JP2023015413A - 化学架橋アルギン酸ゲルファイバ - Google Patents

化学架橋アルギン酸ゲルファイバ Download PDF

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Tsutomu Sato
智裕 鳴海
Tomohiro Narumi
彬 高橋
Akira Takahashi
和行 中山
Kazuyuki Nakayama
昌治 竹内
Shoji Takeuchi
佑 柳沢
Yu Yanagisawa
和弘 池田
Kazuhiro Ikeda
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Abstract

【課題】抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、及び当該アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法の提供。【解決手段】抗体産生細胞６及び基材が含まれるコア層５を、２種類の化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層４で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。【選択図】図１

Description

本発明は、抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法に関する。
遺伝子組換え技術を利用した抗体生産が行われている。これ迄に、抗体産生細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞又は大腸菌等が宿主細胞として用いられ種々の抗体が産生されている。
とりわけ、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）は、浮遊培養が可能な細胞であり、又細胞の増殖速度が速く、ＣＨＯ細胞の大量培養により、目的のタンパク質を大量生産することが容易なことから、抗体の製造に頻用されている。
近年、抗体医薬品の開発・製造において、抗体医薬品の安定生産、低コスト化への取組みが求められており、それらを達成するべく、より生産性の高い効率的な生産システム（例えば、連続生産方法、小規模生産設備による必要な量の抗体産生の為の新規な培養技術、等）の開発が注目されている。
抗体産生細胞の培養は、抗体産生細胞株をスピナーフラスコ等で細胞を起こした後に、培地組成・温度・攪拌条件・ガス交換・ｐＨ等の培養条件を制御しながら拡大培養を行い、最終的に数千から１万Ｌスケールの大規模な生産培養タンクにて培養が行われる。
抗体産生細胞を高密度で連続培養する場合、細胞と培養液の分離方法、効果的な酸素の供給方法等が問題になる場合がある。前者に関しては、重力沈降管や連続遠心分離機を用いて分離する方法等が検討されており、後者に関しては、培養タンク内に入れた多孔質のチューブを通した酸素拡散法、酸素溶解度の高いフッ素化炭素を培養液に添加する等の種々の方法が検討されており、種々の改善が図られている。しかし、抗体を効率的に生産させるためには、未だ種々の問題を解決することが必要とされている。
コア部に各種細胞が含まれるコア・シェル構造を有するマイクロファイバが知られている（特許文献１：国際公開第２０１１／０４６１０５号パンフレット）。
細胞層を含む中空マイクロファイバ、当該マイクロファイバの製造方法が知られている。（特許文献２：国際公開第２０１５／１７８４２７号パンフレット）
アルギン酸ゲル中空ファイバの中空部にて、生体適合性ポリマー含有水溶液中に懸濁した細胞を培養することにより線状細胞凝集塊の作製方法が知られている。（特許文献３：特開２０１４－２３６６９８号公報）
培養液を組織の隅々にまで供給することが可能な３次元細胞構造体の製造方法及び培養方法が知られている。（特許文献４：特開２０１６－７７２２９号公報）
内部に細胞又は水溶性化学物質を含み、最外層に疎水性ポリマーを含む半透膜を備えることを特徴とするマイクロチューブが知られている。（特許文献５：特開２０１７－７７４７３号公報）
細胞と細胞の周りを覆うハイドロゲルとを含む細胞ファイバが知られている。（特許文献６：特許６６０１９３１号公報）
二重同軸層流を有するマイクロ流体装置を用いて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と分化細胞又は体細胞幹細胞をカプセル化したメーター長のコア－シェルハイドロゲル微小繊維の製造方法が知られている。（非特許文献１）
アルギン酸塩とポリアクリルアミドからなるダブルネットワーク（ＤＮ）ハイドロゲルを用いて、機械的特性と取扱性を向上させた、細胞含有ハイドロゲルマイクロファイバーが知られている。（非特許文献２）
しかし、特許文献１～６及び非特許文献１及び２には、抗体産生細胞が含まれるコア層を、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆した高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバ、及び当該アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法が開示されていないし、示唆もされていない。
国際公開第２０１１／０４６１０５号パンフレット 国際公開第２０１５／１７８４２７号パンフレット 特開２０１４－２３６６９８号公報 特開２０１６－７７２２９号公報 特開２０１７－７７４７３号公報 特許６６０１９３１号公報
Nature Materials.,12, p584－590, 2013年. ACS Biomater. Sci. Eng., 3 (3), p392－398, 2017年.
これまで、抗体産生細胞（例えば、抗体遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞等）及び基材（例えば、コラーゲン、培地、アルギン酸等の溶液、それらのゲル、又はそれらの混合物）が含まれるコア層を、架橋アルギン酸ゲル（例えば、天然アルギン酸由来の架橋アルギン酸ゲル（カルシウム架橋アルギン酸ゲル）、化学修飾アルギン酸から形成される化学架橋アルギン酸ゲル、又はイオン架橋及び化学架橋の両方の架橋を有する架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆した抗体生産用のアルギン酸ゲルファイバ、及び当該ゲルファイバを用いて、遺伝子組換え抗体生産を行うことは知られていなかった。又、これまで、一定の長さを有する前記アルギン酸ゲルファイバを形成することや、当該アルギン酸ゲルファイバを用いた連続的な抗体の生産方法も知られていない。
このような状況の下、さらなる抗体の生産方法が求められていた。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、抗体産生細胞及び基材（例えば、ハイドロゲル等の基材であって、具体的には、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、後述の態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、後述の態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材）が含まれるコア層を、後述する式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを被覆層（シェル層）として被覆することにより、抗体産生用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ（当該、化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバである）を作製できることを見出した。又、このように作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いて抗体産生細胞の培養を行ったところ、抗体を長期間連続して産生できることを見出し、本発明を完成するに至った。
後述の実施例から、抗体産生細胞として抗体遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞及び基材として、培地（培養液）、メチルセルロース、又はアルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）からなる群から選択される基材を含むコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有する架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆し、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製し、当該ゲルファイバを培養したところ、長期間連続して抗体（遺伝子組換え）を産生できることが分かった。このように、作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、抗体産生ＣＨＯ細胞にとって抗体の連続産生に適した環境を提供しており、コア層で産生された抗体は、シェル層を連続的に透過しゲルファイバ外に放出された。
本発明により、さらなる抗体の生産方法が提供される。
いくつかの態様では、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有する架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆することで、高い機械的強度を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバが提供される。後述の実施例では、抗体産生細胞を含むコア層を、高い機械的強度を有するシェル層を形成するために、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル（当該架橋アルギン酸ゲルは、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応により形成される化学架橋及び２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン等）より形成されるイオン架橋の両方の架橋、又は、前記化学架橋のいずれかを有している）で被覆した化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製し、抗体産生細胞を培養することにより、コア層で長期間抗体が連続産生され、その抗体がシェル層を透過して、アルギン酸ゲルファイバ外に連続的に放出される特徴を有する。
好ましい態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、抗体の生産に適した環境を提供する。抗体産生細胞がコア層に封入されているため、細胞への物理的ストレスが少なく、封入した抗体産生細胞が長期間に渡り抗体を産生し続けることが期待される。従って、このような化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いた抗体の製造方法は、抗体の生産効率を飛躍的に向上させることが期待できる。例えば、大規模な培養タンクを要する抗体の浮遊培養とは異なり、小規模の生産設備にて抗体を製造することも期待される。少量・多種品目の抗体医薬品製造にも適した次世代型抗体医薬品の連続生産技術としても期待される。
コア層に抗体産生細胞が含有される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの断面図である。 コア層に抗体産生細胞が含有される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。 コア層に抗体産生細胞が含有される化学アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。 コア層に抗体産生細胞が含有されるアルギン酸ゲルファイバの横断面、産生された抗体、代謝物、老廃物、培養液（栄養源）、及び酸素がシェル層を透過することを説明する模式図である。 実施例Ｆ３－３の培養におけるファイバ中の生細胞数を示すグラフである。 実施例Ｆ３－３の培養におけるファイバ中の細胞生存率を示すグラフである。 実施例Ｆ３－３の培養におけるの産生された抗体濃度を示すグラフである。 実施例Ｆ３－４の培養におけるのに抗体生産累積量を示すグラフである。 実施例Ｆ２－３で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（２８日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－４で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（２９日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－５で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（１４日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－６で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（１４日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－７で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（２８日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－９で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（３３日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－１０で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（３３日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。 実施例Ｆ２－８で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの培養後（１４日間）の顕微鏡写真である（写真中の白線のスケールは１０００μｍ）。
［具体的態様］
ここでは、化学架橋アルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法の具体的態様について説明する。より具体的には、以下の態様［１］～［６－１］に記載の通りである。
［１］第１の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて架橋反応により形成される架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
［式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
下記式（Ｉ）：
Figure 2023015413000002
 ［式（Ｉ）中、（ＡＬＧ）は、アルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ１－は、下記表：
Figure 2023015413000003
Figure 2023015413000004
Figure 2023015413000005
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わし；
Ａｋｎは、下記表：
Figure 2023015413000006
 に記載された部分構造式［各式中、波線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体。
［式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
下記式（ＩＩ）：
Figure 2023015413000007
 （式（ＩＩ）中、（ＡＬＧ）はアルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ２－は、下記表：
Figure 2023015413000008
Figure 2023015413000009
Figure 2023015413000010
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体。
［１－１］前記態様［１］の式（Ｉ）において、－Ｌ１－は、好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000011
Figure 2023015413000012
Figure 2023015413000013
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
より好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000014
Figure 2023015413000015
Figure 2023015413000016
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
更に好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000017
Figure 2023015413000018
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーである。
［１－２］前記態様［１］の式（Ｉ）において、Ａｋｎは、好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000019
 に記載された部分構造式［各式中、波線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基であり；
より好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000020
 に記載された部分構造式［各式中、波線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基であり；
更に好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000021
 に記載された部分構造式［各式中、波線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基である。
［１－３］前記態様［１］の式（ＩＩ）において、－Ｌ２－は、好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000022
Figure 2023015413000023
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
より好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000024
Figure 2023015413000025
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーであり；
更に好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000026
Figure 2023015413000027
 に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーである。
［１－４］前記態様［１］の式（Ｉ）において、Ａｋｎ及び－Ｌ２－の組み合わせは、好ましくは、下記表：
Figure 2023015413000028
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１］に記載の通りである）；
より好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure 2023015413000029
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１－１］に記載の通りである）；
更に好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure 2023015413000030
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１－１］に記載の通りである）；
特に好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure 2023015413000031
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中のＡｋｎ、－Ｌ１－の各式は前記態様［１－１］に記載の通りである）；
最も好ましくは、Ａｋｎ－Ｌ１－の組み合わせは、下記部分構造式：
Figure 2023015413000032
 の群から選択される部分構造で示される通りである。
［１－５］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒo細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ－８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０細胞からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
［１－６］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
［１－７］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［１－８］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、例えば、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。
［１－９］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、例えば、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。
［１－１０］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基（Ａｋｎ－Ｌ１－ＮＨ２基：Ａｋｎ、及び－Ｌ１－は、前記態様［１］中の定義と同じである）の導入率が、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１０％の範囲である。
［１－１１］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基（Ｎ３－Ｌ２－ＮＨ２基：－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じである）の導入率が、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１５％の範囲である。
［１－１２］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、例えば、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
Figure 2023015413000033
 ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；
－Ｌ１－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じであり；
Ｘは、下記表：
Figure 2023015413000034
Figure 2023015413000035
 に記載された部分構造式の群から選択される環状基である（各式中、両端の波線外側は含まない）］で表わされる基を介して化学架橋する。
［１－１２－１］前記態様［１－１２］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ１－は、前記態様［１－１］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ１－の定義と同じである。
［１－１２－２］前記態様［１－１２］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ２－は、前記態様［１－２］に記載された好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ２－の定義と同じである。
［１－１２－３］前記態様［１－１２］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、Ｘは、好ましくは、前記態様［１－１２］に記載された部分構造式（ＴＺ－１）、式（ＴＺ－１－ｒ）、式（ＴＺ－２）、式（ＴＺ－２－ｒ）、式（ＴＺ－３）、式（ＴＺ－３－ｒ）、式（ＴＺ－４）、式（ＴＺ－４－ｒ）、式（ＴＺ－５）、式（ＴＺ－５－ｒ）、式（ＴＺ－６）、式（ＴＺ－６－ｒ）、式（ＴＺ－１０）、及び式（ＴＺ－１０－ｒ）からなる群より選択される基であり；より好ましくは、部分構造式（ＴＺ－２）、式（ＴＺ－２－ｒ）、式（ＴＺ－３）、式（ＴＺ－３－ｒ）、式（ＴＺ－５）、式（ＴＺ－５－ｒ）、式（ＴＺ－６）、式（ＴＺ－６－ｒ）、式（ＴＺ－１０）、及び式（ＴＺ－１０－ｒ）からなる群より選択される基であり；更に好ましくは、部分構造式（ＴＺ－２）、式（ＴＺ－２－ｒ）、式（ＴＺ－６）、及び式（ＴＺ－６－ｒ）からなる群より選択される基である。
［１－１２－４］前記態様［１－１２］において、式（ＩＩＩ－Ｌ）で表わされる基の－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の好ましい組み合わせは、下記表の式：

Figure 2023015413000036
Figure 2023015413000037
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
より好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下記表の式：
Figure 2023015413000038
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
更に好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下表の式：
Figure 2023015413000039
 の群から選択される部分構造で示される通りであり（表中の－Ｌ１－は前記態様［１－１］に記載の通り；－Ｌ２－は前記態様［１－３］に記載の通り；－Ｘ－は前記態様［１－２］に記載の通りである）；
特に好ましくは、－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、下記部分構造式［式中、両端の波線外側は含まない］：
Figure 2023015413000040
 の群から選択される部分構造で示される通りである。
［１－１２Ａ］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、好ましくは、前記態様［１－１２］に記載された式（ＩＩＩ－Ｌ）［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、各定義は、前記態様［１－１２］中の定義と同じである］で表わされる基を介して化学架橋され、更に２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、及び亜鉛イオンからなる群から選択されるイオン）を介してイオン架橋されている。
［１－１２Ａ－１］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ１－は、前記態様［１２－１－１］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ１－の定義と同じである。
［１－１２Ａ－２］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ２－は、前記態様［１２－１－２］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ２－の定義と同じである。
［１－１２Ａ－３］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましいＸは、前記態様［１２－１－３］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましいＸの定義と同じである。
［１－１２Ａ－４］前記態様［１－１２Ａ］に記載の式（ＩＩＩ－Ｌ）において、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせは、前記態様［１２－１－４］に記載の、好ましい、より好ましい、更に好ましい－Ｌ２－Ｘ－Ｌ１－の組み合わせの定義と同じである。
［１－１２Ａ－５］前記態様［１－１２Ａ］において、イオン架橋形成に用いられる２価金属イオンは、好ましくは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン又は亜鉛イオンの群から選択される２価金属イオンであり；より好ましくは、カルシウムイオン又はバリウムイオンであり；更に好ましくは、カルシウムイオンである。
［１－１２Ａ－６］前記態様［１－１２Ａ］において、イオン架橋形成に用いられる２価金属イオンは、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液、等からなる群から選択される水溶液を供給源とすることができ；好ましくは、塩化カルシウム水溶液又は塩化バリウム水溶液であり；より好ましくは、塩化カルシウム水溶液である。
［１－１３］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が、例えば、約３００μｍ～約７５０μｍの範囲である。
［１－１４］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、例えば、約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
［１－１５］前記態様［１］～［１－４］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が約３００μｍ～約７５０μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
［２］第２の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、図２に示される、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む、マイクロ流体装置１０を用い、
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０を得る工程
を含むことを特徴とする、前記態様［１］～［１－１５］のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法である。
［２Ａ］第２Ａの態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、図３に示される、導入管ＡＡと導入管ＡＡの導入口１、導入管ＢＢと導入管ＢＢの導入口２、及び導入管ＡＡ及び導入管ＢＢの下流に位置する排出管ＣＣ及びその出口３を含む、Ｔ字型流体装置ＸＸを用い、
（１）導入口２から、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入する工程、
（２）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞６と基材を射出する工程、
（３）排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、２価金属イオンを含む溶液中に射出させる工程、
（４）前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバＣＦＢを得る工程
を含むことを特徴とする、前記態様［１］～［１－１５］のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法である。
［２－１］前記態様［２］又は［２Ａ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ－８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
［２－２］前記態様［２］又は［２Ａ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
［２－３］前記態様［２］又は［２Ａ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［２－４］前記態様［２］又は［２Ａ］において、２価金属イオンが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等からなる群から選択されるイオンであり；好ましくは、カルシウムイオン又はバリウムイオンであり；より好ましくは、カルシウムイオンである。
［２－５］前記態様［２］又は［２Ａ］において、２価金属イオンを含む溶液は、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液、等からなる群から選択される水溶液であり；好ましくは、塩化カルシウム水溶液又は塩化バリウム水溶液であり；より好ましくは、塩化カルシウム水溶液である。
［２－６］前記態様［２］又は［２Ａ］において、２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオンの濃度が、例えば、約１ｍＭ～約１Ｍの範囲、又は約２０～約５００ｍＭの範囲であり；好ましくは、１００ｍＭである。
［２－７］前記態様［２］において、マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速は、例えば、約５０～約１００μＬ／分の範囲である。
［２－７Ａ］前記態様［２Ａ］において、マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速は、例えば、約５０～約１００μＬ／分の範囲である。
［２－８］前記態様［２］において、マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、例えば、約２００～約４００μＬ／分の範囲である。
［２－８Ａ］前記態様［２Ａ］において、マイクロ流体装置ＸＸの導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、例えば、２００～４００μＬ／分の範囲である。
［２－９］前記態様［２］において、マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速は、例えば、約２～約６ｍＬ／分の範囲である。
［２－１０］前記態様［２］において、例えば、マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速が、約５０～約１００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速が、約２００～約４００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速が、約２～約６ｍＬ／分の範囲である。
［２－１０Ａ］前記態様［２Ａ］において、例えば、マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速が、約５０～約１００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置ＸＸの導入口２から射出される前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速が、約２００～約４００μＬ／分の範囲である。
［２－１１］前記態様［２］又は［２Ａ］において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度は、例えば、約４～約３７℃の範囲である。
［３］第３の態様は、次の通りである。抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記態様［１］～［１－４］のいずれか１項に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法であり、前記態様［１］～［１－１５］のいずれか１つに記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養容器に入れ、培地を添加して前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバを含浸させ、培養を行うことによる、抗体の製造方法である。
［３－１］前記態様［３］において、培養容器は、例えば、組織培養用プレート、三角フラスコ、Ｔ－フラスコ、スピナーフラスコ、培養バッグ、動物細胞培養槽等からなる群から選択される容器であり；好ましくは三角フラスコ又は動物細胞培養槽である。。培養は、例えば、静置培養または振とう培養などのいずれの方法を選択してもよく、回分培養（バッチ培養）、流加培養（フェドバッチ培養）、連続培養などのいずれの方法を用いてもよいが、流加培養または連続培養が好ましい。
［３－２］前記態様［３］又は［３－１］において、培養の温度条件は、２８℃～３７℃であり、例えば、培養温度を３７℃または３０℃とし、５％ＣＯ２ 雰囲気下に培養装置（パナソニックヘルスケア（株）， ＭＩＲ－Ｓ１００Ｃ）で１２５ｒｐｍの条件にて培養する。
［３－３］前記態様［３］～［３－２］のいずれか１つにおいて、培養する期間は、例えば、１４日であり；又は２８日であり；又は３３日である。
［３－４］前記態様［３］～［３－３］のいずれか１つにおいて、培養温度は、例えば、約３０～約３８℃の範囲である。
［３－４－１］前記態様［３－４］において、培養温度は、好ましくは、培養開始から終了時までの温度が約３６℃～約３８℃であり、より好ましくは約３７℃である。
［３－４－２］前記態様［３－４］において、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約１．０×１０8細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
［３－４－３］前記態様［３－４］において、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約３．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
［３－４－４］前記態様［３－４］において、培養温度は、より好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約４．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
本明細書中、培養温度又は細胞濃度において、「約」と記載した場合、当該数値の±１０％迄、ある態様では当該数値の±２０％迄の値も含み得るものである。
［３－５］前記態様［３］～［３－４］のいずれか１つにおいて、抗体産生細胞は、例えば、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が、例えば、前記態様[１－１]に記載の細胞であり、すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ－８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
［３－６］前記態様［３］～［３－５］のいずれか１つにおいて、抗体産生細胞が、例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
［３－７］前記態様［３］～［３－６］のいずれか１つにおいて、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材が、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
［３－８］前記態様［３］～［３－７］のいずれか１つにおいて、培養液に、例えば、細胞増殖抑制剤を添加してもよく、培養液中に添加できる細胞増殖抑制剤が、例えば、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、塩化リチウム及び吉草酸からなる群から選択される添加剤であり；好ましくは、バルプロ酸又は吉草酸であり；より好ましくは、吉草酸である。
［４］第４の態様は、前記態様［３］～［３－７］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法で得られるアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過する抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ等からなる群から選択されるアイソタイプを有する抗体である。
［４－１］前記態様［４］において、コア層で産生されシェル層を透過する抗体が有するアイソタイプが、好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＥであり；より好ましくは、ＩｇＧである。
［５］第５の態様は、前記態様［３］～［３－７］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法で得られる化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過する抗体の分子量が、４５，０００～９００，０００の範囲である抗体である。
［５－１］前記態様［５］において、コア層で産生されシェル層を透過する抗体の分子量が、好ましくは、４５，０００～１６０，０００の範囲であり；より１４０，０００～１５０，０００の範囲である。
［６］第６の態様は、前記態様［３］～［３－７］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法にて得られる抗体が、
例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いてムロモナブ－ＣＤ３、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパリビズマブ、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてバシリキシマブ、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてゲムツズマブ オゾガマイシン、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベバシズマブ、イブリツモマブ チウキセタン産生ＣＨＯ細胞を用いてイブリツモマブ チウキセタン、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアダリムマブ、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセツキシマブ、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラニビズマブ、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオマリズマブ、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエクリズマブ、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパニツムマブ、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてウステキヌマブ、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてゴリムマブ、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてカナキヌマブ、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデノスマブ、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてモガムリズマブ、セルトリズマブ ペゴル産生ＣＨＯ細胞を用いてセルトリズマブ ペゴル、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオファツムマブ、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペルツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ エムタンシン、ブレンツキシマブ ベドチン産生ＣＨＯ細胞を用いてブレンツキシマブ ベドチン、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてナタリズマブ、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブ、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアレムツズマブ、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセクキヌマブ、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラムシルマブ、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイピリムマブ、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエボロクマブ、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてメポリズマブ、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアリロクマブ、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイキセキズマブ、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてブロダルマブ、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイダルシズマブ、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエロツズマブ、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペムブロリズマブ、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてサリルマブ、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベズロトクスマブ、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベリムマブ、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてダラツムマブ、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアベルマブ、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュピルマブ、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアテゾリズマブ、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベンラリズマブ、イノツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてイノツズマブ オゾガマイシン、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエミシズマブ、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてグセルクマブ、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュルバルマブ、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオビヌツズマブ、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベドリズマブである。
［６－１］前記態様［６］において、前記態様［３］～［３－７］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法にて産生可能な抗体として、好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ、アダリムマブ産生ＣＨＯを用いてアダリムマブ、又はニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブであり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブである。
以下、各態様についてより詳細に説明する。
１．アルギン酸（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を合成する際に用いる原料のアルギン酸、及びコア層の基材に用いられるアルギン酸について）：
本明細書中、アルギン酸と記載する場合、アルギン酸、アルギン酸エステル、及びそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）からなる群から選択される少なくとも１種のアルギン酸（「アルギン酸類」という場合がある）を意味する。用いられるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来であるのが好ましい。好ましく用いられるアルギン酸類は、レッソニア、マクロシスティス、ラミナリア、アスコフィラム、ダービリア、カジカ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される生体内吸収性の多糖類であって、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ－マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ－グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸がランダムに配列した画分（Ｍ／Ｇ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。
アルギン酸は、褐藻類の海藻から抽出し、精製して製造される天然多糖類の一種であり、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）が重合したポリマーである。アルギン酸のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）、すなわちゲル強度は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．２の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。アルギン酸のＭ／Ｇ比、ＭとＧの配列の仕方等によってアルギン酸の物理化学的性質が異なり、また好ましい用途が異なる場合がある。アルギン酸類のゲル化能力および生成したゲルの性質は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受け、一般的に、Ｇ比率が高い場合にはゲル強度が高くなることが知られている。Ｍ／Ｇ比は、その他にも、ゲルの硬さ、もろさ、吸水性、柔軟性などにも影響を与える。したがって、本発明で使用するアルギン酸は、その最終使用用途に応じて、適切なＭ／Ｇ比や適切な粘度のものを用いるのがよい。
アルギン酸の工業的な製造方法には、酸法とカルシウム法などがあるが、本発明ではいずれの製法で製造されたものも使用することができる。精製により、ＨＰＬＣ法による定量値が８０～１２０質量％の範囲に含まれるものが好ましく、９０～１１０質量％の範囲に含まれるものがより好ましく、９５～１０５質量％の範囲に含まれるものがさらに好ましい。本発明においては、ＨＰＬＣ法による定量値が前記の範囲に含まれるものを高純度のアルギン酸と称する。本発明で使用するアルギン酸又はその塩は、高純度アルギン酸であることが好ましい。市販品としては、例えば、キミカアルギンシリーズとして、（株）キミカより販売されているもの、好ましくは、高純度食品・医薬品用グレードのものを購入して使用することができる。市販品を、さらに適宜精製して使用することも可能である。例えば、低エンドトキシン処理することが好ましい。精製法や低エンドトキシン処理方法は、例えば特開２００７－７５４２５号公報に記載されている方法を採用することができる。
本発明で使用する「アルギン酸」におけるアルギン酸の塩としては、「アルギン酸の１価金属塩」であり、アルギン酸のＤ－マンヌロン酸またはＬ－グルロン酸のカルボン酸の水素イオンを、Ｎａ+やＫ+などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特に、アルギン酸ナトリウムが好ましい。
本明細書中、アルギン酸は、アルギン酸を（ＡＬＧ）として、アルギン酸の任意のカルボキシル基の１つを－ＣＯＯＨとして、（ＡＬＧ）－ＣＯＯＨと表記する場合がある。
本発明で使用するアルギン酸は、その最終使用用途に応じて、適切な重量平均分子量のものを用いるのがよい。例えば、重量平均分子量が１万～１，０００万のものを用いるのが好ましく、より好ましくは１０万以上５００万以下、さらに好ましくは１５万以上３００万以下である。
いくつかの態様では、アルギン酸は、アルギン酸ナトリウムである。アルギン酸ナトリウムは、市販品のアルギン酸ナトリウムを用いることができる。ここで、後述の実施例では、アルギン酸ナトリウムは、下表に記載したＡ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ｂ－１、Ｂ－２、及びＢ－３のアルギン酸ナトリウム（発売元 持田製薬株式会社）を用いている。各アルギン酸ナトリウムの１ｗ／ｗ％の水溶液の粘度、重量平均分子量及びＭ／Ｇ灯を下記の表に示す。
Figure 2023015413000041
前記アルギン酸ナトリウムＡ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ｂ－１、Ｂ－２、及びＢ－３の各物性値は、下記の各種方法により測定した。測定方法は、当該方法に限定されるものではないが、測定方法により各物性値が上記のものと異なる場合がある。
［アルギン酸ナトリウムの粘度測定］
日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従い、回転粘度計法（コーンプレート型回転粘度計）を用いて測定した。具体的な測定条件は以下のとおりである。試料溶液の調製は、MilliQ水を用いて行った。測定機器は、コーンプレート型回転粘度計（粘度粘弾性測定装置レオストレスRS600（Thermo Haake GmbH）センサー：３５／１）を用いた。回転数は、１ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液測定時は１ｒｐｍとした。読み取り時間は、２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とした。３回の測定の平均値を測定値とした。測定温度は２０℃とした。
［アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量測定］
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と、（２）ＧＰＣ－ＭＡＬＳの２種類の測定法で測定した。測定条件は以下のとおりである。
［前処理方法］
試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルターろ過したものを測定溶液とした。
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定
［測定条件（相対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
分子量標準：標準プルラン、グルコース
（２）ＧＰＣ－ＭＡＬＳ測定
［屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定（測定条件）］
示差屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ
測定波長：６５８ｎｍ
測定温度：４０℃
溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度：０．５～２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）
［測定条件（絶対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
本明細書中、アルギン酸、アルギン酸誘導体、架橋アルギン酸、及び架橋アルギン酸の分子量において、単位としてＤａ（ダルトン）を付記する場合がある。
アルギン酸類のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．２の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。アルギン酸類のゲル化能力および生成したゲルの性質は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受け、一般的に、Ｇ比率が高い場合にはゲル強度が高くなることが知られている。Ｍ／Ｇ比は、その他にも、ゲルの硬さ、もろさ、吸水性、柔軟性などにも影響を与える。用いるアルギン酸類および／またはその塩のＭ／Ｇ比は、通常、０．１～４．０であり、ある態様では、０．１～３．０であり、ある態様では、０．１～２．０であり、ある態様では０．５～１．８であり、ある態様では０．８～１．２である。又、別の態様では、０．１～０．５である。
また、本発明で使用するアルギン酸は、その最終使用用途に応じて、適切な粘度や、適切なＭ／Ｇ比のものを用いるのがよい。
本明細書中、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本明細書中、用いられる「アルギン酸エステル」、「アルギン酸塩」とは、特に限定されないが、架橋剤と反応させるため、架橋反応を阻害する官能基を有していないことが必要である。アルギン酸エステルとしては、好ましくは、アルギン酸プロピレングリコール、等が挙げられる。
本明細書中、アルギン酸塩としては、例えば、アルギン酸の１価の塩、アルギン酸の２価の塩が挙げられる。アルギン酸の１価の塩としては、好ましくは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、等が挙げられ、より好ましくは、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムであり、特に好ましくは、アルギン酸ナトリウムである。アルギン酸の２価の塩としては、好ましくは、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸ストロンチウム、等が挙げられる。
アルギン酸は、高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、一般的に重量平均分子量で１０００～１０００万、好ましくは１万～８００万、より好ましくは２万～３００万の範囲である。天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。
本明細書において本発明のアルギン酸誘導体またはアルギン酸又はその塩の分子量を特定する場合は、特段のことわりがない限り、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により算出される重量平均分子量である。本発明で使用するアルギン酸又はその塩としても、その最終使用用途に応じて、適切な分子量分布のものを用いることが望ましい。
例えば、後記実施例に記載したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ともいう）の測定条件にて、好ましくは、１０万～５００万であり、より好ましくは１５万～３００万である。また、ある態様では、５０万～３００万の範囲であり、より好ましくは、１００万～２５０万であり、さらに好ましくは、１００万～２００万の範囲である。
また、例えば、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量(絶対分子量)は、好ましくは１万以上、より好ましくは５万以上、さらに好ましくは６万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、さらに好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万～１００万であり、より好ましくは５万～８０万であり、さらに好ましくは６万～５０万である。
通常、高分子多糖類の分子量を上記のようなＳＥＣ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いた手法で算出する場合、約１０％～約３０％の測定誤差を生じうる。例えば、５０万であれば３５万～６５万、１００万であれば７０万～１３０万程度の範囲で値の変動が生じうる。本明細書中、分子量測定の記載において「約」と記載した場合、当該数値の±１０％迄、ある態様では当該数値の±２０％迄の値も含み得るものである。
ここで、一般に天然物由来の高分子物質は、単一の分子量を持つのではなく、種々の分子量を持つ分子の集合体であるため、ある一定の幅を持った分子量分布として測定される。代表的な測定手法はゲルろ過クロマトグラフィーである。ゲルろ過クロマトグラフィーにより得られる分子量分布の代表的な情報としては、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、分散比（Ｍｗ／Ｍｎ）があげられる。
分子量の大きい高分子の平均分子量への寄与を重視したのが重量平均分子量であり、下記式で表される。
Ｍｗ＝Σ（ＷｉＭｉ）／Ｗ＝Σ（ＨｉＭｉ）／Σ（Ｈｉ）
数平均分子量は、高分子の総重量を高分子の総数で除して算出される。
Ｍｎ＝Ｗ／ΣＮｉ＝Σ（ＭｉＮｉ）／ΣＮｉ＝Σ（Ｈｉ）／Σ（Ｈｉ／Ｍｉ）
ここで、Ｗは高分子の総重量、Ｗｉはｉ番目の高分子の重量、Ｍｉはｉ番目の溶出時間における分子量、Ｎｉは分子量Ｍｉの個数、Ｈｉはｉ番目の溶出時間における高さである。
天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている（ヒアルロン酸の例：Ｃｈｉｋａｋｏ ＹＯＭＯＴＡ ｅｔ．ａｌ． Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．１１７， ｐｐ１３５－１３９（１９９９）、Ｃｈｉｋａｋｏ ＹＯＭＯＴＡ ｅｔ．ａｌ． Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．１２１， ｐｐ３０－３３（２００３））。アルギン酸の分子量測定については、固有粘度（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）から算出する方法、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｇｌｅ Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）により算出する方法が記載された文献がある（ＡＳＴＭ Ｆ２０６４－００（２００６），ＡＳＴＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ発行）。本発明においては、重量平均分子量は、上記文献に示されるような常法にて、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子量を測定し、プルランを標準物質として用いた較正曲線により算出した値とすることができる。
又、本発明においては、重量平均分子量は、上記文献に示されるような常法にて、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）―ＭＡＬＳにより測定した絶対分子量とすることができる。
アルギン酸類の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
本明細書中においてアルギン酸又はその塩の分子量を特定する場合は、特段のことわりがない限り、ゲルろ過クロマトグラフィーにより算出される重量平均分子量である。分子量測定にゲルろ過クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、例えば、後述する本実施例の条件を採用することができる。カラムは、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケアサイエンス社）を用いることができ、展開溶媒として、例えば、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を使用することができ、分子量標準としてブルーデキストラン、チログロブリン、フェリチン、アルドラーゼ、コンアルブミン、オブアルブミン、リボヌクレアーゼＡおよびアプロチニンを用いることができる。
本明細書中で用いられるアルギン酸の粘度は、特に限定されないが、１ｗ／ｗ％のアルギン酸類の水溶液として粘度を測定した場合、好ましくは、１０ｍＰａ・ｓ～１０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、５０ｍＰａ・ｓ～８００ｍＰａ・ｓである。
アルギン酸の水溶液の粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい－平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。より好ましくは、コーンプレート型粘度計を用いる。
アルギン酸類は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸類を製造することができる。さらに、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸類と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸類とすることも可能である。
本明細書中で用いられるアルギン酸は、いくつかの態様においては、低エンドトキシン処理されていないアルギン酸あり、又は別のいくつかの態様においては、低エンドトキシン処理されたアルギン酸である。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルが低いことをいう。より好ましくは、低エンドトキシン処理されたアルギン酸類であることが望ましい。
低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９－３２４００１号公報など参照）、β１，３－グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８－２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２－５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４０：６３８－６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５－０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類に合わせて適宜選択するのが望ましい。
エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エンドスペシー（登録商標）ＥＳ－２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。
用いられるエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、アルギン酸類のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは、５０ＥＵ／ｇ以下、特に好ましくは、３０ＥＵ／ｇ以下である。本発明において、「実質的にエンドトキシンを含まない」とは、日局エンドトキシン試験により測定したエンドトキシン値が前記の数値範囲にあるものを意味する。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ ＵＰ ＬＶＧ（ＦＭＣＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
別のいくつかの態様において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層又はシェル層の形成に用いられる前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を合成する際に用いられるアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）は、特に限定されることは無いが、例えば、前記表２１に記載のアルギン酸ナトリウムＡ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ｂ－１、Ｂ－２、又はＢ－３から選択することが可能である。前記アルギン酸ナトリウムを用いて調整されたアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、例えば、０．１～２．０質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）の範囲である。
又、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層又はシェル層の形成に用いられる前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を合成する際に用いられるアルギン酸ナトリウムは、好ましくは、Ａ－２又はＢ－２であり、又、当該アルギン酸ナトリウムを用いて調整されたアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、好ましくは、１．５質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）である。
いくつかの態様において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の形成に用いられるアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）は、特に限定されることは無いが、コラーゲン溶液、又は培地（または培養液）等を、混合して用いることも可能である。尚、アルギン酸ナトリウム溶液、コラーゲン溶液等に用いられる溶媒は、後述の通りである。
２．化学修飾アルギン酸誘導体
本明細書中の化学修飾アルギン酸誘導体は、アルギン酸の任意の１つ以上のカルボキシル基にアミド結合及び２価のリンカーを介して、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応における反応性基又は当該反応性基の相補的な反応性基が導入されたものである。
より具体的には、下記式（Ｉ）：
Figure 2023015413000042
 ［式（Ｉ）中、（ＡＬＧ）、－Ｌ１－、Ａｋｎ及び－ＮＨ－ＣＯ－の定義は、前述の第１の態様中の定義と同じである］で表されるアルギン酸誘導体、及び下記式（ＩＩ）：
Figure 2023015413000043
 ［式（ＩＩ）中、（ＡＬＧ）、－Ｌ２－、及び－ＮＨ－ＣＯ－の定義は、前述の第１の態様中の定義と同じである］で表されるアルギン酸誘導体である。
前記の２価のリンカー（－Ｌ１－又は－Ｌ２－）は、反応性基と当該反応性基と相補的な反応性基との反応を阻害しない限り、任意の直鎖状基の使用が可能である。具体的には、直鎖のアルキレン基（－（ＣＨ２）ｎ－、ｎ＝１～３０）（当該基中の－ＣＨ２－は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＯＮＨ－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、ベンゼン環、複素環（ピリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、等の５～６員芳香族複素環又は５～６員非芳香族複素環）、等の基で複数個（例えば、１～１０個、又は１～５個）置き換えられても良く、当該－ＣＨ２－の水素原子は、オキソ基（＝Ｏ）、Ｃ１－６アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉｓｏ－プロピル基、等の基）、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、等）、水酸基（－ＯＨ）、等の基から選択される基で複数個（例えば、１～１０個、又は１～５個）置換されていても良い）が挙げられる。
前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされるアルギン酸誘導体の－ＮＨ－ＣＯ－基における、イミノ基（－ＮＨ－）の水素原子をメチル基に置換し－Ｎ（Ｍｅ）－ＣＯ－基することが可能である。
前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされるアルギン酸誘導体における、リンカー（－Ｌ１－、－Ｌ２－）とアルギン酸の結合様式は、－ＮＨ－ＣＯ－結合、又は－Ｎ（Ｍｅ）－ＣＯ－があり；好ましくは、－ＮＨ－ＣＯ－結合である。
本明細書中の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体は、例えば、下記式の方法（詳細は、後述の一般的製造方法を参照）により製造することが可能である。
Figure 2023015413000044
本明細書の式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。又、式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲であり；好ましくは約３０万Ｄａ～約２５０万Ｄａの範囲であり、より好ましくは約５０万Ｄａ～約２００万Ｄａの範囲である。
本明細書中、式（Ｉ）のＡｋｎ－Ｌ１－ＮＨ－基は、アルギン酸構成単位の全てのカルボキシル基に結合している必要はなく、又、式（ＩＩ）のＮ３－Ｌ２－ＮＨ－基は、アルギン酸構成単位の全てのカルボキシル基に結合している必要はない。
本明細書中、式（Ｉ）のＡｋｎ－Ｌ１－ＮＨ－基を反応性基と言う場合、式（ＩＩ）のＮ３－Ｌ２－ＮＨ－基が相補的な反応性基となる。又、逆に式（ＩＩ）のＮ３－Ｌ２－ＮＨ－基を反応性基と言う場合、式（Ｉ）のＡｋｎ－Ｌ１－ＮＨ－基が相補的な反応性基となる。
本明細書中、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基の導入率は、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１０％の範囲である。又、式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基の導入率は、例えば、約０．１％～約３０％の範囲であり；好ましくは、約０．３％～約２０％の範囲であり；より好ましくは、約０．５～約１５％の範囲である。
前記反応性基又は相補的な反応性基の導入率は、アルギン酸類の繰り返し単位であるウロン酸単糖単位のうち、各反応性基が導入されたウロン酸単糖単位の数を百分率で表した値である。本明細書中、特に断らない限り、アルギン酸誘導体（式（Ｉ）または式（ＩＩ））における反応性基又は相補的な反応性基の導入率に用いられる％は、ｍｏｌ％を意味する。各反応性基又は相補的な反応性基の導入率は、後述の実施例に記載の方法により求めることができる。
本明細書中、式（Ｉ）中の環状アルキン基（Ａｋｎ）及び式（ＩＩ）中のアジド基が、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応によりトリアゾール環を形成し、これにより架橋が形成される。
３．Ｈｕｉｓｇｅｎ反応
Ｈｕｉｓｇｅｎ反応（１，３－双極子付加環化反応）は、下記式に示される様に末端アジド基及び末端アルキン基を有する化合物間の縮合反応である。反応の結果、二置換１，２，３－トリアゾール環が収率良く得られ、余計な副生成物が生じないという特徴を有している。当該反応は、１，４－又は１，５－二置換トリアゾール環が生成し得ると考えられるが、銅触媒を用いることで位置選択的にトリアゾール環を得ることが可能である。
Figure 2023015413000045
又、銅触媒を用いないＨｕｉｓｇｅｎ反応がＷｉｔｔｉｇとＫｒｅｂｓにより報告がなされている。即ち、シクロオクチンとフェニルアジドを混合するだけで環化付加体が得られる反応である（下記式中、Ｒ３＝フェニルである）。本反応は、シクロオクチンの三重結合が大きく歪んでいるため、フェニルアジドとの反応による歪みの解消が駆動力となり、反応が自発的に進行することにより、触媒が不要となった。
Figure 2023015413000046
以上の様に、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応は、置換された１級アジド、２級アジド、３級アジド、芳香族アジド、等を有するアジド化合物、及びアジド基の相補的な反応性基である末端又は環状アルキン基を有する化合物を用いることができる。又、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応では、ほぼアジド基及びアルキン基のみが反応することから、反応基質中に種々の官能基（例えば、エステル基、カルボキシル基、アルケニル基、水酸基、アミノ基、等）を置換させることが可能である。
いくつかの態様では、望ましくない副生成物を生じさせず、銅触媒による細胞毒性を回避させる為に銅触媒を用いずに、短時間、容易に、且つ効率的に１，２，３－トリアゾール環による架橋をアルギン酸分子間に形成させる為に、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応のアルキン基としては、例えば、前記態様［１］に記載した環状アルキン基（シクロオクチル基）を用いる。
好ましい態様の化学修飾アルギン酸誘導体の架橋方法においては、当該反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）にて望ましくない副生成物がほとんど形成されない。
４．化学修飾アルギン酸誘導体の合成方法
本明細書において、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体は、各々、Ｈ２Ｎ－Ｌ１－Ａｋｎ（式中、－Ｌ１－及びＡｋｎは、前記態様［１］中の定義と同じである）で表わされるアミン誘導体（ＡＭ－１）、又は、Ｈ２Ｎ－Ｌ２－Ｎ３（式中、－Ｌ２－は、前記態様［１］中の定義と同じである）で表わされるアミン誘導体（ＡＭ－２）を、アルギン酸類の任意のカルボキシル基とを、縮合剤を用いる縮合反応により製造することができる。
Figure 2023015413000047
［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］
０．５重量％～１重量％のアルギン酸水溶液及び式（ＡＭ－１）で表わされるアミンを用いて、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座 第５版 １６、有機化合物の合成ＩＶ、カルボン酸および誘導体、エステル類、ｐ３５－７０、酸アミドおよび酸イミド、ｐ１１８－１５４、アミノ酸・ペプチド、ｐ２５８－２８３、２００７年、丸善』等に記載された方法に準じて、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＢＯＰ試薬）、ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィニッククロリド（ＢＯＰ－Ｃｌ）、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＣＩＰ）、又は４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、等から選択される縮合剤の存在下、アルギン酸が析出しない程度の、テトラヒドロフラン、１、４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、メタノール、エタノール、２－プロパノール、等のアルコール系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等から選択される溶媒と水との混合溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等の無機塩基、又はトリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基の存在下又は非存在下にて、０℃から５０℃間の温度で縮合反応を行うことにより、式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体を製造することができる。
［式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］
０．５重量％～１重量％のアルギン酸水溶液及び式（ＡＭ－２）で表わされるアミンを用いて、前述の［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］に準じて反応をおこなうことにより、式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体を製造することができる。
前記、式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体又は式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法において、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）のアミンの導入率は、当該アミンの性質等を考慮することで、下記（ｉ）～（ｖ）等の反応条件を適宜選択して組み合わせることにより調節が可能になる。（ｉ）縮合剤の等量の増減、（ｉｉ）反応温度の上昇・下降、（ｉｉｉ）反応時間の延長・短縮、（ｉｖ）反応基質のアルギン酸の濃度の調整、（ｖ）式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）のアミンの溶解度を上げる為に水に混和する有機溶媒を添加する、等。
以下に、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）で表わされるアミンのうち、より具体的なアミンの製造方法を示す。
尚、以下の各製造方法中、ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４、ｓ５、ｓ８、ｓ９、ｓ１０、ｓ１１、ｓ１２、ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４、ｔ５、ｔ６、ｔ７、ｔ８、ｔ９、ｔ１０、ｔ１１、ｔ１２、ｍ１、ｎ１、ｍ２ａ、ｎ２ａ、ｐ２ａ、ｍ２ｂ、ｎ２ｂ、ｐ２ｂ、ｍ３、ｎ３、ｐ３、ｍ４ａ、ｎ４ａ、ｍ４ｂ、ｎ４ｂ、ｍ５ａ、ｎ５ａ、ｐ５ａ、ｑ５ａ、ｍ５ｂ、ｎ５ｂ、ｐ５ｂ、ｑ５ｂ、ｍ６ａ、ｎ６ａ、ｐ６ａ、ｍ６ｂ、ｎ６ｂ、ｐ６ｂ、ｍ７、ｎ７、ｍ８ａ、ｎ８ａ、ｍ８ｂ、ｎ８ｂ、ｍ９ａ、ｎ９ａ、ｐ９ａ、ｍ９ｂ、ｎ９ｂ、ｐ９ｂ、ｍ１０、ｎ１０、ｐ１０、ｘ１、ｘ２、ｘ２ａ、ｙ２ａ、ｘ２ｂ、ｙ２ｂ、ｘ３、ｙ３、ｘ４、ｙ４、ｚ４、ｘ５ａ、ｙ５ａ、ｘ５ｂ、ｙ５ｂ、ｘ６ａ、ｙ６ａ、ｚ６ａ、ｖ６ａ、ｘ６ｂ、ｙ６ｂ、ｚ６ｂ、ｖ６ｂ、ｘ７ａ、ｙ７ａ、ｚ７ａ、ｘ７ｂ、ｙ７ｂ、ｚ７ｂ、ｘ８ａ、ｙ８ａ、ｚ８ａ、ｘ８ｂ、ｙ８ｂ、ｚ８ｂ、ｘ９ａ、ｙ９ａ、ｚ９ａ、ｘ９ｂ、ｙ９ｂ、及びｚ９ｂの定義は前記態様［１］中の記載と同じ定義であり；ＲＡ＝メチル基、エチル基、等のＣ１～６アルキル基であり；Ｐ１又はＰ２は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ｔｅｒｔＢｕ基、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｂｎ基、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３基、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３基、等から選択されるアミノ基の保護基であり； Ｐ２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ｔｅｒｔＢｕ基、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｂｎ基、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３基、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３基、－ＳＯ２Ｐｈ、－ＳＯ２ＰｈＭｅ基、－ＳＯ２Ｐｈ（ＮＯ２）基、等から選択されるアミノ基の保護基であり；Ｅ＝ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、等）、－ＯＴｓ基、－ＯＭｓ基、等の脱離基である。
又、以下の各製造方法中、保護基Ｐ１及びＰ２の保護・脱保護は、文献公知の方法、例えば、『プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ） 第４版、２００７年、ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら』の成書に記載された脱保護の方法に準じて、保護・脱保護を行うことができる。
［製造方法Ａ］
式（ＡＭ－ＯＬ－１）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000048
式（ＳＭ－１）の化合物［式（ＳＭ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］及び式（ＲＧ－１）の化合物［式（ＲＧ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１６９、ｐ３３２－３４０、２０１７年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ＡｇＯ３ＳＣＦ３存在下、トルエン等の反応に関与しない溶媒中（ＲＧ－１）を置換させ、続いて（ｉｉ）ＤＢＵを用いて脱臭素化反応を行うことでアルキン基を形成し、更に（ｉｉｉ）保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－１）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｂ］
式（ＡＭ－ＯＬ－２）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000049
＜工程１＞
式（ＳＭ－２）の化合物［式（ＳＭ－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］及び式（ＲＧ－２）［式（ＲＧ－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１４（６）， ｐ１２８０－１２８６； ２０１４年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ＰＰｈ３、及びＮ２（ＣＯ２ＣＨＭｅ２）２の試薬存在下、テトラヒドロフラン等の反応に関与しない溶媒中、光延反応を行い、続いて（ｉｉ）水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、加水分解を行うことにより式（ＩＭ－１）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｂ］＜工程１＞により得られる式（ＩＭ－１）の化合物及び式（ＲＧ－３）［式（ＲＧ－３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、（ｉｉｉ）前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて（ｉｖ）保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－２）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｃ］
式（ＡＭ－ＯＬ－３）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000050
＜工程１＞
式（ＳＭ－１）の化合物及び式（ＲＧ－４）の化合物［式（ＲＧ－４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１２６（４６）、ｐ１５０４６－１５０４７、２００４年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ＡｇＣｌＯ４存在下、トルエン等の反応に関与しない溶媒中、式（ＲＧ－４）の化合物を置換させ、続いて（ｉｉ）ＮａＯＭｅを用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成し、（ｉｉｉ）水酸化リチウム、水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、加水分解を行うことにより式（ＩＭ－２）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｃ］＜工程１＞により得られる式（ＩＭ－２）の化合物及び式（ＲＧ－５）の化合物［式（ＲＧ－５）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－３）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｄ］
式（ＡＭ－ＯＬ－５）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000051
＜工程１＞
式（ＳＭ－３）の化合物［式（ＳＭ－３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｆａｍｉｎｇ Ｚｈｕａｎｌｉ Ｓｈｅｎｑｉｎｇ， １０４５２９８９８， ２２ Ａｐｒ ２０１５年』等に記載された方法に準じて、（ｉ）ピリジン等の塩基存在下、エタノール等の反応に関与しない溶媒中、Ｈ２ＮＯＨ－ＨＣｌを反応させオキシムを形成させ、続いて（ｉｉ）Ｐ２Ｏ５， メタンスルホン酸中、五酸化二リンを反応させ、ベックマン転移を行うことにより８員環ラクタムを形成させる、続いて（ｉｉｉ）ジエチルエーテール等の反応に関与しない溶媒中、ＢＨ３、ＬｉＡｌＨ４等の還元剤を用いてアミド基の還元を行ことにより、式（ＩＭ－３）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｄ］＜工程１＞により得られる式（ＩＭ－３）及び式（ＲＧ－６）［式（ＲＧ－６）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、（iｖ）前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い縮合体が得られる、続いて（ｖ）臭素を付加させて後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫを用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成し、続いて（ｖｉ）保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－５）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｅ］
式（ＡＭ－ＯＬ－６）及び式（ＡＭ－ＯＬ－７）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000052
＜工程１＞
［製造方法Ｄ］＜工程１＞の（ｉｉ）で得られる式（ＩＭ－４）の化合物及び式（ＲＧ－７）の化合物［式（ＲＧ－７）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４６（５）、ｐ６６９－６７７、２０１４年』等に記載された方法に準じて、水酸化ナトリウム等の塩基及びテトラブチルアンモニウムブロマイド等の相間移動触媒の存在下、トルエン等の反応に関与しない溶媒中で、反応することにより式（ＩＭ－５）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｅ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－５）の化合物に、臭素を付加させて後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫ等の塩基を用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成し、続いて保護基Ｐ２を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－６）で表されるアミン化合物、又は式（ＡＭ－ＯＬ－６）の塩として製造することができる。
＜工程３＞
［製造方法Ｅ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－５）の化合物を用いて、［製造方法Ｄ］＜工程１＞の（ｉｉｉ）の還元法に準じて反応を行うことで、式（ＩＭ－６）の化合物を製造することができる。
＜工程４＞
［製造方法Ｅ］＜工程３＞で得られる式（ＩＭ－６）の化合物を用いて［製造方法Ｅ］＜工程２＞と同様に反応を行うことにより式（ＡＭ－ＯＬ－７）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｆ］
式（ＡＭ－ＯＬ－８）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000053
＜工程１＞
式（ＳＭ－４）の化合物［式（ＳＭ－４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， （９）， ｐ１１９１－１１９４； ２００２年』等に記載された方法に準じて、臭素を付加させた後、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫを用いて脱臭素化反応を行うことによりアルキン基を形成することで、式（ＩＭ－７）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｆ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－７）の化合物及び式（ＲＧ－８）の化合物［式（ＲＧ－８）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり（詳細は後述の製造方法Ｈを参照）］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、 １２６（４６）、ｐ１５０４６－１５０４７、２００４年』又は『Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９４、ｐ３２６０－３２７５、１９６１年』等に記載された方法に準じて、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－８）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｇ］
式（ＡＭ－ＯＬ－９）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000054
式（ＳＭ－５）の化合物［式（ＳＭ－５）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『米国特許出願公開２０１３－０１３７８６１号明細書』等に記載された方法に準じて、ジクロロメタン等の反応に関与しない溶媒中で、ピリジン等の塩基存在下／非存在下、クロロギ酸ｐ－ニトロフェニルを反応させることでカーボネート体が得られる。続いて、トリエチルアミン存在下、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド溶媒中、式（ＲＧ－９）の化合物［式（ＲＧ－９）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を反応させることでカルバモイル体が得られる。更に、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＯＬ－９）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｈ］
式（ＡＭ－ＬＫ－１）で表されるアミンの製造方法［式（ＡＭ－ＬＫ－１）のうち、ｔ１＝１，ｔ２＝３のｐ置換アミンは、国際公開第２０１６／１５２９８０号パンフレット等に記載された方法に準じて、製造することもできる。］：
Figure 2023015413000055
＜工程１＞
式（ＳＭ－６）の化合物［式（ＳＭ－６）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］及び式（ＲＧ－１０）の化合物［式（ＲＧ－１０）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－８）を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｈ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－８）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，２９（２３），ｐ６６１９－６６２２；２０１０年』等に記載された方法に準じて、ジメチルスルホキシド等の反応に関与しない溶媒中、ＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－１）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｊ］
式（ＡＭ－ＬＫ－２）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000056
＜工程１＞
式（ＳＭ－７）の化合物［式（ＳＭ－７）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である］及び式（ＲＧ－１１）の化合物［式（ＲＧ－１１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法Ｂ］＜工程１＞に準じる光延反応を行い、続いて水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、エステル基の加水分解を行うことにより、式（ＩＭ－９）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｊ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－９）の化合物及び式（ＲＧ－１２）［式（ＲＧ－１２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより縮合体が得られ、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－２）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｋ］
式（ＡＭ－ＬＫ－３）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000057
＜工程１＞
［製造方法Ｊ］＜工程１＞の式（ＳＭ－７）の化合物及び式（ＲＧ－１３）の化合物［式（ＲＧ－１３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法Ｂ］＜工程１＞に準じる光延反応を行い、続いて水酸化ナトリウム等の塩基存在下、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、水等の反応に関与しない溶媒若しくはそれらの混合溶媒中、エステル基の加水分解を行うことにより、式（ＩＭ－１０）で表される化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｋ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－１０）の化合物及び式（ＲＧ－１４）［式（ＲＧ－１４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより縮合体が得られ、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－３）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｌ］
式（ＡＭ－ＯＬ－４）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000058
＜工程１＞
式（ＳＭ－８）の化合物［式（ＳＭ－８）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『国際公開第２００９／０６７６６３号パンフレット』等に記載された方法に準じて、臭素を付加させて後、ＬｉＮ（ｉ－Ｐｒ）２を用いて脱臭素化を行うことで式（ＩＭ－１１）の化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｌ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－１１）の化合物及び式（ＲＧ－１５）で表わされる化合物［式（ＲＧ－１５）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、水素化ナトリウム等の塩基存在下、テトラヒドロフラン等の反応に関与しない溶媒中で反応させることで、側鎖が導入された化合物が得られる。続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより、式（ＡＭ－ＯＬ－４）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｍ］
式（ＡＭ－ＬＫ－４）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000059
＜工程１＞
式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｍ－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｍ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｍ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
また、式（ＳＭ－Ｍ）で表されるカルボン酸を、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座 第５版 １６、カルボン酸および誘導体、酸ハロゲン化物、酸無水物、９９－１１８頁、２００７年、丸善』、等に記載された方法に準じて、酸ハロゲン化物や酸無水物に変換し、式（ＲＧ－Ｍ－１）の化合物を用いて、トリエチルアミン、ピリジン等の塩基の存在下、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、トルエン、ベンゼン等の芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等から選択される溶媒中、０℃から溶媒が還流する温度で反応させることにより、式（ＩＭ－Ｍ－１）の化合物を同様に製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｍ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｍ－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）らの『プロテクティブ・グループス・イン・オルガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ） 第４版、２００７年、ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）』の成書に記載の方法により、保護基の種類により適宜脱保護法を選択して反応を行うことで、式（ＡＭ－ＬＫ－４）で表わされる化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｎ］
式（ＡＭ－ＯＬ－１７）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000060
＜工程１＞
式（ＳＭ－Ｎ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｎ－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｎ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｎ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｎ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｎ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｎ－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）らの『プロテクティブ・グループス・イン・オルガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ） 第４版、２００７年、ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）』の成書に記載の方法により、保護基の種類により適宜脱保護法を選択して反応を行うことで、式（ＡＭ－ＯＬ－１７）で表わされる化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｒ］
式（ＡＭ－ＬＫ－５）で表されるアミンの製造方法［式（ＡＭ－ＬＫ－５）のうち、ｔ８＝１、ｔ９＝２のアミンは、国際公開第２０１６／１５２９８０号パンフレット等に記載された方法に準じて、製造することもできる。］：
Figure 2023015413000061
＜工程１＞
式（ＳＭ－Ｒ）の化合物［式（ＳＭ－Ｒ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］及び式（ＲＧ－Ｒ－１）の化合物［式（ＲＧ－Ｒ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｒ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｒ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｒ－１）の化合物を用いて、前記［製造方法Ｈ］＜工程２＞と同様にＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－５）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｓ］
式（ＡＭ－ＬＫ－６）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000062
＜工程１＞
［Ｅ＝ＯＴｓ基又はＯＭｓ基の場合］：
式（ＳＭ－Ｓ）の化合物［式（ＳＭ－Ｓ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］及びメタンスルホン酸クロライド、トシル酸クロライド、無水トシル酸等の試薬を用いて、文献公知の方法、例えば、『Journal of the American Chemical Society、136(29)、ｐ10450-10459、2014年』等に記載された方法に準じて、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の塩基存在下、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒など反応に関与しない溶媒、もしくはこれらの混合溶媒を用いて又は無溶媒にて、－７８℃から溶媒が還流する温度で反応を行い、式（ＩＭ－Ｓ－１）で表される化合物を製造することができる。
［Ｅ＝ハロゲン（塩素、臭素、ヨウ素の場合）］：
式（ＳＭ－Ｓ）の化合物を用い、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座 第４版 １９、有機合成Ｉ、炭化水素・ハロゲン化合物、３６３－４８２頁、１９９２年、丸善』等に記載された方法に準じて、下記に示す各種ハロゲン化剤（塩素化剤、臭素化剤、ヨウ素化剤）及び反応に関与しない溶媒を適宜選択し、０℃から溶媒が還流する温度で反応を行うことで、式（ＩＭ－Ｓ－１）で表わされるハロゲン化化合物（Ｅ＝塩素、臭素、ヨウ素）を製造することができる。
＜Ｅ＝塩素の場合＞
塩素化剤として、塩化水素／塩化亜鉛（ＨＣｌ／ＺｎＣｌ２）、塩化水素／ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＣｌ／ＨＭＰＡ）、塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）、四塩化炭素／トリフェニルホスフィン（ＣＣｌ４／ＰＰｈ３）、トリホスゲン／トリフェニルホスフィン（（ＣＣｌ３）２ＣＯ／ＰＰｈ３）、トリホスゲン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＰＯＣl３／ＤＭＦ）等の試薬を用いることで、所望の塩素化物を製造することができる。
＜Ｘ＝臭素の場合＞
臭素化剤として、４８％臭化水素酸（４８％ＨＢｒ）、４８％臭化水素酸／硫酸（４８％ＨＢｒ／Ｈ２ＳＯ４）、臭化水素／臭化リチウム（ＨＢｒ／ＬｉＢｒ）、臭化ナトリウム／硫酸（ＮａＢｒ／Ｈ２ＳＯ４）、三臭化リン（ＰＢｒ３）等の試薬を用いることで、所望の塩素化物を製造することができる。また、式（ＩＭ－Ｓ－１）において、Ｅ＝ＯＴｓ又はＯＭｓの化合物に、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）を反応させることでも、所望の臭素化物を製造することができる。
＜Ｘ＝ヨウ素の場合＞
ヨウ素化剤として、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、ヨウ素／トリフェニルホスフィン（Ｉ２／ＰＰｈ３）等の試薬を用いることで、所望のヨウ素化物を製造することができる。また、 式（ＩＭ－Ｓ－１）において、Ｅ＝ＯＴｓ又はＯＭｓの化合物に、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を反応させることでも、所望のヨウ素化物を製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｓ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－１）の化合物を用いて、前記［製造方法Ｈ］＜工程２＞と同様にＮａＮ３を反応させることで、式（ＩＭ－Ｓ－２）の化合物を製造することができる。
＜工程３＞
［製造方法Ｓ］＜工程２＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－２）の化合物を用いて、前記［製造方法Ｂ］＜工程１＞のエステル基の加水分解反応と同様にして、加水分解を行うことで、式（ＩＭ－Ｓ－３）の化合物を製造することができる。
＜工程４＞
［製造方法Ｓ］＜工程３＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－３）及び式（ＲＧ－Ｓ－１）の化合物［式（ＲＧ－Ｓ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｓ－４）で表わされる化合物を製造することができる。
＜工程５＞
［製造方法Ｓ］＜工程４＞で得られる式（ＩＭ－Ｓ－４）の化合物の保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－ＬＫ－６）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法Ｔ］
式（ＡＭ－ＬＫ－７）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000063
＜工程１＞
式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｔ－１）の化合物［式（ＳＭ－Ｍ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｔ－１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［製造方法Ｍ］＜工程１＞と同様な縮合反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｔ－１）で表わされる化合物を製造することができる。
また、式（ＳＭ－Ｍ）で表されるカルボン酸を、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座 第５版 １６、カルボン酸および誘導体、酸ハロゲン化物、酸無水物、９９－１１８頁、２００７年、丸善』、等に記載された方法に準じて、酸ハロゲン化物や酸無水物に変換し、式（ＲＧ－Ｔ－１）の化合物を用いて、トリエチルアミン、ピリジン等の塩基の存在下、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、トルエン、ベンゼン等の芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等から選択される溶媒中、０℃から溶媒が還流する温度で反応させることにより、式（ＩＭ－Ｔ－１）の化合物を同様に製造することができる。
＜工程２＞
［製造方法Ｔ］＜工程１＞で得られる式（ＩＭ－Ｔ－１）の化合物を用いて、文献公知の方法、例えば、『グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）らの『プロテクティブ・グループス・イン・オルガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ） 第４版、２００７年、ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）』の成書に記載の方法により、保護基の種類により適宜脱保護法を選択して反応を行うことで、式（ＡＭ－ＬＫ－７）で表わされる化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ａ］式（ＡＭ－１－Ｂ１）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000064
式（ＳＭ－Ｂ１）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ１）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ１）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ１）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｂ］式（ＡＭ－１－Ｂ２ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ２ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000065
式（ＳＭ－Ｂ２ａ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ａ）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ２ａ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法ＡＭ－Ａ］と同様にして、反応させることで式（ＡＭ－１－Ｂ２ａ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。同様にして、式（ＳＭ－Ｂ２ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ｂ）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ２ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ２ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて同様に反応を行うことで、式（ＡＭ－１－Ｂ２ｂ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｃ］式（ＡＭ－１－Ｂ３）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000066
式（ＳＭ－Ｂ３）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ３）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＲＧ－Ｂ３）、式（ＲＧ－Ｂ３－１）、及び式（ＲＧ－Ｂ３－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｄ］式（ＡＭ－１－Ｂ５a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ５ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000067
上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ５ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ５ｂ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ５ａ）、式（ＲＧ－Ｂ５ａ）、式（ＲＧ－Ｂ５ａ－１）、式（ＲＧ－Ｂ５ａ－２）、式（ＳＭ－Ｂ５ｂ）、式（ＲＧ－Ｂ５ｂ）、式（ＲＧ－Ｂ５ｂ－１）、及び式（ＲＧ－Ｂ５ｂ－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｅ］式（ＡＭ－１－Ｂ６a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ６ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000068
上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ６ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ６ｂ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ６ａ）、式（ＲＧ－Ｂ６ａ）、式（ＳＭ－Ｂ６ｂ）、及び式（ＲＧ－Ｂ６ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｆ］式（ＡＭ－１－Ｂ１０）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000069
上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ１０）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ１０）、式（ＲＧ－Ｂ１０）、式（ＲＧ－Ｂ１０－１）、及び式（ＲＧ－Ｂ１０－２）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｇ］式（ＡＭ－１－Ｂ４a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ４ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000070
式（ＳＭ－Ｂ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ４ａ）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ４ａ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１２６（４６）、ｐ１５０４６－１５０４７、２００４年』等に記載された方法に準じて、＜工程１a＞トリフルオロメタンスルホン酸銀、ＡｇＣｌＯ４等の試薬存在下、トルエン、ジクロロメタン等の反応に関与しない溶媒中反応させることで、式（ＩＭ－Ｂ４ａ－１）の化合物が得られ、＜工程２a＞続いて水素化ナトリウム、ＮａＯＭｅ等の塩基を用いて脱臭素化反応を行うことにより式（ＩＭ－Ｂ４ａ－２）の化合物が得られ、＜工程3a＞更に、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ４a）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
同様にして、式（ＲＧ－Ｂ４ａ）の代わりに、式（ＲＧ－Ｂ４b）を用いて、上記スキームに従い反応を行うことにより式（ＡＭ－１－Ｂ４b）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｈ］式（ＡＭ－１－Ｂ８a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ８ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000071
上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ａ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ８ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ８ｂ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ８ａ）又は式（ＳＭ－Ｂ８ｂ）は、市販化合物又は［製造方法ＡＭ－Ｇ］に記載の反応に準じて製造ができる化合物であり、式（ＲＧ－Ｂ８ａ）又は式（ＲＧ－Ｂ８ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｊ］式（ＡＭ－１－Ｂ７）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000072
式（ＳＭ－Ｂ７）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ７）の化合物［式（ＳＭ－Ｂ７）の化合物及び式（ＲＧ－Ｂ７）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－１－Ｂ７）で表されるアミン化合物、又はその塩として製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｋ］式（ＡＭ－１－Ｂ９a）及び式（ＡＭ－１－Ｂ９ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000073
上記合成スキームに従い反応を行うことで（各工程の反応は［製造方法ＡＭ－Ｊ］に記載の反応に準じる）、式（ＡＭ－１－Ｂ９ａ）及び式（ＡＭ－１－Ｂ９ｂ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。上記スキーム中、式（ＳＭ－Ｂ７）、式（ＲＧ－Ｂ９ａ）又は式（ＲＧ－Ｂ９ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物である。
［製造方法ＡＭ－Ｌ］式（ＡＭ－２－Ｚ１）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000074
式（ＳＭ－Ｚ１）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ１）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、文献公知の方法、例えば、『Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，２９（２３），ｐ６６１９－６６２２；２０１０年』等に記載された方法に準じて、ジメチルスルホキシド等の反応に関与しない溶媒中、ＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ１）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
尚、式（ＡＭ－２－Ｚ１）で表されるアミン化合物、又はその塩は、市販化合物として入手可能なものもある。
［製造方法ＡＭ－Ｍ］式（ＡＭ－２－Ｚ２ａ）及び式（ＡＭ－２－Ｚ２ｂ）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000075
式（ＳＭ－Ｚ２a）の化合物又は式（ＳＭ－Ｚ２ｂ）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ２a）の化合物及び式（ＳＭ－Ｚ２ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、［製造方法ＡＭ－Ｌ］と同様にして、ＮａＮ３を反応させアジド基を導入した後、保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ２a）又は式（ＡＭ－２－Ｚ２b）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。尚、式（ＡＭ－２－Ｚ２a）又は式（ＡＭ－２－Ｚ２b）で表されるアミン化合物、又はその塩は、市販化合物として入手可能なものもある。
［製造方法ＡＭ－Ｎ］式（ＡＭ－２－Ｚ３）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000076
式（ＳＭ－Ｚ３）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ３）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ３）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ３）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ３）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｏ］式（ＡＭ－２－Ｚ４）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000077
式（ＳＭ－Ｚ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ４）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ４）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ４）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］の化合物を用いて、前記［式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体の製法］と同様な縮合反応を行い、続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより式（ＡＭ－２－Ｚ４）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
［製造方法ＡＭ－Ｐ］式（ＡＭ－２－Ｚ５a）及び式（ＡＭ－２－Ｚ５b）で表されるアミンの製造方法：
Figure 2023015413000078
式（ＳＭ－Ｚ５a）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５a）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ５a）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５a）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて、水素化ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基存在下、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、等の反応に関与しない溶媒中で反応させることで、側鎖が導入された化合物が得られる。続いて保護基Ｐ１を脱保護することにより、式（ＡＭ－２－Ｚ５ａ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
同様にして、式（ＳＭ－Ｚ５ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５ｂ）の化合物［式（ＳＭ－Ｚ５ｂ）の化合物及び式（ＲＧ－Ｚ５ｂ）の化合物は市販化合物又は市販化合物から文献公知の製造方法により製造できる化合物であり］を用いて同様に反応を行うことで、式（ＡＭ－２－Ｚ５ｂ）で表されるアミン化合物、又はその塩を製造することができる。
式（ＡＭ－２－Ｚ６ａ）、式 （ＡＭ－２－Ｚ６ｂ）、式（ＡＭ－２－Ｚ７ａ）、式 （ＡＭ－２－Ｚ７ｂ）、式 （ＡＭ－２－Ｚ８ａ）、式（ＡＭ－２－Ｚ８ｂ）、式（ＡＭ－２－Ｚ９ａ）、及び式（ＡＭ－２－Ｚ９ｂ）で表わされるアミノ化合物、又はそれらの塩は、前記［製造方法ＡＭ－Ａ］～［製造方法ＡＭ－Ｐ］に準じて、下記スキームに示す製造方法により製造することができる。
Figure 2023015413000079
Figure 2023015413000080
Figure 2023015413000081
Figure 2023015413000082
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を製造する為に用いられる、アルキン基が導入されたアミン（Ａｋｎ－Ｌ１－ＮＨ２）又はアジド基が導入されたアミン（Ｎ３－Ｌ２－ＮＨ２）については、前記［製造方法Ａ］～［製造方法Ｎ］、［製造方法Ｐ］～［製造方法Ｔ］及び［製造方法ＡＭ－Ａ］～［製造方法ＡＭ－Ｐ］に記載される各反応、文献公知の方法、例えば、『実験化学講座 第５版、各本、２００７年、丸善』、『Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (Edited by Richard C. Larock), 2018年』、『Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis, (Edited by Laszlo Kurti, Barbara Czako), Academic Press, 2005年』等に記載の方法を適宜組み合わせることにより、所望のアミンを製造することができる。
本明細書中、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）で表わされるアミン化合物（各々の式の下位の式も含む）は、製薬学的に許容される塩（例えば、酸付加塩）を形成する場合がある。かかる塩としては、製薬学的に許容し得る塩であれば特に限定されないが、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、よう化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、エナント酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、乳酸、ソルビン酸、マンデル酸等の脂肪族モノカルボン酸等との塩、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸等の脂肪族ジカルボン酸との塩、クエン酸等の脂肪族トリカルボン酸との塩、安息香酸、サリチル酸等の芳香族モノカルボン酸との塩、フタル酸等の芳香族ジカルボン酸の塩、桂皮酸、グリコール酸、ピルビン酸、オキシル酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステイン等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸類との酸付加塩が挙げられる。酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。
前記塩は、常法に従い、例えば、本発明の化合物と適量の酸もしくは塩基を含む溶液を混合することにより目的の塩を形成させた後に分別濾取するか、もしくは該混合溶媒を留去することにより得ることができる。塩に関する総説として、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｓｔａｈｌ＆Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００２）が出版されており、本書に詳細な記載がなされている。
本明細書中、式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）で表わされるアミン化合物（各々の式の下位の式も含む）又はその塩は、水、エタノール、グリセロール等の溶媒と溶媒和物を形成し得る。
本明細書中、特に断りのない限り、環状基に可変置換基が置換している場合、該可変置換基は環状基の特定の炭素原子に結合されていない事を意味する。例えば、下記式Ａにおける可変置換基Ｒｓは、該式Ａにおける炭素原子ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ又はｖの何れかに置換する事ができる事を意味する。
Figure 2023015413000083
本明細書中、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のリンカー（－Ｌ１－又は－Ｌ２－）、及び式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のＡｋｎ基において不斉炭素が存在する場合には、その各光学異性体も包含されることを意味する。
例えば、式（Ｉ）中の－Ｌ１－が、式（Ｌ１－８ａ）であり、ｍ８ａ＝２、ｎ８ａ＝１、Ｒ１＝Ｍｅの場合の下記式（Ｌ１－８ａ－Ｍ）（式中、破線両外側は含まない）：
Figure 2023015413000084
 である場合、Ｒ１基が置換する炭素の立体配置がＳ体である下記式（Ｌ１－８ａ－Ｍ－Ｓ）及びベンジル基が置換する炭素の立体配置がＲ体である下記式（Ｌ１－８ａ－Ｍ－Ｒ）（いずれの式中、破線両外側は含まない）：
Figure 2023015413000085
 で表わされるリンカーが含まれることを意味する。
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のリンカー（－Ｌ１－又は－Ｌ２－）、及び式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体中のＡｋｎ基において不斉炭素が存在する場合（光学活性体である場合）には、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）に対応するアミン誘導体（ＡＭ－１）を合成する工程において、そのラセミ体から通常の光学分割手段（分離手法）により、各光学活性体に分離することが可能であり、又、式（Ｉ）に対応するアミン誘導体である式（ＡＭ－１）又は式（ＡＭ－２）を合成する工程において、不斉合成を用いることで光学異性体の一方を選択的に合成でき、各光学活性体を合成することが可能である。
５．架橋アルギン酸ゲル（シェル層）
架橋アルギン酸ゲルは、（ｉ）２価の金属イオン結合を介した架橋、（ｉｉ）化学結合を介した架橋、又は（ｉｉｉ）２価の金属イオン結合及び化学結合の両方を介した架橋を有するものがある。ここで提供される、いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応により形成されるトリアゾール環による化学架橋、及び２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン）により部分的に形成されるイオン架橋を含む、架橋アルギン酸ゲルである。又、いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応により形成されるトリアゾール環による化学架橋を含む、架橋アルギン酸ゲルである。
２価金属イオンと接触することにより、イオン架橋アルギン酸ゲルが形成される時間は、例えば、瞬時（例えば、１～５秒）～数時間（例えば、１～３時間）である。Ｈｕｉｓｕｇｅｎ反応を進行させることにより、化学架橋アルギン酸ゲルが形成される時間は、例えば、数秒～２４時間、数秒～１２時間、又は数秒～３０分間である。
前記アルギン酸ゲルを得る為に用いられる２価金属イオンとしては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等が挙げられ、好ましくはカルシウムイオン又はバリウムイオンであり、より好ましくはカルシウムイオンである。
２価金属イオンを含む溶液としては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオンを含む溶液（例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、等の水溶液）、バリウムイオンを含む溶液（例えば、塩化バリウム水溶液等の水溶液）が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム水溶液である。
２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオン濃度（例えば、カルシウムイオン又はバリウムイオン濃度）は、特に限定されないが、例えば、１ｍＭ～１Ｍの範囲、又は５ｍＭ～５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは２０ｍＭ～１００ｍＭである。
前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液を調製する際に用いる溶媒、又は、２価金属イオンを含む溶液等を調製する際に用いる溶媒は、特に限定されないが、それぞれ独立して、例えば、水道水、純水（例えば、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水、ＲＯ－ＥＤＩ水、等）、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）、培地（すなわち、細胞培養用培地（または培養液））、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び生理食塩水等が挙げられ、好ましくは超純水である。
２価の金属イオン結合を介した架橋アルギン酸ゲルは、超高速にて反応が進行して得られ、可逆的であるのに対して、化学結合を介した架橋アルギン酸ゲルは、比較的温和な条件でゆっくり反応が進行して得られ、非可逆的である。架橋アルギン酸ゲルの物性は、例えば、使用する２価金属イオンが含まれる水溶液（例えば、塩化カルシウム水溶液）の濃度、若しくは、化学修飾アルギン酸誘導体に導入される反応性基の導入率を変化させる等の方法で、調整が可能である。
即ち、使用する２価金属イオンが含まれる水溶液の濃度の調整、又は式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体に導入された反応性基の導入率の調整により、高い機械的強度を有する所望の架橋アルギン酸ゲル、例えばコア層よりも高い機械的強度を有する所望の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
前記の架橋反応を利用し、前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いることで、、化学架橋アルギン酸ゲルファイバ（アルギン酸構造体）を作成することが可能となる。例えば、イオン架橋反応により、前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液から瞬時にファイバ状の構造体を作ることができ、当該構造体の構造強化（例えば、長期安定性の獲得、等）の為に、化学結合による架橋反応（本発明の場合、Huisugen反応）を利用すること可能である。又、例えば、２価の金属イオン結合及び化学結合の両方を介して作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、、イオン架橋により取り込まれた２価金属イオンは可逆的に放出されて、化学結合による架橋のみが残ったゲルファイバを作ることも可能である。
ある態様の架橋アルギン酸ゲルは、前記式（Ｉ）及び前記式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を混合してＨｕｉｓｇｅｎ反応を行うことにより、得ることができる。
ある態様の架橋アルギン酸ゲルは、化学架橋（アルキン基及びアジド基から形成されるトリアゾール環による架橋）を介して三次元の網目構造を形成する。好ましいアルギン酸誘導体は、架橋後の架橋アルギン酸ゲルの安定性が改善したものである。
いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
Figure 2023015413000086
 ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ１－、－Ｌ２－、及びＸは、前記態様[１－１２]の定義と同じである］で表わされる基を介して架橋された架橋アルギン酸ゲルである。
いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体と、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の混合比は、式（Ｉ）の誘導体と式（ＩＩ）誘導体の重量比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１であり；好ましくは１：１．０～３．０である。
いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体と、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の混合比は、式（ＩＩ）の誘導体と式（Ｉ）誘導体の重量比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１である。
いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体と、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の混合比は、より好ましくは式（Ｉ）のアルギン酸誘導体と式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体の反応性基の導入率（ｍｏｌ％）比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１であり；好ましくは１：１．０～３．０である。
いくつかの態様にて、架橋アルギン酸ゲルを調製する際の、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体と、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の混合比は、より好ましくは式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体と式（Ｉ）のアルギン酸誘導体の反応性基の導入率（ｍｏｌ％）比にて、例えば、１：１．０～４．０、又は１：１．０～３．０、又は１：１．０～２．０、又は１：１．０～１．５、又は１：１である。
尚、前記混合比において、式（Ｉ）のアルギン酸誘導体を式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体に、式（ＩＩ）のアルギン酸誘導体を式（Ｉ）の誘導体に、それぞれ置き換えることも可能である。
架橋アルギン酸ゲルは、アルギン酸の構成単位の全てのカルボキシル基が上記式（ＩＩＩ－Ｌ）の架橋を有している必要はない。架橋アルギン酸における、上記式（ＩＩＩ－Ｌ）で表わされる架橋の導入率（架橋率とも言う）は、例えば、約０．１～約８０％、約０．３～約６０％、約０．５～約３０％、または約１．０～約１０％の範囲である。
架橋アルギン酸ゲルを得るためのＨｕｉｓｇｅｎ反応における前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされるアルギン酸誘導体の濃度は、通常約１～５００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約５～１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。
Ｈｕｉｓｇｅｎ反応の反応温度（化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製する際の温度）は、通常、外温約４～約６０℃であり、好ましくは外温約１５～約３７℃の範囲である。
６．化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
「化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」は、コア層及び前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層からなる線維状（ファイバ状）の構造体を意味する。図１に、コア・シェル構造を有するファイバとして形成された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの一例の断面図を示す。この化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、その外径がｃであり、直径ａのコア層５と厚さｂのシェル層４を含み、コア層５には、抗体産生細胞６と基材が含まれ、シェル層４は架橋アルギン酸ゲルを含む。
ここで、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材及びシェル層を構成する基材（すなわち、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル）は、異なる基材であっても良く又は同一の基材であっても良い。
いくつかの態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバでは、抗体産生細胞、コラーゲン（溶媒又はゲル）、又はアルギン酸（溶液又はゲル）を含むコア層が、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層により被覆して形成されたもの、すなわち、コア層に含まれる基材及びシェル層を構成する基材が異なるものである。
「化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」は、上記のコア・シェル構造（中心軸を通る中空部分構造）を有し、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が例えば０．２μｍ～２０００μｍ程度であり（但し、外径は当該径に限定されない）、繊維状の構造体で有ることから、ここでは、「化学架橋アルギン酸中空マイクロファイバ」と言うこともある。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバの中心軸に対する垂直方向の断面形状としては、円形、楕円系、又は多角形（例えば、四角形、五角形等）等の多様な形状であっても良く、好ましくは、図１に示されるような円形の断面形状である。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径は、例えば、約１００～４００μｍである。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層の厚さは、シェル層の厚さは、「（アルギン酸ゲルファイバの外径－コア層の直径）／２」により求めることができる。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径は、アルギン酸ゲルファイバの外径が、約３００μｍ～約７５０μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、約１００μｍ～約４００μｍの範囲である。
いくつかの形態において、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径は、例えば、約１００μｍであり、そしてアルギン酸ゲルファイバの外径は、例えば、約３００μｍである。このとき、シェル層の厚さは、例えば、約１００μｍである。
上記の化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径、並びにシェル層の内径及び化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外径は、例えば、位相差光学顕微鏡による画像からの計測値であって、当該化学架橋アルギン酸ゲルファイバの数カ所における計測値の平均値として表される。上記の化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層及びシェル層は、通常、実質的に均一な厚みを有しており、好ましくは、各層は、±５％の範囲内の厚さ均一性を有する。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバの長さは、例えば、約２～約５０ｍである。
本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバにおいて、コア層を形成する基材としては、細胞毒性を有さないものであれば特に限定されないが、例えば、ハイドロゲル等であって、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、メチルセルロース、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）、又はメチルセルロースからなる群から選択される基材である。
本明細書中、コア層は、前記基材に抗体産生細胞を含ませ、全体を適切な濃度の溶液としたものから形成される。例えば、アルギン酸ナトリウム溶液を用いる場合、例えば、約０．１～約２．０質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）溶液であり、好ましくは、約１．５質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）溶液であり；コラーゲン溶液を用いる場合、例えば、約０．１～約２．０質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％）溶液であり、好ましくは約０．２～約１．５（ｗ／ｗ％）または（ｗ／ｖ％）溶液である。
コア層の基材に用いる溶媒も特に限定されないが、例えば、、細胞培養用培地（または培養液）、アルギン酸ナトリウムを含む培地、等張緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び生理食塩水等が挙げられ、好ましくは、アルギン酸ナトリウムを含む培地、または等張緩衝液である。
本明細書中、細胞培養用培地には、市販の培地基材又は調製済み培地、若しくは自製した培地を使用することができる。又、天然培地（例えば、ソイビーン－カゼインダイジェスト培地（ＳＣＤ培地）等がある）又は合成培地（増殖に必要な各種栄養素を全て化学薬品にて補う培地である）を使用することもできる。又、当該培地は、特に限定されることは無いが、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン等）が含まれる基本培地であれば良く、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、Ｇ０１６培地、等が挙げられる。
又、前記培地には、更に血清が含まれていても良い。前記血清としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられる。培地に含まれる血清の濃度は、例えば、２質量％以上１０質量％以下である。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生細胞としては、抗体発現ベクターにより形質転換された培養細胞であり、その培養細胞が特に限定されることは無いが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、又はＵＡＣＣ－８１２細胞等（これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＡＴＣＣ細胞系カタログに記載されているものもある）から、適宜選択することができる。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生細胞は、好ましくは、抗体発現ベクターにより形質転換されたＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、又はＰＥＲＣ６細胞であり、より好ましくは、抗体発現ベクターにより形質転換されたＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＮＳ０であり、更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生ＣＨＯ細胞としては、特に限定されることは無いが、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等が挙げられる。
本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生ＣＨＯ細胞として、より好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり、更に好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層は、架橋アルギン酸ゲル（例えば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル）を含む。当該架橋アルギン酸ゲルは、被覆される抗体産生細胞を含むコア層に比べて、より高い又は同等な機械的強度を有するゲルであっても良く、好ましくは、当該架橋アルギン酸ゲルは、被覆される抗体産生細胞を含むコア層に比べて、より高い機械的強度を有するゲルである。又、培養時に化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外に存在している培養液（栄養源）及び酸素等の成分に対して十分な透過性を有しているものである。
前記架橋アルギン酸ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。前記架橋アルギン酸ゲル中には、生体成分や非生体成分を必要に応じて添加することもできる。
ここで提供される、いくつかの態様の架橋アルギン酸ゲルは、外的刺激によりゲル化する架橋アルギン酸ゲルである。外的刺激としては、例えば、２価金属イオンの添加（２価金属イオンを含む溶液の添加）、酵素処理、ｐＨ変動、加熱、ＵＶ照射、放射線照射などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、２価金属イオンである。
前記２価金属イオンとしては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等が挙げられ、好ましくはカルシウムイオン又はバリウムイオンであり、より好ましくはカルシウムイオンである。
前記カルシウムイオン又はバリウムイオンを含む溶液としては、特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、、塩化バリウム水溶液等の水溶液が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム水溶液である。
本明細書中、化学架橋アルギン酸ゲルファイバとは、いくつかの態様において、シェル層の架橋アルギン酸ゲルが、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応により形成されるトリアゾール環による化学架橋、及び２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン、等）により部分的に形成されるイオン架橋を含む架橋アルギン酸ゲルであるゲルファイバであり、又、いくつかの態様において、シェル層の架橋アルギン酸ゲルが、架橋としてＨｕｉｓｇｅｎ反応により形成されるトリアゾール環による化学架橋を含む架橋アルギン酸ゲルであるゲルファイバである。
好ましくは、化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、当該ゲルファイバを形成した後の早い段階で、培養液に浸潤させ培養を開始することができる。より好ましくは、コア層に含まれる、抗体産生細胞を壊死させることなく、コア層の直径が大きなゲルファイバを提供することができる。即ち、化学架橋アルギン酸ゲルファイバにより、抗体産生細胞がある一定数含まれたコア層を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバを容易に得ることができる。
コア層を被覆するシェル層によっては、十分な機械的強度が得られないことにより、コア層を被覆する段階でシェル層が潰れる場合や、壊れてしまう場合があり得る。しかし、本発明者らは、コア層を被覆するシェル層に、前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、２価金属イオン（例えば、カルシウムイオン）及びHuisgen反応により架橋し硬化させることで、コア層を被覆するのに十分な強度を有しており、又、培養液（栄養源）及び酸素を供給することができる化学架橋アルギン酸ゲルファイバが得られることを見出した。好ましい態様では、シェル層を形成する、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルは、コア層よりも高い機械的強度を有する架橋アルギン酸ゲルとなっている。
従って、化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、高い機械的強度を有する式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバである。又、ここでは、この化学架橋アルギン酸ゲルファイバを、「抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」と言うこともある。
ここで、「コア層よりも高い機械的強度を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバ」とは、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に、被覆されるコア層を形成する基材（例えば、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、又は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル、及びそれらの混合物等からなる群から選択される基材）と比べて実質的に同一又はより高い機械的強度を有するゲル（例えば、アルギン酸ゲルやアガロースゲルを挙げることができるが、これらに限定されることはない）を用いることで、コア層を被覆する段階でシェル層が潰れたり、壊れたりする恐れが少ない、アルギン酸ゲルを意味する。
シェル層を形成するゲルとして、好ましくは、カルシウムイオンなどの２価金属イオンの存在下でゲル化し、更に化学反応によりゲル化する性質を有するアルギン酸ゲル（例えば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル、２価金属イオンによるイオン架橋及びHuisgen反応による化学架橋を有する架橋アルギン酸ゲル）を用いることで、コア層よりも高い機械的強度を有する化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得ることもできる。
ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、その両端がアルギン酸ゲル、又は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲル等で封止されたゲルファイバであっても良い。当該ゲルファイバの両端を封止することにより、培養期間中にコア層が化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外へ漏れだすことの防止に繋がる。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、２種類の異なるゲルによりコア・シェル構造を有するファイバとして形成されている場合や、さらに多重構造を有している場合も包含される。又、シェル層の被覆も多層被覆からなる被覆であってもよく、例えば、２種類以上の異なる強度を有するシェル層により、２層以上の被覆が形成されていてもよい。
［アルギン酸ゲルファイバの製造方法］
ここでは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、例えば、図２又は図３に示されるマイクロ流体装置を用いることを含む方法が提供される。
以下に、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの作製方法について説明する。
前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバの作製方法は特に限定されないが、例えば、図２又は図３に示されるマイクロ流体装置を用いて行う。ここでのマイクロ流体装置は、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを作製するのに好ましく用いられる装置である。
マイクロ流体装置は、例えば、導入口が３つ、出口が１つの微細流路を作るための装置であり、第１の導入口に第１の液、第２の導入口に第２の液、及び第３の導入口に第３の液を適当な速さで流すと、第１の液と第２の液が交差して一本となった流路では、第１の液と第２の液が混ざることなく、２層のきれいな層流になり、さらに、その下流で第３の液と交差して３つの液が一本となった流路では、第１の液と第２の液と第３の液が混ざることなく、３層のきれいな層流になる。マイクロ流体装置としては、例えば、図２に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）１０を挙げることができる。
又、例えば、導入口が２つ、出口が１つの微細流路を作るための装置であり、第１の導入口に第１の液、及び第２の導入口に第２の液を適当な速さで流すと、第１の液と第２の液が混ざることなく、２層のきれいな層流になる。マイクロ流体装置としては、例えば、図３に示すようなＴ字型マイクロ流体装置ＸＸを挙げることができる。
２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができるマイクロ流体装置１０は、例えば、Ｗｏｎｊｅ Ｊｅｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｖｉａ “ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｙ” ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ ｔｕｂｅｓ， Ｌａｂ Ｃｈｉｐ， ２００４， ４， ｐ５７６－５８０ のＦｉｇ．１、又は、例えば、特開２０１６－７７２２９号公報（出願人：国立大学法人 東京大学）の図１又は図２に具体的に記載されているものを挙げることができる。いくつかの態様では、これらに記載されているマイクロ流体装置１０の具体例またはそれと同様な装置を用いて、同様な作製条件にて、アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
図２に示すように、マイクロ流体装置１０は、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む。
図２は、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。一例として、コア層の基材にアルギン酸ナトリウム溶液を用い、シェル部の基材に前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を用いる作製方法について説明する。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、例えば下記工程（１）～（４）を含む方法により製造することができる。
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、アルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、アルギン酸ナトリウム溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
（１）～（４）の工程を行うことにより、シェル層の前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液がゲル化し、シェル層４にカルシウム架橋及びHuisgen反応により形成される化学架橋からなる架橋アルギン酸ゲルを含み、またコア層５に抗体産生細胞６と基材を含む化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０を製造することができる。
また、前記方法により得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバを、例えば３７℃程度で数分（例えば、２～５分）～約１時間程度加熱してもよく、例えば、コア層５の抗体産生細胞６を含む基材がコラーゲン溶液の場合には、ゲル化させることが可能となる。
図３に示すように、マイクロ流体装置ＸＸ（以下、Ｔ字型流体装置ＸＸとも言う）は、導入管ＡＡと導入管ＡＡの導入口１、導入管ＢＢと導入管ＢＢの導入口２、導入管ＡＡ及び導入管ＢＢの下流に位置する排出管ＣＣ及びその出口３、及びキャツプであるＣａｐ１～Ｃａｐ３を含む。又、排出管ＣＣより排出されるファイバ状物質を受ける容器として、２価金属イオンを含む溶液を含むビーカー等の容器ＤＤが用いられる。
図３は、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。一例として、コア層の基材にアルギン酸ナトリウム溶液を用い、シェル部の基材に前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を用いる作製方法について説明する。
化学架橋アルギン酸ゲルファイバは、例えば下記工程（１）～（４）を含む方法により製造することができる。
（１）導入口２から、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入する工程、
（２）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞６と基材を射出する工程、
（３）排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、２価金属イオンを含む溶液中に射出させる工程、
（４）前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
（１）～（４）の工程を行うことにより、シェル層の前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液がゲル化し、シェル層にカルシウム架橋及びHuisgen反応により形成される化学架橋からなる架橋アルギン酸ゲルを含み、またコア層５に抗体産生細胞６と基材を含む化学架橋アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
マイクロ流体装置ＸＸにおいて、排出管ＣＣは、マイクロ流体装置ＸＸに導入できる太さのものであれば特に限定はされない。
マイクロ流体装置ＸＸにおいて、導入管ＡＡは、マイクロ流体装置ＸＸのに導入できる太さのものであれば特に限定はされない。
図２に示すマイクロ流体装置１０を用いる場合、導入口２及び３における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば、約２００～約４００μＬ／分程度であってもよい。導入口２及び３における溶液の射出速度を調節することにより、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みを適宜調節できる。例えば、導入口２及び３における溶液の射出速度を速くすると、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みが小さくなり、一方、射出速度を遅くすると、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みが大きくなる。
図２に示すマイクロ流体装置１０を用いる場合、導入口１から射出される抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液は、例えば、以下の通り調製する。
コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ－５０）にＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＨＣＯ３で構成されるバッファーを４：１で添加し、コラーゲン濃度を４ｍｇ／ｍＬに調製する。その後、培地で所定の濃度に調製した細胞懸濁液と１：１で混合し、コラーゲン終濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）の抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液を調製する。
マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速（射出速度）は特に限定されないが、例えば、約５０～約１００μＬ／分程度であってもよい。
マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液は、例えば、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、溶媒（例えば、ＭｉｌｌｉＱ水、等）を添加して、所定の濃度（例えば、各化学修飾アルギン酸誘導体の溶液が１．５質量％（ｗ／ｗ％））の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を調製する。
マイクロ流体装置１０の導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、特に限定されないが、例えば、約２００～約４００μＬ／分程度の範囲であってもよい。
マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液は、例えば、塩化カルシウムを用いて、ＭｉｌｌｉＱ水を添加して、所定の濃度（例えば、約１００ｍＭ）の塩化カルシウム水溶液を調製する。マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速は、特に限定されないが、例えば約２～約６ｍＬ／分程度の範囲であってもよい。
図３に示すＴ字型流体装置ＸＸを用いる場合、 導入口１及び２における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば、約５０～約４００μＬ／分程度であってもよい。導入口１及び導入口２における溶液の射出速度を調節することにより、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みを適宜調節できる。
図３に示すＴ字型流体装置ＸＸを用いる場合、導入口１から射出される抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液は、例えば、以下の通り調製する。
コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ－５０）にＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＨＣＯ３で構成されるバッファーを４：１で添加し、コラーゲン濃度を４ｍｇ／ｍＬに調製する。その後、培地で所定の濃度に調製した細胞懸濁液と１：１で混合し、コラーゲン終濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）の抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液を調製する。
図３に示すＴ字型流体装置ＸＸの導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速（射出速度）は特に限定されないが、例えば、約５０～約１００μＬ／分程度であってもよい。
図３に示すＴ字型流体装置ＸＸの導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液は、例えば、前記態様［１］に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、溶媒（例えば、ＭｉｌｌｉＱ水、等）を添加して、所定の濃度（例えば、各化学修飾アルギン酸誘導体の溶液が１．５質量％（ｗ／ｗ％）又は（ｗ／ｖ％））の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を調製する。
Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口２から射出される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の流速は、特に限定されないが、例えば、約２００～約４００μＬ／分程度の範囲であってもよい。
作製される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０の外径は、特に限定されないが、前述の通りであり、例えば、約０．２μｍ～約２０００μｍの範囲、又は約５０μｍ～約１０００μｍの範囲であっても良く、好ましくは、約２００μｍ～約８００μｍの範囲である。化学架橋アルギン酸ゲルファイバ２０の長さは特に限定されず、前述の通りであり、例えば数ｍｍ～数ｍ程度であってもよい。当該ファイバの断面形状としては、前述の通りであり、例えば、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等が挙げられる。
いくつかの態様では、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度は、例えば、約４～約３７℃の範囲であり、好ましくは約３５℃である。
いくつかの態様では、化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養液中で培養することにより、抗体産生細胞が培養され、抗体を産生することができる。アルギン酸ゲルファイバは、培養液を適切に交換することにより、抗体産生細胞を数か月の連続培養することが可能となる。
本明細書中の記載において「約」と記載した場合、特に断りが無い場合には、当該数値の±２０％迄、好ましくは当該数値の±１０％迄の値も含み得るものである。
［抗体産生細胞の培養方法］
ここでは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いることを含む、抗体の製造方法が提供される。以下、「抗体の製造方法」を「抗体産生細胞の培養方法」という場合がある。
好ましい態様の抗体産生細胞の培養方法によれば、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを製造した後、直ぐに抗体産生細胞の培養を開始する。これにより、図４に示すように、コア層への培養液（栄養源）及び酸素の供給をすぐに行うことができる。特に好ましい態様では、コア層での抗体産生細胞の壊死を十分に防ぎつつ、抗体を産生することができる。
以下に、抗体産生細胞の培養方法の一例について、具体的に説明するが、これに限定されない。ベントキャップ付三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、 Ｃａｔ．４３１１４３に、コア層に抗体産生細胞を含むアルギン酸ゲルファイバを入れ、後述する表２６の組成である培地（３０ ｍＬ）を添加し、ゲルファイバを含浸させた後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にインキュベータ内で培養装置（パナソニックヘルスケア（株）ＭＩＲ－Ｓ１００Ｃ）を用いた１２５ ｒｐｍの条件で振とうしながら培養を行う。２～３日に一回、培地１．８ ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ Ｆｅｅｄ ００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０ ｍＬに保つ。
又、好ましい態様の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造技術は、コア層に含まれる抗体産生細胞がある一定数以上には増殖しないことにより、細胞への物理的ストレスが少ないため、封入した抗体産生細胞が長期間に渡り抗体を産生し続ける可能性を有している点で優れている。
特に好ましい態様では、抗体の生産・精製効率を飛躍的に向上させる可能性があり（例えば、好ましい態様のマイクロゲルファイバを用いることで、大規模な培養タンクを要する浮遊培養とは異なり、小規模の生産設備にて抗体を培養することも可能となる）、少量・多種品目の抗体医薬品（具体的には、抗体医薬品等）の製造にも適した次世代型抗体医薬品の連続生産技術として期待できる。
培養により産生された抗体（例えば、トシリズマブ）は、アルギン酸ゲルファイバのコア層に貯留されても良く、好ましくは、アルギン酸ゲルファイバのシェル層を透過しアルギン酸ゲルファイバ外の培養液中に貯留される。尚、抗体の回収・精製は、後述の記載を参照し、行うことが可能である。
好ましい態様では、図４に示すように、コア層内で産生された抗体がシェル層を透過して化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外へ順次放出されることとなり、抗体の連続培養が可能なサイクルが形成可能である。尚、このとき、代謝物及び老廃物も化学架橋アルギン酸ゲルファイバ外へ放出されてもよい。
実際に、後述の実施例では、シェル層の架橋アルギン酸ゲルを形成する為の原料として、式（Ｉ）の化学修飾アルギン酸誘導体に化合物（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）、化合物（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃ）又は化合物（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２）、式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体に化合物（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ）又は化合物（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）を用いて作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバの場合、産生された抗体（トシリズマブ）がコア層及び培養液中に貯留された事が確認できた。
抗体産生細胞が含まれるコア層を、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルで被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養する、培養容器としては、例えば、組織培養用プレート、三角フラスコ、Ｔ－フラスコ、スピナーフラスコ、培養バッグ、動物細胞培養槽等からなる群から選択される容器であり；好ましくは三角フラスコ又は動物細胞培養槽である。 培養は、静置培養、振とう・揺動培養などのいずれの方法を選択してもよい。
抗体の生産性向上には、培養当たりの抗体産生細胞数の増大化が有効であるが、一方で過剰な増殖が起こり、培養環境が悪化し、培養期間の短縮が起こりうる。いくつかの態様の抗体の製造方法にて、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる、抗体産生細胞の過剰増殖に起因する細胞への物理的ストレスを少なくする為の方法として、例えば、コア層に含まれる抗体産生細胞がある一定数以上に増殖しない方法としては、培養中の培養温度のコントロール、培養液中に細胞増殖抑制剤を添加する、等の方法が挙げられる。
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、例えば、約３０～約３８℃の範囲である。
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、好ましくは、培養開始から終了時までの温度が約３７℃である。
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約１．０×１０８細胞／ｍＬ～約１０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約３．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養温度は、より好ましくは、培養開始時の温度が約３７℃であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の細胞濃度が、約４．０×１０８細胞／ｍＬ～約８．０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が約３０℃である。
細胞増殖抑制剤とは、培養期間中、過剰な細胞増殖を抑制することが可能な剤である。いくつかの態様の抗体の製造方法にて、培養液中に添加できる細胞増殖抑制剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、塩化リチウム及び吉草酸からなる群から選択される添加剤であり；好ましくは、バルプロ酸又は吉草酸であり；より好ましくは、吉草酸である。細胞増殖抑制剤を培養液に添加するタイミングは、培養開始時点、又は培養期間中（必要な細胞数まで増殖できた時点）のいずれでも可能である。
抗体は、定常領域の構造上の違いにより、下記表に示されるようなクラス（アイソタイプ）やサブクラスに分類される。
ヒトＩｇの分類
Figure 2023015413000087
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、抗体産生細胞を培養することよってアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等からなる群から選択されるクラス（アイソタイプ）を有する抗体が挙げられる。抗体産生細胞を培養することによってアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体は、好ましくは、ＩｇＧ、又はＩｇＥのクラス（アイソタイプ）の抗体であり、より好ましくは、ＩｇＧのクラス（アイソタイプ）の抗体である。
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、抗体産生細胞を培養することによって、アルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体の分子量は、特に限定されることは無いが、例えば、４５，０００～９００，０００の範囲にある抗体である。いくつかの態様の抗体の製造方法にてアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体の分子量は、好ましくは、４５，０００～１６０，０００の範囲であり、より好ましくは、１４０，０００～１５０，０００の範囲である。
本明細書中、前記記載の各抗体産生ＣＨＯ細胞を用いて前記記載の抗体の製造方法にて培養を行う場合、用いた抗体産生ＣＨＯ細胞に対応する抗体が産生される。例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いる場合、抗体としてムロモナブ－ＣＤ３が産生される。
産生される抗体としては、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いてムロモナブ－ＣＤ３（ＩｇＧ；１５０，０００）、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ（ＩｇＧ；１４４，５１０）、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパリビズマブ（ＩｇＧ；“１４７，７００”）、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ（ＩｇＧ；“１４９，０００”）、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてバシリキシマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ゲムツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてゲムツズマブ オゾガマイシン（ＩｇＧ；“１５３，０００”）、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベバシズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、イブリツモマブ チウキセタン産生ＣＨＯ細胞を用いてイブリツモマブ チウキセタン（ＩｇＧ；１４８，０００）、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアダリムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセツキシマブ（ＩｇＧ；１５１，８００）、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラニビズマブ（ＩｇＧ；４８，０００）、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオマリズマブ（ＩｇＥ；１４９，０００）、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエクリズマブ（ＩｇＧ；１４５，２３５）、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパニツムマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてウステキヌマブ（ＩｇＧ；１４８，０７９～１４９，６９０）、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてゴリムマブ（ＩｇＧ；１４９，８０２～１５１，０６４）、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてカナキヌマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデノスマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてモガムリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、セルトリズマブ ペゴル産生ＣＨＯ細胞を用いてセルトリズマブ ペゴル（ＩｇＧ；９０，０００）、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオファツムマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペルツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、トラスツズマブ エムタンシン産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ エムタンシン（ＩｇＧ；１５１，０００）、ブレンツキシマブ ベドチン産生ＣＨＯ細胞を用いてブレンツキシマブ ベドチン（ＩｇＧ；１５３，０００）、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてナタリズマブ（ＩｇＧ；１４６，１７８）、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブ（ＩｇＧ；１４５，０００）、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアレムツズマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセクキヌマブ（ＩｇＧ；１５１，０００）、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラムシルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイピリムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエボロクマブ（ＩｇＧ；１４１，７８９）、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてメポリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアリロクマブ（ＩｇＧ；１４５８９２．０４９．）、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイキセキズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてブロダルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイダルシズマブ（ＩｇＧ；４７，７８２）、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエロツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペムブロリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてサリルマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベズロトクスマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベリムマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてダラツムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアベルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュピルマブ（ＩｇＧ；１５２，０００）、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアテゾリズマブ（ＩｇＧ；１４４，６１１）、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベンラリズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、イノツズマブ オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてイノツズマブ オゾガマイシン（ＩｇＧ；１５９，０００）、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエミシズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてグセルクマブ（ＩｇＧ；１４６，０００）、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュルバルマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオビヌツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００～１５０，０００）、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベドリズマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）が挙げられる（抗体名後のカッコ内は、当該抗体のクラス（アイソタイプ）及び分子量を示す）。
産生された抗体は、例えば、下記の３工程を経て精製が行われる。
〔工程１〕培地中に含まれる、抗体以外のタンパク質及び固形物をほぼ取り除く為に、遠心分離法又はフィルターによる濾過等を行う。
〔工程２〕例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いたアフィニティークロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにて目的とする抗体を取り出す。
〔工程３〕工程２で混入してきた夾雑物を除去する為に、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、目的とする抗体を高純度精製する。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いたアフィニティークロマトグラフィー：
ＩｇＧの精製法としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いた抗体の精製方法が知られている。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた抗体の精製法として、下記方法が１例として挙げられる。（１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが固定されたビーズが充填されたカラムを用いて、前記〔ステップ１〕の方法で得られてくる溶液に血清を添加した溶液をろ過することで、ＩｇＧがカラム中のビーズに結合して、他の血清成分がカラム外へ流出がされる。（２）その後、カラムに酸性溶液を通過させることにより、ビーズに結合していたＩｇＧが切れて、カラム外へ溶出されてＩｇＧが得られる。尚、ＩｇのＰｒｏｔｅｉｎ ＡとＰｒｏｔｅｉｎ Ｇへの結合力が、動物種やサブクラスによって違うことから、目的によって、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを使い分けることができる。
イオン交換クロマトグラフィー：
タンパク質が有する電気的な性質（電荷）を利用してタンパク質を分離する方法である。正電荷を示す塩基性タンパク質は、負電荷をもつ陽イオン交換体（担体）にイオン結合し、負電荷を示す酸性タ ンパク質は正電荷を持つ陰イオン交換体に結合することから、タンパク質が含まれる試料をイオン交換体が充填されたカラムを通すことで、タンパク質がイオン交換体に結合する。その後、カラムを通す溶媒の塩濃度を高濃度にすることで、タンパク質とイオン交換体とのイオン結合が弱くなり、結合力の弱いタンパク質から順番に、イオン交換体から外れて、カラム外へ流出してくる。陽イオン交換体又は陰イオン交換体の選択は、試料として用いるタンパク質の電荷から選択するものとする。
ゲルろ過クロマトグラフィー：
タンパク質の分子量の違いを利用してタンパク質を分離する方法である。小孔が付いている担体が充填されたカラムに試料を流すことで、分子量の小さいタンパク質は、前記小孔に入り込みながら流出してき、分子量の大きいタンパク質は前記小孔に入らずに流出してくる為、カラムを通過する時間が分子量の小さいタンパク質は遅く、分子量の大きいタンパク質は早くなることから、時間差的にタンパク質を分離することが可能となる。
尚、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報、その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[化学修飾アルギン酸誘導体の合成法]
核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）の測定には、ＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＥＣＸ４００ ＦＴ－ＮＭＲ（日本電子）を用いた。液体クロマトグラフィー－質量分析スペクトル（ＬＣ－Ｍａｓｓ）は以下の方法で測定した。［ＵＰＬＣ］Ｗａｔｅｒｓ ＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムおよびＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．７μｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝５：９５（０分）～９５：５（１．０分）～９５：５（１．６分）～５：９５（２．０分）の移動相およびグラジエント条件を用いた。
１Ｈ－ＮＭＲデータ中、ＮＭＲシグナルのパターンで、ｓはシングレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはカルテット、ｍはマルチプレット、ｂｒはブロード、Ｊはカップリング定数、Ｈｚはヘルツ、ＣＤＣｌ３は重クロロホルム、ＤＭＳＯ－ｄ６は重ジメチルスルホキシド、Ｄ２Ｏは重水、ＣＤ３ＯＤは重メタノールを意味する。１Ｈ－ＮＭＲデータ中、水酸基（ＯＨ）、アミノ基（ＮＨ２）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）のプロトン等、ブロードバンドであるため確認ができないシグナルについては、データに記載していない。
ＬＣ－Ｍａｓｓデータ中、Ｍは分子量、ＲＴは保持時間、［Ｍ＋Ｈ］＋，［Ｍ＋Ｎａ］＋は分子イオンピークを意味する。
実施例中の「室温」は、通常約０℃から約３５℃の温度を示すものとする。
実施例中の反応性置換基導入率（モル％）は、１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）の積分比から算出されたアルギン酸を構成する単糖（グルロン酸およびマンヌロン酸）単位のモル数に対する導入された反応性置換基のモル数の割合を示すものとする。
実施例において、反応性基又は相補的な反応性基が導入される前のアルギン酸ナトリウムは、前記表２１に記される物性値を示すアルギン酸ナトリウムを用いた。
表２３－１～表２３－２には、（実施例Ａ－１）～（実施例Ａ－１５）及び（実施例１）～（実施例１７）で得られた、反応性基が導入されたアルギン酸誘導体の物性値（具体的には、反応性基導入率（ｍｏｌ％）、分子量、及び重量平均分子量（万Ｄａ））を示す。
表２４－１～表２４－６には、（実施例Ａ－１）～（実施例Ａ－１５）及び（実施例１）～（実施例１７）中の各中間体の１Ｈ－ＮＭＲを示す。
表２５には、（実施例Ａ－１）～（実施例Ａ－１５）及び（実施例１）～（実施例１７）中の各中間体のＬＣ－Ｍａｓｓを示す。
（実施例Ａ－１）
ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（実施例Ａ－１ａ、実施例Ａ－１ｂ、実施例Ａ－１ｃ、実施例Ａ－１ｄ、実施例Ａ－１ｅ、実施例Ａ－１ｆ、実施例Ａ－１ｇ、及び実施例Ａ－１ｈ）の合成：
Figure 2023015413000088
（実施例Ａ－１ａ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４３．６ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１１．６５ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（４０３．５ μＬ）を加えた。この溶液に、市販のジベンゾシクロオクチン－アミン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、８３．６２ ｍｇ）のエタノール溶液（２ ｍＬ）を滴下し、室温で１８時間攪拌した。塩化ナトリウム（４００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（８７．２ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２（３７６ ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｂ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－１）の合成：
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－１）水溶液（１９．３２ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（４９．４７ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１７８．８ μＬ）を加えた。この溶液に、市販のジベンゾシクロオクチン－アミン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、３７．０５ ｍｇ）のエタノール溶液（４ ｍＬ）を滴下し、室温で２０時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（３８．６４ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－１（１８４ ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｃ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－３）の合成：
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－３）水溶液（１５．０６ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３８．５７ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１３９．４ μＬ）を加えた。この溶液に、市販のジベンゾシクロオクチン－アミン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、２８．８８ ｍｇ）のエタノール溶液（２ ｍＬ）を滴下し、室温で２３時間攪拌した。塩化ナトリウム（１５０ ｍｇ）を加えた後、エタノール（６０．２４ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－３（１６４ ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｄ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ａ）の合成：
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（５３．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１１．０ ｍｇ）、ジベンゾシクロオクチン－アミン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、３６．９ ｍｇ）のエタノール（５．３ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１１３．７ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（５３０ ｍｇ）を加えた後、エタノール（１０１ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ－（Ｉ）－Ｂ－２ａ（４６５ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｅ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３５．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４．７ ｍｇ）、ジベンゾシクロオクチン－アミン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、４．９ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１７．７ μＬ）、エタノール（３．５ ｍＬ）を加え、３０℃で３．５時間攪拌した。塩化ナトリウム（３５０ ｍｇ）を加えた後、エタノール（７０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ（３２９ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｆ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｃ）の合成：
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６７．０ ｍｇ）、ジベンゾシクロオクチン－アミン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（ＥＸ１－ＳＭ、１６．７ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（６０．５ μＬ）、エタノール（６．０ ｍＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ－（Ｉ）－Ｂ－２ｃ（５５８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｇ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－１ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｂ（１．１７４ ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１ｈ）ジベンゾシクロオクチン－アミン基導入アルギン酸（ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃ）の合成：
（実施例Ａ－１ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃ（１．１３８ ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－２）Ｎ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメトキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン基導入アルギン酸（化合物ＥＸ２－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000089
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１０．９ ｍＬ）に、室温で、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２７．９１ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１００．９ μＬ）を加えた。この溶液に、市販のＮ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメトキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン［ＣＡＳ１２６３１６６－９３－３］（ＥＸ－２－ＳＭ、２４．５４ ｍｇ）のエタノール（２ ｍＬ）及び水（１ ｍＬ）溶液を、室温で滴下し、同温度で２１時間攪拌した。塩化ナトリウム（１００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（２１．８ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ２－（Ｉ）－Ａ－２（１００ ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
（実施例Ａ－３） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－３ａ、実施例Ａ－３ｂ、実施例Ａ－３ｃ、実施例Ａ－３ｄ、実施例Ａ－３ｅ、実施例Ａ－３ｆ、及び実施例Ａ－３ｇ）の合成：
Figure 2023015413000090
＜工程１＞メチル ４－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）ベンゾエート（化合物ＥＸ３－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000091
トリフェニルホスフィン（０．９６ ｇ）のテトラヒドロフラン（２．５９ ｍＬ）溶液に、氷冷撹拌下、アゾジカルボン酸ジエチル（４０％トルエン溶液，１．９２ ｍＬ）溶液を加え、室温で２０分間撹拌した。この溶液に対し、氷冷撹拌下、市販の４－ヒドロキシ安息香酸 メチル［ＣＡＳ：９９－７６－３］（化合物ＥＸ３－ＳＭ、０．３７ ｇ）及び２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）エタノールアミン［ＣＡＳ：２６６９０－８０－２］（０．３９ ｇ）のテトラヒドロフラン（１．１ ｍＬ）溶液を加え、室温で１７時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～４０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）により精製し、化合物１と化合物２の混合物を得た。この混合物をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）に溶解させ、１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５ ｍＬ）で２回、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去し、化合物ＥＸ３－ＩＭ－１（０．４５ ｇ）をピンク色のオイル状物質として得た。
＜工程２＞４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド塩酸塩（化合物ＥＸ３－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000092
（実施例Ａ－３）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－１（０．４４ ｇ）のメタノール（４．４ ｍＬ）溶液に水酸化リチウム一水和物（０．２５ ｇ）を加え、６０度で３時間３０分撹拌した。反応液に１規定－塩酸（５ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。残留物をアセトニトリル（４．４ ｍＬ）に溶解させ、３－アジドプロパン－１－アミン［ＣＡＳ：８８１９２－１９－２］（０．１５ ｇ）とＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．５７ ｇ）を加えた。続いて、氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５２ ｍＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応液に対し水（１０ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５ ｍＬ）で３回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１６％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～１００％酢酸エチル）により精製し、化合物ＥＸ３－ＩＭ－２（０．７１ ｇ）を含む画分を得た。
化合物ＥＸ３－ＩＭ－２を含む画分（０．７１ ｇ）に対し、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（４．９ ｍＬ）を加え、室温で２０分間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテルを加えた後、析出物を濾過することで、標記化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（０．４９ ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ａ） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000093
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１９．６ ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５０．１９ ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（５４．３７ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１８１．４ μＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（３９．２ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２（１９８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｂ） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－１）の合成：
Figure 2023015413000094
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－１）水溶液（１９．３２ ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（４９．４７ ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（５３．３９ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１７８．８ μＬ）を加え、室温で２０時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（３８．６４ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、化合物ＥＸ－（ＩＩ）－Ａ－１（２２１ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｃ） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－３）の合成：
Figure 2023015413000095
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－３）水溶液（１５．０６ ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３８．５７ ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（４１．７８ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１３９．４ μＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。塩化ナトリウム（１５０ ｍｇ）を加えた後、エタノール（６０．２４ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－３（１５５ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｄ） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ）の合成：
Figure 2023015413000096
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１２５．６ ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（４５．４ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（２１１．８ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２（５５３ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｅ） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
Figure 2023015413000097
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３５．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４．７ ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（５．３ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（２６．５ μＬ）を加え、３０℃で３．５時間攪拌した。塩化ナトリウム（３５０ ｍｇ）を加えた後、エタノール（７０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ（３０４ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｆ） ４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ｃ）の合成：
Figure 2023015413000098
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６７．０ ｍｇ）、（実施例Ａ－３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ３－ＩＭ－３（１８．１ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（９０．８ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２（５６８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－３ｇ）４－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（３－アジドプロピル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－３ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ（１．１７１ ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－４）４－（３－アミノプロポキシ）－Ｎ－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000099
＜工程１＞ ４－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロポキシ）安息香酸（化合物ＥＸ４－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000100
トリフェニルホスフィン（２．０７ ｇ）のテトラヒドロフラン（７ ｍＬ）溶液に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル （４０％トルエン溶液，４．１５ ｍＬ）を加え、析出物が形成するまで撹拌した。更に１時間撹拌後、市販のｔｅｒｔ－ブチル（３－ヒドロキシプロピル）カルバマート［ＣＡＳ：５８８８５－５８－８］（１．１５ ｇ）及び４－ヒドロキシ安息香酸メチルエステル［ＣＡＳ:９９－７６－３］（化合物ＥＸ４－ＳＭ、１ ｇ）のテトラヒドロフラン（３ ｍＬ）溶液を加え、３時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～６６％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）により精製した。この精製物をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）に溶解させ、１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５ ｍＬ）で２回、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去し、化合物ＥＸ４－ＩＭ－１（２．９４ ｇ）を含む画分を白色固体として得た。
化合物ＥＸ４－ＩＭ－１を含む画分（２．９４ ｇ）のメタノール（１５．６ ｍＬ）溶液に対し、室温撹拌下、水酸化リチウム・一水和物（１．０６ ｇ）を加え、６０℃で３時間撹拌した。室温に冷却後、減圧下で溶媒を留去した。この残留物に対し、水（２０ ｍＬ）を加え、メチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）で２回抽出した。水層を１規定－塩酸（２５ ｍＬ）を用い酸性にし、酢酸エチル（２０ ｍＬ）で３回抽出し、水（１０ ｍＬ）及び飽和食塩水（１０ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。残留物にメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（３０ ｍＬ）及び１規定－水酸化ナトリウム水溶液（２０ ｍ）を加え、メチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）で２回抽出した。水層を１規定－塩酸（２０ ｍＬ）を用い酸性にし、酢酸エチル（２０ ｍＬ）で２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去し、化合物ＥＸ４－ＩＭ－２（１．４ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ ４－（３－アミノプロポキシ）－Ｎ－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド塩酸塩（化合物ＥＸ４－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000101
（実施例Ａ－４）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ４－ＩＭ－２（１ ｇ）、市販の２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン［ＣＡＳ：１６６３８８－５７－４］（０．６２ ｇ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（１．３５ ｇ）のアセトニトリル（２０ ｍＬ）溶液に対し、氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ ｍＬ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。反応液に対し水（２０ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ）で３回抽出し、水（１０ ｍＬ）及び飽和食塩水（１０ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１６％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～１００％酢酸エチル）により精製し、化合物ＥＸ４－ＩＭ－３（１．３７ ｇ）を含む画分を得た。
化合物ＥＸ４－ＩＭ－３を含む画分（１．３７ ｇ）に対し、１，４－ジオキサン（９．５８ ｍＬ）を加えた。この溶液に対し、水冷撹拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（９．５８ ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１００ ｍＬ）を加えた後、懸濁液を室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ ｍＬ）及びメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０ ｍＬ）でトリチュレートした。得られた固体を濾過し、減圧下乾燥することで、標記化合物ＥＸ４－ＩＭ－４（１．２３ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞ ４－（３－アミノプロポキシ）－Ｎ－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000102
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１９．６ ｍＬ）に、氷冷撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５０．１９ ｍｇ）、（実施例Ａ－４）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ４－ＩＭ－４（７０．３５ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１８１．４ μＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（３９．２ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ４－（ＩＩ）－Ａ－２（１９９ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－５）Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－５ａ、、実施例Ａ－５ｂ及び実施例Ａ－５ｃ）の合成：
Figure 2023015413000103
＜工程１＞ ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（クロロメチル）ベンザミド）エチル）カルバメート（化合物ＥＸ５－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000104
ＥＸ５－ＳＭ（４－（クロロメチル）ベンゾイル クロリド、［ＣＡＳ：８７６－０８－４］（２．０ ｇ）をテトラヒドロフラン（１０．０ ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［ＣＡＳ：５７２６０－７３－８］（１．７ ｇ）とＮ，Ｎ‘－ジイソプロピルエチルアミン（３．７ ｍＬ）のテトラヒドロフラン（１０．０ ｍＬ）溶液を、氷水冷下滴下し、室温で１．５時間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（３０ ｍＬ）と水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。有機層を半飽和重曹水（１０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルでトリチュレートした後、得られた固体をろ取し、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで洗浄して、標記化合物ＥＸ５－ＩＭ－１（２．９ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（アジドメチル）ベンザミド）エチル）カルバメート（ＥＸ－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000105
アジ化ナトリウム（１００ ｍｇ）をジメチルスルホキシド（６．０ ｍＬ）に溶かし、（実施例Ａ－５）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－１（４００ ｍｇ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に、氷水冷下、水（１２ ｍＬ）を加え、析出した固体をろ過し、水洗した。得られた固体を、５０℃で減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－ＩＭ－２（３８０ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド 塩酸塩（化合物ＥＸ５－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000106
（実施例Ａ－５）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－２（２５０ ｍｇ）に、氷水冷下で、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．７５ ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（５．２５ ｍＬ）を加え、得られた沈殿をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－ＩＭ－３（１９２ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４－１＞（実施例Ａ－５ａ）Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000107
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８４ ｍｇ）、（実施例Ａ－５）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－３（５２ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（２５２ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（４０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２（１８５ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４－２＞（実施例Ａ－５ｂ） Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ｂ－２）の合成：
Figure 2023015413000108
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（２０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８４ ｍｇ）、（実施例Ａ－５）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ５－ＩＭ－３（２６ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１５１ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（２００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（４０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ｂ－２（１８７ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－５ｃ）Ｎ－（２－アミノエチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ）の合成：
（実施例Ａ－５ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ５－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ（２７６ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－６） Ｎ－（３－アミノペンチニル）－５，６－ジヒドロ－１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン基（ＡＤＩＢＯ－Ｃ５－アミン）導入アルギン酸（化合物ＥＸ６－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure 2023015413000109
＜工程１＞ Ｎ－トリフルオロアセチル－５－アミノペンタン酸（ＥＸ６－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000110
５－アミノペンタン酸（ＥＸ６－ＳＭ１、［ＣＡＳ：６６０－８８－８］２．０ ｇ）、トリフルオロ酢酸 エチルエステル（３．１ｍＬ）、トリエチルアミン（３．６ ｍＬ）をメタノール（９０．０ ｍＬ）に溶解し、４０℃で５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残さにエタノール（１０ ｍＬ）を加え減圧濃縮する操作を２回行った。濃縮残さを酢酸エチル（２００ ｍＬ）に溶解し、０，１モル濃度のリン酸２水素ナトリウム水溶液（７０ ｍＬ）で３回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ６－ＩＭ－１（１．８ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ （Ｚ）－Ｎ－（５－（ジベンゾ［ｂ、ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－５－オキソペンチル－トリフルオロアセタミド（化合物ＥＸ６－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000111
（実施例Ａ－６）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ６－ＩＭ－１（６１７ ｍｇ）に、塩化チオニル（４４０ μＬ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ μＬ）を加え、８０℃で１，５時間撹拌し、反応液を減圧濃縮した。残さの塩化メチレン（１．０ ｍＬ）溶液を、［製造法Ｄ］＜工程１＞記載の方法に従い，５－ジベンゾスベレノン［ＣＡＳ:２２２２－３３－５］から合成した化合物ＥＸ６－ＳＭ２［ＣＡＳ:２３２９４－９３－６］（５００ ｍｇ）、ピリジン（５８５ μＬ）の塩化メチレン（５．０ ｍＬ）溶液に氷水冷下で加え、室温で３０分間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ－ブチルメチルメチルエーテル（２０ ｍＬ）で希釈し、水（１０ ｍＬ）、１規定－塩酸（１０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。得られた残さを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン～６０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製した後、得られた固体をｔｅｒｔ－ブチルメチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンでトリチュレートした。固体をろ過後、ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ６－ＩＭ－２（８４０ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（５－（１１，１２－ジブロモ－１１，１２－ジヒドロジベンゾ［ｂ、ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－５－オキソペンチル－トリフルオロアセタミド（化合物ＥＸ６－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000112
（実施例Ａ－６）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ６－ＩＭ－２（７００ ｍｇ）の塩化メチレン（２．８ ｍＬ）溶液に、ピリジニウムブロミドペルブロミド（６１２ ｍｇ）を氷水冷下で加え、室温で１．５時間撹拌した後、ピリジニウムブロミドペルブロミド（１１１ ｍｇ）を加え、室温でさらに１時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（２０ ｍＬ）で希釈し、２規定－塩酸（１０ ｍＬ）、飽和食塩水（５ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して、標記粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－３（１．０３ ｇ）を黄色アモルファスとして得た。
＜工程４＞Ｎ－（３－アミノペンチニル）－５，６－ジヒドロ－１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ、ｆ］アゾシン－トリフルオロアセタミド（ＥＸ６－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000113
（実施例Ａ－６）＜工程３＞で得られた粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－３（１００ ｍｇ）のテトラヒドロフラン（１．５ ｍＬ）溶液に、ｔeｒｔ－ブトキシカリウム（１００ ｍｇ）を、室温撹拌下、少量ずつ、８時間かけて加えた。反応液を酢酸エチル（１５ ｍＬ）で希釈し、水（３ ｍL）、飽和食塩水（２ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して、標記粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－４（５８ ｍｇ）を淡茶色ガム状物質として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（３－アミノペンチニル）－５，６－ジヒドロ－１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ、ｆ］アゾシン（化合物ＥＸ６－ＩＭ－５）の合成：
Figure 2023015413000114
（実施例Ａ－６）＜工程４＞で得られた粗化合物ＥＸ６－ＩＭ－４（５８ ｍｇ）のメタノール（１．２ ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（４０ ｍｇ）の水（０．２５ ｍＬ）溶液を加え、室温で２３時間撹拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチル（１０ ｍＬ）、塩化メチレン（１ｍL）、半飽和食塩水（２ ｍL）を加え、分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮した。得られたガムをシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル～５０％メタノール／酢酸エチル）で精製して、標記化合物ＥＸ６－ＩＭ－５（２２ ｍｇ）を無色ガム状物質として得た。
＜工程６＞ Ｎ－（３－アミノペンチニル）－５，６－ジヒドロ－１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン（ＡＤＩＢＯ－Ｃ５－アミノ）基導入アルギン酸（ＥＸ６－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure 2023015413000115
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（２８．５ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６０ ｍｇ）、（実施例Ａ－６）＜工程５＞で得られた化合物ＥＸ６－ＩＭ－５（２２ ｍｇ）のエタノール（２．９ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（７２ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（２８５ ｍｇ）を加えた後、エタノール（５７ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ６－（Ｉ）－Ｂ－２（２７７ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－７） Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（実施例Ａ－７ａ、実施例Ａ－７ｂ、及び実施例Ａ－７ｃ）の合成：
Figure 2023015413000116
＜工程１＞ ｔeｒｔ－ブチル（２－（４－アジドベンザミド）エチル）カルバメート（化合物ＥＸ７－ＩＭ－1）の合成：
Figure 2023015413000117
４－アジド安息香酸（ＥＸ７－ＳＭ、［ＣＡS：６４２７－６６－３］７００ ｍｇ）に、塩化チオニル（７８３ μＬ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ μＬ）を加え、７０℃で１時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残さに塩化メチレン（１ ｍＬ）をｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート［ＣＡＳ：５７２６０－７３－８］（８２５ ｍｇ）、ピリジン（１．０４ ｍＬ）の塩化メチレン（７．０ ｍＬ）溶液に氷水冷下で加え、室温で１時間撹拌した。反応液をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（３０ ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍL）、飽和重曹水（５ ｍＬ）、０．５規定－クエン酸（５ｍＬで２回）、水（５ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残さをｔｅｒｔ－ブチルメチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンでトリチュレートし、固体をろ過した後、ｔｅｒｔ－ブチルメチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ７－ＩＭ－１（１．１ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド 塩酸塩（化合物ＥＸ７－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000118
（実施例Ａ－７）＜工程１＞で得られた化合物（ＥＸ７－ＩＭ－１、５００ ｍｇ）を、１，４－ジオキサン（１．５ ｍＬ）に懸濁した。氷水冷下４規定－塩化水素／ジオキサン溶液（３．５ ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１０．５ ｍＬ）を加え、室温で５０分間撹拌した。固体をろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ７－ＩＭ－２（３６５ ｍｇ）を淡ベージュ色固体として得た。
＜工程３－１＞（実施例Ａ－７ａ） Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ）の合成：
Figure 2023015413000119
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３０．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６３ ｍｇ）、（実施例Ａ－７）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ７－ＩＭ－２（１８ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１１４ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（３００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（６０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ（２８２ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３－２＞（実施例Ａ－７ｂ） Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
Figure 2023015413000120
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（６０．０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６７ ｍｇ）、（実施例Ａ－７）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ７－ＩＭ－２（１５ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（９１ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（６００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（１２０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ７－（ＩＩ）－Ｂ－２ｂ（５６０ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－７ｃ） Ｎ－（２－アミノエチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ７－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
アルギン酸をＡ－２に変えて（実施例Ａ－７ａ）と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ７－（ＩＩ）－Ａ－２（２７１ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure 2023015413000121
＜工程１＞ ｔｅｒｔ－ブチル（４－（4（（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）メチル）ベンジル）カルバメート（化合物ＥＸ８－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000122
文献公知の方法（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）１１：４１８９－４２０６）を参考に，１，４－ビス（アミノメチル）ベンゼン［ＣＡＳ：５３９－４８－０］から合成したｔｅｒｔ－ブチル（４－（アミノエチル）ベンジル）カルバメート［ＣＡＳ:１０８４６８－８０－４］（ＥＸ８－ＳＭ１、０．６７ ｇ）、トリエチルアミン（０．３９ ｍＬ）及びメタノール（６．６７ ｍＬ）の混合物に対し、氷冷撹拌下、トリフルオロ酢酸エチル（０．４４ ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温に昇温し、同温で５時間撹拌した。反応を水（１０ ｍＬ）で停止し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で３回抽出した。回収した有機層を飽和食塩水（５ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させた有機層を濾過後、濃縮し、標記粗化合物ＥＸ８－ＩＭ－１（０．６７１ ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
＜工程２＞ Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド塩酸塩（化合物ＥＸ８－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000123
（実施例Ａ－８）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ８－ＩＭ－１（０．５ ｇ）の１，４－ジオキサン溶液（３．５ ｍＬ）に対し、水冷撹拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（３．５ ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（４０ ｍＬ）を加えた後、析出物を濾過することで、標記化合物ＥＸ８－ＩＭ－２（０．３６ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（４－（（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド）メチル）ベンジル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（化合物ＥＸ８－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000124
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い、シクロヘプテン［ＣＡＳ:６２８－９２－２］から合成したカルボン酸［ＣＡＳ:９１７７５６－４２－４］（ＥＸ８－ＳＭ２、０．１７ ｇ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．２６ ｇ）のアセトニトリル（１．７ ｍＬ）溶液に対し、氷冷撹拌下、（実施例Ａ－８）＜工程２＞で得られたＥＸ８－ＩＭ－２（０．２６ ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５１ ｍＬ）を滴下し、室温で１時間３０分撹拌した。水（５ ｍＬ）を加え反応を停止させた後、酢酸エチル（５ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を飽和食塩水（３ ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させた有機層を濾過後、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１２％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～１００％酢酸エチル）により精製し、標記化合物ＥＸ８－ＩＭ－３（０．１８９ ｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程４＞ Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド（化合物ＥＸ８－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000125
（実施例Ａ－８）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ８－ＩＭ－３（０．１８ ｇ）及びメタノール（１．８ ｍＬ）の混合物に対して、氷冷撹拌下、炭酸カリウム（０．１２６ ｇ）水溶液（０．９ ｍＬ）を滴下し、室温で１７時間３０分撹拌した。メタノールを減圧下で留去し、酢酸エチル（５ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を飽和食塩水（５ ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過後、減圧下で溶媒を留去し、標記粗化合物ＥＸ８－ＩＭ－４（０．１３ ｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２）の合成：
Figure 2023015413000126
１重量％に調整したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ｂ－２）水溶液（５０．８６ ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（０．１１８ ｇ）を加えた。続いて、（実施例Ａ－８）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ８－ＩＭ－４（０．０３５ ｇ）のエタノール（３ ｍＬ）溶液を同温で滴下し、４０度で４時間攪拌した。室温に冷却後、塩化ナトリウム（５００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（１０１．７２ ｍＬ）を加え、３０分間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（２ ｍＬ）で３回洗浄後、減圧下乾燥し、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２（５２１ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－８ｂ）Ｎ－（４－（アミノエチル）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
アルギン酸をＡ－２に変えて（実施例Ａ－８）＜工程５＞と同様の方法にて、標記化合物ＥＸ８－（Ｉ）－Ａ－２（２８５ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－９）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－オキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（９ａ、９ｂ、９ｃ）の合成：
Figure 2023015413000127
（実施例Ａ－９ａ）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
＜工程１＞ ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）カルバメート（ＥＸ９－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000128
市販のｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート（ＥＸ９－ＳＭ１、３．００ ｇ、［ＣＡＳ：５７２６０－７３－８］）のテトラヒドロフラン（１２．０ ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（２．２４ ｍＬ）を滴下した。反応混合物を、室温で１４．５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣にｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（５ ｍＬ）とｎ－ヘプタン（２５ ｍＬ）を加え、トリチュレートした。固体を濾過後、ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－１（４．３６ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド 塩酸塩（ＥＸ９－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000129
（実施例Ａ－９ａ）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－１（０．５０ ｇ）に、ギ酸（３．１ ｍＬ）を加え、室温で２２．５時間撹拌した。ギ酸を留去し、トルエンで共沸した。得られた油状物に塩化水素／メタノールを加え、減圧濃縮した。酢酸エチル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで順次共沸した後、減圧乾燥して、標記粗化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（０．３５ ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（ＥＸ９－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000130
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（ＥＸ８－ＳＭ２、１００ ｍｇ）にエタノール（１．０ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３０４ ｍｇ）、（実施例Ａ－９ａ）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（１５９ ｍｇ）、トリエチルアミン（１５３ μＬ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。水（４ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５ ｍＬ、５ ｍＬ）で抽出した。有機層を、０．５規定－クエン酸（５ ｍＬ）、水（５ ｍＬ×２）、飽和食塩水（３ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～６０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（１０３ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド（ＥＸ９－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000131
（実施例Ａ－９ａ）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（１０３ ｍｇ）のメタノール（１．５５ ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（８９ ｍｇ）の水（５１５ μＬ）溶液を加え、室温で６時間撹拌した。メタノールを減圧下で留去し、水（２ ｍＬ）を加えた後、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１５ ｍＬ、１０ ｍＬ×５）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（７５ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000132
１重量％に調整したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ａ－２）水溶液（３０ ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８４ ｍｇ）、（実施例Ａ－９ａ）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（１７ ｍｇ）のエタノール（３ ｍＬ）溶液、１モル％重曹水（７６ μＬ）を順次加え、３０度で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（０．３ ｇ）を加えた後、エタノール（６０ ｍＬ）を加え、１．５時間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（１０ ｍＬ×５）で洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－（Ｉ）－Ａ－２（２９０ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－９ｂ）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ａ）の合成：
＜工程１＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド 塩酸塩（ＥＸ９－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000133
（実施例Ａ－９ａ）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－１（０．５０ ｇ）を、１，４－ジオキサン（３．０ ｍＬ）に懸濁した。氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（７．０ ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３０．０ ｍＬ）を加え、室温で５０分間撹拌した。固体をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（０．７０ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（ＥＸ９－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000134
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（ＥＸ８－ＳＭ２、３００ ｍｇ）と（実施例Ａ－９ｂ）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－２（３８０ ｍｇ）を用い、（実施例Ａ－９ａ）＜工程３＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（３２２ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド（ＥＸ９－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000135
（実施例Ａ－９ｂ）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－３（３２２ ｍｇ）を（実施例Ａ－９ａ）＜工程４＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（２３８ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ａ）の合成：
Figure 2023015413000136
１重量％に調整したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ｂ－２）水溶液（１２０ ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（３３５ ｍｇ）、（実施例Ａ－９ｂ）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（６８ ｍｇ）のエタノール（１２ ｍＬ）溶液、１モル％重曹水（３０３ μＬ）を順次加え、３０度で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（１．２ ｇ）を加えた後、エタノール（２４０ ｍＬ）を加え、１．５時間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（２０ ｍＬ×５）で洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ａ（１．１６ ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－９ｃ）Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ）の合成：
Figure 2023015413000137
１重量％に調整したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ｂ－２）水溶液（１２０ ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１６７ ｍｇ）、（実施例Ａ－９ｂ）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ９－ＩＭ－４（３４ ｍｇ）のエタノール（１２ ｍＬ）溶液、１モル％重曹水（１５１ μＬ）を順次加え、３０度で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（１．２ ｇ）を加えた後、エタノール（２４０ ｍＬ）を加え、１．５時間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノール（２０ ｍＬ×５）で洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ９－（Ｉ）－Ｂ－２ｂ（１．１２ ｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１０）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000138
＜工程１＞ ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（クロロメチル）ベンザミド）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１０－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000139
ＥＸ５－ＳＭ（４－（クロロメチル）ベンゾイル クロリド、０．５０ ｇ）をテトラヒドロフラン（５．０ ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－アミノエトキシ）エチル）カルバメート（０．５４ ｇ、［ＣＡＳ：１２７８２８－２２－２］）とジイソプロピルエチルアミン（０．９２ ｍＬ）のテトラヒドロフラン（５．０ ｍＬ）溶液を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（２５ ｍＬ）と水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘプタンの混合溶媒でトリチュレートした後、得られた固体をろ取し、ｎ－ヘプタンで洗浄して、標記化合物ＥＸ１０－ＩＭ－１（０．７９ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（アジドメチル）ベンザミド）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１０－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000140
アジ化ナトリウム（１０９ ｍｇ）をジメチルスルホキシド（７．５ ｍＬ）に溶かし、（実施例Ａ－１０）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１０－ＩＭ－１（５００ ｍｇ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、氷水冷下、水（１５ ｍＬ）を加え、析出した固体をろ過し、水洗した。得られた固体を乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－ＩＭ－２（４７８ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド 塩酸塩（ＥＸ１０－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000141
（実施例Ａ－１０）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１０－ＩＭ－２（４００ ｍｇ）に、氷水冷下で、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（２．８ ｍＬ）を加え、室温で１．７５時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（８．４ ｍＬ）を加え、ガム状物を得た。上清をデカントにて除き、ジイソプロピルエーテルでデカント洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－ＩＭ－３（２９８ ｍｇ）をベージュ色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000142
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２ ｍｇ）、（実施例Ａ－１０）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１０－ＩＭ－３（３０ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１５１ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（４００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（８０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－（ＩＩ）－Ａ－２（４０８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１１）Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１１－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000143
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（４－（クロロメチル）ベンザミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１１－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000144
ＥＸ５－ＳＭ（４－（クロロメチル）ベンゾイル クロリド、０．５０ ｇ）をテトラヒドロフラン（５．０ ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（０．６６ ｇ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．９２ ｍＬ）のテトラヒドロフラン（５．０ ｍＬ）溶液を滴下し、室温で４．７時間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（２５ ｍＬ）と水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。有機層を半飽和重曹水（１０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣にｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルを加え、固体をろ過にて除いた。得られたろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～酢酸エチル）で精製して、標記化合物ＥＸ１１－ＩＭ－１（０．８２ ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（４－（アジドメチル）ベンザミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１１－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000145
（実施例Ａ－１１）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１１－ＩＭ－１（０．８２ ｇ）のジメチルスルホキシド（１１．７ ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（１５２ ｍｇ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。反応液に、氷水冷下、水（２３ ｍＬ）を加え、同温にて３０分撹拌した。酢酸エチル（３０ ｍＬ、１０ ｍＬ）で抽出し、有機層を水（１０ ｍＬ×３）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、析出した固体をろ過し、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１１－ＩＭ－２（０．８０ ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド 塩酸塩（ＥＸ１１－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000146
（実施例Ａ－１１）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１１－ＩＭ－２（０．８０ ｇ）に、氷水冷下で、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（５．３ ｍＬ）を加え、室温で１．７５時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１６．０ ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。溶媒をデカントにより除き、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた残渣を減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１１－ＩＭ－３（０．７３ ｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－（アジドメチル）ベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１１－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000147
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２ ｍｇ）、（実施例Ａ－１１）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１１－ＩＭ－３（３８ ｍｇ）のエタノール（４．０ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１５１ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（０．４ ｇ）を加えた後、エタノール（８０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１１－（ＩＩ）－Ａ－２（４１６ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１２）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－６－（アジドメチル）ニコチンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１２－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000148
＜工程１＞ メチル ６－（アジドメチル）ニコチナート（ＥＸ１２－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000149
文献公知の方法（Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．（２０１２）５１：５８５２－５８５６）を参考に、市販のメチル ６－（ヒドロキシメチル）ニコチナート［ＣＡＳ：５６０２６－３６－９］（ＥＸ１２－ＳＭ１、０．５ ｇ）及びテトラヒドロフラン（５ ｍＬ）の混合物に対し、氷冷撹拌下、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（０．６８ ｇ）及びトリエチルアミン（０．６３ ｍＬ）を加えた。この反応混合物を室温で２０時間３０分撹拌した後、同温で、アジ化ナトリウム（０．２９ ｇ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチル（１０ ｍＬ）及び水（１０ ｍＬ）を加え、反応液を希釈した後、水層を酢酸エチル（１０ ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過後、減圧下で濃縮することで粗生成物を得た。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で生成することで、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－１（０．３４ ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
＜工程２＞６－（アジドメチル）ニコチン酸（ＥＸ１２－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000150
（実施例Ａ－１２）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－１（０．３４２ ｇ）及びメタノール（６．８４ ｍＬ）の混合物に対し、１モル濃度－水酸化リチウム・一水和物（５．３４ ｍＬ）を室温で加え、同温で３０分撹拌した。反応終了後、酢酸（０．４１ ｍＬ）を加え、反応液を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル～酢酸エチル／メタノール）で精製し、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－２（０．２８ ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
＜工程３＞ ｔｅｒｔ－ブチル （２－（２－（６－（アジドメチル）ニコチンアミド）エトキシ）エチル）カルバマート（ＥＸ１２－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000151
（実施例Ａ－１２）＜工程２＞で得られた化合物１２－ＩＭ－２（１００ ｍｇ）、市販のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－（２－アミノエトキシ）エチルアミン［ＣＡＳ：１２７８２８－２２－２］（１０８．０７ μＬ）及びアセトニトリル（２０００ μＬ）の混合物に対し、氷冷撹拌下、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（２１３．４３ ｍｇ）及びトリエチルアミン（１５６．４８ μＬ）を加え、室温で１時間４５分撹拌した。その後、室温撹拌下、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－（２－アミノエトキシ）エチルアミン（５４ μＬ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（１０６．７ ｍｇ）を加え、同温にて１７時間撹拌した。水（５ ｍＬ）を加え反応を停止させ、酢酸エチル（１０ ｍＬ）を加えた。水層を酢酸エチル（１０ ｍＬ）で３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過後、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－３（１８７ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）６－（アジドメチル）ニコチンアミド ２塩酸塩（ＥＸ１２－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000152
（実施例Ａ－１２）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－３（０．１８７ ｇ）及び１，４－ジオキサン溶液（１．３１ ｍＬ）の混合物に対し、水冷撹拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．３１ ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（２０ ｍＬ）を加えた後、析出物を濾過することで、標記化合物ＥＸ１２－ＩＭ－４（０．１６ ｇ）をオフホワイト色固体として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－６－（アジドメチル）ニコチンアミド基導入アルギン酸の合成（ＥＸ１２－（ＩＩ）－Ａ－２）：
Figure 2023015413000153
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（３９．５５ ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（９１．５２ ｍｇ）及び１モル濃度－重曹水（１８３ μＬ）を加えた。続いて、（実施例Ａ－１２）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ１２－ＩＭ－４（３０ ｍｇ）、水（１ ｍＬ）及びエタノール（１ ｍＬ）の混合物を同温で加え、４０℃で４時間攪拌した。塩化ナトリウム（４００ ｍｇ）を加えた後、エタノール（７９．１ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１２－（ＩＩ）－Ａ－２（３７８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１３）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000154
＜工程１＞ ｔeｒｔ－ブチル（２－（２－（４－アジドベンザミド）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１３－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000155
４－アジド安息香酸（ＥＸ７－ＳＭ、３００ ｍｇ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－アミノエトキシ）エチル）カルバメート［ＣＡＳ：１２７８２８－２２－２］（３７６ ｍｇ）をアセトニトリル（６．０ ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．７７ ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０７ μＬ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（１０ｍL）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残さを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～７０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ１３－ＩＭ－１（６７３ ｍｇ）を淡黄色ガム状物として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド 塩酸塩（ＥＸ１３－ＩＭ－2）の合成：
Figure 2023015413000156
（実施例Ａ－１３）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１３－ＩＭ－１、６７０ ｍｇ）に、氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（４．７ ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１４．０ ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。得られた固体をろ取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－ＩＭ－２（６０４ ｍｇ）を淡ベージュ色固体として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000157
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２ ｍｇ）、（実施例Ａ－１３）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１３－ＩＭ－２（３１ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（１５１ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（０．４ ｇ）を加えた後、エタノール（８０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－（ＩＩ）－Ａ－２（４００ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１４）Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－アジドベンズアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000158
＜工程１＞ ｔeｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（４－アジドベンザミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＥＸ１４－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000159
４－アジド安息香酸（ＥＸ７－ＳＭ、３００ ｍｇ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（４５７ ｍｇ）をアセトニトリル（６．０ ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．７７ ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０７ μＬ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（１０ｍL）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残さを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（４０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～９０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ１４－ＩＭ－１（６０３ ｍｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド 塩酸塩（ＥＸ１４－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000160
（実施例Ａ－１４）＜工程１＞で得られた化合物（ＥＸ１４－ＩＭ－１、６００ ｍｇ）に、氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン溶液（４．２ ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテル（１２．０ ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した。溶媒をデカントにより除き、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた残渣を減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１４－ＩＭ－２（５９６ ｍｇ）をベージュ色ガム状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－４－アジドベンザミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４－（ＩＩ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000161
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２ ｍｇ）、（実施例Ａ－１４）＜工程２＞で得られた化合物ＥＸ１４－ＩＭ－２（４５ ｍｇ）のエタノール（４．０ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１５１ μＬ）を加え、３０℃で３時間攪拌した。塩化ナトリウム（０．４ ｇ）を加えた後、エタノール（８０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１４－（ＩＩ）－Ａ－２（４０８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ａ－１５）Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－オキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000162
＜工程１＞ ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）エトキシ）エチルカルバメート（ＥＸ１５－ＩＭ－１）の合成：
Figure 2023015413000163
ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート（ＥＸ９－ＳＭ１、１．０ ｇ、［ＣＡＳ：５７２６０－７３－８］）のテトラヒドロフラン（４．０ ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（０．６ ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で、３．５時間撹拌した。反応液を、減圧下濃縮して、標記粗化合物ＥＸ１５－ＩＭ－１（１．５ ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド 塩酸塩（ＥＸ１５－ＩＭ－２）の合成：
Figure 2023015413000164
（実施例Ａ－１５）＜工程１＞で得られた化合物ＥＸ１５－ＩＭ－１（１．５ ｇ）に、氷水冷下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン溶液（１０．３ ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３０ ｍＬ）を加え、３０分間室温で撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、ジイソプロピルエーテルで共沸した後、減圧乾燥して、標記化合物ＥＸ１５－ＩＭ－２（１．３ ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞ Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド）エトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（ＥＸ１５－ＩＭ－３）の合成：
Figure 2023015413000165
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（ＥＸ８－ＳＭ２、３００ ｍｇ）、（実施例Ａ－１５）＜工程２＞で得られた化合物（４４３ ｍｇ）をアセトニトリル（６．０ ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（０．７５ ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９２０ μＬ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。有機層を、水（１０ｍL）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン～７０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物ＥＸ１５－ＩＭ－３（４６９ ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程４＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド（ＥＸ１５－ＩＭ－４）の合成：
Figure 2023015413000166
（実施例Ａ－１５）＜工程３＞で得られた化合物ＥＸ１５－ＩＭ－３（２２０ ｍｇ）のメタノール（３．０ ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１０３ ｍｇ）の水（０．９９ ｍＬ）溶液を加え、室温で４．５時間撹拌した。メタノールを減圧下で留去し、水（２ ｍＬ）を加えた後、食塩で飽和させた。酢酸エチル（１５ ｍＬ、１０ ｍＬ×４）抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル（１０ ｍＬ）に溶かし、不溶物をろ過して除いた後、減圧濃縮して、標記粗化合物ＥＸ１５－ＩＭ－４（１４０ ｍｇ）を淡黄色ガム状物として得た。
＜工程５＞ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－（Ｉ）－Ａ－２）の合成：
Figure 2023015413000167
１重量％に調整したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製、Ａ－２）水溶液（４０ ｍＬ）に、室温撹拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１２ ｍｇ）、（実施例Ａ－１５）＜工程４＞で得られた化合物ＥＸ１５－ＩＭ－４（３０ ｍｇ）のエタノール（４．０ ｍＬ）溶液、１モル％重曹水（１０１ μＬ）を順次加え、３０℃で３時間攪拌した。反応液に、塩化ナトリウム（０．４ ｇ）を加えた後、エタノール（８０ ｍＬ）を加え、３０分間攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶かし、凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１５－（Ｉ）－Ａ－２（４１０ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１）
３－アジドプロピルアミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000168
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５６ ｍｇ）、市販の３-アジドプロピルアミン［ＣＡＳ：８８１９２－１９－２］（１－１、５．１ ｍｇ）のエタノール（２ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（５０ μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２ ｇ）、エタノール（４０ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１－Ａ２（１８７ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例２）
２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ２－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000169
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１０．９ ｍＬ）に、氷冷攪拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５５．８３ ｍｇ）及び１モル濃度－重曹水（２５２．１７ μＬ）を加えた。続いて、市販の２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン［ＣＡＳ：１６６３８８－５７－４］（２－１、２６．３６ ｍｇ）のエタノール（１ ｍＬ）及び水（１ ｍＬ）溶液を加え、室温で１５時間攪拌した後、塩化ナトリウム（１００ ｍｇ）、エタノール（２１．８ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、標記化合物ＥＸ２－Ａ２（９９ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例３）
２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000170
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（３－アジドプロピル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（３－２）の合成：
Figure 2023015413000171
市販の３-アジドプロピルアミン［ＣＡＳ：８８１９２－１９－２］（１－１、４１ μＬ）、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)グリシン［ＣＡＳ：４５３０－２０－５］（３－１）のエタノール（２ ｍＬ）溶液に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）１９７ ｍｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた油状物をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０ ｍＬ）に溶解し、飽和重曹水、水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物３－２（９５ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）アセタミド 塩酸塩（３－３）の合成：
Figure 2023015413000172
（実施例３）＜工程１＞で得られた化合物（３－２、９５ ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（６６５ μＬ）を加えた後、室温で１時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（２．０ ｍＬ）を加え、減圧濃縮した。得られた油状物を、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルでデカント洗浄後、減圧濃縮して、標記化合物３－３（６２ ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程３＞
２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ３－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000173
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５６ ｍｇ）、（実施例３）＜工程２＞で得られた化合物（３－３、１０．６ ｍｇ）のエタノール（２ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（７６ μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２ ｇ）、エタノール（４０ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ３－Ａ２（２０７ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例４）
３－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ４－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000174
＜工程１＞
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（（３－アジドプロピル）アミノ）－３－オキソプロピル）カルバメート（４－２）の合成：
Figure 2023015413000175
市販の３-アジドプロピルアミン［ＣＡＳ：８８１９２－１９－２］（１－１、４１ μＬ）、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β－アラニン［ＣＡＳ：３３０３－８４－２］（４－１）のエタノール（２ ｍＬ）溶液に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）１４６ ｍｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物４－２（１２４ ｍｇ）を白色ワックス状物として得た。
＜工程２＞２－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）プロパンアミド 塩酸塩（４－３）の合成：
Figure 2023015413000176
（実施例４）＜工程１＞で得られた化合物（４－２、１２４ ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（８６８ μＬ）を加えた後、室温で１時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（２．６ ｍＬ）を加え、減圧濃縮した。得られた油状物を、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルでデカント洗浄後、減圧濃縮して、標記化合物４－３（９３ ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程３＞３－アミノ－Ｎ－（３－アジドプロピル）プロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ４－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000177
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２０ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（５６ ｍｇ）、（実施例４）＜工程２＞で得られた化合物（４－３、１２．６ ｍｇ）のエタノール（２ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（７６ μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２ ｇ）、エタノール（４０ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ４－Ａ２（２１１ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例５）
Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－アジドアセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ５－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000178
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（４－（（２－アジドアセタミド）メチル）ベンジル）カルバメート（５－２）の合成：
Figure 2023015413000179
市販の２-アジド酢酸［ＣＡＳ：１８５２３－４８－３］（１－１、４１ μＬ）から、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２０１７）， １９（２３）， ６４００－６４０３に記載の方法と同様に調整したアジド酢酸クロリドの塩化メチレン（１．０ｍＬ）溶液を、市販の１－（Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチトキシカルボニル－アミノメチル）－４－（アミノメチル）ベンゼン［ＣＡＳ：１０８４６８－００－４］（５－１、１００ ｍｇ）、トリエチルアミン（１１８ μＬ）の塩化メチレン（１．０ ｍＬ）溶液に、氷水冷下で加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（２０ ｍＬ）、水（５ ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和重曹水、水、飽和食塩水で順次洗浄した。不溶物をろ去し、ろ液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル／ｎ－ヘプタンでトリチュレートした。得られた固体をろ取し、標記化合物５－２（９１ ｍｇ）を薄いベージュ固体として得た。
＜工程２＞Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－アジドアセトアミド 塩酸塩（５－３）の合成：
Figure 2023015413000180
（実施例５）＜工程１＞で得られた化合物（５－２、９１ ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（６３７ μＬ）を加えた後、１，４－ジオキサン（６２７ μＬ）を追加した後、室温で３．５時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３．８ ｍＬ）を加え、１０分間撹拌した。得られた固体をろ過して、標記化合物５－３（６２ ｍｇ）をベージュ固体として得た。
＜工程３＞Ｎ－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－アジドアセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ５－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000181
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２５ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（７０ ｍｇ）、（実施例５）＜工程２＞で得られた化合物（５－３、１６．１ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（９５ μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２５ ｇ）、エタノール（５０ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ５－Ａ２（２３９ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例６）
２－（４－アジドフェノキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ６－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000182
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アジドフェノキシ）エチル）カルバメート（６－３）の合成
Figure 2023015413000183
市販の４－アジドフェノール［ＣＡＳ：２４５４１－４３－３］（６－１、０．３ ｇ）、市販のｔｅｒｔ－ブチル （２－ブロモエチル）カルバメート［ＣＡＳ：３９６８４－８０－５］（６－２、０．６ ｇ）及びＮ－メチルピロリドン（３ ｍＬ）の混合物に対し、室温で炭酸カリウム（０．６１ ｇ）を加えた。反応混合物を８０℃で６時間３０分攪拌し、室温まで冷却した後、水（１０ ｍＬ）及びメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）を加えた。生じた懸濁液をセライトろ過し、残留物をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ ｍＬ）で２回洗浄した。ろ液を分離し、有機層を減圧下で濃縮することで粗生成物を得た。この粗生成物をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）に溶解させ、１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５ ｍＬ）で２回、水（５ ｍＬ）で２回、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで標記化合物６－３（０．４１１ ｇ）を紫色の油状物として得た。
＜工程２＞２－（４－アジドフェノキシ）エタン‐１－アミン 塩酸塩（６－４）の合成
Figure 2023015413000184
（実施例６）＜工程１＞で得られた化合物（６－３、０．４１ ｇ）及び１，４－ジオキサン（２．８７ ｍＬ）の混合物に対し、水冷攪拌下、４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（２．８７ ｍＬ）を加えた後、室温で１８時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（４０ ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で３０分攪拌した。析出物をろ過し、回収した固体を減圧乾燥して、標記化合物６－４（０．２８３４ ｇ）を淡い紫色固体として得た。
＜工程３＞２－（４－アジドフェノキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ－６－Ａ２）の合成
Figure 2023015413000185
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２９．６６ ｍＬ）に、室温で４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（９１．５２ ｍｇ）及び１モル濃度－重曹水（６８．６３ μＬ）を加えた。続いて、（実施例６）＜工程２＞で得られた化合物（６－４、１４．７３ ｍｇ）の水（１ ｍＬ）及びエタノール（１ ｍＬ）溶液を室温にて加え、同温で４２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（３００ ｍｇ）、エタノール（５９．３ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ６－Ａ２（２６９ ｍｇ）をピンク色固体として得た。
（実施例９ａ、９ｂ）
Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（２－シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９ａ－Ａ２、ＥＸ９ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure 2023015413000186
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－オキソ－２－（（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）アミノ）エチル）カルバメート（９－１）の合成：
Figure 2023015413000187
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）グリシン（９１ ｍｇ、［ＣＡＳ：４５３０－２０－５］）、及び（実施例Ａ－９ｂ）＜工程１＞と同様な方法で得られた化合物（ＥＸ９－ＩＭ－２、１００ ｍｇ）をアセトニトリル（３．０ ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（２１７ ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２８１ μＬ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（１５ ｍＬ）、水（５ ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：４０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル）で精製し、標記化合物９－１（１８０ ｍｇ）を薄いベージュアモルファスとして得た。
＜工程２＞Ｎ－（２－（２－アミノアセタミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド 塩酸塩（９－２）の合成：
Figure 2023015413000188
（実施例９）＜工程１＞で得られた化合物（９－１、１８０ ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．２ ｍＬ）を加えた後、室温で０．８時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３．６ ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。得られた固体をろ過して、標記化合物９－２（１１４ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（９－３）の合成：
Figure 2023015413000189
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、８０ ｍｇ）、（実施例９）＜工程２＞で得られた化合物（９－２、１１０ ｍｇ）に、エタノール（１．６ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２１９ ｍｇ）、トリエチルアミン（６７ μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、水（３．２ ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した後、固体をろ過し、水で洗浄した。得られた固体に、酢酸エチル／エタノール（１／１、１０ ｍＬ）を加え、不溶物をろ去した。ろ液を減圧濃縮して、標記化合物９－３（１０１ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（アミノエチル）－２－（２－（シクロオクト－イン－１－イロキシ）アセタミド）アセタミド（９－４）の合成：
Figure 2023015413000190
（実施例９）＜工程３＞で得られた化合物（９－３、６０ ｍｇ）のメタノール（１．８ ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（５９ ｍｇ）の水（０．３ ｍＬ）溶液を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、水（２ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１５ｍＬ，１０ ｍＬ×４）で抽出し、抽出層を減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（１０ ｍＬ）、エタノール（１ｍＬ）を加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物９－４（４９ ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程５－１＞Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（２－シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９ａ－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000191
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（３８ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１０６ ｍｇ）、（実施例９）＜工程４＞で得られた化合物（９－４、３０．３ ｍｇ）のエタノール（３．８ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（９６ μＬ）を加えた。３０℃で３．２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．３８ ｇ）、エタノール（７６ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ９ａ－Ａ２（３８１ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程５－２＞Ｎ－（２－アミノエチル）－２－（２－シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ９ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure 2023015413000192
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（３８ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（６４ ｍｇ）、（実施例９）＜工程４＞で得られた化合物（９－４、１８．２ ｍｇ）、１モル濃度－重曹水（５８ μＬ）を加えた。３０℃で３．２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．３８ ｇ）、エタノール（７６ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ９ｂ－Ｂ２（３６６ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１０）
Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）プロパナミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000193
＜工程１＞ｔｅｒｔ－ブチル（３－オキソ－３－（（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）アミノ）プロピル）カルバメート（１０－１）の合成：
Figure 2023015413000194
市販のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)-β-アラニン（１１３ ｍｇ、［ＣＡＳ：３３０３－８４－２］）、（実施例Ａ－９ｂ）＜工程１＞と同様な方法で得られた化合物（ＥＸ９－ＩＭ－２、１００ ｍｇ）をアセトニトリル（３．３ ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（２６１ ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３１９ μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（１５ ｍＬ）、水（５ ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ ｍＬ）でトリチュレートした。固体をろ取し、酢酸エチル（２０ ｍＬ）に溶解した。有機層を、１規定－クエン酸、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０ ｍＬ）でトリチュレートした後、固体をろ取し、標記化合物１０－１（８０ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞３－アミノ－Ｎ－（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）プロパナミド 塩酸塩（１０－２）の合成：
Figure 2023015413000195
（実施例１０）＜工程１＞で得られた化合物（１０－１、８０ ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（１．１ ｍＬ）を加えた後、室温で２時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（３．４ ｍＬ）を加え、１．５時間撹拌した。得られた固体をろ過して、標記化合物１０－２（６１ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）－Ｎ－（２－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）エチル）プロパナミド（１０－３）の合成：
Figure 2023015413000196
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、４４ ｍｇ）、（実施例１０）＜工程２＞で得られた化合物（１０－２、６１ ｍｇ）に、エタノール（１．２ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１１５ ｍｇ）、トリエチルアミン（３９ μＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液に、水（３．７ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５ ｍL, ５ ｍL）で抽出した。有機層を、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム乾燥後、減圧濃縮した。得られた固体に、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（１０ ｍＬ）を加え、トリチュレートし、ろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（８０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル→２０％メタノール／酢酸エチル）で精製して、標記化合物１０－３（６０ ｍｇ）を淡黄色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（アミノエチル）－３－（２－（シクロオクト－イン－１－イロキシ）アセタミド）プロパナミド（１０－４）の合成：
Figure 2023015413000197
（実施例１０）＜工程３＞で得られた化合物（１０－３、６０ ｍｇ）のメタノール（３．０ ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（４２ ｍｇ）の水（０．３ ｍＬ）溶液を加え、室温で３時間撹拌後、さらに、炭酸カリウム（４２ ｍｇ）の水（０．３ ｍＬ）溶液を加え、室温で１６．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、飽和食塩水（２ｍＬ）を加え、さらに塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１５ｍＬ，１０ ｍＬ×４）で抽出し、抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（５ ｍＬ）と数滴のメタノールを加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物１０－４（３１ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）プロパナミド基導入アルギン酸（ＥＸ１０－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000198
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４１ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（114 ｍｇ）、（実施例１０）＜工程４＞で得られた化合物（１０－４、３０．５ ｍｇ）のエタノール（４．１ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１０３ μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．４１ ｇ）、エタノール（８２ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１０－Ａ２（４０６ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１１ａ、１１ｂ）
２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１１ａ－Ａ２、ＥＸ１１ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure 2023015413000199
＜工程１＞Ｅ－Ｎ－（２－（（２－ブロモシクロオクト－２－エン－１－イル）オキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（１１－３）の合成
Figure 2023015413000200
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したジブロモ体（１１－１、１ ｇ）及び文献公知の方法（国際公開第２０１５／１４０８０７号パンフレット）に従い合成したアルコール体（１１－２、５．２８ ｇ）の混合物に対し、室温でジクロロメタン（２ ｍＬ）を加えた。内温を室温に保ちながら、反応容器をアルミホイルで包み、光から保護した。続いて、室温でトリフルオロメタンスルホン酸銀（１．９２ ｇ）を一度に加え、同温にて１時間攪拌した。攪拌後、氷冷下で飽和食塩水（５ ｍＬ）を加え、析出した銀塩をセライトろ過により除去し、残留物をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０ ｍＬ）で洗浄した。ろ液を分離し、有機層を水（５ ｍＬ）で２回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮することで粗生成物を得た。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－へプタン／酢酸エチル）で精製し、化合物１１－３（０．４６ ｇ）を含む画分を得た。
＜工程２＞２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミン（１１－４）の合成
Figure 2023015413000201
（実施例１１）＜工程１＞で得られた化合物（１１－３、０．４６ ｇ）を含む画分及びジメチルスルホキシド（１．３８ ｍＬ）の混合物に対し、水冷攪拌下、２８％ナトリウムメトキシドメタノール溶液（１．８２ ｍＬ）を加え、室温で１６時間攪拌した。水（１０ ｍＬ）を加え反応を停止させ、メタノールを減圧下で濃縮した。生じた溶液をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮することで標記化合物１１－４（０．１９６ ｇ）の粗生成物を褐色油状物として得た。
＜工程３－１＞２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１１ａ－Ａ２）の合成
Figure 2023015413000202
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（６９．２ ｍＬ）に、室温で４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２１３．５５ ｍｇ）を加えた。続いて、（実施例１１）＜工程２＞で得られた化合物（１１－４、２６．７８ ｍｇ）の水（１ ｍＬ）及びエタノール（１ ｍＬ）溶液を室温にて加え、同温で２４時間攪拌した後、塩化ナトリウム（７００ ｍｇ）、エタノール（１３８．４ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１１ａ－Ａ２（６６１ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３－２＞２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１１ｂ－Ｂ２）の合成
Figure 2023015413000203
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（７０．１ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２１６．４ ｍｇ）及び（実施例１１）＜工程２＞で得られた化合物（１１－４、２７．１４ ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１１－Ｂ２（６４８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１２）
２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１２－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000204
＜工程１＞２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル）アセタミド（１２－２）の合成：
Figure 2023015413000205
市販の２－（２－アミノエトキシ）エタノール［ＣＡＳ：９２９－０６－６］（１２－１、２．０ ｍＬ）のテトラヒドロフラン（８．０ ｍＬ）溶液に、２，２，２－トリフルオロ酢酸エチル（２．５ ｍＬ）を、５分かけて滴下した後、室温で２０時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチル（３０ ｍＬ）、水（１０ ｍＬ）を加え、分液した。水層を酢酸エチル（１０ ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を、水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物１２－２（３．７ ｇ）を無色油状物として得た。
＜工程２＞（Ｅ）－Ｎ－（２－（２－（（２－ブロモシクロオクト－２－エン－１－イル）オキシ）エトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１２－３）の合成：
Figure 2023015413000206
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したジブロモ体（１１－１、０．３ ｇ）を塩化メチレン（０．５４ ｍＬ）に溶解し、アルミホイル遮光下、（実施例１２）＜工程１＞で得られた化合物（１２－２、１．８６ ｇ）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（０．５２ ｇ）を加えた。遮光下、室温で１．５時間撹拌後、反応液に、氷水冷下、飽和重曹水（２．０ ｍＬ）、飽和食塩水（３．０ ｍＬ）を順次加えた。固体をセライトにてろ去し、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（１０ ｍＬ×３）洗浄した。ろ液を分液し、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物１２－３（４２４ ｍｇ）を薄い茶色油状物として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセタミド（１２－４）の合成：
Figure 2023015413000207
（実施例１２）＜工程２＞で得られた化合物（１２－３、１００ ｍｇ）を、テトラヒドロフラン（０．７ ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．７ ｍＬ）に溶解した。６０％水素化ナトリウム（２１ ｍｇ）を、氷水下で加え、同温で３時間撹拌した。６０％水素化ナトリウム（１０ ｍｇ）を加え、室温で１時間、さらに６０％水素化ナトリウム（１０ ｍｇ）を加え、室温で２０時間撹拌した。水（３ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５ ｍＬ、１０ ｍＬ）で抽出し、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン→５０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン）で精製して、標記化合物１２－４（３７ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程４＞２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（１２－５）の合成：
Figure 2023015413000208
（実施例１２）＜工程３＞で得られた化合物（１２－４、３７ ｍｇ）のメタノール（５５５ μＬ）溶液に、炭酸カリウム（５０ ｍｇ）の水（１８５ μＬ）溶液を加え、室温で１７時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、水（１ ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１０ ｍＬ×４）で抽出し、抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（１０ ｍＬ）と数滴のメタノールを加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物１２－５（３０ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エトキシ）エタン－１－アミノ基導入アルギン酸（ＥＸ１２－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000209
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（５２ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４５ ｍｇ）、（実施例１２）＜工程４＞で得られた化合物（１２－５、２９ ｍｇ）のエタノール（５．２ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（１３１ μＬ）を加えた。３０℃で３．２時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．５２ ｇ）、エタノール（１０４ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１２－Ａ２（５２２ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１３）
３－アミノ－Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）プロパナミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000210
＜工程１＞３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパン酸（１３－２）の合成：
Figure 2023015413000211
市販のβ－アラニン［ＣＡＳ：１０７－９５－９］（１３－１、２．０ ｇ）をメタノール（４０．０ ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３．３ ｍＬ）を加えた。水冷下で２，２，２－トリフルオロ酢酸（３．４ ｍＬ）を５分間で滴下後、室温で２０．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、水（２０ ｍＬ）を加え、１規定－塩酸でｐＨ４に調整した。酢酸エチル（１００ ｍＬ×２、５０ ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して、標記化合物１３－２（２．９ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパナミド）エトキシ）エチル）カルバメート（１３－３）の合成：
Figure 2023015413000212
（実施例１３）＜工程１＞で得られた化合物（１３－２、４００ ｍｇ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート（８－１、４４１ ｍｇ、［ＣＡＳ：５７２６０－７３－８］）のエタノール（４．０ ｍＬ）溶液に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（８９７ ｍｇ）を加え、３．５時間撹拌した。反応液に、水（５ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ、１０ ｍＬ）で抽出後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル）で精製して、標記化合物１３－３（４５１ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパナミド 塩酸塩（１３－４）の合成：
Figure 2023015413000213
（実施例１３）＜工程２＞で得られた化合物（１３－３、４５１ ｍｇ）に、氷水冷下４規定－塩化水素／１，４－ジオキサン（３．１６ ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液に、ジイソプロピルエーテル（６．４ ｍＬ）を加え、減圧濃縮して、標記化合物１３－４（４３３ ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル－３－（２，２，２－トリフルオロアセタミド）プロパナミド（１３－５）の合成：
Figure 2023015413000214
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、１１１ ｍｇ）、（実施例１３）＜工程３＞で得られた化合物（１３－４、２１５ ｍｇ）に、エタノール（１．７ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２５３ ｍｇ）、トリエチルアミン（１０２ μＬ）を加え、室温で２１時間撹拌した。反応液に、水（５ ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５ ｍL）で抽出した。有機層を、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ｎ－ヘプタン→酢酸エチル→１５％メタノール／酢酸エチル）で精製して、標記化合物１３－５（３５ ｍｇ）を無色油状物として得た。
＜工程５＞３－アミノ－Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）プロパナミド（１３－６）の合成：
Figure 2023015413000215
（実施例１３）＜工程４＞で得られた化合物（１３－５、３５ ｍｇ）のメタノール（７００ μＬ）溶液に、炭酸カリウム（３３ ｍｇ）の水（１７５ μＬ）溶液を加え、室温で１６．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、水（２ ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムで飽和させた。酢酸エチル（１０ ｍＬ×５）で抽出し、抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（１０ ｍＬ）と数滴のメタノールを加え、不溶物をろ去した。得られたろ液を減圧濃縮して、標記化合物１３－６（２４ ｍｇ）を無色ガム状物として得た。
＜工程６＞３－アミノ－Ｎ－（２－（２－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセタミド）エトキシ）エチル）プロパナミド基導入アルギン酸（ＥＸ１３－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000216
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２８ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（７８ ｍｇ）、（実施例１３）＜工程５＞で得られた化合物（１３－６、２４ ｍｇ）のエタノール（２．８ ｍL）溶液、１モル濃度－重曹水（７１ μＬ）を加えた。３０℃で３．５時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．２８ ｇ）、エタノール（５６ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１３－Ａ２（２７２ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１４ａ、１４ｂ）
Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４ａ－Ａ２、ＥＸ１４ｂ－Ｂ２）の合成：
Figure 2023015413000217
＜工程１＞Ｎ－（２－ブロモエチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（１４－２）の合成：
Figure 2023015413000218
市販の２－ブロモエチルアミン臭化水素酸塩［ＣＡＳ：２５７６－４７－８］（１４－１、３ ｇ）のメタノール（３０ ｍＬ）溶液に対し、氷冷攪拌下、トリエチルアミン（４．２９ ｍＬ）を加えた。この混合物に対し、同温でトリフルオロ酢酸エチル （１．９２ ｍＬ）を徐々に加え、室温で４２時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧下で濃縮し、水（１０ ｍＬ）を加えた。酢酸エチル（１０ ｍＬ）で３回抽出し、有機層を水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮することで、標記化合物１４－２（２．４５７ ｇ）を淡い褐色固体として得た。
＜工程２＞ｔｅｒｔ－ブチル （４－（２－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）エトキシ）ベンジル）カルバメート（１４－４）の合成
Figure 2023015413000219
市販のｔｅｒｔ－ブチル （４－ヒドロキシベンジル）カルバメート［ＣＡＳ：１４９５０５－９４－２］（１４－３、０．３６ ｇ）、（実施例１４）＜工程１＞で得られた化合物（１４－２、０．４６ ｇ）、ヨウ化カリウム（０．３５ ｇ）及びＮ－メチルピロリドン（３．６ ｍＬ）の混合物に対し、室温で炭酸カリウム（０．４５ ｇ）を加え、１４０℃で５時間攪拌した。反応終了後、室温まで冷却し、水（１０ ｍＬ）で希釈した。メチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１０ ｍＬ）で３回抽出し、有機層を１規定－水酸化ナトリウム水溶液（５ ｍＬ）で２回、水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物１４－４（０．２０２ ｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程３＞Ｎ－（２－（４－（アミノメチル）フェノキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド 塩酸塩（１４－５）の合成
Figure 2023015413000220
（実施例１４）＜工程２＞で得られた化合物（１４－４、０．２ ｇ）を用い、（実施例６）＜工程２＞と同様の操作を実施することで、標記化合物１４－５（０．１４７ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程４＞Ｎ－（２－（４－（（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド）メチル）フェノキシ）エチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（１４－６）の合成
Figure 2023015413000221
文献公知の方法（Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．（２０１８）２２：１０８－１１０）に従い合成したカルボン酸（７－４、５０ ｍｇ）、（実施例１４）＜工程３＞で合成した化合物（１４－５、８１．９６ ｍｇ）及びエタノールの混合物に対し、氷冷攪拌下、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１３７．２２ ｍｇ）及びトリエチルアミン（３８．２５ μＬ）を加え、室温で１時間３０分攪拌した。反応終了後、水（２ ｍＬ）を加え、懸濁液を攪拌し、メチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（０．５ ｍＬ）を加えた。分離した水層をメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ ｍＬ）で２回抽出し、水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥した有機層をろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－へプタン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物１４－６（９９ ｍｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程５＞Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド（１４－７）の合成
Figure 2023015413000222
（実施例１４）＜工程４＞で得られた化合物（１４－６、９９ ｍｇ）及びメタノール（１４８５ μＬ）の混合物に対し、水冷攪拌下、炭酸カリウム（６４．１７ ｍｇ）及び水（４９５ μＬ）を加え、室温で１５時間攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧下で濃縮し、生じた水層を酢酸エチル（５ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５ ｍＬ）及び飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥させた有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで、標記化合物１４－７（６８ ｍｇ）の粗生成物を黄色油状物として得た。
＜工程６－１＞Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４ａ－Ａ２）の合成
Figure 2023015413000223
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４９．４４ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１５２．５４ ｍｇ）及び（実施例１４）＜工程５＞で得られた化合物（１４－７、３７．７９ ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１４ａ－Ａ２（４７９ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程６－２＞Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）－２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１４ｂ－Ｂ２）の合成
Figure 2023015413000224
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）水溶液（４０．０８ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１２３．６６ ｍｇ）及び（実施例１４）＜工程５＞で得られた化合物（１４－７、３０．６４ ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１４ｂ－Ｂ２（３５６ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１５）
２－アミノ－Ｎ－［３－（１１，１２－ジヒドロジベンズ［ｂ，f］アゾシン－５（６H）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000225
＜工程１＞
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル－Ｎ－［３－（１１，１２－ジヒドロジベンズ［ｂ，f］アゾシン－５（６H）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド－２－カルバメート基（１５－２）の合成：
Figure 2023015413000226
市販の３－アミノ－１－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－１－プロパノン［ＣＡＳ：１２５５９４２－０６－３］（１５－１、５０ ｍｇ）、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］グリシン［ＣＡＳ：２９０２２－１１－５］（５４ ｍｇ）をアセトニトリル（１．５ ｍＬ）に溶解した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（７６ ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０ μＬ）を加え、室温で４．５時間撹拌した。反応液に、酢酸エチル（１５ ｍＬ）、水（５ ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、標記化合物１５－２（６３ ｍｇ）を薄いベージュアモルファスとして得た。
＜工程２＞２－アミノ－Ｎ－［３－（１１，１２－ジヒドロジベンズ［ｂ，f］アゾシン－５（６H）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド（１５－３）の合成：
Figure 2023015413000227
（実施例１５）＜工程１＞で得られた化合物（１５－２、６３ ｍｇ）に、ピぺリジン（５６ μＬ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３１５ μＬ）溶液を加え、室温で３０分間攪拌した。反応液に、酢酸エチル（１５ ｍＬ）、水（５ ｍＬ）を加え、分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた固体に、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（５ ｍＬ）を加え、トリチュレートした後、ろ取し、標記化合物１５－３（１０ ｍｇ）を薄いベージュ固体として得た。ろ液から回収し、追加で、標記化合物１５－３（１１ ｍｇ）を淡黄色ガム状物として得た。
＜工程３＞
２－アミノ－Ｎ－［３－（１１，１２－ジヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－３－オキソプロピル］アセタミド基導入アルギン酸（ＥＸ１５－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000228
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（１９ ｍＬ）に、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１０６ ｍｇ）、（実施例１５）＜工程２＞で得られた化合物（１５－３、２１ ｍｇ）のエタノール（１．９ ｍＬ）溶液、１モル濃度－重曹水（４８ μＬ）を加えた。３０℃で３時間攪拌した後、塩化ナトリウム（０．１９ ｇ）、エタノール（３８ ｍＬ）を順次加え、３０分間室温で攪拌した。得られた沈殿をろ取し、エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。得られた固体を水に溶解後凍結乾燥して、標記化合物ＥＸ１５－Ａ２（１８８ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１６）
２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１６－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000229
＜工程１＞（２，２，２－トリフルオロアセチル）グリシン（１６－２）の合成
Figure 2023015413000230
グリシン（１６－１、２ ｇ）をメタノール（１０ ｍＬ）に懸濁させ、４℃まで冷却した。同温にて、トリフルオロ酢酸エチル（３．５ ｍＬ）及びトリエチルアミン（３．７１ ｍＬ）を加え、室温で２３時間攪拌した。反応終了後、１規定－塩酸（２０ ｍＬ）をｐＨ２になるまで徐々に加え、酢酸エチル（１０ ｍＬ）で３回抽出し、水（５ ｍＬ）及び飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧下で濃縮し、淡黄色油状物を得た。得られた油状物を酢酸エチル（２０ ｍＬ）に溶解させ、ｎ－へプタン（１０ ｍＬ）を加えた。この溶液を減圧下で濃縮することで標記化合物１６－２（３．２２ ｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程２＞
Ｎ－（２－（（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（１６－３）の合成
Figure 2023015413000231
化合物１１－４（８０ ｍｇ）及び（実施例１６）＜工程１＞で得られた化合物（１６－２、８１．８３ ｍｇ）の混合物に対し、氷冷攪拌下、エタノール（１６００ μＬ）及び４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（２３９．２１ ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。水（２ ｍＬ）を加え反応を停止させ、メチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。この粗生成物をｎ-ヘプタン（１０ ｍＬ）でトリチュレートし、ろ過及び減圧下で乾燥させることで標記化合物１６－３（９５．１ ｍｇ）を白色固体として得た。
＜工程３＞２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アセトアミド（１６－４）の合成
Figure 2023015413000232
（実施例１６）＜工程２＞で得られた化合物（１６－３、６０ ｍｇ）、メタノール（９００ μＬ）、炭酸カリウム（５１．７８ ｍｇ）及び水（３００ μＬ）を用い、（実施例１４）＜工程５＞と同様の操作を実施することで、標記化合物１６－４（１５ ｍｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程４＞２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）アセトアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１６－Ａ２）の合成
Figure 2023015413000233
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（２９．６６ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（９１．５２ ｍｇ）及び（実施例１６）＜工程３＞で得られた化合物（１６－４、１５ ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１６－Ａ２（２７９ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例１７）
（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニルプロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１７－Ａ２）の合成：
Figure 2023015413000234
＜工程１＞（２，２，２－トリフルオロアセチル）－Ｌ－フェニルアラニン（１７－２）の合成
Figure 2023015413000235
Ｌ－フェニルアラニン［ＣＡＳ：６３－９１－２］（１７－１、２ ｇ）をメタノール（１０ ｍＬ）に溶解させ、４℃まで冷却した。続いて、同温にて、トリフルオロ酢酸エチル（１．５９ ｍＬ）及びトリエチルアミン（１．６９ ｍＬ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応終了後、１規定－塩酸（１０ ｍＬ）をｐＨ１になるまで徐々に加え、懸濁液を３０分攪拌した。懸濁液をろ過し、回収した固体を減圧下で乾燥させることで標記化合物１７－２（２．５３ ｇ）を白色固体として得た。
＜工程２＞（２Ｓ）－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニル－２－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）プロパンアミド（１７－３）の合成
Figure 2023015413000236
化合物１１－４（６０ ｍｇ）及び（実施例１７）＜工程１＞で得られた化合物（１７－２、９３．７ ｍｇ）の混合物に対し、氷冷下、エタノール（１２００ μＬ）及び４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１７９．４１ ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。水（２ ｍＬ）を加え反応を停止させ、メチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ ｍＬ）で３回抽出した。有機層を水（５ ｍＬ）、飽和食塩水（５ ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層をろ過後、減圧下で濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘプタン／酢酸エチル）で精製することで、標記化合物１７－３（５７ ｍｇ）を白色アモルファスとして得た。
＜工程３＞（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニルプロパンアミド（１７－４）の合成
Figure 2023015413000237
（実施例１７）＜工程２＞で得られた化合物（１７－３、５７ ｍｇ）、メタノール（８５５ μＬ）、炭酸カリウム（３８．３９ ｍｇ）及び水（２８５ μＬ）を用い、（実施例１４）＜工程５＞と同様の操作を実施することで、標記化合物１７－４（３５ ｍｇ）を淡黄色油状物として得た。
＜工程４＞（２Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（シクロオクト－２－イン－１－イロキシ）エチル）－３－フェニルプロパンアミド基導入アルギン酸（ＥＸ１７－Ａ２）の合成
Figure 2023015413000238
１重量％に調製したアルギン酸ナトリウム（持田製薬株式会社製：Ａ－２）水溶液（４７．４６ ｍＬ）、４－（４、６－ジメトキシ－１、３、５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（１４６．４４ ｍｇ）及び（実施例１７）＜工程３＞で得られた化合物（１７－４、３４．５３ ｍｇ）を用い、（実施例１１）＜工程３－１＞と同様の操作を行い、標記化合物ＥＸ１７－Ａ２（３８３ ｍｇ）を白色固体として得た。
（実施例Ｐ１～Ｐ７）
下記に示される（実施例Ｐ１）～（実施例Ｐ７）のアルギン酸誘導体を前記実施例に示される方法に準じて合成する製造する。
Figure 2023015413000239
アルギン酸誘導体の物性データ
Figure 2023015413000240
Figure 2023015413000241
中間体化合物のNMRデータ
Figure 2023015413000242
Figure 2023015413000243
Figure 2023015413000244
Figure 2023015413000245
Figure 2023015413000246
Figure 2023015413000247
中間体化合物のLC-Massデータ
Figure 2023015413000248
［実施例Ｆ１－１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ１の製法
図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ１を作製した。細胞は、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いた。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０６細胞／ｍＬ（１×１０７細胞／２５ｍファイバ１本）の細胞を含む抗体産生培地溶液（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を導入して射出することにより、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。流入速度は、マイクロ流体装置１０の導入口からのコア層の流入速度：０．０５ｍＬ／ｍｉｎ；マイクロ流体装置２の導入口からのシェル層の流入速度：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；マイクロ流体装置３の導入口からのＣａＣｌ２溶液の流入速度：５ｍＬ／ｍｉｎとした。
［実施例Ｆ１－２］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ２の製法
実施例Ｆ１－１と同様にして、図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ２を作製した。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（１×１０８細胞／２５ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む抗体産生培地溶液（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭＣａＣｌ２水溶液を導入し、［実施例Ｆ１－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ１－３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ３の製法
実施例Ｆ１－１と同様にして、図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ３を作製した。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度２×１０８細胞／ｍＬ（４×１０８細胞／２５ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む抗体産生培地溶液（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭＣａＣｌ２水溶液を導入し、［実施例Ｆ１－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ１－４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ４の製法
実施例Ｆ１－１と同様にして、図２に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＡ４を作製した。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／５０ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率１／１）を導入し、導入口３から１００ｍＭＣａＣｌ２水溶液を導入し、［実施例Ｆ１－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長５０ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１の製法
図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１を作製した。細胞は、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いた。Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度１×１０８細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／３ｍファイバ１本）の細胞を含む１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ｂ－２ｂの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液中に射出することにより、コア層直径約３００μｍ、外径約５５０μｍ、全長３ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。流入速度は、Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口１からのコア層の流入速度：０．０５ｍＬ／ｍｉｎ；Ｔ字型流体装置ＸＸの導入口２からのシェル層の流入速度：０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。
［実施例Ｆ２－２］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ２の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ２を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／３ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５重量％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５質量％（ｗ／ｗ％）の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約４００μｍ、外径約７５０μｍ、全長３ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／３ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ａ－２ｂ／化学修飾アルギン酸ＥＸ１－（Ｉ）－Ａ－２ｃの比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約４００μｍ、外径約７００μｍ、全長３ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／７ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約２８０μｍ、外径約５８０μｍ、全長７ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－５］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む０．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３３０μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－６］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．０％のメチルセルロース溶液（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３５０μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－７］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３３０μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－８］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（５×１０６細胞／１ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約７００μｍ、全長１ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－９］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２×１０７細胞／６ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約６５０μｍ、全長６ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ２－１０］化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０の製法
実施例Ｆ２－１と同様にして、図３に模式的に示す製造過程にしたがって、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０を作製した。マイクロ流体装置ＸＸの導入口１から、細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬ（２．５×１０７細胞／７ｍファイバ１本）のトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む１．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（持田製薬株式会社製：Ｂ－２）を導入し、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞と基材を射出し、導入口２から、１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ及び１．５ｗ／ｖ％の化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の水溶液（化学修飾アルギン酸ＥＸ３－（ＩＩ）－Ｂ－２ａ／化学修飾アルギン酸ＥＸ８－（Ｉ）－Ｂ－２の比率が１／１）を導入し、Ｔ字型流体装置ＸＸの管内を当該化学修飾アルギン酸の混合溶液にて充填させ、［実施例Ｆ２－１］と同様の操作を実施することで、コア層直径約３００μｍ、外径約６００μｍ、全長７ｍの化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得た。
［実施例Ｆ３－１］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養：

培地組成： G016 培地に下表の各種添加物を加え調製した。

Figure 2023015413000249
１２５ ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－３または実施例Ｆ２－４で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３またはＢ４を入れ、上記表の組成である培地（３０ ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５ ｒｐｍで振とうしながら培養を４週間実施した。２～３日に一回、培地１．８ ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ Ｆｅｅｄ ００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０ ｍＬに保った。培養期間において、ファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数および細胞生存率を計測するともに培養液のトシリズマブ濃度を測定した。トシリズマブ濃度はヒトＩＬ－６ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｃａｔ＃２００－０６ＲＣ）を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３のファイバ培養２８日後の生細胞数は４．８×１０７個、生存率は５９％であり、培養液のトシリズマブ濃度は０．３ｍｇ／ｍＬであった。また、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４ファイバの培養２９日後の生細胞数は１．７×１０７個、生存率は５１％、培養液のトシリズマブ濃度は０．３ｍｇ／ｍＬであった。化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３及びＢ４を用いた培養において、培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。図９は、実施例Ｆ２－３で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ３の培養後（２８日間）の顕微鏡写真であり、図１０は、実施例Ｆ２－４で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ４の培養後（２９日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－２］各種コア材料で構成した化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養：
１２５ ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－５または実施例Ｆ２－６で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５またはＢ６を入れ、上記表の組成である培地（３０ ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５ ｒｐｍで振とうしながら培養を実施した。２～３日に一回、培地１．８ ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ Ｆｅｅｄ ００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０ ｍＬに保った。培養期間において、ファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数および細胞生存率を計測した。実施例Ｆ２－５で作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５の培養１４日後の生細胞数は１．６×１０７個、生存率は７０％であり、また、実施例Ｆ２－６で作製した化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６の培養１４日後の生細胞数は４．４ｘ１０７個、生存率は５７％であった。図１１は、実施例Ｆ２－５で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ５の培養後（１４日間）の顕微鏡写真であり、図１２は、実施例Ｆ２－６で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ６の培養後（１４日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－３］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養温度シフト条件下の培養：
１２５ ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－７で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７を入れ、上記表の組成である培地（３０ ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５ ｒｐｍで振とうしながら培養を実施した。２～３日に一回、培地１．８ ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ Ｆｅｅｄ ００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０ ｍＬに保った。一部の培養フラスコは、培養開始２日後、５日後または７日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。培養期間において、ファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数および細胞生存率を計測するともに培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。
その結果を図５～図７に示す。図５に化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７中の生細胞数を示す。図６に化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７中の細胞生存率を示す。図７に産生された抗体濃度を示す。図１３は、実施例Ｆ２－７で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ７の培養後（２８日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－４］化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いたトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（培養系のファイバ量を変えた培養）：
１２５ ｍＬポリカーボネート製三角フラスコにトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を含む実施例Ｆ２－９で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９を１本、または実施例Ｆ２－１０で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０を２本入れ、上記表の組成である培地（３０ ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５ ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、５日後に培養温度を３０℃とし、同温度にて培養を継続した。この間、２～３日に一回、培養容液のグルコース濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えない範囲で、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ Ｆｅｅｄ ００）の添加、または培養液半量を新鮮培地に交換した。Ｆｅｅｄ液添加および培地交換処理は培養液総量が変わらないように、処理前に培養系から添加液量相当量の培養液を抜いてから行った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。その結果を図８に示す。図８に化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９を１本、化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０を２本での抗体生産累積量を示す。図１４は、実施例Ｆ２－９で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ９の培養後（３３日間）の顕微鏡写真であり、図１５は、実施例Ｆ２－１０で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ１０の培養後（３３日間）の顕微鏡写真である。
［実施例Ｆ３－５］アルギン酸中空マイクロファイバB中でのトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養（細胞周期抑制剤添加）：
１２５ ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例Ｆ２－８で得られた化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８を入れ、上記表の組成である培地（３０ ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、インキュベータ内で１２５ ｒｐｍで振とうしながら培養を開始し、３日後または５日後に吉草酸を終濃度１．５ｍＭまたは３ｍＭ となるように添加した。この培養において、２～３日に一回、培地１．８ ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ液（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ Ｆｅｅｄ ００３）１．８ｍＬを添加し、培地の総量を３０ ｍＬに保った。経時的に培養液のトシリズマブ濃度をＣｅｄｅｘ Ｂｉｏアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティクス社）によりヒトＩｇＧ濃度として測定し、培養開始から７日後及び１４日後にファイバ内のトシリズマブ生産細胞の細胞数、細胞生存率を計測した。培養液に検出されるトシリズマブ産生細胞の濃度は１×１０４細胞／ｍＬ未満であった。図１６は、実施例Ｆ２－８で作製された化学架橋アルギン酸ゲルファイバＢ８の培養後（１４日間）の顕微鏡写真である。
Figure 2023015413000250
ここでは、抗体産生細胞がコア層に含まれた抗体生産用の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ（化学架橋アルギン酸中空マイクロファイバ）が提供される。また、当該化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法、及び当該化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いた抗体の培養方法を提供することができる。
ａ：アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径
ｂ：アルギン酸ゲルファイバのシェル層の厚さ
ｃ：アルギン酸ゲルファイバの外径
４：シェル層
５：コア層
６：抗体産生細胞
１０：マイクロ流体装置
１：抗体産生細胞６を含む基材の導入口
２：式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の導入口
３：塩化カルシウム溶液の導入口
２０： 化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
４０：導入管
５０：出口
ＸＸ：Ｔ字型流体装置
１：抗体産生細胞６を含む基材の導入口
２：式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の導入口
３：出口
ＤＤ：塩化カルシウム溶液を含むビーカー等
ＣＦＢ： 化学架橋アルギン酸ゲルファイバ
ＡＡ：導入管・ガラスキャピラリＡ
ＢＢ：導入管・ＥＴＦＥチューブ
ＣＣ：排出管・ガラスキャピラリＣ
ＺＺ：ガラスキャピラリＡの先端部（射出口）
Ｃａｐ１：シリコンキャツプ
Ｃａｐ２：シリコンキャツプ
Ｃａｐ３：シリコンキャツプ

Claims (23)

  1. 抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて、前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバ：
    ［式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
    下記式（Ｉ）：
    Figure 2023015413000251
     ［式（Ｉ）中、（ＡＬＧ）は、アルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ１－は、下記表：
    Figure 2023015413000252
    Figure 2023015413000253
    Figure 2023015413000254
     に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わし；
    Ａｋｎは、下記表：
    Figure 2023015413000255
     に記載された部分構造式［各式中、波線右側は含まない］からなる群より選択される環状アルキン基表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体；

    ［式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体］
    下記式（ＩＩ）：
    Figure 2023015413000256
     （式（ＩＩ）中、（ＡＬＧ）はアルギン酸を表わし；－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；－Ｌ２－は、下記表：
    Figure 2023015413000257
    Figure 2023015413000258
    Figure 2023015413000259
     に記載された部分構造式［各式中、両端の波線外側は含まない］からなる群より選択されるリンカーを表わす）で表される化学修飾アルギン酸誘導体。
  2. コア層に含まれる抗体産生細胞が、抗体発現ベクターにより形質転換されたＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ－２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｍｏｌｔ－４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ－４５－３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、及びＵＡＣＣ－８１２細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  3. コア層に含まれる基材が、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地、培養液、メチルセルロース、スクロース溶液、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の溶液、前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材である、請求項１又は２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  4. シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  5. シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体のゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量が、約１０万Ｄａ～約３００万Ｄａの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  6. シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基：Ａｋｎ－Ｌ１－ＮＨ２基（Ａｋｎ、及び－Ｌ１－は、請求項１の定義と同じである）の導入率が、約０．１％～約３０％の範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  7. シェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルの形成に用いられる式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の反応性基：Ｎ３－Ｌ２－ＮＨ２基（－Ｌ２－は、請求項１の定義と同じである）の導入率が、約０．１％～約３０％の範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  8. 化学架橋アルギン酸ゲルファイバの外径が３００μｍ～７５０μｍの範囲であり、化学架橋アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が１００μｍ～４００μｍの範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
  9. 化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、下記式（ＩＩＩ－Ｌ）：
    Figure 2023015413000260
     ［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、両端の－ＣＯＮＨ－及び－ＮＨＣＯ－は、アルギン酸の任意のカルボキシル基を介したアミド結合を表わし；
    －Ｌ１－は、請求項１の定義と同じであり；
    －Ｌ２－は、請求項１の定義と同じであり；
    Ｘは、下記表：
    Figure 2023015413000261
    Figure 2023015413000262
     に記載された部分構造式の群から選択される環状基である（各式中、両端の波線外側は含まない）］で表わされる基を介して化学架橋する、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  10. 化学架橋アルギン酸ゲルファイバのシェル層に含まれる架橋アルギン酸ゲルが、請求項９の式（ＩＩＩ－Ｌ）［式（ＩＩＩ－Ｌ）中、各定義は、請求項９の定義と同じである］で表わされる基を介して化学架橋され、更に２価金属イオンを介してイオン架橋されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバ。
  11. 抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む、マイクロ流体装置１０を用い、
    （１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
    （２）導入口２から、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、前記式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液の第２の層流を形成する工程、
    （３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
    （４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、前記式（Ｉ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体及び前記式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
    を含むことを特徴とする、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  12. 抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、導入管ＡＡと導入管ＡＡの導入口１、導入管ＢＢと導入管ＢＢの導入口２、及び導入管ＡＡ及び導入管ＢＢの下流に位置する排出管ＣＣ及びその出口３を含む、Ｔ字型流体装置ＸＸを用い、
    （１）導入口２から、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体の混合溶液を導入する工程、
    （２）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して、導入管ＡＡの最先端ＺＺから抗体産生細胞６と基材を射出する工程、
    （３）排出管ＣＣの出口３から、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体が含まれるシェル層で被覆されるファイバ状物質を、２価金属イオンを含む溶液中に射出させる工程、
    （４）前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを得る工程
    を含むことを特徴とする、化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  13. コア層に含まれる抗体産生細胞が、請求項２に記載の細胞である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  14. コア層に含まれる基材が、請求項３に記載の基材である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  15. ２価金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、及び亜鉛イオンからなる群から選択されるイオンである、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  16. ２価金属イオンを含む溶液が、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、及び塩化バリウム水溶液なる群から選択される水溶液である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  17. 化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度が、４～３７℃の範囲である、請求項１１又は１２に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
  18. 抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、請求項１に記載の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表わされる化学修飾アルギン酸誘導体を用いて前記両アルギン酸誘導体間に架橋を形成することにより得られる架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される化学架橋アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法であり、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化学架橋アルギン酸ゲルファイバを培養容器に入れ、培地を添加して前記化学架橋アルギン酸ゲルファイバを含浸させ、培養を行うことによる、抗体の製造方法。
  19. コア層に含まれる抗体産生細胞が、請求項２に記載の細胞である、請求項１８に記載の抗体の製造方法。
  20. コア層に含まれる基材が、請求項３に記載の基材である、請求項１８に記載の抗体の製造方法。
  21. 培養温度が、３０℃～３８℃の範囲である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
  22. 培養温度が、培養開始時の温度が３７℃であり、コア層の細胞濃度が、１．０×１０８細胞／ｍＬ～１０×１０８細胞／ｍＬに到達した時点～培養終了時迄の温度が３０℃である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
  23. 細胞増殖抑制剤を添加する、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
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JP5633077B2 (ja) * 2009-10-14 2014-12-03 国立大学法人 東京大学 被覆されたマイクロゲルファイバ
JP6332782B2 (ja) * 2013-06-07 2018-05-30 国立大学法人 鹿児島大学 細胞凝集塊作製法
JP7094888B2 (ja) * 2016-03-24 2022-07-04 武田薬品工業株式会社 アルギネートヒドロゲル組成物
CN116874636A (zh) * 2018-06-14 2023-10-13 持田制药株式会社 新型交联海藻酸
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