CN101381676A - 贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物工程技术领域的贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置及方法，所述装置三维复合多孔支架和配套冻存瓶。三维复合多孔支架以承载培养的贴壁细胞形式垂直叠加置入冻存瓶。三维复合多孔支架由含钙生物陶瓷原料和有机凝胶及黏合性高分子，冷冻干燥制得。利用三维复合多孔支架以静置培养或连续灌注培养方式扩增贴壁细胞，而后直接以原培养态置入冻存瓶，加入冻存保护液，即可冻存。复苏时可直接水浴后稍加去除冻存液的清洁步骤即可正常继续培养。本发明使贴壁细胞常规扩增及冻存速率快、环节少、安全性好、操作简便、存活率高，在冻存中及复苏后能良好保持原来生长状态，并可在任何时刻冻存，不受时间与日程的限制。

Description

贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置及方法
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的装置及方法，具体是一种贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置及方法。
背景技术
三维支架培养是实验室贴壁细胞扩增培养方法中较先进高效的一种培养手段，能够避免因培养过程中出现细胞接触抑制而降低扩增速率的弊端。但在细胞收集、消化传代、冻存后重新复苏方面，仍有诸多困难，如：(1)正因细胞生长良好密度较高，消化的效率很难均一，消化水平与受损程度有极大差别；(2)由于细胞生长到生物陶瓷等三维支架载体内部，纵然达到理想的酶解水平，但至今无将细胞驱出支架诸多大孔径以便收获保存的安全有效的操作技巧，尤其是当不破碎、损坏支架完整体系的情况下，获得扩增的贴壁细胞(而非单纯检测所需指标，以牺牲细胞及生物载体骨架为代价)，则当今实验室操作技术及装置更处于空白阶段；(3)普通生物载体多是高钙含量的陶瓷支架，其质地与胶原组织相差很远，且生物亲和力相对较差，很难真实模拟体内微重力环境下贴壁细胞(如骨髓腔中骨髓间充质干细胞)的疏松网孔系统中柔和且具一定抗压弹力的生长环境；(4)将细胞消化后收集，再离心，加入冻存液的过程不但烦琐费力，而且大大增加了培养后染菌的机会，且该过程严重的降低了细胞活力；(5)在培养中如遇紧急变故，需要临时中断培养，则基本无计可施，只能强制消化冻存或放弃培养，不能随工作人员的需要任意指定终端的冻结时间点，并且在设计实验中，当培养周期很长，而工作人员在该周期需要流动或外出，不能持续关注(换液、检菌及实验指标检测等)培养细胞时，实验则不能进行。
经对现有技术的文献检索发现，《中国实验血液学杂志》杂志2003年11期李秀森等人发表的《人骨髓间充质干细胞原位冷冻保存方法的改进》以及《军事医学科学院院刊》杂志1998年3月期刊中卢柏松等人的《中国仓鼠卵巢细胞集落的简易原位贴壁冻存方法》文中，已产生了贴壁细胞原位冻存的思想，但以上二者都是针对二维平板的原位冻存技术，其作用相对来说更狭窄，保存的细胞数量有限，投入产出比较低，并且都将整个培养器皿加以共同冻存，致使对器皿有部分损伤，可能影响后续复苏和再扩增。同时，由于本身冻存的是培养器皿，体积过大的限制，无法放入液氮罐，而只能放入-70℃冰箱冷藏，其冻存效果不易达到标准冻存要求(液氮保存)。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置及方法，使贴壁细胞常规扩增及冻存方法速率快、环节少、安全性好、操作简便、存活率高。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明所涉及的实验室贴壁细胞三维支架培养及冻存装置，包括三维复合多孔支架和配套冻存瓶。三维复合多孔支架以承载高密度培养的贴壁细胞形式垂直叠加置入冻存瓶，达到原位冻存的目的。
所述三维复合多孔支架，为片状，其显微结构为疏松多孔(孔径为30-100μm)的海绵状刚性骨架，与人体骨髓腔环境类似。
所述冻存瓶为圆柱内腔玻璃瓶，垂直叠放两块或三块三维支架。
所述冻存瓶由内腔圆柱体的瓶身和塑料螺丝口密封瓶盖组成。
本发明所涉及的贴壁细胞三维支架立体培养及原位冻存方法，利用三维复合多孔支架在普通平板或生物反应器内以静置或连续灌注培养方式扩增贴壁细胞，而后直接以原培养态置入冻存瓶，加入二甲亚砜(DMSO)为代表的冻存保护液，即可冻存。复苏时可直接水浴后稍加去除冻存液的清洁步骤即可正常继续培养。
本发明包括以下步骤：
第一步，制备三维复合多孔支架：由含钙生物陶瓷原料(如β-磷酸三钙)和有机凝胶及黏合性高分子通过二次冻干共制而成。
所述制备三维复合多孔支架，具体为：
精确称量10g β-磷酸三钙(β-TCP)加入纯净水50ml，加热下搅拌30min，用超声波处理10min—15min，加入明胶(10％)与壳聚糖(5％)各25ml，另加入羧甲基纤维素钠0.5g；加热搅拌20min，得到低粘度的热熔胶；将普通滤纸在低浓度(0.05mol/l)戊二醛溶液中充分浸泡，铺在平置锡箔纸上，把上下相通的内腔约2cm左右直径、厚度约5mm的片柱状模具(一片模具板可包含十几至几十个腔洞)置于其上，将上述热熔胶倾倒在模具孔内至平齐孔边缘，所有孔倒满后再在顶端附上另一张浸泡戊二醛溶液的滤纸，并用平面重物置于其上，20min后-20℃冷冻2小时，-70℃冷冻过夜，冻干机内干燥30小时，取出后加总计10ml的0.5mol/l硼氢化钠均匀分配于每个孔，静置3小时以上，-70℃预冷冻过夜，二次冻干30小时，制得多孔复合支架载体。
第二步，灭菌后，PBS缓冲液冲洗三维复合支架5次，在无菌培养基中浸泡过夜，换液，在三维复合多孔支架上方接种贴壁细胞悬液，使其被多孔支架吸收，渗入多孔骨架内，将支架-细胞复合体在培养液中培养。
第三步，冻存时直接用无菌匙取出支架小块，沥干培养液或用无菌含血清的培养液冲洗一次再稍稍沥干，置入冻存瓶，加入冻存液至浸没三维复合多孔支架5mm左右，采用程序冻存或分步冻存，最终保藏在液氮中。
第四步，复苏时直接将冻存瓶在37℃水浴中(轻微晃动)解冻一分钟，取出三维复合多孔支架用培养基冲洗并浸泡培养基片刻，换液即可继续培养。
本发明所能带来的优势主要表现在高效快速的细胞扩增速率和较高存活率上，在实施例中，骨髓间充质干细胞经三维培养，利用CCK-8试剂盒检测细胞活力、ALP试剂盒检测碱性磷酸酶水平，证实了细胞扩增速率可提高6倍(相对于二维平板)且总体成骨分化能力也提高了6倍，对于急需骨骼修复的患者而言，等待周期可减少为六分之一。经原位冻存复苏后，经测定冻存前后同等细胞样品细胞存活率相对于传统二维平皿培养提高了50％至70％。通过电镜扫描显示，间充质干细胞与三维支架有很好的相容性，胞外基质与支架载体表面良好相融，呈现多方向性成纤维细胞样形态。总体操作过程前后减少了7个环节，时间和人力大大降低，且染菌风险极大水平的减少。
附图说明
图1为本发明装置的结构示意图
图中1为冻存瓶盖、2为三维复合多孔支架、3为冻存瓶身。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例所涉及的实验室贴壁细胞三维培养并原位冻存装置，包括冻存瓶瓶盖1、三维复合多孔支架2、冻存瓶瓶身3。冻存瓶瓶盖1和冻存瓶瓶身3组成冻存瓶。
所述冻存瓶盖1为螺丝口可密封普通塑料，可根据需要在瓶盖内腔顶部垫一橡胶垫片便于密封。
所述三维复合多孔支架2为直径2cm左右、高度5mm的圆片状疏松多孔生物载体。显微结构特征为多孔海绵状刚性骨架。
所述冻存瓶瓶身3为玻璃制备，内腔为圆柱状，内腔高度为2cm至2.5cm，可容纳2或3片三维支架载体垂直叠放并加入二甲亚砜等冻存保护液。外形为长方体便于在保存时互相紧靠节省空间，与内腔最薄厚度应达到0.5cm以上，则既不会在冷冻与水浴时破损，又能很好的传热。
相比于所查阅文献中，二维原位冻存体积过大，冻存密度过低；收集后冻存细胞生存率不高，破坏生长状态而言，本实施例可整齐排列冻存瓶，方便分别单独冻存单独复苏，不会互相污染。在冻存中及复苏后能良好保持原来生长状态，并可在原则上任何时刻冻存，不受试验者时间与日程的限制。
本实施例中，三维复合多孔支架2制备工艺为：无机生物陶瓷原料粉末以50ml，加热下搅拌混溶并略加超声震荡处理，在搅拌下加入有机水凝胶的热溶胶液以及少量辅助增稠成型的聚纤维素类高分子溶液，在上下相通的内径约2cm左右直径、厚度约5mm的片柱状模具(一片模具板可包含十几至几十个腔洞)底部垫一张浸泡中低浓度戊二醛溶液的滤纸，将热熔胶倒入模具腔，倒满后，模具板上板面再轻轻贴上一张同上所述的滤纸，用平板压实。模具以及内含支架于4℃冷藏，共同放入-20℃预冷冻，再于-70℃冷冻过夜，用冷冻真空干燥机冻干30小时左右至干燥。揭去上下板面的滤纸，加入硼氢化钠足量保证去除游离的戊二醛，静置3小时以上，-70℃预冷冻过夜，再次冻干30小时，制得疏松多孔并具备高生物亲和力的三维支架。
实施例2
本实施例所涉及的实验室贴壁三维支架培养和原位冻存方法，以培养骨髓间充质干细胞(MSC)为例：
(1)制备三维支架工艺：以β-磷酸三钙(β-TCP)为原料10g，纯净水混溶50ml，加热下(80℃以上)搅拌30min，超声震荡处理10min，边搅拌下边加入体积浓度为5％壳聚糖和体积浓度为10％明胶各25ml以及少量羧甲基纤维素钠，加热搅拌，模具板底部垫上浸过低浓度0.05mol/l戊二醛溶液的滤纸，将热熔胶倒满模具腔后，模具板上板面轻轻贴上一张同上所述的滤纸，用平板压实。经-20℃预冷冻2小时，及-70℃超低温冷冻过夜，用冷冻真空干燥机冻干30小时左右至干燥。揭去上下板面的滤纸，加入0.5mol/l硼氢化钠足量保证去除游离的戊二醛，静置3小时以上，-70℃预冷冻过夜，再次冻干30小时，制得疏松多孔并具备高生物亲和力的三维复合多孔支架。
(2)在平皿或反应器内放入灭菌的三维复合多孔支架，灭菌方法采用干热灭菌，并建议用无菌培养液冲洗并浸泡。缓慢滴加MSC细胞悬液，至完全被疏松多孔的无菌干燥三维复合多孔支架吸收，加入培养基，37℃二氧化碳培养箱中培养，根据实验需求定期换液。
(3)冻存时直接用无菌匙取出支架小块，沥干培养液或用无菌含血清的培养液冲洗一次再稍稍沥干，置入冻存瓶，加入冻存液二甲亚砜(DMSO)至浸没三维复合多孔支架5mm左右，采用程序冻存或分步冻存，最终保藏在液氮中。
(4)重新复苏时，将冻存瓶在37℃水浴一分钟内解冻，在超净工作台中，将支架用无菌匙取出或倒出在无菌平皿中，吸走DMSO，反复用无菌培养基冲洗去除DMSO，按照正常培养方式，继续进行三维复合多孔支架培养。
由于此实施例中β-TCP具有高生物亲和力，与水凝胶共制成具有一定抗压强度、较好柔韧度、低脆碎度的生物载体，与胞外胶原纤维和糖蛋白等结构类似，在冻存时能较好的保护细胞，不受到冰晶的损伤。

Claims (10)

1.一种贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置，其特征在于，包括三维复合多孔支架和配套冻存瓶，三维复合多孔支架以承载培养的贴壁细胞形式垂直叠加置入冻存瓶，其中：
所述三维复合多孔支架，为片状，其显微结构为疏松多孔的海绵状刚性骨架，其孔径为30-100μm；
所述冻存瓶为圆柱内腔玻璃瓶，垂直叠放两块或三块三维复合多孔支架。
2.根据权利要求1所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置，其特征是，所述冻存瓶由内腔圆柱体的瓶身和塑料螺丝口密封瓶盖组成。
3.根据权利要求2所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置，其特征是，所述瓶盖腔顶部设有无菌橡胶垫片。
4.根据权利要求1所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存装置，其特征是，所述三维复合多孔支架为直径2cm左右、高度5mm的圆片状疏松多孔生物载体。
5.一种贴壁细胞三维支架培养原位冻存方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步，制备三维复合多孔支架：由含钙生物陶瓷原料和有机凝胶及黏合性高分子通过二次冻干共制而成；
第二步，在三维复合多孔支架上方接种贴壁细胞悬液，使其被多孔支架吸收，渗入多孔骨架内，将支架-细胞复合体在培养液中培养；
第三步，冻存时直接用无菌匙取出支架小块，沥干培养液或用无菌含血清的培养液冲洗一次再稍稍沥干，置入冻存瓶，加入冻存液至浸没三维复合多孔支架5mm左右，采用程序冻存或分步冻存，最终保藏在液氮中；
第四步，复苏时直接将冻存瓶在37℃水浴中解冻一分钟，取出三维复合多孔支架用培养基冲洗并浸泡培养基片刻，换液继续培养。
6.根据权利要求5所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存方法，其特征是，所述制备三维复合多孔支架，具体为：
称量10g β-磷酸三钙加入纯水50ml，加热下搅拌30min，用超声波处理后，加入明胶壳聚糖各25ml，另加入羧甲基纤维素钠0.5g，加热搅拌20min，得到低粘度的热熔胶；将普通滤纸在戊二醛溶液中充分浸泡，铺在平置锡箔纸上，把上下相通的片柱状模具置于其上，将上述热熔胶倾倒在模具孔内至平齐孔边缘，所有孔倒满后再在顶端附上另一张浸泡戊二醛溶液的滤纸，并用平面重物置于其上，约20min后，-20℃冷冻2小时，-70℃冷藏过夜，冻干机内干燥30小时，取出后加10ml的硼氢化钠于每个孔，静置3小时以上，-70℃预冷冻过夜，二次冻干30小时，制得三维复合多孔支架。
7.根据权利要求5所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存方法，其特征是，所述明胶，其体积浓度为10％；所述壳聚糖，其体积浓度为5％。
8.根据权利要求5所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存方法，其特征是，所述用超声波处理后，其超声波处理时间为10min—15min。
9.根据权利要求5所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存方法，其特征是，所述戊二醛溶液，其浓度为0.05mol/l；所述硼氢化钠，其浓度为0.5mol/l。
10.根据权利要求5所述的贴壁细胞三维支架培养原位冻存方法，其特征是，所述片柱状模具，其内腔直径2cm左右、厚度约5mm，一片模具板包含十几至几十个腔洞。
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