JP5633077B2 - 被覆されたマイクロゲルファイバ - Google Patents

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Description

本発明はアルギン酸ゲルなどで被覆されたマイクロゲルファイバに関する。
細胞やタンパク質の研究への応用性からハイドロゲルを用いたマイクロビーズ(Advanced Materials, 19, pp.2696, 2007; Lab on a Chip, 8, pp.259, 2008)やマイクロファイバ(Lab on a Chip, 4, pp.576, 2004; Langmuir, 23, pp.9104, 2007; Lab on a Chip, 8, pp.1255, 2008)が注目されている。特にハイドロゲルを基材とするマイクロファイバは生化学的センサー(Lab on a Chip, 4, pp.576, 2004)や人工組織(Langmuir, 23, pp.9104, 2007; Lab on a Chip, 8, pp.1255, 2008)の構築に有用であり、織布構造を構築することにより大面積で複雑な3次元構造体を製造するために有用であると期待される。
もっとも、ハイドロゲルからなるマイクロファイバのうち、アルギン酸ゲルを基材とするマイクロファイバは取り扱いのために十分な機械的強度を有しているものの、その他のハイドロゲル材料から製造されるマイクロファイバ(例えばペプチドハイドロゲルからなるマイクロファイバ)は強度的に脆く、微小構造の織布を製造するためのマイクロファイバとしては利用できないという問題を有している。このような観点から、アルギン酸ゲル以外のハイドロゲルを基材とするマイクロファイバの強度を改善する手段が切望されている。
Advanced Materials, 19, pp.2696, 2007 Lab on a Chip, 8, pp.259, 2008 Lab on a Chip, 4, pp.576, 2004 Langmuir, 23, pp.9104, 2007 Lab on a Chip, 8, pp.1255, 2008
本発明の課題は機械的強度が改善されたマイクロゲルファイバを提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ハイドロゲルを基材とするマイクロファイバをアルギン酸ゲルで被覆すると、得られたコアシェル構造のマイクロファイバの機械的強度が飛躍的に高まること、及びこのようにして得られた被覆マイクロファイバを用いて織布構造やシリンダ構造などの3次元構造体を構築できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むマイクロファイバが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、高強度ハイドロゲルがアルギン酸ゲル又はアガロースゲルである上記のマイクロファイバ；マイクロゲルファイバがハイドロゲルを基材とするファイバである上記のマイクロファイバ；マイクロゲルファイバがキトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、又はフィブリンゲル、あるいはそれらの混合物からなる群から選ばれるハイドロゲルを基材とするファイバである上記のマイクロファイバ；ハイドロゲルがコラーゲンゲルである上記のマイクロファイバ；被覆されるべきマイクロゲルファイバの外径が100 nm〜1,000μmの範囲であり、高強度ハイドロゲルによる被覆後のマイクロファイバの外径が200 nm〜2,000μmの範囲である上記のマイクロファイバが提供される。
さらに好ましい態様によれば、マイクロゲルファイバ中に細胞を含む上記のマイクロファイバ；マイクロゲルファイバ中に成長因子を含む上記のマイクロゲルファイバ；上記のいずれかのマイクロファイバを含む構造体；織布構造又はらせん構造を有する上記の3次元構造体が本発明により提供される。
また、高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むマイクロファイバから高強度ハイドロゲルによる被覆又は被覆されたマイクロゲルファイバのいずれかを除去することにより得ることができるファイバも本発明により提供される。
さらに、上記のいずれかのマイクロファイバを含む構造体を構築した後、高強度ハイドロゲルによる被覆又は被覆されたマイクロゲルファイバのいずれかを除去することにより得ることができる構造体が本発明により提供される。
別の観点からは、マイクロゲルファイバ中に細胞を含む上記のマイクロファイバから高強度ハイドロゲルによる被覆を除去することにより得ることができる細胞ファイバが提供される。また、細胞ファイバの製造方法であって、(a)高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバであってマイクロゲルファイバ内に細胞を含むマイクロファイバを製造する工程；(b)該マイクロファイバを培養してマイクロゲルファイバ内に細胞培養物を含むマイクロファイバを得る工程；及び(c)上記工程(c)で得られたマイクロファイバから高強度ハイドロゲルを除去する工程を含む方法が提供される。マイクロゲルファイバがコラーゲンゲルであり、高強度ハイドロゲルがアルギン酸ゲルであることが好ましい。
さらに、マイクロゲルファイバ中に細胞を含む上記のマイクロファイバを含む構造体を構築した後、高強度ハイドロゲルによる被覆を除去することにより得ることができる細胞構造体が本発明により提供される。また、細胞シート又は細胞ブロックなどの細胞構造体の製造方法であって、(a)高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバであってマイクロゲルファイバ内に細胞を含むマイクロファイバを製造する工程；(b)該マイクロファイバを培養してマイクロゲルファイバ内に細胞培養物を含むマイクロファイバを得る工程；(c)該マイクロファイバを用いて2次元又は3次元構造体を得る工程；及び(d)上記工程(c)で得られた2次元又は3次元構造体から高強度ハイドロゲルを除去する工程を含む方法が提供される。マイクロゲルファイバがコラーゲンゲルであり、高強度ハイドロゲルがアルギン酸ゲルであることが好ましい。
本発明のマイクロファイバは機械的強度に優れており、例えば織布構造、シリンダ構造、又はチューブ構造などの3次元構造を構築するために好適に使用することができる。例えばハイドロゲル中に細胞を含むマイクロファイバを用いて織布構造やチューブ構造を構築することにより、細胞シートや細胞ブロックなどの細胞構造体を容易に調製することができる。
二重の同軸の層流装置(Lab. Chip, 4, pp.576, 2004, Fig.1)を用いてコア・シェル構造のファイバを製造する方法を示した図である。(A)は方法の概念図を示し(流速：Qcore＋Qshell＝100μl/min、Qsheath＝3.6 ml/min)、(B)は得られたコア・シェル構造のファイバの様子を示す。(C)及び(D)はコア直径とシェル被服厚がコア部流体及びシェル部流体の流速比(Qcore/Qshell)に応じて変化することを示す。(E)はコア部流体として3T3線維芽細胞を含むコラーゲン溶液を用い、シェル部流体としてアルギン酸ナトリウム溶液を用いてコア部に細胞を含むコア・シェル構造のマイクロファイバを調製する方法の概念図であり、(F)は得られたコア・シェル構造のマイクロファイバを示す。 (A)はシリコンチューブ内に吸引されたマイクロファイバを示し、(B)は拡大図を示す。 マイクロファイバにより構築可能な3次元構造体の具体例としてWire(直線状構造)、Sheets(織布構造)、Sylinders(シリンダー構造)を示した図である。 マイクロファイバ状のゲルを用いて織布構造を調製する方法の概念図及び調製された織布構造を示した図である。(A)は織機(左)及び織布調製方法(右)の概念図を示し、（B)は水中でマイクロファイバ状のゲルを用いて織布の調製する方法の具体例を示す。（C）は調製された織布構造のゲルを示し、(D)は織布の蛍光イメージを示し、(E)は(D)のイメージの拡大図を示し、(F)はシートの断面図を示す。図中、Wrap gel wireは縦糸であるマイクロファイバ状ゲル、Weft gel wireは横糸であるマイクロファイバゲルを示す。 らせん構造の3次元構造体を調製する方法を示した図である。(A)は2種類のマイクロファイバを用いてらせん構造を調製する概念図であり、直径1 mmのガラス製円筒に巻き取った2本のマイクロファイバにアガロースをディップコートした後に円筒を引き抜くことで異なる2本のマイクロファイバーからなる2重鎖ラセン構造体を製造する方法を示し、(B)はらせん構造の拡大図、(C)は断面図を示す。(D)は3T3線維芽細胞を含むマイクロファイバを用いて調製したらせん構造の3次元構造体の表面の共焦点像であり、その断面の概念図を右側に示した。 アルギン酸ハイドロゲルファイバの調製方法を模式図として示した図である。 (A)はアルギン酸ナトリウム溶液(青色)と塩化カルシウム溶液が接触する位置でゲル化が生じ、ファイバの直径が塩化カルシウム溶液の流速(Qsheath)に応じて変化することを示す。(B)はファイバの直径と塩化カルシウム溶液の流速との関係を示し(ファイバ直径は45μm)、(C)は得られたアルギン酸ハイドロゲルファイバの外観を示す。バーは500μmを示す。 ミクロファイバをガラス製毛細管(内径1 mm)に銅線(直径50μm)を用いて引き込んだ様子を示した図である。(A)はその方法の模式図であり、(B)はガラス管内にアルギン酸ハイドロゲルファイバを引き込んだ様子を示す。 アルギン酸ハイドロゲルファイバを直径1 mmのガラス管に巻き取った様子を示した図である。 内側の流体に蛍光マイクロビーズ(それぞれ青、緑、及び赤色、直径0.2-1.0μm)及び細胞(それぞれ3T3線維芽細胞(赤)及びジャーカット細胞(緑))を加えて調製した蛍光マイクロビース(A)又は細胞(B)を含むアルギン酸ハイドロゲルファイバ(直径70μm)を示した図である。 3種類のビーズをそれぞれ含む3本のハイドロゲルファイバを用いて手編みにより撚糸構造を形成する方法の概念図(A)及び得られた撚糸構造の蛍光顕微鏡写真(B)を示した図である。 細胞を含むコラーゲン製のマクロゲルファイバを高強度ハイドロゲル(アルギニン)で被覆したマイクロファイバ(1)を製造し、細胞培養を行って細胞培養物をマイクロゲルファイバ内に含むマイクロファイバ(2)を製造する工程、及び該マイクロファイバ(2)を2次元又は3次元構造体に形成する工程、又は該マイクロファイバ(2)からアルギン酸ゲルを除去して細胞培養物を露出させた細胞ファイバを製造する工程を示した図である。 コア部のコラーゲンゲル及びシェル部のアルギン酸ゲルからなり3T3線維芽細胞及び可視化のためのポリスチレン製ブルービーズをコア部に含むマイクロファイバを製造し(A)、37℃で30分間インキュベートした後にマイクロファイバの様子を光学的に観察した結果(B及びC)を示した図である。 HepG2細胞をコア部に含むマイクロファイバを製造して培養することにより得られたコア部にHepG2細胞の培養物を含むマイクロファイバを示した図である。Aは培養初日、Bは培養3日目、Cは培養11日目の結果を示し、Dはアルギン酸ゲルを酵素処理により除去した後に得られた細胞ファイバの様子を示す。 HepG2細胞(A: 培養14日目)、Min6細胞(B: 培養18日目)、Hela細胞(C: 培養6日目)、及びラット脳由来の初代大脳皮質細胞(D: 培養8日目)の細胞培養物を含むゲルファイバを製造した後にシェル部のアルギン酸ゲルを除去することにより得た細胞ファイバの様子を示した図である。 ラット脳由来の初代大脳皮質細胞の細胞ファイバ(14日目)におけるCa2+イメージングの結果を示した図である。(A)は細胞ファイバの位相差像、(B)はカルシウムイオン検出試薬としてFluo4-AMを用いた蛍光像を示す。(C)はFluo-4による細胞ファイバーの見かけ(pseudo)カラーイメージであり、蛍光強度(ΔF/F0)を4点(1-4)でモニターした。(D)は1-4の場所でいずれもカルシウム振動の同期が認められたことを示す。 HepG2細胞を含む細胞ファイバが培養により乳酸を分泌することを示した図である。 Hela細胞の細胞培養物をコア部のコラーゲンゲルに含みシェル部がアルギン酸ゲルであるゲルファイバにより織布構造の細胞構造体を構築し、その後にアルギン酸ゲルを除去して製造された細胞シートの様子を示した図である。Aは織布構造の製造方法の概念図であり、Bは得られた細胞シートの織布構造を示す写真である。C(可視光像)及びD(蛍光像)は縦糸6本×横糸5本の織布構造を有する細胞構造体の顕微鏡像であり、Eは約1.5 cm長の細胞ファイバを平行に配列させた細胞構造体を示す。 HepG2細胞の細胞培養物をコア部のコラーゲンゲルに含みシェル部がアルギン酸ゲルであるゲルファイバ、及びMin6細胞の細胞培養物をコア部のコラーゲンゲルに含みシェル部がアルギン酸ゲルであるゲルファイバを用いて、直径1mmのガラス管に2本の異なるゲルファイバを巻き取ることにより形成されたヘテロコイル構造の細胞構造体を示した図である。Aは可視光像、Bは蛍光像を示す。Cはシェル部のアルギン酸ゲルを除去して培養を継続することによりコラーゲンゲルに埋め込まれた状態でコイル構造が維持されている様子を示す。 コラーゲンゲルファイバ(コア部:3種類の異なる蛍光ビーズを含む)をアルギン酸ゲル(シェル部)で被覆したマイクロファイバにより調製された織布構造の二次元構造体を透明フィルム上でアガロースゲルにより薄くコーティングした状態を示した図である。 図20に示す二次元構造体をピンセットでつまみあげた様子を示した図である。 織布構造の二次元構造体の中央に穴(直径1.5 mm)を開けた状態を示した図である。 図22に示す二次元構造体の穴にガラス棒を通し、そのガラス棒と直角に交差するように右と左に１本ずつのガラス棒を置いて布構造を折り曲げた様子を示した図である。 折り曲げた状態の構造体をアガロースゲルで固定した状態を示した図である。 ガラス棒と透明フィルムを取り除いた後に余分な部分をカッターで切り取る様子を示した図である。 得られたTシャツ型の3次元構造体(縦6 mm×横6 mm)を直立させた状態を示した図である。 得られたTシャツ型の3次元構造体の蛍光像である。蛍光ビーズに由来する3種類の蛍光が観測された。 細胞(Hela細胞又はNIH/3T3細胞)を含むコア部のコラーゲンゲル及びシェル部にそれぞれ接着性タンパク質(ad-protein)としてフィブリンを添加したマイクロファイバ(Type B)又はフィブリン無添加のマイクロファイバ(Type A)における細胞増殖の結果を示した図である。 HepG2細胞の細胞ファイバをコア部に含むマイクロファイバ(コア部：コラーゲンゲル、シェル部：アルギン酸ゲル)を培養することにより分泌されるアルブミンの量をディッシュ上でHepG2細胞を培養した場合と比較した結果を示した図である。 マイクロファイバからアルギン酸ゲルを除去する前後における機械的強度を測定する方法の概念図(A)及び測定中の様子(B)を示した図である。細ガラス管(直径0.12 mm)の湾曲量を測定することによりマイクロファイバに負荷した圧力を計算した。 3T3細胞ファイバをコア部のコラーゲンゲル中に含むマイクロファイバのシェル部(アルギン酸ゲル)を除去する前後の機械的強度を示した図である。 コア部としてコラーゲンゲル、シェル部としてアルギン酸ゲル(1.5%)を有するマイクロファイバのコア部に神経幹細胞を導入したマイクロファイバを作製し、7日間培養した結果を示した図である。上段はマイクロファイバ作製直後の様子を示し、下段は培養7日後の様子を示す。
本発明のマイクロファイバは高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むことを特徴としている。
典型的には、本発明のマイクロファイバは、マイクロゲルファイバであるコア部分、及び高強度ハイドロゲルを含むシェル(被覆)部分を含むコア・シェル構造を有している。本明細書において「マイクロゲルファイバ」は被覆されるべきファイバを意味しており、「マイクロファイバ」は被覆後のファイバを意味する。
本発明のマイクロファイバには、高強度ハイドロゲルで被覆されるべきマイクロゲルファイバが2種類の異なるゲルによりコア・シェル構造を有するファイバとして形成されている場合や、さらに多重構造を有している場合も包含される。さらに、高強度ハイドロゲルによる被覆も多層被覆からなる被覆であってもよい。例えば、2種類以上の異なる強度を有する高強度ハイドロゲルで2層以上の被覆が形成されていてもよい。
マイクロファイバ形状とは、例えば外径が10μm〜1 mm 程度の繊維状の形状を意味しているが、外径は上記の範囲に特に限定されるわけではない。断面形状としては、円形、楕円系、又は四角形や五角形などの多角形など多様な形状であってもよい。断面形状としては円形が好ましい。マイクロファイバの長さは特に限定されないが、数mm〜数十cm程度である。被覆されるべきマイクロゲルファイバの外径は特に限定されないが、例えば100 nm〜1,000μm程度の範囲であり、好ましくは10〜500μmの範囲である。高強度ハイドロゲルによる被覆後のマイクロファイバの外径も特に限定されないが、例えば200 nm〜2,000μmの範囲であり、好ましくは50〜1,000μmの範囲である。
本発明のマイクロファイバでは、被覆すべきマイクロゲルファイバの基材となるハイドロゲルと実質的に同一又はより高い機械的強度、好ましくはより高い機械的強度を有するハイドロゲルを高強度ハイドロゲルとして使用することができる。高強度ハイドロゲルの種類は特に限定されないが、通常用いられるハイドロゲル、例えばコラーゲンゲルやポリビニルアルコールハイドロゲルと比べて実質的に同一又はより高い機械的強度を有するハイドロゲルを用いることが好ましい。より好ましくは、常用いられるハイドロゲル、例えばコラーゲンゲルやポリビニルアルコールハイドロゲルと比べてより高い機械的強度を有するハイドロゲルを用いることができる。このようなゲルとしては、例えばアルギン酸ゲルやアガロースゲルを挙げることができるが、これらに限定されることはない。また、高強度ハイドロゲルとしては、カルシウムイオンなどの金属イオンの存在下でゲル化する性質を有するハイドロゲルを好ましく用いることができる。このような観点からはアルギン酸ゲルが好ましい。また、アガロースゲルやUV照射などにより硬化する光硬化性ゲルなどを用いることもできる。ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。
マイクロゲルファイバの基材としてはハイドロゲルを好適に用いることができる。ハイドロゲルの種類は特に限定されないが、例えば、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、又はフィブリンゲル、あるいはそれらの混合物などを基材とするハイドロゲルを用いることができる。市販されている製品として、例えばマトリゲル(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)などを用いてもよい。また、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、又はポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーに紫外線や放射線を照射して形成することができるハイドロゲルなどを用いてもよい。また、ヒドロゲルとして超分子ヒドロゲルを用いてもよい。超分子ヒドロゲルはモノマー分子が自己集合した非共有結合性のヒドロゲルであり、例えば「スマートバイオマテリアルとしての超分子ヒドロゲル」、Dojin News, 118, pp.1-17, 2006に具体的に説明されている。
マイクロゲルファイバの調製にあたっては水と混じりあう性質を有する水性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキシドなどを添加してもよい。ハイドロゲルの強度を高めるために適宜の成分や溶媒を配合することもできる。このような観点から、例えば、ポリビニルアルコールハイドロゲルの調製のために溶媒としてジメチルスルホキシドを添加することも可能である。
マイクロゲルファイバには、例えば、細胞、タンパク質、脂質、糖類、核酸類、又は抗体などの生体成分の1種又は2種以上を添加することができる。細胞の種類は特に限定されないが、例えば、分化万能性を有するES細胞やiPS細胞、分化多能性を有する各種の幹細胞(造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞など)、分化単一性を有する幹細胞(肝幹細胞、生殖幹細胞など)などのほか、分化した各種の細胞、例えば骨格筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、大脳皮質細胞などの神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、皮膚細胞などを挙げることができる。マイクロゲルファイバは、細胞をマイクロゲルファイバ内で培養して得られる細胞培養物を含んでいてもよい。もっとも細胞や生体成分は上記に例示したものに限定されることはない。上記の細胞の培養、細胞の維持や増殖、又は細胞の機能発現などに適した各種の成長因子、例えば上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、インスリン様成長因子(IGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、神経成長因子(NGF)などをマイクロゲルファイバに添加してもよい。成長因子を用いる場合には、成長因子の種類に応じて適宜の濃度を選択することができる。また、マイクロゲルファイバには非生体成分を添加してもよい。例えば、カーボンナノファイバなどの繊維類、触媒物質など無機物質類、抗体などで被覆されたビーズ類、又はマイクロチップなどの人工物を添加することも可能である。必要に応じて、シェル部を構成する高強度ハイドロゲル中にも生体成分や非生体成分を添加することもできる。
本発明のマイクロファイバの製造方法は特に限定されないが、例えば、図1に示すような二重の同軸マイクロ流体装置(coaxial microfluidic device)を用いることにより簡便に調製することができる。2つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができる二重のマイクロ流体装置は、例えば、Lab Chip, 4, pp.576-580, 2004のFig.1に具体的に説明されており、本発明のマイクロファイバを調製するためにはこの刊行物に記載された装置を好適に使用することができる。
図1(A)はモデル実験として2種類のアルギン酸ゲルからなるコア・シェル構造のマイクロファイバを調製する方法を概念図として示した図である。架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出し、同軸のコア・シェル状態の流体を形成させ、その流体をCaCl2を含む水溶液中に導入してゲル化させることにより、内側(コア部)及び外側(被覆部であるシェル部)の2種類のゲルからなるマイクロファイバを構築することができる。射出速度は特に限定されないが、口径50μm〜2 mm程度のサイズを有する同軸マイクロ流体装置を用いる場合には、10〜500μ/min程度で2種類の溶液を射出することができる。2種類の溶液の射出速度を調節することにより、コア部の直径及びシェル部の被覆厚みを適宜調節できる(図1(C)及び(D))。カルシウムイオンを含む水溶液への導入速度も特に限定されないが、例えば1〜10 ml/min程度とすることができる。
この方法を用いて、内側(コア部)の溶液としてコラーゲン溶液を用いると、コア部としてコラーゲンゲル及びシェル部としてアルギン酸ゲルを有するコア・シェル構造のマイクロファイバを製造することができる。この際、コラーゲン溶液に線維芽細胞などの細胞を添加しておくと、コア部に線維芽細胞を含むコア・シェル構造のマイクロファイバを製造することができる(図1(E))。コラーゲン溶液を用いる場合には、カルシウムイオンを含む水溶液を通過させた後、37℃程度で数分から1時間程度の加熱を行うことによりコラーゲンをゲル化させることができる。一般的には、シェル部の高強度ハイドロゲルを先に形成させ、内側のコア部を加熱、紫外線照射、又は放射線照射などによりゲル化させることができるが、内側のコア部の調製にカルシウムイオンで架橋する水溶性高分子鎖、例えばフィブリンモノマーなどの溶液を用い、外側のシェル部の溶液としてアルギン酸ナトリウム溶液を用いると、カルシウムイオンを接触させることによりシェル部及びコア部のゲル化を同時に行うこともできる。
このようにして得られるコア・シェル構造のマイクロファイバから必要に応じてシェル部の高強度ハイドロゲルを除去してマイクロゲルファイバを露出させたファイバを製造することもできる。例えば、高強度ハイドロゲルとしてアルギン酸ゲルを用い、マイクロゲルファイバの基材ゲルとしてコラーゲンを用いたコア・シェル構造のマイクロファイバを製造した後、EDTAなどのキレート剤を適宜の濃度で作用させてカルシウムイオンを除去することにより高強度ハイドロゲルのみを除去し、コラーゲンゲルからなるファイバを調製することができる。上記の除去操作はマイクロファイバを成形した後に行ってもよい。
また、コア・シェル構造のマイクロファイバから必要に応じてコア部のハイドロゲルを除去し、高強度ゲルからなる中空ファイバを調製することも可能である。例えば、高強度ハイドロゲルとしてアガロースゲルを用い、マイクロゲルファイバの基材ゲルとしてアルギン酸ゲルを用いたコア・シェル構造のマイクロファイバを製造した後、EDTAなどのキレート剤を適宜の濃度で作用させてカルシウムイオンを除去することによりコア部のアルギン酸ゲルのみを除去し、中空のアガロースゲルファイバを調製することができる。上記の除去操作はマイクロファイバを成形した後に行ってもよい。
このようにして得られたマイクロファイバをシリコンチューブ内に吸引し、チューブの縦軸方向にゲルを伸張して保存することができる。ゲル化後のマイクロファイバを水中又は緩衝液中などに保存するとゲルを直線状に保つことが一般には困難になるが、マイクロファイバを水中又は緩衝液中などに入れた後、この水性媒体に内径100μm〜数mm程度のシリコンチューブの先端を浸漬してシリコンチューブを吸引することにより、マイクロファイバが先端からシリコンチューブ内に吸引され、チューブの縦軸方向に伸張された直線状態でシリコンチューブ内に吸引される。この状態を図2に示す。この状態でゲルを保存することができ、さらに使用にあたってはマイクロファイバを内包したシリコンチューブを適宜の長さに切断して所望の長さのゲルを調製することが可能になる。保存にあたっては、必要に応じてチューブ内に防腐剤、pH調節剤、緩衝剤など適宜の薬剤を添加することができる。
本発明のマイクロファイバは機械的強度に優れており、例えば二重鎖又は三重鎖などの撚糸構造、織布構造、シリンダ構造、ラセン構造、チューブ構造などの3次元構造を構築するために好適に使用することができる。本明細書において用いられる「構造体」の用語は1本のマイクロファイバを成形して得られるあらゆる構造体、又は2本以上のマイクロファイバを用いて構築可能なあらゆる構造体を包含しており、外観上は直線状を呈する撚糸構造や、外観上は平面を呈するシートなどの構造体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においてもこれらの用語を限定的に解釈してはならない。特に3次元構造であることを意図する場合には「3次元構造体」と呼ぶ場合もある。3次元構造体の概念図を図3に示す。
また、本発明のマイクロファイバを複数束ねて用いることもできる。例えば、マイクロゲルファイバ中に細胞を添加したマイクロファイバを調製し、横方向に複数のマイクロファイバを束ねて一列のマイクロファイバからなるシートを形成して培養することによりシート状の細胞培養物（本明細書において「細胞シート」と呼ぶ）を調製することができる。また、上記のシートを複数積み重ねてブロック状として培養を行うことにより、ブロック状の細胞培養物（本明細書において「細胞ブロック」と呼ぶ）を調製することもできる。
例えば、織布構造の3次元構造体を調製するためには、縦糸の間隔が1〜5 mm程度となるようなミクロ織機を用いて、縦糸及び／又は横糸として上記のマイクロファイバを用いて織布構造のゲルを調製すればよい。この方法の概念図及び織布構造のゲルの例を図4に示す。図4(C)に示された織布構造において、縦糸及び横糸として本発明のマイクロファイバを用いることができるが、横糸又は縦糸としてアルギン酸マイクロファイバなどを用いることもできる。アルギン酸マイクロファイバは、例えば上記の同軸マイクロ流体装置を用いて、内側流体をアルギン酸ナトリウム溶液とし、外側流体をCaCl2溶液とすることにより調製することができる。例えば織布構造などを含む2次元構造体又は3次元構造体の構造を維持するためにアガロースゲルなどを用いて薄くコーティングすることが好ましい場合もある。
横糸及び縦糸として用いるマイクロファイバは、先に説明したようにシリコンチューブ内に保存された状態で織機に配置し、シリコンチューブ内からマイクロファイバが供給されるようにすることが好ましい。図4(A)は縦糸がシリコンチューブ内から供給されることを示す概念図である。
また、チューブ構造の3次元構造体を調製するためには、例えば図5(A)に示すようにガラス管などの円筒を用いてマイクロファイバを巻き上げた後に外側をアガロースゲルやアルギン酸ゲルなどで被覆し、その後に円筒を引き抜くことによりチューブ構造体を形成することができる。この際、異なる2種類の本発明マイクロファイバを用いてヘテロチューブ構造を形成することもでき、あるいは1本の本発明マイクロファイバと補強のためのアルギン酸マイクロファイバとを用いて強度に優れたチューブ構造体を形成することも可能である。図5(A)は2種類の異なる本発明マイクロファイバを用いて巻上げを行ない、ラセン構造をアガロースで固定化する様子を示した模式図である。
さらに、本発明のマイクロファイバを用いて任意の構造体、好ましくは3次元構造体を構築した後、必要に応じて、シェル部の高強度ハイドロゲルを除去してマイクロゲルファイバを露出させ、マイクロゲルファイバにより構築された3次元構造体を製造することができる。例えば、高強度ハイドロゲルとしてアルギン酸ゲルを用い、マイクロゲルファイバの基材ゲルとしてコラーゲンを用いたコア・シェル構造のマイクロファイバを用いて3次元構造体を構築した後、EDTAなどのキレート剤を適宜の濃度で作用させてカルシウムイオンを除去することにより高強度ハイドロゲルのみを除去し、コラーゲンゲルにより構築された3次元構造体を調製することができる。このようにして得られるコラーゲンゲルによる3次元構造体は、例えば細胞培養などの目的に好適に使用することができる。
あるいは、本発明のマイクロファイバを用いて任意の構造体、好ましくは3次元構造体を構築した後、必要に応じてコア部のハイドロゲルを除去し、高強度ゲルからなる中空ファイバで構築された3次元構造体を調製することも可能である。例えば、高強度ハイドロゲルとしてアガロースゲルを用い、マイクロゲルファイバの基材ゲルとしてアルギン酸ゲルを用いたコア・シェル構造のマイクロファイバを用いて3次元構造体を構築した後、EDTAなどのキレート剤を適宜の濃度で作用させてカルシウムイオンを除去することによりコア部のアルギン酸ゲルのみを除去し、中空のアガロースゲルファイバにより構築された3次元構造体を調製することができる。
マイクロゲルファイバ中に細胞を含む上記のマイクロファイバを製造し、適宜の培養を行ってマイクロゲルファイバ内に細胞培養物を形成した後、高強度ハイドロゲルによる被覆を除去することにより細胞培養物を露出させて、細胞培養物からなる細胞ファイバを得ることができる。例えば、マイクロゲルファイバとしてコラーゲンゲルファイバを用い、高強度ハイドロゲルとしてアルギン酸ゲルを用いることが好ましい。このようにして得られる細胞ファイバは細胞の集合体をマイクロゲルファイバ内に含むファイバであり、ファイバ形状をそのまま保つことができるという特徴がある。細胞を含むコア部のコラーゲンゲル及びシェル部のアルギン酸ゲルには、必要に応じて接着性を高めるためのタンパク質、例えばフィブリンなどを添加しておいてもよい。このようなタンパク質はコア部にのみ添加してもよいが、好ましくはコア部及びシェル部の両方に添加しておくことができる。例えばフィブリンをコア部及びシェル部の両方に添加すると細胞が集合してクラスターを形成せずに均一に増殖して細胞ファイバを形成できるようになる場合がある。添加すべきタンパク質の種類及び量は特に限定されず、培養すべき細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
また、マイクロゲルファイバ中に細胞を含む上記のマイクロファイバを製造し、適宜の培養を行ってマイクロゲルファイバ内に細胞培養物を形成した後、このマイクロファイバを用いて適宜の2次元又は3次元構造体を形成することができる。あるいは、マイクロゲルファイバ中に細胞を含む上記のマイクロファイバを製造し、適宜の2次元又は3次元構造体を形成してもよい。その後、得られた2次元又は3次元構造体から高強度ハイドロゲルを除去することにより細胞培養物を露出させて、上記の細胞ファイバにより構築された2次元の細胞シート又は3次元の細胞ブロックを製造することもできる。これらの概念図を図12に示す。それぞれ異なる細胞を含む2種以上のマイクロファイバを用いて2次元又は3次元構造体を形成し、必要に応じて高強度ハイドロゲルを除去することもできる。この方法により、2種以上の異なる細胞ファイバを含む2次元の細胞シート又は3次元の細胞ブロックを形成することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1(参考例)
アルギン酸ハイドロゲルファイバーを同軸の層流装置(Lab. Chip, 4, pp.576, 2004; Langmuir, 23, pp.9104, 2007)を用いて図6(A)に示す方法で製造した。内側の流体として1.5% w/vアルギン酸ナトリウム(流速 Qinner=9μl/min)を用い、外側の流体として780 mM塩化カルシウム溶液(Qsheath=0.2-1.0 ml/min)を用いてアルギン酸ハイドロゲルファイバを製造した(図6)。2つの流体が接触する位置でゲル化が生じ、得られたファイバの直径は外側流体の流速に応じて30μmから95μmとなった(図7(A)及び(B))。ゲル化したアルギン酸ハイドロゲルファイバは脱イオン水を入れたペトリ皿で受けた(図7(C))。
ガラス製毛細管(内径1 mm)に銅線(直径50μm)を先端部がループを形成するようにとおし、そのループでアルギン酸ハイドロゲルファイバを捕捉してガラス管内に引き込んだ。図8(A)は引き込みの模式図であり、図8(B)はこのようにしてガラス管内にアルギン酸ハイドロゲルファイバを引き込んだ様子を示す。この手法によりハイドロゲルファイバの末端をしっかり保持することが可能になる。アルギン酸ハイドロゲルファイバは機械的強度に優れており、直径1 mmのガラス管に巻き取ることができた(図9)。
内側の流体に蛍光マイクロビーズ(それぞれ青、緑、及び赤色、直径0.2-1.0μm)及び細胞(それぞれ3T3線維芽細胞(赤)及びジャーカット細胞(緑))を加えて、上記と同様にして蛍光マイクロビース(図10(A))又は細胞（図10(B)）を含むアルギン酸ハイドロゲルファイバ(直径70μm)をそれぞれ調製した。これらのマイクロビース及び細胞を添加したハイドロゲルファイバは同様の機械的強度を有していた。上記の3種類のビーズをそれぞれ含む3本のハイドロゲルファイバを用いて手編みにより撚糸構造を形成した。図11(A)にはその概念図、図11(B)には得られた撚糸構造の蛍光顕微鏡写真を示す。
例2(参考例)
例1と同様にして、ただし二重の同軸の層流装置(Lab. Chip, 4, pp.576, 2004, Fig.1)を用いてコア・シェル構造のファイバを製造した。コア用流体として1.5% w/vアルギン酸ナトリウム(オレンジ色に着色)及びシェル用流体として1.5% w/vアルギン酸ナトリウム(緑色に着色)を用い、鞘部の流体として780 mM塩化カルシウム溶液(Qsheath=3.6 ml/min)を用いた(図1(A))。得られたコア・シェル構造のファイバの様子を図1(B)に示す。得られたファイバにおけるコア直径とシェル被服厚はコア部流体及びシェル部流体の流速比(Qcore/Qshell)に応じて変化した(図1(C)及び(D))。
例3
例2と同様にして、ただしコア部の流体として3T3線維芽細胞(細胞数1〜10×106 cells/ml)を含むコラーゲン溶液(濃度2mg/ml)を用いて、コラーゲンマイクロゲルファイバが強度ハイドロゲルであるアルギン酸ゲルにより被覆されたマイクロファイバを製造した。図1(E)に方法の概念図を示す。得られたマイクロファイバはコア部であるコラーゲンゲル中に3T3細胞を含むコア・シェル構造を有しており(図1(F))、十分な機械的強度を有するファイバであった。
例4(参考例)
図4(A)及び(B)に示された方法で織布構造の3次元構造体を調製した。縦糸及び横糸として例1で得られたアルギン酸ハイドロゲルファイバ(直径230μm)を用いて図4(C)に示す織布構造を編み上げた。同様にして、縦糸の一部及び横糸として異なる蛍光色を有するアルギン酸ハイドロゲルファイバを用いて織布構造の3次元構造体を調製した(図4(D))。図4(E)は拡大図であり、(F)は断面図である)
例5
例4と同様にして縦糸として例3で得られたマイクロファイバ(コア部直径40μm、外径140μm、3T3線維芽細胞密度107 cells/ml)を用い、横糸として例1で得られたアルギン酸ハイドロゲルファイバを用いて織布構造の3次元構造体を製造した。
例6
2種類のマイクロファイバ(マイクロファイバA：コア部直径40μm、外径140μm、緑色蛍光着色；マイクロファイバB：コア部直径40μm、外径140μm、オレンジ色蛍光着色)を図5(A)に示すように2本そろえた状態ですき間ができないようにガラス管(直径1 mm)に巻き取り、得られたらせん構造体の外側をアガロースゲル(3%)でコーティングしてらせん構造の3次元構造体を製造した。図5(B)はらせん構造の拡大図、図5(C)は断面図を示す。
例7
例6と同様にして3T3線維芽細胞を含むマイクロファイバ(コア部直径40μm、外径140μm、細胞密度107 cells/ml)をガラス管に巻き取ってらせん構造の3次元構造体を調製した。図5(D)は得られたらせん構造の表面の共焦点像であり、その断面図の概念図を右側に示した。
例8
例3と同様にして、コア部のコラーゲンゲル及びシェル部のアルギン酸ゲルからなり3T3線維芽細胞(細胞数1〜10×106 cells/ml)及び可視化のためのポリスチレン製ブルービーズ(直径15μm)をコア部に含むマイクロファイバ(コア部直径80μm、外径150μm、細胞密度:107 cells/ml、ビーズ密度:0.5%(w/v))を製造し、37℃で30分間インキュベートした後にマイクロファイバの様子を光学的に観察した。3T3細胞とコア部のコラーゲンゲルはシェル部のアルギン酸ゲルにより被覆されていることが確認できた(図13)。
例9
例3と同様にしてHepG2細胞をコア部に含むマイクロファイバを製造して培養することによりコア部にHepG2細胞の培養物を含むマイクロファイバを製造した。培養を継続することによりコラーゲンゲルからなるコア部は増殖した細胞で満たされていき、11日目にはコア部が完全に細胞で満たされたマイクロファイバ(コア部にコラーゲンゲルと細胞培養物を含みアルギン酸ゲルにより被覆されたマイクロファイバ)を得ることができた(図14A-C)。このマイクロファイバから酵素処理によりアルギン酸ゲルを除去してファイバ状の細胞培養物(細胞ファイバ)を露出させたところ、細胞ファイバの形態はそのまま保たれており、細胞どおしが強く結合しているものと推定された(図14D)。
同様にしてHepG2細胞(培養14日目)、Min6細胞(培養18日目)、Hela細胞(培養6日目)、及びラット脳由来の初代大脳皮質細胞(培養8日目)を用いて細胞培養物をコア部のコラーゲンゲル中に含むゲルファイバを製造した(図15A-D)。初代大脳皮質細胞の培養においては成長因子としてB-29及びG-5（Gibco）をメーカー指定の標準濃度でコア部に添加した。その後にシェル部のアルギン酸ゲルを除去することにより各細胞ファイバを製造した。
例10
例9により得られたラット脳由来の初代大脳皮質細胞(培養8日目)の細胞ファイバの機能を調べたところ、多数の皮質ニューロンにおいて自発的なCa2+振動が認められ、皮質細胞ファイバ中で神経ネットワークが形成されていることが示された(図16D)。また、例9により得られたHepG2細胞の細胞ファイバは培養により乳酸を分泌することが確認された(図17)。
例11
Hela細胞の細胞培養物をコア部のコラーゲンゲルに含みシェル部がアルギン酸ゲルであるゲルファイバにより織布構造の細胞構造体を構築した。織布構造の細胞シートの調製方法の概念図を図18Aに示す。得られた織布構造の細胞シートはセンチメートルレベル(約1〜2 cm)の細胞構造体であった(図18B)。縦糸6本×横糸5本の織布構造の細胞構造体を図18C(可視光像)及び図18D(蛍光像)に示す。また、約1.5 cm長の細胞ファイバを平行に配列させた細胞構造体を製造した(図18E)。
例12
HepG2細胞の細胞培養物をコア部のコラーゲンゲルに含みシェル部がアルギン酸ゲルであるゲルファイバ、及びMin6細胞の細胞培養物をコア部のコラーゲンゲルに含みシェル部がアルギン酸ゲルであるマイクロファイバを用いて、ヘテロコイル構造の細胞構造体を形成した(図19)。得られたコイル構造の細胞構造体はアルギン酸ゲルを除去した後にも増殖を続けており、細胞構造体に含まれる細胞が生物学的機能を保持していることが示された(図19C)。
例13
コラーゲンゲルファイバ(コア部:3種類の異なる蛍光ビーズを含む)をアルギン酸ゲル(シェル部)で被覆したコアシェル構造のマイクロファイバを用いて布状の2次元構造体を製造し、それを用いてTシャツ構造の3次元構造体を製造した。マイクロファイバにより織布状の二次元構造体を製造して透明なフィルム上に置き、織布構造を維持するためにアガロースゲルで薄くコーティングした(図20)。アガロースでコーティングされた織布構造体は十分な機械的強度を有しており、ピンセットで構造体を持ち上げることができた(図21)。織布構造体の中央部にパンチで穴(直径1.5 mm)をあけ(図22)、開けた穴に直径1mmのガラス棒を通し、さらにそのガラス棒と直角に交差するように右と左に１本ずつのガラス棒を置いて布構造を折り曲げた(図23)。折り曲げた後、隙間にアガロースゲルを流し込みゲル化させ、折った状態で布構造を固定した(図24)。ガラス棒と透明フィルムを取り除き、余分な部分をカッターで切り取ってTシャツ型の3次元構造体を調製した(図25)。図26には得られた3次元構造体(縦6 mm×横6 mm)を直立させた状態で示した。首と腕の通る穴の開いたTシャツ型の3次元構造体が得られたことが分かる。図27は上記の3次元構造体の蛍光像である。蛍光ビーズに由来する3種類の蛍光が観測された。
例14
細胞(Hela細胞又はNIH/3T3細胞)を含むコア部のコラーゲンゲル及びシェル部のアルギン酸ゲルにそれぞれ接着性タンパク質としてフィブリン(フィブリノーゲン添加量:1 mg/mL)を添加したマイクロファイバ(Type B)又はフィブリン無添加のマイクロファイバ(Type A)を製造して培養を行った。方法及び結果を図28に示す。Hela細胞はType Aのマイクロファイバ中で良好に増殖したが(図(C)左)、3T3細胞は増殖せず、細胞ファイバを形成することなく細胞集団(クラスター)を形成した(図(C)中央)。一方、フィブリンを添加したType Bのマイクロファイバ中では3T3細胞についても良好な増殖及び細胞ファイバの形成が認められた(図(C)右)。Type Aのマイクロファイバにおいては細胞の種類による増殖速度の違いが認められた(図(E))。
例15
HepG2細胞を含むコア部のコラーゲンゲルにアルギン酸ゲルのシェル部を設けたマイクロファイバを製造して培養することによりコア部にHepG2細胞の細胞ファイバを含むマイクロファイバを得た。このマイクロファイバを培養することにより分泌されるアルブミンの量をディッシュ上でHepG2細胞を培養した場合に分泌されるアルブミンの量と比較したところ、細胞ファイバから分泌されるアルブミンの量がディッシュ上で培養を行った場合を上回っていた。結果を図29に示す。コア部に封入されたHepG2細胞は3次元的な至適環境下に維持されており、その結果、2次元的なディッシュ上の培養条件よりもより多量のアルブミンを分泌するすることができるものと考えられた。
例16
NIH/3T3細胞を含むコア部のコラーゲンゲル及びシェル部のアルギン酸ゲルにそれぞれ接着性タンパク質としてフィブリンを添加したマイクロファイバ(Type B)を例14の方法で製造して培養することにより3T3細胞ファイバをコア部に含むマイクロファイバを得た。このマイクロファイバからアルギン酸ゲルを除去する前後における機械的強度を図30に示す方法により測定して、シェル部のアルギン酸ゲルによる機械的強度の増強効果を確認した。図30の(A)及び(B)の方法に従って細ガラス管(直径0.12 mm)の湾曲量を測定することによりマイクロファイバに負荷した張力を計算した。マイクロファイバが断裂するときに負荷されていた張力を機械的強度とした。この結果、シェル部を有するマイクロファイバはシェル部を除去した場合に比べて高い機械的強度を与えた(図31上段及び下段)。
例17
コア部としてコラーゲンゲル、シェル部としてアルギン酸ゲル(1.5%)を有するマイクロファイバのコア部に神経幹細胞を導入したマイクロファイバを作製した。コア部にはコラーゲン500μL に対して0.5 μL EGF、5 μL FGF、10 μL B27を添加し、細胞密度を6.8 × 107 cells/mlとなるようにマイクロファイバを作製し、10 mLのNeurobasal A に1% 抗生物質(ペニシリン及びストレプトマイシン)、2μL EGF、20μL FGF、及び200μL B27 を添加した培地を用いて7日間培養を継続した。結果を図32に示す。上段はマイクロファイバ作製直後の様子を示し、下段は培養7日後の様子を示す。神経幹細胞がマイクロファイバのコア部で増殖し、コア部を満たしていた。

Claims (11)

  1. 高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むマイクロファイバであって、該高強度ハイドロゲルが該マイクロゲルファイバの基材となるハイドロゲルより高い機械的強度を有するマイクロファイバ。
  2. 高強度ハイドロゲルがアルギン酸ゲル又はアガロースゲルである請求項１に記載のマイクロファイバ。
  3. マイクロゲルファイバがキトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、又はフィブリンゲル、あるいはそれらの混合物からなる群から選ばれるハイドロゲルを基材とするファイバである請求項１又は２に記載のマイクロファイバ。
  4. 被覆されるべきマイクロゲルファイバの外径が100 nm〜1,000μmの範囲であり、高強度ハイドロゲルによる被覆後のマイクロファイバの外径が200 nm〜2,000μmの範囲である請求項１ないし３のいずれか１項に記載のマイクロファイバ。
  5. マイクロゲルファイバ中に細胞又は細胞培養物を含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載のマイクロファイバ。
  6. マイクロゲルファイバ中に成長因子を含む請求項５に記載のマイクロファイバ。
  7. 請求項１に記載の高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むマイクロファイバから高強度ハイドロゲルによる被覆を除去する工程、又は請求項１に記載の高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むマイクロファイバからマイクロゲルファイバを除去する工程を含むファイバの製造方法。
  8. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載のマイクロファイバを含む構造体。
  9. 織布構造又はらせん構造を有する請求項８に記載の構造体。
  10. 請求項５に記載のマイクロファイバから高強度ハイドロゲルによる被覆を除去する工程を含む細胞ファイバの製造方法。
  11. 請求項５に記載のマイクロファイバにより構築された2次元又は3次元構造体から高強度ハイドロゲルによる被覆を除去する工程を含む細胞構造体の製造方法。
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