CN103405773B - 一种可生物降解的温敏性原位水凝胶的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可生物降解的温敏性原位水凝胶的制备与应用，该水凝胶以水溶的、具有温度敏感性的两亲型嵌段聚合物聚丁内酯丙交酯-聚乙二醇-聚丁内酯丙交酯为载体材料，将药物分散或溶解在其水溶液中，或者将荷载药物的微球、脂质体、乳滴等粒子分散在其中。在温度低于相转变温度时，该水凝胶以液体形式存在，可经注射等方式给药；在给药部位温度升高至体温时，可形成凝胶，药物以扩散或/和溶蚀的方式缓慢释放，而且药物的释放速率可通过改变聚合物的浓度、分子量、亲水嵌段/疏水嵌段比例或嵌段组成比例来调节。该水凝胶可经眼部、经皮、阴道、尿道、直肠、鼻腔、耳部的方式给药。

Description

一种可生物降解的温敏性原位水凝胶的制备与应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体涉及温敏性嵌段聚合物的合成与表征，以及由其作为载体材料制备的一种具有缓释功能的原位水凝胶的具体应用。

技术背景：

水凝胶是一类由天然或合成高分子材料经过物理或化学方法交联形成的具有三维网状结构的含水系统。自从1960年Wichterle和Lim首次将聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯（pHEMA）作为凝胶材料用于隐形眼镜以来，由于水凝胶优越的拟生态性，使其在药物传递系统、组织工程和再生医学等领域应用受到了极大的关注。尤其是刺激敏感性水凝胶或环境敏感性水凝胶，能够对外界环境中诸如物理（温度、磁场、电场等）或化学（pH、离子强度、酶等）的微小变化做出响应，产生相应的结构或理化性质方面的变化，例如表现为相转变行为、体积膨胀或粘度增大等，显示了一定的优势。其中因为温度的改变不仅容易控制而且体内外都适用，因此温度敏感性水凝胶成为迄今研究最广、最为深入的一类水凝胶。

温敏性水凝胶的一个显著特点就是具有临界相转变温度，即凝胶材料会随着温度的升高，由溶胶状态转变为凝胶状态或由凝胶状态转变为溶胶状态，前者称为最低临界溶解温度（LCST），后者称为最高临界溶解温度（HCST）。从实用性出发，目前研究的大多是具有LCST的温度敏感性水凝胶。聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）是一种最为典型的温敏性材料，由于其分子中的酰胺键与水分子可形成氢键，而氢键的形成和断裂又易受到温度的影响，所以具有LCST（32℃左右），被广泛用于温敏性水凝胶的研究中。但是，由于该水凝胶在溶胀状态下单位体积聚合物质量较小，导致其所形成的凝胶孔径大、强度低，因此对药物的控释效果较差。为了解决这一问题，并使其LCST更接近于人体体温便于应用，对其进行了诸如嵌段共聚、接枝修饰等结构改造方面的研究。此外，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）也是一种具有温敏性的嵌段聚合物，现已上市的有ICI的泊洛沙姆（poloxamers）和BASF的普郎尼克（pluronics），它的水溶液可随温度的升高，由胶束聚集而形成凝胶。由于其水凝胶给药体系具有缓释、对水难溶性药物的增溶、稳定等作用，因而现已用于丝裂霉素C、白细胞介素多种药物的缓释给药系统。尽管PEO-PPO-PEO嵌段共聚物在诸多领域得到了应用，然而，由于其水凝胶强度低、体内溶蚀快，因而对药物的缓释时间较短。更为重要的是以上两种材料均为非生物降解性材料，由其制备的水凝胶在使用过程中可能存在安全性问题，例如在手术移除PNIPAAm凝胶时可能造成的残留，长期应用PEO-PPO-PEO可引起高胆固醇和高甘油三脂症，在一定程度上限制了它们的广泛应用。

为了开发应用更为安全、凝胶性质更为理想（凝胶强度和凝胶时间可调）的温敏性水凝胶，人们利用可生物降解的天然多糖、蛋白及其衍生物材料，诸如硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、纤维素、海藻酸、葡聚糖、胶原、明胶、弹性蛋白和丝心蛋白等用于水凝胶的制备，并取得了很好的进展。除了对天然材料的开发应用之外，人们还相继合成了一系列具有温度敏感性的聚合物，主要是具有生物相溶性和可生物降解性的聚酯聚醚类嵌段聚合物。该类嵌段聚合物通常有亲水段和疏水段组成，而亲水段以PEG和mPEG最为常见。疏水段有PLLA、PCL、PLGA、PHB、PCLA等。例如已有相关的专利（PLGA-PEG-PLGA，Rathietal：美国专利No.6004573；PLGA-PEG-PLGA，乔明曦等：中国专利公开号200510046409.8；PEG-PLGA-PEG，Rathietal：美国专利No.6117949）报道，其中以PEG和PLGA组成的ABA型三嵌段共聚物的研究最为深入，并已有相应的水凝胶制剂OncoGel进入Ⅱ期临床试验。

另外，此类两亲性嵌段共聚物的凝胶机理是基于胶束的聚集，而胶束又具有典型的内部疏水和外部亲水的核-壳结构，因而该类水凝胶除了可以荷载亲水性的大分子诸如蛋白多肽类药物于胶束间外，还可以荷载疏水性的小分子药物于胶束内，具有更广的载药谱。

总之，基于此类温度敏感性原位水凝胶独特的胶凝机理、凝胶结构、载药能力和缓释性能，将其开发为可直接作用于病灶部位的局部用缓释制剂，不论从降低社会医疗开支的角度出发，还是从提供更人性化的医疗服务方面考虑都具有重要的意义。

发明内容：

本发明是以温敏性的两亲型嵌段聚合物聚丁内酯丙交酯-聚乙二醇-聚丁内酯丙交酯（PBLA-PEG-PBLA）为载体材料，制备了一种可多途径给药的原位水凝胶药物制剂，该水凝胶药物制剂在温度低于体温时以液体形式存在，当温度升高至体温时可形成凝胶。

为此，本发明提供一种以温敏性的两亲型嵌段聚合物聚丁内酯丙交酯-聚乙二醇-聚丁内酯丙交酯为原料制备的水凝胶药物制剂。

本发明的水凝胶药物制剂，其中温敏性的两亲型嵌段聚合物，是以聚乙二醇为引发剂，以丙交酯和β-丁内酯为单体，经开环聚合反应而成，分子量为2000至100000，优选3000-5000，疏水嵌段的重量百分比为10-95%，优选50%-67%，亲水嵌段的重量百分比为5-90%，优选33%-50%。疏水嵌段中丙交酯的百分含量为10-90%，优选80%-90%，β-丁内酯的百分含量为10-90%，优选10%-20%。分子量的大小或嵌段比例可通过投料来控制。

本发明的水凝胶药物制剂，是将所述两亲型嵌段聚合物聚丁内酯丙交酯-聚乙二醇-聚丁内酯丙交酯，药物和溶剂混合配制而成，其中两亲型嵌段聚合物在溶液中的浓度为6%-45%。优选浓度为10-30%。

本发明的水凝胶药物制剂，可加入药用上或生理上可以接受的物质来调节制剂的胶凝温度至临床所需温度，这些物质选自不同分子量大小的PEG，泊洛沙姆等大分子物质，或使氯化钠、葡萄糖等小分子物质。

本发明的水凝胶药物制剂，其中溶剂选自水、缓冲液、体液、细胞培养液、组织液以及其它水溶液和不以有机溶剂为主体的介质。

此类两亲性嵌段共聚物的凝胶机理是基于胶束的聚集，而胶束又具有典型的内部疏水和外部亲水的核-壳结构，因而该类水凝胶除了可以荷载亲水性的大分子诸如蛋白多肽类药物于胶束间外，还可以荷载疏水性的小分子药物于胶束内，可用于抗肿瘤药物、抗炎镇痛药、局麻药或其它临床上需要发挥长效的局部治疗或全身作用的药物。因此，本发明的水凝胶药物制剂，其中药物可以选自肿瘤坏死因子-α、神经生长因子、表皮生长因子、骨形态发生蛋白、胰岛素、生长激素释放因子、内啡肽、肝素酶、白细胞介素-2等蛋白多肽类药物，也可以选自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、丝裂霉素等小分子药物。

本发明的水凝胶药物制剂，主药可以是化学药物，以紫杉醇为例，其组成是：

药物紫杉醇

两亲型嵌段聚合物PBLA-PEG-PBLA

溶剂水

本发明的水凝胶药物制剂，主药可以是多肽/蛋白药物等生物大分子，以肿瘤坏死因子为例，其组成是：

药物肿瘤坏死因子-α

两亲型嵌段聚合物PBLA-PEG-PBLA

溶剂水

本发明的水凝胶药物制剂的制备方法，包括将药物，两亲型嵌段聚合物以及溶剂混合而成，必要时还可加入其它药物可接受的载体。其中所载药物可以直接溶解或分散在凝胶溶液中，也可以将荷载药物的微球、脂质体、乳滴等粒子分散在其中。

本发明的药物制剂，药物以扩散和/溶蚀方式缓慢释放，其给药途径为注射、经皮、眼部、阴道、尿道、鼻腔、耳道等，可产生局部或全身治疗作用。

体内安全性评价试验表明该凝胶具有较好的生物相容性和生物可降解性。

本发明的优点在于：温敏性嵌段聚合物的合成过程可控，结构可调，与同类聚合物PLGA-PEG-PLGA相比，因为用疏水性更强的β-丁内酯替代了GA，因而在不影响胶凝性质的基础上具有更低的临界胶凝浓度，可减少材料用量；水凝胶的制备过程简单，载药谱广，给药方便；凝胶缓释效果明显，释药速率可调，并具有较好的生物相容性和生物可降解性。以上优点经过了试验证明。

附图说明：

图1嵌段聚合物的合成路线

图2嵌段聚合物的¹HNMR与¹³CNMR（溶剂为CD₃Cl，温度25℃）

图3嵌段聚合物水溶液的相图

图4不同温度下的胶束粒径

图5溶菌酶的体内释放曲线

图6荷瘤小鼠的体重变化

图7荷瘤小鼠的瘤重比较

图8荷瘤小鼠的生存率

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

先将反应物进行如下纯化：PEG和丙交酯（LA）在常温下减压干燥，β-丁内酯（β-BL）经氢化钙加热回流1h后，减压蒸馏。

具体合成步骤为：分别称取PEG₁₅₀₀4.0g和LA9.0g，置于干燥的三颈烧瓶中，油浴加热至130℃使熔融，磁力搅拌下持续抽真空，以除去其中的残留水分，2h后，在氮气保护下，加入β-BL1.0g和0.3%（w/w，相对于单体质量）的Sn(Oct)₂，反复抽真空-充氮气后，在氮气保护下升温至150℃反应6h。反应完成后，放至室温，加蒸馏水适量，在75℃左右水浴中反复洗涤，除去未反应的单体或低分子量产物，冷冻干燥后，4℃贮存。

实施例2

称取实例1中合成的聚合物适量，加蒸馏水，室温下磁力搅拌使溶解，分别制备浓度为10、15、20、25和30%的聚合物溶液，运用小瓶翻转法测定其相转变温度，并绘制相图。

实施例3

取实例1中合成的聚合物，配制浓度为0.5%的聚合物水溶液。运用动态光散射法测定不同温度下胶束的粒径。

实施例4

取实例1中合成的聚合物，配制浓度为15%的聚合物水溶液，加入溶菌酶，轻摇至溶，得到载药量为20mg/mL的聚合物溶液。精密移取该载药聚合物溶液1mL至试管中（Φ=1cm），置摇床37±0.5℃水浴中孵育5min，待胶凝后，加含有0.025%的NaN₃PBS5mL作为释放介质，设定摇床速度为50rpm，在不同时间点移取释放介质，并补充同体积的释放介质以维持漏槽条件。在281nm处测定吸光度，代入标准曲线方程计算溶菌酶的累积释放量。在测定时，为避免释放介质对测定结果的干扰，应以不含药的凝胶在相同时间点的释放介质作为空白对照。实施例5

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水凝胶

处方组成：组分名称重量

TNF-α10ug

PBLA-PEG-PBLA共聚物0.30g

制备工艺：取PBLA-PEG-PBLA共聚物，加水溶解制备成浓度为15%的溶液，将TNF-α溶解于其中。

实施例6

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)载药水凝胶的抗肿瘤活性：取S180荷瘤小鼠24只，随机分成6组，每组4只，设为阴性对照组、阳性对照组与凝胶组。阴性对照组分为瘤内注射生理盐水组和瘤内注射空白凝胶组；阳性对照组为TNF-α生理盐水溶液瘤内注射组（5000IU/只）；凝胶组分为TNF-α凝胶溶液瘤内注射高（10000IU/只）、中（5000IU/只）、低（2500IU/只）三个剂量组。在给药7天后，将小鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤组织并拍照观察。以肿瘤生长曲线和抑瘤率来评价抑瘤效果。并以开始给药时间点起记，每2天称量小鼠体重，绘制体重随时间变化曲线。

同时，取肿瘤体积100-200mm3的荷瘤小鼠30只，随机分成3组，每组10只，设为瘤内注射生理盐水组、TNF-α生理盐水溶液瘤内注射组（5000IU/只）与TNF-α凝胶溶液瘤内注射组（5000IU/只），考察荷瘤小鼠的生存期。即以开始给药时间点起记，记录各组小鼠的生存情况，绘制生存曲线。

实施例7

紫杉醇水凝胶

处方组成：组分名称重量

紫杉醇0.020g

PBLA-PEG-PBLA共聚物0.30g

制备工艺：将PBLA-PEG-PBLA共聚物和紫杉醇溶于乙腈，减压旋蒸除去乙腈，使成凝胶状，加水溶解制备成共聚物浓度为15%的溶液。

Claims (3)

1.一种以温敏性的两亲型嵌段聚合物聚丁内酯丙交酯-聚乙二醇-聚丁内酯丙交酯为原料制备的水凝胶药物制剂，由以下成分制成：

TNF-α10ug

PBLA-PEG-PBLA共聚物0.30g

制备工艺：取PBLA-PEG-PBLA共聚物，加水溶解制备成浓度为15％的溶液，将TNF-α溶解于其中。

2.一种以温敏性的两亲型嵌段聚合物聚丁内酯丙交酯-聚乙二醇-聚丁内酯丙交酯为原料制备的水凝胶药物制剂，由以下成分制成：

紫杉醇0.020g

PBLA-PEG-PBLA共聚物0.30g

制备工艺：将PBLA-PEG-PBLA共聚物和紫杉醇溶于乙腈，减压旋蒸除去乙腈，使成凝胶状，加水溶解制备成共聚物浓度为15％的溶液。

3.权利要求1或2所述的药物制剂，其特征在于，所述PBLA-PEG-PBLA共聚物的制备方法如下：

先将反应物进行如下纯化：PEG和丙交酯LA在常温下减压干燥，β-丁内酯经氢化钙加热回流1h后，减压蒸馏；

具体合成步骤为：分别称取PEG₁₅₀₀4.0g和LA9.0g，置于干燥的三颈烧瓶中，油浴加热至130℃使熔融，磁力搅拌下持续抽真空，以除去其中的残留水分，2h后，在氮气保护下，加入β-BL1.0g和相对于单体质量0.3％(w/w)的Sn(Oct)₂，反复抽真空-充氮气后，在氮气保护下升温至150℃反应6h，反应完成后，放至室温，加蒸馏水适量，在75℃左右水浴中反复洗涤，除去未反应的单体或低分子量产物，冷冻干燥后，4℃贮存。