estos resultados muestran claramente que GP2 es superior en el marcaje de PPC PDX1+/NKX6-1+ (Fig. 7B, C).

El análisis de citometría de flujo de los marcadores de la superficie celular previamente identificados CD142 y CD200 en la línea celular informadora PDXeG cultivada en MEF (Fig. 7A) mostró que la mayoría de las células GFP+ y GFP- se tiñen con CD142 y CD200. Por lo tanto, estos marcadores no son lo suficientemente específicos para reconocer las células PDX1+/NKX6-1+ en un cultivo heterogéneo de células madre.

En conjunto, estos descubrimientos muestran que los nuevos marcadores de la superficie celular GP2, Cd49d y FOLR1 pueden usarse para aislar células progenitoras pancreáticas derivadas de hESC y que los CD200 y CD142 previamente publicados no son tan específicos como GP2 o FOLR1 en el reconocimiento de células progenitoras pancreáticas.

Ejemplo de referencia 10 - Diferenciación de PPC GP2+/CD49d- purificadas en células que expresan insulina / Potencial de linaje de hPPC GP2+ purificadas hacia el linaje de células beta.

Para mostrar que las células progenitoras pancreáticas GP2+/CD49d- aisladas tienen la capacidad de diferenciarse en células que expresan insulina, estas células se volvieron a sembrar después de la separación por FACS (Fig. 8A). Este experimento de resiembra se realizó usando la línea celular HUES4 no etiquetada genéticamente (figura 8). Las PPC purificadas se volvieron a sembrar en placas recubiertas con fibronectina y se diferenciaron más en presencia de forskolina, ALKi, Nogina y Nicotinamida. Durante las 24-48 horas iniciales, también se añadió inhibidor de Rock para incrementar la viabilidad después de la separación (Fig. 8B). Como aparecen muy pocas células CD49d+ en estos cultivos, se separaron las células GP2+ y las células limitadas/pocas que expresan GP2 bajo (Fig. 8C).

Las células GP2+ diferenciadas (Cd49d-) mostraron un enriquecimiento significativo de células CPEP+ en comparación con las células con GP2bajo (CD49d-) (Figura 8D), esto también se confirmó mediante la cuantificación del área de células CPEP+/DAPI (Figura 8F).

El análisis de inmunofluorescencia de células GP2+/CD49d- diferenciadas se muestra en la Fig. 8E. Finalmente, el análisis de la secreción de insulina estimulada por la glucosa en las células derivadas de las PPC GP2+ confirmó que estas células también responden a la glucosa (Figura 5G). Por lo tanto, mediante el uso de nuestro protocolo modificado, las PPC GP2+ se pueden diferenciar en células de péptido C monohormonal (CPEP)+ que responden a la glucosa.

Ejemplo 11 - El silenciamiento de CDKN1a promueve la expansión de las células progenitoras pancreáticas humanas GP2+

Entre los genes que se enriquecieron en las PPC PDX1+/NKX6-1+ sobre la base de nuestro análisis de micromatrices, encontramos varios genes específicos del ciclo celular, en particular CDKN1a y CDKN2a. Para investigar si estos genes eran dianas importantes (implicados) en la maquinaria del ciclo celular que regula la expansión de los progenitores pancreáticos, realizamos la inactivación mediada por ARNsi de las dianas elegidas en las células progenitoras pancreáticas desde diferentes puntos de tiempo. De hecho, la inactivación de CDKN1a (Fig. 9B) en las células progenitoras pancreáticas tempranas elevó significativamente (se observó un incremento >60 %, datos no mostrados) el número de células progenitoras pancreáticas en proliferación en la fase G2/M (Fig. 9C-E). Este efecto proliferativo estaba ausente si la inactivación de CDKN1a se realizaba en progenitores pancreáticos GP2+ maduros (Fig. 9F-H). Como era de esperar, la tinción por inmunofluorescencia con Ki67 confirmó un incremento notable de las células Ki67+ en los progenitores pancreáticos tempranos en los que se inactivó CDKN1a (Fig. 9I).

REFERENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para aislar una población enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicho método:

exponer una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, en donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1 a:

a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para las células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo así la población celular en células PDX1 ; y/o

y/o

en donde la población celular se expone al menos al tercer ligando y opcionalmente al primer y/o segundo ligando, y en donde el tercer marcador es GP2;

2. El método según la reivindicación 1, en donde la población celular se expone al primer ligando y en donde el primer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a CD49d.

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la población celular se expone al segundo ligando, y en donde el segundo ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a una diana seleccionada del grupo que consiste en: FOLR1, CDH1/ECAD, F3/CD142, PDX1, FOXA2, EPCAM, HES1 y GATA4, preferiblemente FOLR1.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a CD49d y el tercer ligando es un anticuerpo dirigido frente a GP2.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a CD49d, el segundo ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a FOLR1 y el tercer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a GP2.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células progenitoras pancreáticas bona fide se derivan de células capaces de diferenciarse tales como células madre pluripotentes humanas.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células capaces de diferenciarse se seleccionan del grupo que consiste en células iPS humanas (hIPSC), células ES humanas (hESC) y células madre humanas naíf (NhSC).

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células capaces de diferenciarse se derivan de células aisladas de un individuo.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos una célula de la población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide tiene la capacidad de diferenciarse más en una célula productora de insulina.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha población celular está enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide, comprendiendo dicha población celular enriquecida al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.