JPS63198979A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

〈従来技術及び発明が解決しようとする問題点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養周基村上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態となっていることが必要
である。

しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。

この点を改善するため、生体高分子であるコラーゲンや
その変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布したも
の（特開昭５８−７１８８４号公報参照）や、高分子材
料上に可溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞培
養床（特開昭６１−５２２８０号公報参照）が提案され
ている。

しかしながら、」１記の従来技術は、高分子基材への糖
や蛋白質などの固定化が十分でなく容品に脱離してしま
い、細胞との接着性が十分でない。

さらに、これらの方法による細胞培養用基材は、いずれ
も材料表面の全面が処理された基材しか得らず、接着し
た細胞の配列、形態を細胞の伸展、増殖に有利な形態に
制御することができない。従って、上記の細胞培養用基
材は、細胞との接着性および細胞の伸展性と増殖性が不
十分であり、細胞培養を高密度かつ長期に亘って行なう
ことができないという間通がある。

く口　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記の問題
点を解決すべくなされた、この発明の細胞培養用基°材
は、プラズマ、スパッタリング、γ線、オゾンまたは化
学処理のいずれかにより全面処理され、さらに紫外線、
電子線またはイオンのいずれかにより部分的な照射処理
がされた高分子基材表面に、糖、蛋白質、脂質およびそ
れらの複合体（以下、これらを糖蛋白質等と称する）が
担持されていることを特徴とするものである。

なお、上記高分子基材は、多孔質材料であるのが好まし
い。また、上記基材が中空糸であるものが好ましい。さ
らに、紫外線、電子線またはイオンによる部分的な照射
処理は、パターン化して、特に、格子模様、縞模様、水
玉模様等に処理するのが好ましい。

この発明の細胞培養用基材は、上記の構成よりなり、高
分子基材表面に糖蛋白質等が担持されているので、細胞
との接着性に優れる。すなわち、細胞表面の細胞膜の構
造は、脂質二重層の中に、膜内粒子と呼ばれる各種の糖
蛋白質、糖脂質等が分布をもって埋めこまれており、こ
れらが、上記脂質二重層の中を自由に移動でき細胞の接
着に関与している。上記糖蛋白質等は、膜内粒子とイオ
ン結合、疎水結合等により結合可能な部位を有するので
、細胞との接着性が高まると共に細胞を安定した形態、
配置で保持することができる。また、上記高分子基材表
面は、プラズマ、スパッタリング、γ線、オゾンまたは
化学処理により全面処理されており、表面が改質される
と共に各種親水性官能基が導入され、さらに、これらの
改質がされた基材の表面は紫外線、電子線またはイオン
のいずれかにより部分的な照射処理がされており、これ
らの照射処理により微細な模様が基材表面に形成されて
いる。基材表面に導入された官能基と糖蛋白質等の官能
基とが共有的、イオン的または疎水的に結合するので、
糖蛋白質等を基材に強固に結合できる。さらに、微細模
様に形成された表面には、糖蛋白質等をその高次構造を
維持した状態で固定化することができる。上記の作用の
結果、本発明の細胞培養用基材は、細胞の安定な接着を
促すと共に接着した細胞の良好な伸展および増殖を可能
にすることができる。

また、上記高分子基材が、多孔質材料であるときは、多
孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に亘り
細胞培養することができる。特に、前記高分子基材が中
空糸であるものは、中空部内や中空糸の外側に培養液等
を潅流することにより、中空糸上に細胞を高密度に育成
、増殖させることができる。

以下、この発明をより詳細に説明する。

この発明に使用される高分子基材としては、賦形性、機
械的強度を有するものであればいかなるものでも使用で
き、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポ
リエチレン、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポ
リテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等の
フッ素系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリ
メチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニル
アルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、
ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニ
リデン、ポリカーボネート、ボリアリレート、ポリフェ
ニレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
ブチレンテレフタレート等のポリエステル樹脂、エポキ
シ樹脂、ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セル
ロース系樹脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種
々の重合体もしくは共重合体またはそれらのブレンド物
が例示できる。

上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容品にする孔を有する多孔質高分子
基材が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基
材からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、中空糸としては、種々の大きさの
ものが使用でき、例えば、内径５０〜１０００μ厘程度
のものが用いられる。

また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、高分子基材は
１００〜ａｏｏ　Ｉｎ程度の粒径のものが用いられる。

上記高分子基材の表面をプラズマ、スパッタリング、γ
線、オゾンまたは化学処理する方法は、いずれも慣用の
手段が用いられる。これらの表面処理により、高分子基
材表面に、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基
、ヒドロパーオキシド基、スルホ基、ニトロ基、アミノ
基、水酸基等の官能基が導入される。

上記処理において、プラズマ処理には慣用のプラズマ装
置が用いられ、例えば、ペルジャーにより構成される反
応容器内に対向する一対の電極を設け、その電極間に高
分子基材を保持した後、電極間に交流電源を接続して、
これにより電極間にプラズマを発生させ、このプラズマ
を高分子基材の表面に作用させる方法等が挙げられる。

スパッタリング処理には、慣用のスパッタリング装置が
用いられ、高分子基材は、真空槽内の陰極の近傍に配設
され、励起された正イオンは高分子基材に衝突し、その
運動エネルギーで基材表面が物理的に改質される。さら
に、雰囲気ガス中に、含酸素化合物（例えば、酸素ガス
、水等）、含窒素化合物（例えば、窒素ガス、アンモニ
ア等）のような反応しやすいガスを含む場合には、上記
スパッタリングにより活性化された表面と反応し、酸化
物、窒化物等が基材表面に導入され、基材表面の親水性
を一層高めることができる。

γ線照射処理に用いられる線源としては、一般にコバル
ト６０が利用される。照射線量は特に限定されず、基材
の種類、活性化させる程度等により適宜選択される。

オゾン処理する方法は、慣用の方法が用いられ、例えば
、高分子基材が配設された反応容器内に、オゾン発生装
置により発生させたオゾン（必要に応じて、アルゴン等
の不活性ガスとの混合ガスとして）を導入することによ
り行われる。所望に応じて、加圧条件下に行なってもよ
く、また有機溶媒等を用いてもよい。反応容器中のオゾ
ンの濃度は、通常０．２〜１０容量％、好ましくは０．
３〜３容量％とされ、反応は通常室温で行われる。

オゾン処理した後、通常の方法に従って、水洗、乾燥さ
れる。

化学処理は、上記基材に無機または有機試薬を作用させ
て行われ、作用させる試薬の種類により、またはその後
の処理により、種々の官能基、例えば、カルボニル基、
カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、アミノ基、チオー
ル基、水酸基等を基材表面に導入することができる。

上記化学処理は高分子基材の化学構造に応じて適宜選択
されるが、例えば、クロム酸、過酸、過酸化水素、過ヨ
ウ素酸、硝酸等の酸化剤で処理することにより、カルボ
ニル基、ヒドロパーオキシド基、アルデヒド基等が導入
される。さらに、これらの官能基は酸化または還元する
ことにより、カルボキシ基、水酸基等に変換することが
できる。

また、クロルスルホン酸、発煙硫酸等のスルホン化剤を
作用させることによりスルホ基を導入することができ、
発煙硝酸、濃硝酸、硝酸と硫酸混合酸等のニトロ化剤を
作用させることによりニトロ基を導入することができ、
該ニトロ基は還元することによりアミノ基に変換するこ
とができる。さらに、ハロゲン含有ポリマーにあっては
、ジチオカーバメート誘導体と反応させた後、加水分解
してチオール基を導入することもできる。

なお、化学処理は、上記の例に限定されるものではなく
、いわゆる高分子反応として、高分子と無機または有機
の低分子化合物との反応として知られている全ての反応
が適用できる。

上記プラズマ、スパッタリング、γ線、オゾンまたは化
学処理がなされ、全面に親水性官能基が導入された基材
表面に、紫外線、電子線またはイオンのいずれかを部分
的に照射処理して、照射部分の官能基を変換したり、表
面の物理的形状を変化させる。紫外線、電子線またはイ
オンの部分的照射は、例えば、マスクの使用や、ビーム
を絞ることにより、ｐの単位で処理することができる。

この際、パターン化、特に、格子模様、縞模様、水玉模
様等の微細模様を形成するように処理するのが好ましい
。

上記紫外線処理に使用される紫外線としては、高分子材
料の表面で化学反応を生じさせる波長のものが使用され
、紫外線のうち、２００ｎｍ未満の遠紫外線は、光エネ
ルギーが大きいため、より効率的に処理することができ
る。

なお、上記紫外線を放射する光源としては、クセノンア
ーク、メタルハライドランプなども使用できるが、大面
積の処理が可能な水銀灯やコヒーレントで微細加工が可
能なレーザが好適に用いられる。上記水銀灯としては、
３８８ｎｓの波長が主である高圧水銀灯、２５３．７ｎ
−および１８４．９ｎ−の波長の光を同時に放射する低
圧水銀灯が例示できる。

また、レーザとしては、Ａｒ、Ｈｅ−Ｃｄ、Ｎ２等のレ
ーザの他に、短波長と高出力の光を放射するエキシマレ
ーザが利用できる。エキシマレーザは、短時間に高いエ
ネルギーを基材に与え、基材を化学的および物理的に大
きく改質できるため、好適に用いられる。

電子線処理における電子線源としては、各種の電子線加
速機、コックロフトワルソン型、バンプグラフ型、共振
変圧器型等が使用でき、また照射線量としては、１〜５
０　Ｍ　ｒａｄ程度が用いられる。

イオン処理は、慣用のイオンビーム照射装置が用いられ
、マスクや集束イオンビームの採用により、部分的、微
細模様に照射される。イオンとしては、各種のイオンを
用いることができ、特に限定されないが、Ｈｅ中、Ａｒ
＋、Ｃ＋、Ｎ十等のイオンを例示することができる。ま
た、好適なイオンエネルギーの値としては０．０５ｋｅ
ｖ〜５００Ｋｅｙが挙げられ、この値未満では効果が小
さく、またこの値を越えると基材の炭化が顕著に進み好
ましくない。

この発明の細胞培養基材は、上記の処理が行われた後、
その表面に糖蛋白質等を担持することにより製造される
。ここで用いる糖蛋白質等は、細胞と親和性があり、基
材と細胞の接着を促進するものであればいずれも用いる
ことができ、例えば、ラクトース、ガラクトース等のオ
リゴ糖、アルブミン等の蛋白質、リン脂質等の脂質、グ
ロボシド、ガングリオシド等の糖と脂質との数合体であ
る糖脂質、細胞質や血清中に含まれる脂質と蛋白質との
複合体であるリボ蛋白質、糖と蛋白質との複合体である
糖蛋白質等が挙げられ、特にオリゴ糖、コラーゲン、ゼ
ラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロネクチ
ン、ビトロネクチン、フィブリン等の糖蛋白質が好適に
用いられ、これらは２種またはそれ以上組み合せて使用
することも有用である。基材上に糖蛋白質等を担持する
方法は、従来の技術がいずれも応用できる。一般には、
上記処理された高分子基材を、上記の糖蛋白質等の１種
類または２ｆ！ｌｉ類以上を含有する溶液に浸漬したり
、または該溶液を基材表面に塗布した後、乾燥すること
により行われる。この際、糖蛋白質等が変性しにくい条
件で乾燥するのが好ましい。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げラレ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞ＨｅＬａ、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５、ヒト肝
由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｌｖｅｒ　、ヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞ＩＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来ナマルバ
細胞等が例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の条
件で培養が行なわれる。

本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。

本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、第１図に基づいて説明すると以下の
通りである。

第１図に示す細胞培養器は、サポートスクリーン■上に
載置されたフィルム状細胞培養用基材（１）の両端が、
ポリカーボネート等からなるハウジング口）内の両側に
設けられたスペーサ（６）により保持されている。また
、上記ハウジングＧ）には、増殖させる細胞懸濁液をハ
ウジングＧ）内に満すための孔（４）が設けられている
と共に、培養液を潅流させるための管（５）が取付られ
ている。なお、上記孔（４）は、細菌等が侵入するのを
防止するため、フィルタ付きの蓋（７）で被冠されてい
る。

上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔（４）から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材（１
）上に接着させると共に、前記孔（４）をフィルタ付き
の上記蓋ａ）で被冠し、所定の培養条件の下、上記培養
液を前記管（５）を通じて所定時間潅流させることによ
り行なわれる。

〈実施例および比較例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１並びに比較例１および２ ポリエチレンテレフタレートフィルム（膜厚１００μｍ
、径４５ｍ−φの円形フィルム）を１３．５８　ＭＨｚ
の高周波電源を有するペルジャー型プラズマ装置に設置
し、アンモニアガスを１０ｃｃ／分で流しながら、放電
出力６０Ｗ、圧力０．３５ＴＯｒｒ％処理時間１０分の
条件で処理した。このフィルムの処理面にＤｅｅｐ　Ｕ
Ｖ露光装置により石英板上に画かれたクロムマスクの画
像を通して、波長２５０〜３００ｎ■の紫外線を照射し
、１μ−幅の間隔で紫外線処理部と未処理部が交互に並
ぶパターンが形成された処理フィルムを得た。これを４
５ｍｍφのガラスシャーレにセットし、高圧蒸気滅菌後
、無菌のフィブロネクチン（シグマ社製、牛血清より採
取）のトリス緩衝溶液（濃度０．１ｗ／ｙｆ）をフィル
ム全面に濡らし、１０分後、溶液を排出して、室温で乾
燥させた。このシャーレにヒト由来子宮頚部癌細胞（Ｈ
ｅｌａ　５−３）を培養した。培養液は、１０％牛脂児
血清を含むイーグルＭＥＭ培地で、培養液１′Ｍ１当り
２Ｘ１０４個の培養細胞を播種し、５％炭酸ガス、９５
％空気雰囲気、温度３７℃の環境下、３日間の培養を行
なったところ、培養液１１１当り、平均３．３Ｘ１０Ｓ
個の細胞数となり、良好な増殖が観察された。

一方、ポリエチレンテレフタレートフィルムをそのまま
用いた他は、実施例１と同様に試験を行なった比較例１
では、培養液１１！当り平均１．１×１０５個の細胞数
となった。

またポリエチレンテレフタレートフィルムを実施例１と
同様のプラズマ処理を行なっただけのフィルムを実施例
１と同様に培養試験を行なった比較例２では、培養液１
１１当り平均１．８×１０５個の細胞数となった。

実施例２ ポリエーテルスルホン（ＩＣ１社製、５２００Ｐ）をＮ
−メチル−２−ピロリドンに溶解し、２７重量％溶液を
調整した。この溶液をガラス板上にドクターナイフで厚
さ３００−に流延し、一定時間放置後、ガラス板ごと温
度１５℃に保たれたＮ−メチル−２−ピロリドン５％水
溶液中に浸漬し、凝固させ多孔質フィルムを得た。この
多孔質フィルムを５０　ｍｍφの円形に打抜き、実施例
１で用いたのと同じペルジャー型プラズマ装置に設置し
、窒素ガスを１０ｃｃ／分で流しながら、放電出力８０
Ｗ１圧力０．３０Ｔｏｒｒｓ処理時間１０分の条件で処
理した。

処理したフィルムを電子線描画装置にセットし、プラズ
マ処理面に、加速電圧１５ＫｅＶで照射部２７７１幅、
未照射部２μ思幅が交互に並ぶ縞模様の電子線パターン
処理を行なった。このフィルムをプラズマ処理−電子線
処理された面が上に向くように添付図面に示す細胞培養
器（内径４７ｓｓφ）に装着し、全体を高圧蒸気滅菌後
、無菌のコラーゲン溶液（タイプ■、濃度０．３％）を
孔（４）から注入し、１０分間静置後、溶液を排出し、
室温で乾燥させた。続いて、孔（４）からハムスター仔
腎由来細胞（ＢＨＫ−２１）のイーグルＭＥＭ培地（１
０％牛脂児血清添加）懸濁液（細胞数２．１×１０４個
／１りを満した。孔（４）には、細菌等をカットするフ
ィルタ付きの蓋（７）をし、管（５）を通して新鮮なイ
ーグルＭＥＭ培地を潅流し、３７℃で１週間培養を行な
った。培養終了後、フィルムに付着している細胞をトリ
プシン−ＥＤＴＡ溶液で分離し、細胞数を計算したとこ
ろ３．５×１０５個／ν！であった。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、プ
ラズマ、スパッタリング、γ線、オゾンまたは化学処理
のいずれかにより表面処理されて親水性官能基が導入さ
れた高分子基材表面が、紫外線、電子線またはイオンに
より部分的に照射処理され、微細模様が形成されており
、糖蛋白質等を基材表面に強固かつその高次構造を維持
した状態で固定化することができ、また高次構造を維持
した状態で固定化された糖蛋白質等は細胞との親和性に
優れ、細胞との接着性が高まると共に細胞を伸展、増殖
に適した形態、配置で接着させることができるので、高
密度かつ長期間の細胞培養が可能になるという特有の効
果を奏する。従って、この発明の細胞培養用基材は、動
物細胞の培養によるホルモン等の有用物の生産システム
に利用できる他、例えばインスリン産生細胞を基材表面
に接着、培養することにより人工膵臓が形成できるよう
に人工臓器の構築に利用できる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器の一例
を示す断面図である。 （１）・・・細胞培養用基材、（２）・・・サポートス
クリーン、（３）・・・ハウジング、（４）・・・孔、
（５）・・・管。 特許出願人　　住友電気工業株式会社 （ほか３名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プラズマ、スパッタリング、γ線、オ ゾンまたは化学処理のいずれかにより全 面処理され、さらに紫外線、電子線また はイオンのいずれかによる部分的な照射 処理がされた高分子基材表面に、糖、蛋 白質、脂質およびそれらの複合体のいず れか１種類以上が担持されていることを 特徴とする細胞培養用基材。 ２、高分子基材が多孔性である上記特許請 求の範囲第１項記載の細胞培養用基材。 ３、高分子基材が中空糸である上記特許請 求の範囲第１項または第２項記載の細胞 培養用基材。 ４、紫外線、電子線またはイオンのいずれ かによる部分的な照射処理が、格子模様 に処理するものである上記特許請求の範 囲第１項記載の細胞培養用基材。 ５、紫外線、電子線またはイオンのいずれ かによる部分的な照射処理が、縞模様に 処理するものである上記特許請求の範囲 第１項記載の細胞培養用基材。 ６、紫外線、電子線またはイオンのいずれ かによる部分的な照射処理が、水玉模様 に処理するものである上記特許請求の範 囲第１項記載の細胞培養用基材。