CN1164622C - 光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法包括首先在紫外光辐照下，将聚合物材料在过氧化氢溶液中氧化，以在聚合物材料表面引入大分子过氧化氢基团，然后利用氧化后的聚合物材料表面的大分子过氧化氢基团作为引发剂，引发含有活性官能团的乙烯基单体在聚合物材料表面的自由基接枝聚合反应，将活性官能团引入到材料表面，再与生物活性因子反应，将生物活性因子共价健合于聚合物材料表面，赋于聚合物材料表面良好的细胞相容性和生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法。
背景技术
生物材料可以定义为直接和生理环境相接触的材料。在应用中，生物材料不可避免的与人体内的各种细胞、组织和器官相接触，因此要求材料具有良好的细胞相容性。生物材料的细胞相容性主要是指生物材料与组织接触时不会对组织中的细胞产生毒害作用，并要求材料表面有利于细胞的粘附，并有促进细胞的铺展，迁移、分化、并维持细胞正常的表型和细胞正常生理功能(如软骨细胞的分泌蛋白多糖和II型胶原的功能)的作用。
人工合成的聚合物材料由于具有良好的物理机械性能和可加工性已被广泛地应用于生物医用领域如人造器官、组织工程，骨组织修复、外科整形以及药物控释等。例如利用可降解聚合物材料聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)或其共聚物(PLGA)做成的三维多孔支架材料已被应用于骨组织工程和软骨组织工程。其作用是为细胞提供一个赖以生存的三维立体环境。然而绝大多数人工合成的聚合物材料都具有较强的疏水性，其表面也都是化学惰性的，导致这些聚合物材料的生物相容性尤其是细胞相容性不理想。例如聚乳酸，有研究表明由于其较高的疏水性使得细胞在其表面的粘附率很低，细胞在三维支架内较难贴壁和铺展，大大限制了其作为可降解组织工程支架材料的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了提高人工合成聚合物材料的细胞相容性，提出光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法。
本发明提出的制备细胞相容性生物材料的方法包括首先在紫外光辐照下，将聚合物材料在过氧化氢溶液中氧化，以在聚合物材料表面引入大分子过氧化氢基团，然后利用氧化后的聚合物材料表面的大分子过氧化氢基团作为引发剂，引发含有活性官能团的乙烯基单体在聚合物材料表面的自由基接枝聚合反应，将活性官能团引入到材料表面，再与生物活性因子反应，将生物活性因子共价健合于聚合物材料表面，赋于聚合物材料表面良好的细胞相容性和生物活性。
本发明提出的光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法包括以下步骤：
1)将聚合物材料放入浓度为10～40％的过氧化氢溶液中，在紫外光辐照下氧化，氧化温度20～80℃，时间0.1～10小时，在聚合物材料表面引入大分子过氧化氢基团，去离子水冲洗，除去游离的过氧化氢分子；
2)将氧化后的聚合物材料浸于浓度为1～20％含活性官能团的乙烯基单体溶液中，然后除氧充氮，在紫外光辐照下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，反应温度20～50℃，时间20～80min；
或者将氧化后的聚合物材料浸于浓度为1～20％的含活性官能团的乙烯基单体溶液中，除氧充氮，在亚铁离子存在条件下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，单体中亚铁离子的浓度为0.01～0.1M，反应温度20～50℃，时间20～80min；
或者将氧化后的聚合物材料浸于浓度为1～20％的含活性官能团的乙烯基单体溶液中，将单体预先吸附在材料表面，然后将材料取出，除氧充氮，在紫外光辐照下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，反应温度20～50℃，时间20～80min；
3)采用甲基磺酰氯法或碳化二亚胺脱水缩合法将生物活性因子共价健合于上述步骤2)所得材料表面。
发明中所说的聚合物材料是聚氨酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯和聚氯乙烯的二维膜和三维多孔支架。
发明中所说的含活性官能团的乙烯基单体是含有酰氨基团的丙烯酰氨和甲基丙烯酰胺，含有羧基的丙烯酸和甲基丙烯酸，含有羟基的甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯醇、烯丙氧基乙醇，含有磺酸基团的苯乙烯磺酸及其钠盐、钾盐、铵盐等。
发明中所说的生物活性因子是指具有良好生物相容性的胶原、明胶、壳聚糖、硫酸软骨素；具有抗凝血功能的肝素和水蛭素；具有促进细胞粘附和增值功能的纤维粘连蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列肽段、多聚赖氨酸、层粘连蛋白，具有促进细胞分化的分化诱导因子骨形态发生蛋白。
本发明中将生物活性因子共价健合于经接枝聚合反应的材料表面，即生物活性因子固定化可采用甲基磺酰氯法实现或采用碳化二亚胺脱水缩合法实现。
甲基磺酰氯法包括先将经接枝聚合反应后，表面引入羟基的聚合物浸于甲基磺酰氯的乙醚溶液中，甲基磺酰氯的体积浓度为1～20％，反应温度10～30℃，时间0.5～20小时，利用甲基磺酰氯与聚合物材料表面的羟基反应使羟基活化，然后再浸入含生物活性因子的水溶液中，使活化后的羟基与生物活性因子中的氨基反应，生物活性因子的浓度为1～100mg/ml，反应温度0～50℃，反应时间1～24小时。
碳化二亚胺脱水缩合法包括先将经接枝聚合反应后，表面引入羧基的聚合物浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中进行。反应温度为0～400C，反应时间为1～24小时。利用水溶性的碳化二亚胺将羧基活化，然后再浸入含生物活性因子的水溶液中，使活化的羧基与生物活性因子中的氨基反应，生物活性因子的浓度为1～100mg/ml，反应温度0～50℃，反应时间1～24小时。
本发明的方法，通过对材料表面的化学改性，可在原本呈化学惰性的聚合物表面引入化学活性基团，使聚合物材料表面具有良好的化学活性，进一步将一些具有良好细胞相容性或特定功能的生物活性因子引入材料表面，从而赋予材料表面良好的细胞相容性或特定的生物活性，同时本发明对聚合物材料本体的良好的物理机械性能没有影响。
附图说明
图1 表面接枝聚甲基丙烯酸的PU平面膜(a)和其表面进一步固定明胶后的PU膜(b)的XPS谱图中的C1s和N1s峰。明胶的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图2 人体血管内皮细胞在PU膜(a)和表面固定明胶后的PU膜(b，c，d)以及聚苯乙烯培养板(e)上的增殖率，其中固定明胶后的PU膜表面的N1s/C1s面积比分别为(b)5.58％，(c)6.55％，(d)7.89％细胞接种密度为15×104/ml。培养时间为4天。明胶的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图3 人体血管内皮细胞在表面固定明胶后的PU膜上的形态。其中膜表面的N1s/C1s面积比分别为(a)5.58％，(b)6.55％，(c)7.89％细胞接种密度为15×104/ml.培养时间为4天。明胶的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图4 表面接枝聚甲基丙烯酸的PU平面膜(a)和其表面进一步固定RGD后的PU膜(b)的XPS谱图中的C1s和N1s峰。RGD的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图5 人体血管内皮细胞在表面固定RGD后的PU膜上的形态。细胞接种密度为15×104/ml。培养时间为4天。RGD的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图6 表面固定不同生物活性因子前后PLLA膜的ATR谱图。其中a为未改性PLLA膜，b为表面固定明胶的PLLA膜，c为表面固定胶原的PLLA膜，d为表面固定壳聚糖的PLLA膜。I-酰氨I；II-酰氨II。生物活性因子的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图7表面固定不同生物活性因子前后PLLA膜XPS谱图中的C1s峰。其中a为未改性PLLA膜，b为表面固定明胶的PLLA膜，c为表面固定胶原的PLLA膜，d为表面固定壳聚糖的PLLA膜。(I)C-C；(II)C-O；(III)C(＝O)-NH；(IV)C(＝O)-O。生物活性因子的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图8a 软骨细胞在未改性PLLA膜上的激光共聚焦显微镜照片。FDA染色。
图8b 软骨细胞在固定胶原后的PLLA膜上的激光共聚焦显微镜照片。FDA染色。胶原的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图9 PLLA膜表面固定不同的生物活性因子前后软骨细胞在其表面的粘附率、增殖率和细胞活性。其中a为聚苯乙烯培养板，b为未改性PLLA膜，c为表面固定明胶的PLLA膜，d为表面固定胶原的PLLA膜，e为表面固定壳聚糖的PLLA膜。生物活性因子的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法。
图10 表面固定明胶后PLLA膜的XPS谱图。明胶的固定采用甲基磺酰氯法。
具体实施方式
实施例1
将聚氨酯(PU)平面膜于过氧化氢溶液(30v％)中氧化8小时，温度为50℃，氧化在紫外光下进行，紫外光由250W的高压汞灯提供。将氧化后的PU平面膜用大量去离子水冲洗，真空干燥后浸于盛有甲基丙烯酸(MAA)水溶液(10v％)的试管中放置2小时，将MAA预先吸附于PU平面膜表面。将膜取出，放置于石英聚合管中，除氧充氮后由紫外光引发MAA在PU膜表面的接枝聚合反应，紫外光仍然由250W的高压汞灯提供，接枝时间为1小时，温度为50℃。然后将PU平面膜浸于含有10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，反应在0℃下进行4小时，反应后PU平面膜表面的羧基被活化。再将PU平面膜与明胶的磷酸盐缓冲液溶液(10mg/ml)反应，反应在0℃下进行24小时。明胶被共价键合于材料表面。改性前后XPS谱图中的C1s和N1s峰的变化证明了PU膜表面明胶的存在(见表1和图1)。细胞培养结果表明表面固定明胶后的PU膜对人体血管内皮细胞的相容性明显提高(见图2和图3)
表1表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)的聚氨酯(PU)平面膜(PU-g-PMAA)和表面进一步固定明胶后的PU膜(PU-g-PMAA-b-Gelatin)表面的N1s/C1s面积比。明胶的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法
表1
接枝密度(×10-2mg/cm2) 4.97 14.29 21.56
N1s/C1s面积比(％，PU-g-PMAA) 2.45 2.22 2.05
N1s/C1s面积比(％，PU-g-PMAA-g-Gelatin) 5.58 6.55 7.89
实施例2
按照实施例1的方法，将明胶溶液换成含有10mg/ml精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(RGD)的磷酸盐缓冲液，其它条件不变，将RGD共价键和于PU平面膜表面。改性前后XPS谱图中的C1s和N1s峰的变化证明了PU膜表面RGD的存在(见表2和图4)。细胞培养结果表明表面固定RGD后的PU膜对人体血管内皮细胞的相容性明显提高(见表3和图5)
表2表面接枝PMAA的PU膜(PU-g-PMAA)和其表面进一步固定RGD后的PU膜(PU-g-PMAA-g-RGD)表面的N1s/C1s面积比。RGD的固定采用碳化二亚胺脱水缩合法
表2
样品 PU-g-PMAA PU-g-PMAA-g-RGD
N1s/C1s面积比(％) 2.05 5.49
表3人体血管内皮细胞在PU-g-PMAA-RGD和对照PU表面的粘附率和细胞活性(相对于组织培养级聚苯乙烯)。细胞接种密度15×104/ml。分别培养12小时和4天后测定细胞粘附率和增值率。
表3
样品 PU PU-g-RGD
细胞粘附率 54.8±5.0 125.0±3.5
细胞活性(％) 31.5±4.0 115.2±5.0
实施例3
将PLLA平面膜在过氧化氢溶液(30v％)中氧化40分钟，温度为50℃，氧化在紫外光下进行，紫外光由250W的高压汞提供。将氧化后的PLLA膜用大量去离子水冲洗，真空干燥后浸于盛有甲基丙烯酸(MAA)水溶液(10v％)的石英聚合管中，除氧充氮，由紫外光引发MAA在PLLA膜表面的接枝聚合反应。接枝时间为1小时，温度为50℃，紫外光仍然由250W的高压汞提供。然后，将平面膜浸于含有10mg/ml EDAC的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，反应在0℃下进行4小时，反应后PLLA平面膜表面的羧基被活化。再将PLLA平面膜与含有4mg/ml胶原的醋酸溶液(pH＝3)反应，反应在0℃下进行24小时。胶原大分子被共价键合于材料表面。材料表面被物理涂附的胶原与被共价键合于材料表面的胶原之间有较强的相互作用，因而也能够在材料表面稳定存在，大大提高了材料表面的胶原含量。改性前后的ATR谱图和XPS谱图中C1s峰的变化证明了PLLA膜表面胶原的存在(见图6和图7)。细胞培养结果表明该方法改性后的PLLA平面膜对软骨细胞的相容性明显提高(见图8a，图8b，图9)。利用同样的方法也可将明胶和壳聚糖固定在PLLA膜表面，提高其对软骨细胞的相容性(见图6和图7和图9)
实施例4
将PLLA平面膜在过氧化氢溶液(30v％)中氧化40分钟，温度为50℃，氧化在紫外光下进行，紫外光由250W的高压汞提供。将氧化后的PLLA膜用大量去离子水冲洗，真空干燥后浸于盛有甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)水溶液(5v％)的石英聚合管中，除氧充氮后由紫外光引发HEMA在PLLA膜表面的接枝聚合反应。接枝时间为1小时，温度为50℃，紫外光仍然由250W的高压汞提供。然后，将接枝PHEMA后的PLLA膜浸于含有10mg/ml甲基磺酰氯的乙醚中，25℃下反应2小时，PLLA平面膜表面的羟基被活化。然后将PLLA平面膜与含有4mg/ml明胶的磷酸盐缓冲液反应，反应在30℃下进行24小时。明胶被共价键和于PLLA平面膜表面。改性后XPS谱图中N1s峰的出现证明了明胶在PLLA膜表面的存在(见图10)。
Claims (3)
1.光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将聚合物材料放入浓度为10～40％的过氧化氢溶液中，在紫外光辐照下氧化，氧化温度20～80℃，时间0.1～10小时，在聚合物材料表面引入大分子过氧化氢基团，去离子水冲洗，除去游离的过氧化氢分子；
所说的聚合物材料是聚氨酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸—羟基乙酸、聚己内酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯和聚氯乙烯的二维膜和三维多孔支架；
2)将氧化后的聚合物材料浸于浓度为1～20％含活性官能团的乙烯基单体溶液中，然后除氧充氮，在紫外光辐照下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，反应温度20～50℃，时间20～80min；
或者将氧化后的聚合物材料浸于浓度为1～20％的含活性官能团的乙烯基单体溶液中，除氧充氮，在亚铁离子存在条件下，单体中亚铁离子的浓度为0.01～0.1M，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，反应温度20～50℃，时间20～80min；
或者将氧化后的聚合物材料浸于浓度为1～20％的含活性官能团的乙烯基单体溶液中保持1～10小时，将单体预先吸附在材料表面，然后将材料取出，除氧充氮，在紫外光辐照下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，反应温度20～50℃，时间20～80min；
上述的含活性官能团的乙烯基单体是含有酰氨基团的丙烯酰氨和甲基丙烯酰胺，含有羧基的丙烯酸和甲基丙烯酸，含有羟基的甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯醇、烯丙氧基乙醇，含有磺酸基团的苯乙烯磺酸及其钠盐、钾盐、铵盐；
3)采用甲基磺酰氯法或碳化二亚胺脱水缩合法将生物活性因子共价健合于上述步骤2)所得材料表面；
所说的生物活性因子是指具有良好生物相容性的胶原、明胶、壳聚糖、硫酸软骨素；具有抗凝血功能的肝素和水蛭素，具有促进细胞粘附和增殖功能的纤维粘连蛋白、精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸序列肽段、多聚赖氨酸、层粘连蛋白，具有促进细胞分化的分化诱导因子骨形态发生蛋白。
2.按权利要求1所述的光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法，其特征在于所说的甲基磺酰氯法包括先将经接枝聚合反应后表面引入羟基的聚合物浸于甲基磺酰氯的乙醚溶液中，甲基磺酰氯的体积浓度为1～20％，反应温度10～30℃，时间0.5～20小时，然后浸入含生物活性因子的水溶液中，生物活性因子的浓度为1～100mg/ml，反应温度0～50℃，反应时间1～24小时。
3.按权利要求1所述的光氧化接枝与生物活性因子固定化制备细胞相容性生物材料的方法，其特征在于所说的碳化二亚胺脱水缩合法包括先将经接枝聚合反应后表面引入羧基的聚合物浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，反应温度为0～40℃，反应时间为1～24小时，然后浸入含生物活性因子的水溶液中，生物活性因子的浓度为1～100mg/ml，反应温度0～50℃，反应时间1～24小时。
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