CN109985236B - 克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶及制备方法 - Google Patents

克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶，属于生物大分子药物的眼用缓控释制剂领域。单抗克隆抗体药物被包裹在具有良好生物相容性及生物可降解性的多囊脂质体中，进而多囊脂质体分散于温敏性高分子材料形成的溶胶中，当溶胶经玻璃体腔注射后会在体温下凝固成半固体凝胶形成多囊脂质体‑温敏水凝胶复合制剂，从而控制抗体药物的释放。本发明根据多囊脂质体和水凝胶制剂的优势，保持抗体药物体外释放可达60天左右，减小抗体药物一般剂型的突释问题，同时极大保持了抗体药物的活性，更大程度上延长了抗体药物在玻璃体注射后眼内的滞留时间，减少注射频次的同时提高了患者的顺应性。

Description

克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶及制备方法
技术领域
本发明涉及一种克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶及制备方法。
背景技术
众所周知，缓释制剂具有延缓药物释放的特性，可以较大程度降低药物被机体吸收的速度，减少了普通制剂给药所呈现出的血药浓度峰谷现象，以便保持血药浓度在比较平稳的有效范围内，在提高药物安全性同时，达到更佳的治疗效果。其主要适用于需要长期给药的慢性病，尤其是对于半衰期较短、需要频繁给药的药物，可有效地提高患者的顺应性。
目前，以聚酯或聚酸酐为骨架材料的缓释制剂在解决药物缓释方面具有广泛的应用，如中国专利CN104107165A报道艾塞那肽微球体外释放时间约3周左右，药物释放时间较普通制剂明显增加。但是微球制剂仍存在两方面问题难以解决：(1)由于在制备过程中，药物可能存在于微球表面或内部孔道内，当在溶液中释放时，表面和孔道内的药物会扩散出来，最终导致突释现象明显。对于治疗窗范围较窄的药物，需要特别注意。(2)PLGA或PLA等高分子材料虽然具有可生物降解及良好生物相容性，但由于其降解产物为乳酸等酸性较强物质，其会对注射部位或组织产生刺激性甚至引起炎症。同时，在包裹生物大分子药物时，材料的降解产物所产生的酸性环境会使蛋白发生酸降解，严重影响蛋白多肽的生物活性。虽然有中国专利CN102188384提出，可添加碱性物质来中和微球释放所造成的酸性环境，但在实际生产中添加一味辅料需要相应增加大量质控研究，并且国家食药总局药品评审中心发布的《化学药品注射剂基本技术要求(试行)》中辅料基本选用原则中规定：在满足需要的前提下，注射剂所用辅料的种类及用量应尽可能小。
多囊脂质体是Kim团队于1983年最先发现并进行研究的一种缓释制剂，其以磷脂、胆固醇和中性脂质为囊材，由多个非同心的水性腔室即囊泡组成的类似球形的制剂，随着囊泡逐个破裂，药物从其中释放而达到缓释目的，其主要适合包封水溶性的药物，且包封率较高。同时，磷脂的双分子层结构，对于蛋白药物的稳定性也起到一定保护作用，但由于磷脂自身对温度较敏感的特性，中国专利CN102274183A报道多囊脂质体体外释放仅一周左右，释放时间较短，并未根本性解决药物缓释的目的。
水凝胶是一类可在水中发生溶胀，最终形成具有网格状结构且能够吸收大量的水份而不被溶解的高分子化合物。温敏性水凝胶具有良好的生物相容性、低毒性及生物可降解性，在水溶液中其特定浓度和温度下，可表现溶胶至凝胶的相转变特性，即可在体温条件下自发形成具有缓释特性的凝胶，从而达到药物长期缓慢释放目的。温敏水凝胶一般用于局部注射，在体内原位形成，作为骨架材料而承载水溶性药物。但由于其内部网状结构，水分子很容易从孔道进入到凝胶内部，从而加快药物的释放。国外文献报道(Xu等，Sustainedrelease of
Figure BDA0002030283350000021
from polysaccharides cross-linked hydrogels for oculardrug delivery)某种水凝胶释放抗体药物的时间仅3天左右，因此水凝胶的释药特征并非理想中的骨架溶蚀，扩散机制在水凝胶释放药物过程中也起到了关键作用。
现有技术中，采用玻璃体腔注射的方式治疗眼部新生血管性疾病早已有报道。本团队在CN106924184A中公开了一种眼部玻璃体注射用多囊脂质体，用于治疗眼后段疾病，如湿性黄斑变性，增殖性糖尿病视网膜病变，新生血管性青光眼，特发性脉络膜新生血管等。虽然多囊脂质体具备一定的缓释效果，并且在保证抗体结构及活性方面也具有巨大的优势，但为了能得到一种释放更持久的缓释制剂，有必要提出一种更加有效的技术方案，以解决抗体药物在玻璃体中更加长效释放的目的。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶。
一种克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶，所述凝胶包括下列重量份的各组分：
抗VEGF单抗1份；
蛋白稳定剂1～20份；
中性磷脂1～10份；
二棕榈酰磷脂酰甘油0.2～20份；
三油酸甘油酯0.2～20份；
胆固醇0.8～80份；
渗透压调节剂A 1～20份；
渗透压调节剂B 1～20份；
赖氨酸20～30份；
温敏性凝胶材料5～100份；
所述渗透压调节剂A是蔗糖、海藻糖中一种或多种；
所述渗透压调节剂B是葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种或多种。
本发明还一种克服突释、保持抗体活性的多囊脂质体凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制含渗透压调节剂A和蛋白稳定剂的抗VEGF单抗溶液作为内水相；
(2)将中性磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、三油酸甘油酯和胆固醇溶于有机溶剂中，得到脂质相；
(3)配制含渗透压调节剂B和赖氨酸的水溶液作为外水相；
(4)将所述内水相在8000～12000rpm高速剪切条件下滴加到所述脂质相中，形成w/o初乳；
(5)将所述初乳在2000～8000rpm高速剪切条件下滴加到所述外水相溶液中，形成w/o/w复乳，氮吹或37℃～40℃旋转蒸发，除去有机溶剂，所得溶液3000rpm离心，弃去上清液，加入生理盐水重新分散，得到多囊脂质体混悬液；
(6)取一定体积多囊脂质体混悬液在3000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，离心，取下部沉淀与温敏性凝胶材料涡旋混匀，缓慢升温可得所述多囊脂质体凝胶缓释制剂；
所述渗透压调节剂A质量浓度为3％～10％，优选4％～6％；
所述渗透压调节剂B质量浓度为2％～8％，优选3％～5％。
由于在制备多囊脂质体过程中有油水界面的出现，单抗极易吸附在界面，从而使疏水性基团外翻，导致抗体结构发生变化，进而使蛋白活性丧失。蛋白活性受油水界面、有机溶剂、温度、pH值等影响，同时也与制备过程中工艺有一定关系。为最大限度保持抗体的活性，本发明在制备多囊脂质体时加入了蛋白稳定剂，其可为BSA、HSA、PVA、明胶的至少一种，优选BSA或HSA中一种或两种，由于本发明是为研制一种治疗患者眼后段新生血管病变的长效缓释制剂，因此优选HSA。蛋白稳定剂的作用是其可在一定浓度下替代抗体在油水界面的聚集，从而保证抗体的活性，其质量百分数为2％～40％，w/v。
需要说明的是，本发明内水相中的渗透压调节剂不能是葡萄糖。选择主要是依据单克隆抗体，如贝伐单抗在5％葡萄糖及右旋糖中容易发生浓度依赖性降解，因此不宜选用，且处方筛选中也得到论证，若渗透压调节剂为葡萄糖，在一定时间段内抗体的含量会发生相应降低。
优选的，步骤(6)中所述温敏性凝胶材料为聚乳酸羟基己酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基己酸或聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸三嵌段共聚物，溶胶质量百分浓度为10％～40％，优选20％～30％；溶胶的相变温度为32℃～37℃。
优选的，所述温敏性凝胶材料的制备方法：取一定量聚乳酸羟基己酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基己酸或聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸三嵌段共聚物溶于pH值6.0～9.8的缓冲液中或含有碱性物质的去离子水中，其中碱性物质与三嵌段共聚物质量比为1：1～1：10，三嵌段共聚物在溶液中的浓度为10％～40％；在0℃～4℃条件下，溶胀3h～48h，形成溶胶。所述PCLA-PEG-PCLA的制备方法包括：采用开环聚合的方法来制备嵌段共聚物PCLA-PEG-PCLA,即己内酯(CL)与丙交酯(LA)先合成PCLA，再与PEG共聚，具有反应简易，易操作，产率高等优势，是目前合成嵌段共聚物最常用的方法。所述PEG数均分子量为1000～6000，优选1500～2000；疏水端数均分子量1500～5000，更优选1500～2000。
上述嵌段共聚物的浓度对本发明缓释效果来说是重要的，所形成的溶胶浓度越低，其所需相变温度越高，反之亦然。以嵌段共聚物材料PCLA-PEG-PCLA为例，当其浓度为20％～30％时，相变温度是32℃～34℃，是较佳的相变温度；当PCLA-PEG-PCLA浓度低于10％时，其相变温度在35℃～37℃，溶胶较稀，玻璃体注射后流动性较大，形成凝胶时间较长，不利于药物的缓慢释放；当PCLA-PEG-PCLA浓度高于40％，溶胶较稠，在室温下极易发生相变，变为半固态，失去应用意义。
在嵌段共聚物材料形成溶胶时加入一定pH缓冲液或含碱性物质的水溶液，其目的是为了防止材料在降解过程中产生的酸性环境对抗体活性产生影响及刺激眼内组织，其弱碱性的pH值可保持制剂的内外环境保持恒定。
优选的，步骤(1)中所述抗VEGF单抗为贝伐单抗、雷株单抗、阿柏西普中的一种，浓度为5～100mg/mL。
优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为氯仿或氯仿与乙醚的混合溶液；优选氯仿与乙醚的混合溶液中，二者体积比为1：1。
优选的，步骤(3)中所述赖氨酸质量浓度为10～80mmol/L，更优选30～50mmol/L。
优选的，步骤(4)中所述内水相与所述脂质相的体积比为1：1～1：10，更优选1：1～2：3。
优选的，步骤(5)中所述初乳与所述外水相体积比在1：1～1：5，更优选1：2～1：3。
优选的，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液；pH值为6.0～9.8，优选7.4～8.5；碱性物质为氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锌、碳酸钙、碳酸镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸锌、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢镁、磷酸钠、磷酸镁、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钙或磷酸氢镁；碱性物质与嵌段共聚物w/v质量比为1：1～1：10。
优选的，步骤(2)中所述中性磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂、二芥酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基卵磷脂、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺的至少一种；所述中性磷脂占脂质总质量百分比为20％～60％，所述三油酸甘油酯占脂质总质量百分比为5％～20％，所述二棕榈酰磷脂酰甘油占脂质总质量的百分比为5％～20％，所述胆固醇占脂质总质量百分比为10％～50％。
有益效果：本发明多囊脂质体凝胶缓释制剂主要包括单克隆抗体、脂质、蛋白稳定剂、渗透压调节剂、赖氨酸及温敏性凝胶材料。该缓释制剂所使用的材料无毒、无刺激性，具有良好生物相容性及可降解性。降解产物不会刺激眼部组织产成炎症，同时最大程度降低了眼内炎、玻璃体出血等并发症的发生；降解产物的中性特性可保持抗体药物的生物活性，不至于在酸性条件下发生酸降解；多囊脂质体-温敏凝胶复合缓释制剂降低了药物突释现象，延长了药物在玻璃体中的释放时间，减少了给药次数，提高了患者的顺应性。
附图说明
图1为本发明实施例1～3中蛋白稳定剂对多囊脂质体中抗体活性的影响；
图2为本发明实施例1中载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂体外释放曲线；
图3为本发明实施例1中载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂的SEM图；
图4为本发明对比例1中贝伐单抗多囊脂质体体外释放曲线；
图5为本发明对比例2中贝伐单抗温敏水凝胶的体外释放曲线；
图6为本发明实施例1、实施例4、对比例3以及对比例4的四种制剂在释放溶液里贝伐单抗的抗体活性；
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
实施例1
载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备(LG1)：
贝伐单抗多囊脂质体(Bev-MVLs)制备：将3mL含6％蔗糖和10％(w/v)HSA的25mg/mL的贝伐珠单抗溶液作为内水相；精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇，三油酸甘油酯分别23mg、7mg、19mg、7mg于10ml烧杯中，加3ml氯仿溶解，得脂质相；将内水相在10000rpm高速剪切条件下滴加到脂质相中，剪切5min，形成w/o型初乳；将所述初乳在4000rpm高速剪切条件下滴加到盛有12mL的4％葡萄糖和60mmol/L的赖氨酸外水相溶液中，保持1min，形成w/o/w型复乳；37℃旋转蒸发，得到多囊脂质体混悬液；
多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备：精密称定聚乳酸羟基己酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基己酸(PCLA-PEG-PCLA)嵌段共聚物材料1g，加入pH9.0缓冲液4mL低温下搅拌，使其溶胀均匀，得到温敏性凝胶材料，备用；取5mL多囊脂质体混悬液，3000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，下部沉淀加入温敏性凝胶材料中，涡旋混匀，得多囊脂质体凝胶缓释制剂。
实施例2
载有雷株单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备：
雷株单抗多囊脂质体(Ran-MVLs)制备：将2mL含6％蔗糖和10％(w/v)HSA的25mg/mL的雷株单抗溶液作为内水相；精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇，三油酸甘油酯分别14mg、5mg、13mg、5mg于10ml烧杯中，加2ml氯仿与乙醚混合溶液(1:1，v/v)溶解，得脂质相；将内水相在10000rpm高速剪切条件下滴加到脂质相中，剪切5min，形成w/o型初乳；将所述初乳在4000rpm高速剪切条件下滴加到盛有9mL的5％葡萄糖和40mmol/L的赖氨酸外水相溶液中，保持1min，形成w/o/w型复乳；37℃旋转蒸发，得到多囊脂质体混悬液；
多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备：精密称定聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)嵌段共聚物材料1g，加入含有200mg氢氧化镁的4mL去离子水低温下搅拌，使其溶胀均匀，得到凝胶，备用；取2mL多囊脂质体混悬液，3000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，下部沉淀加入凝胶中，涡旋混匀，得多囊脂质体凝胶缓释制剂。
实施例3
载有阿柏西普的多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备：
阿柏西普多囊脂质体(Afl-MVLs)制备：将2mL含5％蔗糖和10％(w/v)HSA的10mg/mL的阿柏西普溶液作为内水相；精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇，三油酸甘油酯分别15mg、6mg、15mg、6mg于10ml烧杯中，加2ml氯仿与乙醚混合溶液(1:1，v/v)溶解，得脂质相；将内水相在11000rpm高速剪切条件下滴加到脂质相中，剪切6min，形成w/o型初乳；将所述初乳在6000rpm高速剪切条件下滴加到盛有8mL的4％葡萄糖和40mmol/L的赖氨酸外水相溶液中，保持1min，形成w/o/w型复乳；37℃旋转蒸发，得到多囊脂质体混悬液；
多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备：精密称定PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物材料0.5g，加入含有100mg氢氧化镁的2mL去离子水低温下搅拌，其溶胀均匀，备用；取2mL多囊脂质体混悬液，3000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，下部沉淀加入凝胶中，涡旋混匀，得多囊脂质体凝胶缓释制剂。
由于在制备过程中有油水界面及温度、剪切力等因素影响，将上述实施例1～3中多囊脂质体制备后进行抗体活性测定。本实验采用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnent Assay，ELISA)来测定抗体活性。
检测原理：先将抗原包被于酶标板，制备成为固相抗原；向包被的酶标板中加入待测抗体进行孵育，再加入HRP标记的抗原形成了抗原-抗体-酶标抗原的复合物，加入底物TMB显色。TMB经HRP酶催化成蓝色，最后加入酸转成黄色。选用酶标仪读出OD值后与同浓度对照品OD值相比，即得待测抗体的相对结合活性。
实施例1～3中多囊脂质体所包含的抗体活性与未加入蛋白稳定剂的多囊脂质体中抗体活性结果如图1所示，由图1可看出，当加入蛋白稳定剂后，三种单抗的活性均在80％以上，这主要是由于大量白蛋白占据油水界面，减少抗体与油水界面的接触，保证抗体的高级结构不被破坏，进而保持抗体的活性。未加蛋白稳定剂的多囊脂质体处方，经检测其抗体活性受到不同程度破坏，活性均在50％以下，说明大量抗体在制备过程中由于油水界面的出现，导致活性丧失。
载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂(LG1)体外释放曲线如图2所示，由图2可看出，多囊脂质体凝胶缓释制剂其体外释放缓慢释放达56天以上，在前3天释放较快，随后保持缓慢释放的状态。这主要是在释放初期，存在于凝胶浅表面的多囊脂质体释放药物，而在释放中后期，凝胶浅层药物几乎释放完全，剩余的包裹在凝胶内部的多囊脂质体中药物主要依靠多囊脂质体的扩散与溶蚀、凝胶骨架的溶蚀降解方式释放出来。
载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂(LG1)的SEM图如图3所示。从图中可以看出，多囊脂质体颗粒外层包裹凝胶层，凝胶层致密、均匀。
实施例4
载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂的制备(LG2)
制备方法同实施例1。不同之处仅在于，步骤(2)采用的嵌段共聚物是温PLGA-PEG-PLGA。
对比例1
贝伐单抗多囊脂质体的制备：
3mL含6％蔗糖和10％(w/v)HSA的25mg/mL的贝伐珠单抗溶液作为内水相；精密称取二油酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰甘油，胆固醇，三油酸甘油酯分别23mg、7mg、19mg、7mg于10ml烧杯中，加3ml氯仿溶解，得脂质相；将内水相在10000rpm高速剪切条件下滴加到脂质相中，剪切5min，形成w/o型初乳；将所述初乳在4000rpm高速剪切条件下滴加到盛有12mL的4％葡萄糖和60mmol/L的赖氨酸外水相溶液中，保持1min，形成w/o/w型复乳；37℃旋转蒸发，得到多囊脂质体混悬液。
对比例1的贝伐单抗多囊脂质体体外释放曲线如图4所示，由图4可看出，普通多囊脂质体其体外释放时间在13天左右，较图2中复合制剂的体外释放时间短，药物在释放过程中近乎保持匀速释放。
对比例2
贝伐单抗温敏水凝胶的制备
贝伐单抗温敏水凝胶的制备：精密称定PCLA-PEG-PCLA嵌段共聚物材料1.2g，加入pH9.0缓冲液4mL低温下搅拌,使其溶胀均匀，备用；向上述溶胶中加入0.4mL浓度25mg/mL的贝伐单抗溶液，涡旋混合均匀，即得。
对比例2的贝伐单抗温敏水凝胶的体外释放曲线如图5所示，由图5可以看出，贝伐单抗温敏水凝胶其体外释放约为32天左右，在第1天突释较明显，分散在凝胶浅表的药物通过扩散快速释放，在第3天之后，药物释放变得缓慢，药物释放主要是通过扩散与凝胶骨架溶蚀相结合的方式进行。
对比例3
贝伐单抗微球-温敏水凝胶的制备(MG1)
贝伐单抗微球的制备：0.2mL含10％(w/v)HSA的100mg/mL的贝伐单抗溶液作为水相；精密称取100mg PLGA溶于1mL二氯甲烷中，得到油相；将水相在12000rpm高速剪切条件下滴加到油相中，形成w/o型初乳；将所述初乳在8000rpm高速剪切条件下滴加到浓度1％PVA水溶液中，形成w/o/w型复乳；所得复乳500rmp搅拌3h，得到固化微球，经离心、洗涤、冷冻干燥，得到贝伐单抗微球。
微球-温敏水凝胶复合制剂的制备：精密称定PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物材料0.4g，加入pH9.0缓冲液2mL低温下搅拌，低温下搅拌，使其溶胀均匀，备用；取冻干后贝伐单抗微球20mg加入上述凝胶中，涡旋混匀，得微球-温敏水凝胶复合制剂。
对比例4
贝伐单抗微球-温敏水凝胶的制备(MG2)
对比例4的制备方法同对比例3。不同之处仅在于，步骤(2)中的嵌段共聚物材料不是加入pH9.0缓冲液，而是加入去离子水中。
以实施例1中制备的载有贝伐单抗的多囊脂质体凝胶缓释制剂(LG1)为对照，将LG2、MG1、MG2制剂分别进行体外释放研究，释放介质为去离子水，在释放7天时取释放液进行抗体浓度测定，取相同浓度抗体溶液作为对照，通过ELISA测得样品的OD值。
抗体活性保存率(％)＝复合制剂释放液中贝伐单抗OD值/相同浓度贝伐单抗对照品OD值×100％。
其结果如图6所示，从结果可以看出，在释放后的第7天，释放溶液中抗体活性依次为LG1＞LG2＞MG1＞MG2。PCLA-PEG-PCLA是由PEG引发丙交酯(LA)和己内酯(ε-CL)开环聚合所得到的嵌段聚合物，其降解产物为乳酸与羟基己酸，相对于PLGA-PEG-PLGA的降解产物乳酸与羟基乙酸，羟基己酸的酸性远弱于羟基乙酸，因此CL的介入可使降解产物酸性得到减弱，PCL降解速度较慢也会延缓PCLA-PEG-PCLA材料的降解。在相同释放条件下，所释放的活性药物尤其是生物大分子药物在释放初期被包裹在嵌段共聚物的降解产物中，其活性与周围酸性环境有密切关系，因此LG1＞LG2。
当生物大分子药物从PLGA微球中释放时，由于PLGA降解产生的酸性环境，大分子药物活性受到了影响；而大分子从被包埋的多囊脂质体中释放时，由于脂质体降解产物无酸性和有良好生物相容性，因此大分子的活性未受到较大影响，LG2＞MG1。
大分子药物无论从多囊脂质体还是微球中释放出来都必须经过外层包裹的水凝胶，由于水凝胶降解产物带有一定酸性，势必会影响药物活性，因此在水凝胶制备过程中加入磷酸盐缓冲液等弱碱性物质十分重要，其目的主要是中和过多酸性物质，保持环境的近中性。MG2中的水凝胶无弱碱性物质加入，因此MG2相对于MG1，其大分子药物在释放过程中活性除了受到微球降解所致的酸性环境外还受到水凝胶降解酸性环境的影响，其抗体活性MG1＞MG2。
本发明单抗克隆抗体药物被包裹在具有良好生物相容性及生物可降解性的多囊脂质体中，多囊脂质体分散在温敏性高分子材料形成的溶胶中，当溶胶经玻璃体腔注射后，会在体温下凝固成水凝胶骨架，从而形成多囊脂质体-温敏水凝胶复合制剂，从而控制抗体药物的释放。本发明使抗体在体外释放可达60天左右，不但减小抗体药物的突释及较大程度保持了蛋白的活性，更大程度上延长了抗体药物在玻璃体注射后眼内的滞留时间，在减少注射频次的同时提高了患者的顺应性。

Claims (9)

1.一种克服突释和保持抗体活性的多囊脂质体凝胶，其特征在于，所述凝胶包括下列重量份的各组分：
抗VEGF单抗1份；
蛋白稳定剂1～20份；
中性磷脂1～10份；
二棕榈酰磷脂酰甘油0.2～20份；
三油酸甘油酯0.2～20份；
胆固醇0.8～80份；
渗透压调节剂A 1～20份；
渗透压调节剂B 1～20份；
赖氨酸20～30份；
温敏性凝胶材料5～100份；
所述渗透压调节剂A是蔗糖和海藻糖中一种或两种；
所述渗透压调节剂B是葡萄糖、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；
所述温敏性凝胶材料为聚乳酸羟基己酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基己酸或聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸三嵌段共聚物；
所述温敏性凝胶材料的制备方法：取一定量聚乳酸羟基己酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基己酸或聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸三嵌段共聚物溶于pH值为7.4～8.5的缓冲液中或含有碱性物质的去离子水中，其中碱性物质与三嵌段共聚物质量比为1：1～1：10，三嵌段共聚物在溶液中的浓度为10%～40%；在0℃～4℃ 条件下，溶胀3h～48h，形成溶胶；
所述碱性物质为氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锌、碳酸钙或碳酸镁。
2.一种如权利要求1所述的克服突释和保持抗体活性的多囊脂质体凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配制含渗透压调节剂A和蛋白稳定剂的抗VEGF单抗溶液作为内水相；
（2）将中性磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、三油酸甘油酯和胆固醇溶于有机溶剂中，得到脂质相；
（3）配制含渗透压调节剂B和赖氨酸的水溶液作为外水相；
（4）将所述内水相在8000～12000rpm高速剪切条件下滴加到所述脂质相中，形成w/o初乳；
（5）将所述初乳在2000～8000rpm高速剪切条件下滴加到所述外水相溶液中，形成w/o/w复乳，氮吹或37℃～40℃旋转蒸发，除去有机溶剂，所得溶液3000rpm离心，弃去上清液，加入生理盐水重新分散，得到多囊脂质体混悬液；
（6）取一定体积多囊脂质体混悬液在3000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤3次，离心，取下部沉淀与温敏性凝胶材料涡旋混匀，缓慢升温可得所述多囊脂质体凝胶缓释制剂；
所述渗透压调节剂A质量浓度为3%～10%；
所述渗透压调节剂B质量浓度为2%～8%。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中所述温敏性凝胶材料的溶胶质量百分浓度为20%～30%；溶胶的相变温度为32℃～37℃。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述抗VEGF单抗为贝伐单抗、雷株单抗或阿柏西普，浓度为5～100mg/mL。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述有机溶剂为氯仿或氯仿与乙醚的混合溶液；所述氯仿与乙醚的混合溶液中，二者体积比为1：1。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述赖氨酸质量浓度为10～80mmol/L。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述内水相与所述脂质相的体积比为1：1～1：10。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述初乳与所述外水相体积比在1：1～1：5。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述中性磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂、二芥酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基卵磷脂、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺的至少一种；所述中性磷脂占脂质总质量百分比为20%～60%，所述三油酸甘油酯占脂质总质量百分比为5%～20%，所述二棕榈酰磷脂酰甘油占脂质总质量的百分比为5%～20%，所述胆固醇占脂质总质量百分比为10%～50%。
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