CN105383805B

CN105383805B - 生物组织样本的冻存方法和生物组织冻存容器

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Publication number: CN105383805B
Application number: CN201510691181.1A
Authority: CN
Inventors: 杜祥
Original assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Current assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CN105383805A

Abstract

本发明提供了一种生物组织的冻存方法和生物组织冻存容器，冻存方法包括：将生物组织置于承载片的表面，将粘附有生物组织的承载片沿生物组织冻存容器的长轴方向放置于生物组织冻存容器中，密封生物组织冻存容器并置于低温下冻存；冻存容器包括容器本体、密封盖和至少一个用于承载分离后的生物组织的承载片，该承载片可分离地置于容器本体内；本发明的冻存方法能够解决由于生物组织容易被冻存在生物组织冻存容器的内壁上而产生的生物组织不易被识别、不易被取出或者在取出时受损的问题，并且能避免生物组织在制作冰冻切片时被反复冻融的情况出现，从而有利于对生物组织的样本质量(例如所含的RNA、蛋白、抗原、抗体等生物大分子)的保护。

Description

生物组织样本的冻存方法和生物组织冻存容器

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，涉及一种生物组织的冻存方法和生物组织冻存容器。

背景技术

在研究生物体生命活动的过程中，常常将离体生物组织作为实验对象进行研究，这些组织包括正常组织或肿瘤组织等。

为了对生物组织的结构特性或生化特性进行更深入的研究，常常需要先对生物组织进行低温保存(例如在液氮中进行保存)，在冻存后不同的时候按需求再进行对这些生物组织的研究。冻存容器常被用来执行对生物组织的低温保存这一功能。

为了使冻存容器既能长期维持低温保存功能又能便于人们随时取出在冻存容器内保存的生物组织，冻存容器常常用耐低温的透明材料制成，例如聚三氟氯乙烯、聚四氟乙烯等；然而，如果冻存后的生物组织为白色或透明组织，当其粘附在冻存容器的内壁上时，往往与冻存容器的色差较小而不容易被人眼识别并取出。

另外，生物组织在低温下大多会冻成一团并且牢牢地粘贴在冻存容器的内壁上，通常呈团状沉积在冻存容器的最底部，这常常使得生物组织在低温下不易取出。若使用镊子等夹取装置从冻存容器上强行剥离生物组织，则有可能对生物组织的形态学造成不可逆的损害，进而影响到实验结果的稳定性。一般采取的方法是先将生物组织在常温下放置一定时间，待生物组织表面温度升高，处于解冻状态时，再取出生物组织并置于冰冻切片机的样品托上，使用冷冻包埋液包埋后再次低温冷冻，然后进行切片、染色以及进行形态学观察，或进行任何其他相关研究。这样的操作会造成生物组织的反复冻融，有可能对生物组织的结构产生影响，从而不利于后续的形态学观察，也可能造成生物组织内的RNA、DNA或蛋白质等大分子物质的变性和降解，从而影响到生物组织标本的质量，进而对实验结果产生不利的影响。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种生物组织的冻存方法，该方法一方面能够解决由于生物组织被冻存在冻存容器的内壁上而导致的不易被识别或者不易被取出的问题，另一方面能够避免生物组织在制作冰冻切片时被反复冻融，从而有利于对组织标本质量的保护。

本发明的另一个目的在于提供一种能够实现上述方法的生物组织冻存容器。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种生物组织的冻存方法，其包括如下步骤：

(1)、将分离后的生物组织置于承载片的表面；

(2)、将粘附有生物组织的承载片沿生物组织冻存容器的长轴方向放置于生物组织冻存容器中；

(3)、密封生物组织冻存容器并置于低温下冻存。

在本发明的优选实施例中，承载片可以为软木片。

在本发明的优选实施例中，软木片可以进一步含有以下组分：软木脂45±5wt％、木质素27±3wt％、纤维素12±3wt％、丹宁酸6±3wt％、蜡状物5±1wt％和杂质成分5±1wt％，其中，软木脂、木质素、纤维素、丹宁酸、蜡状物和杂质成分的重量百分比之和应为100wt％。

在本发明的优选实施例中，软木片可以优选为含有以下组分：软木脂45wt％、木质素27wt％、纤维素12wt％、丹宁酸6wt％、蜡状物5wt％和杂质成分5wt％；此时，软木片的抗拉强度为770N/mm²，或维氏硬度为240HV，或布氏硬度为228HB，或洛氏硬度为20.3HRC。

在本发明的优选实施例中，生物组织可以包括人体组织或哺乳动物器官组织。

在本发明的优选实施例中，低温优选为在‐20℃以下。

一种使用上述的冻存方法对生物组织进行冻存的生物组织冻存容器，包括：容器本体、与容器本体可拆卸连接的密封盖、以及至少一个用于承载分离后的生物组织的承载片，承载片沿容器本体的长轴方向可分离地置于容器本体内。

在本发明的优选实施例中，承载片可以为软木片。

在本发明的优选实施例中，软木片可以优选为含有以下组分：软木脂45±5wt％、木质素27±3wt％、纤维素12±3wt％、丹宁酸6±3wt％、蜡状物5±1wt％和杂质成分5±1wt％，但软木脂、木质素、纤维素、丹宁酸、蜡状物和杂质成分的重量百分比之和应为100wt％。

在本发明的优选实施例中，软木片的厚度可以为6±2mm。

在本发明的优选实施例中，容器本体的内底面可以设有至少一条用于固定承载片的端部的固定槽，固定槽的槽口宽度等于承载片的端部的厚度。

在本发明的优选实施例中，容器本体的内侧壁可以设有至少一个用于固定承载片的侧边部的卡合部。

在本发明的优选实施例中，卡合部可以为卡槽，卡槽的槽口宽度等于承载片的侧边部的厚度。

在本发明的优选实施例中，卡合部可以包括两个对向设置的卡槽，卡槽的槽口宽度等于或大于承载片的侧边部的厚度。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

首先，本发明采用与生物组织冻存容器可分离的承载片来承载分离后的生物组织，然后将承载有生物组织的承载片放入生物组织冻存容器中冻存，生物组织在被冻存时粘附在承载片上，而不会粘附到生物组织冻存容器的内壁上，从而解决了当前的冻存方法中由于生物组织块被冻存到生物组织冻存容器的内壁上而造成的不易被识别或不易被取出的问题。

其次，由于承载片具有良好的吸水性，而新鲜分离的生物组织是湿润的，故而很容易粘附在承载片上而不易移动位置，操作者可以在冻存之前就将生物组织调整到所需的位置；当此后需要使用该生物组织作冰冻切片时，可直接快速将承载片取出，无需等生物组织解冻即可直接制成冷冻切片或其他冷冻状态下的组织样品，使得生物组织在冰冻组织样品中很大程度保持冻存前的状态，能够避免在制作冰冻组织样品时对生物组织所进行的反复冻融，有利于降低反复冻融对生物组织造成的损害，例如降低反复冻融对其中所含的RNA、蛋白、抗原抗体等生物大分子所造成的损害。

附图说明

图1为本发明实施例二的生物组织冻存容器的示意图。

图2为本发明实施例二的放置了承载片的生物组织冻存容器的示意图。

图3为本发明实施例二的样品托的示意图。

图4为本发明实施例二中固定了承载片的样品托的侧视图。

图5为本发明实施例三的生物组织冻存容器的容器本体的示意图。

图6为本发明实施例四的生物组织冻存容器的容器本体的内底部示意图。

图7为本发明实施例四的放置了承载片的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

图8为本发明实施例四的放置了承载有生物组织的承载片的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

图9为本发明实施例五的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

图10为本发明实施例五的放置了承载片的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

图11为本发明实施例六的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

图12为本发明实施例六的放置了承载片的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

图13为本发明实施例六的放置了承载有生物组织的承载片的生物组织冻存容器的容器本体的俯视图。

附图标记：

生物组织冻存容器1、容器本体2、密封盖3、承载片4、生物组织5、容器本体6、支承架7样品托8、容器本体9、固定槽10、槽口11、承载片12、生物组织13、容器本体14、内侧壁15、卡合部16、承载片17、卡合部18、容器本体19、内侧壁20、卡槽21、承载片22和生物组织23。

具体实施方式

本发明提供了一种生物组织的冻存方法以及用于实现该方法的生物组织冻存容器。以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一

一种生物组织的冻存方法，包括如下步骤：

(1)、将所需的生物组织从生物体内分离；

(2)、将新鲜分离的生物组织处理为合适的大小，置于承载片上，使该生物组织粘附在承载片的表面；

(3)、将粘附了生物组织的承载片沿生物组织冻存容器的长轴方向放置于生物组织冻存容器中；

(4)、密封该生物组织冻存容器，将其以合适的方向置于低温下进行冻存。

其中，在步骤(1)中，生物组织可以为各种人体组织或动物组织，包括手术切除的组织和实验动物组织。根据实验需要，这些生物组织可以是肿瘤组织及与其配对对照的正常组织，如肠癌组织和相应的肠上皮组织等。这些生物组织还可以是肌肉组织、脂肪组织、囊壁组织、器官组织等以及分别与之相配对的肿瘤组织或癌组织。实际上，只要具有细胞组成、有结构的、经冻存可以保存的生物组织均可以使用上述的冻存方法。

在步骤(2)中，承载片由质地柔软的材料制成，优选为有颜色的软木片，更优选为棕色的软木片。

软木片的组成成分可以优选为含软木脂45wt％、木质素27wt％、纤维素12wt％、丹宁酸6wt％、蜡状物5wt％以及其他(如杂质成分等)5wt％。

因为软木片的质地柔软，几乎不含水分，即使在低温下也不会被冻得很硬，方便被修剪为所需的形状，从而更好地适用于冷冻切片机的样品托，所以对软木片的形状没有特别的要求，可以根据需要加工为圆形、椭圆形、多边形(如梯形或矩形)等规则形状，也可以为不规则形状，只要保证软木片能够沿生物组织冻存容器的长轴方向放入生物组织冻存容器中，并且在被放入生物组织冻存容器后，软木片在其内不会发生大幅度的移位即可，这样即使冻存缸内的冻存液发生扰动也不会影响到被冻存的生物组织的初始冻存位置，从而避免产生生物组织由于粘贴在生物组织冻存容器的内壁上而造成的不易被识别或者不易被取出的问题。

在步骤(3)中，低温是指‐20℃以下，优选为-80℃至‐20℃之间。

实施例二

如图1和图2所示，本实施例提供了一种生物组织冻存容器1，其包括：容器本体2、密封盖3和承载片4。

容器本体2呈中空圆柱状，与密封盖3可拆卸地连接。当容器本体2与密封盖3连接在一起时，二者形成密闭的空间，以防止在冻存时外界物质(如冻存液等)进入该空间内，从而避免空间被污染。

容器本体2与密封盖3可以通过螺纹连接、搭扣连接等各种密封连接方式。若容器本体2与密封盖3通过螺纹连接形成密封连接，则可以在容器本体2的外侧面设外螺纹，在密封盖3的内侧面设内螺纹，容器本体2和密封盖3通过外螺纹和内螺纹的吻合进行连接。

本实施例中的容器本体2的内底面直径(即内直径)为1cm，内底面到容器本体2的开口的距离为3.8cm。

如图2所示，承载片4外形为长方体，用于粘附分离后的生物组织5。承载片4可以沿着生物组织冻存容器的长轴方向(即Y方向)可分离地置于容器本体2内。承载片4的长度H₁应大于容器本体2的内直径R₁，有助于使承载片4在容器本体2内始终沿着生物组织冻存容器的长轴方向摆放。承载片4的宽度W₁不能太小于容器本体2的内直径R₁，否则承载片4可能在容器本体2内发生较大幅度的移动，从而承载片4上的生物组织5也随之移位，进而可能使得生物组织5在移位过程中粘附到容器本体2的内侧壁上。承载片4的宽度W₁也不能太接近于容器本体2的直径R₁，否则镊子等夹取装置就不容易从容器本体2中取出承载片4，或者在取出承载片4时影响承载片4上冻存的生物组织的形态。

综上，承载片4的宽度W₁一般比容器本体2的内直径R₁小0.05‐0.5mm为宜，优选为小0.1‐0.3mm。本实施例中承载片4的厚度为0.1cm，宽度为0.85cm，长度为2.1cm，承载片4的宽度W₁比容器本体2的直径R₁小0.15cm。

承载片4优选为带有颜色的软木片，其含有以下组分：软木脂45wt％、木质素27wt％、纤维素12wt％、丹宁酸6wt％、蜡状物5wt％以及其他5wt％。此时，该软木片的抗拉强度为770N/mm²，维氏硬度为240HV，布氏硬度为228HB，洛氏硬度为20.3HRC。然而，软木片的各组分的含量也不限于上述比例，软木脂的取值可以在45±5wt％的范围内，木质素的取值可以在27±3wt％的范围内，纤维素的取值可以在12±3wt％的范围内，丹宁酸的取值可以在6±3wt％的范围内，蜡状物的取值可以在5±1wt％的范围内，其他(如杂质成分)的取值可以在5±1wt％的范围内，需要保证软木脂、木质素、纤维素、丹宁酸、蜡状物和杂质成分的重量百分比之和为100wt％。

选择软木片作为承载片4来放置生物组织5的原因如下：

(1)、由于软木片略有吸水性，而新鲜分离的组织含有一定的水分，当新鲜分离的组织被置于软木片上时，新鲜分离的组织很容易以一定的形态粘附在软木片上，即使发生轻微的晃动也不会改变位置，从而有效避免了承载有组织的软木片在放入生物组织冻存容器时因发生晃动而导致的组织粘附到生物组织冻存容器的管壁上或沉入底部的情况的发生。

(2)、在生物组织被冻存之前，操作者可以事先将生物组织以所需的形状、角度、或方向粘附在软木片上，使生物组织直接以该种形态被冻存。此后，当需要使用该生物组织作冰冻切片时，直接快速将软木片取出，并将软木片的没有粘附有生物组织的一侧固定在冰冻切片机的样品托6(如图3和图4所示)上，然后用预冷后的冷冻包埋液直接包埋仍然处于冻存状态的组织，即可制成冰冻组织样品。在制成的冰冻组织样品中，组织仍然能以被冻存时的原始状态存在，不需要每次经历先解冻，再调整组织的形态，然后包埋，接着继续冻存的反复冻融过程，在提高样品处理效率的同时也能够最大限度地降低反复冻融对组织造成的损害。

(3)、由于软木片在低温下不容易与容器本体2冻结在一起，使用镊子等夹取装置可以很容易地取出软木片，并同时取出粘附在软木片上的生物组织。

(4)、由于软木片在低温下也不会冻得很硬，被取出后很容易被修剪为所需的形状，以适应于各种尺寸的样品托。

实施例三

实施例二中的生物组织冻存容器的容器本体呈中空圆柱状。实际上，生物组织冻存容器的容器本体并不局限于上述形状，只要能起到便于冻存生物组织并且防止冻存液进入容器本体内部即可。

如图5所示，生物组织冻存容器的容器本体6的底部外侧还可以设置支承架7，以更稳妥地支承起生物组织冻存容器整体，其它结构同实施例二。

实施例四

实施例二或三中的生物组织冻存容器每管只能冻存一个生物组织。一方面，当需要大量冻存生物组织时，就需要同等数量的生物组织冻存容器，可能提高冻存的成本；另一方面，因为每管只能冻存一个生物组织，在需要对很多组织制作很多冰冻切片时，需要不断地打开生物组织冻存容器以取出其中冻存的生物组织，费时费力，不利于提高冰冻切片效率。

为了解决上述问题，本实施例的生物组织冻存容器在结构上进行了改进，使得一个生物组织冻存容器能够同时冻存多个生物组织，这样，在制作冰冻切片时，只要关闭或打开生物组织冻存容器一次，便能取出在其中冻存的多个生物组织，从而提高了冰冻切片的制片效率。

如图6所示，本实施例中的生物组织冻存容器的容器本体9的内底面设有三排用于固定承载片的其中一个端部的固定槽10。这三排固定槽10呈平行排列，从容器本体9的内底部的一侧延伸至另一侧。固定槽10的槽口11朝向生物组织冻存容器的密封盖3开启。如图6和图7所示，槽口11的内宽W₂等于所述承载片12的端部的厚度W₃，便于承载片12能够很好地被固定槽10约束而不致发生移位现象。

如图8所示，当将粘附有生物组织13的承载片12的其中一个端部嵌合入固定槽10中后，承载片12便被固定在固定槽10中。因为新鲜分离的含水的生物组织13与承载片12粘附地较紧，所以生物组织13的形态也能随之保持。这样，每个生物组织冻存容器可以同时冻存三个生物组织。当然，根据具体情况，每片承载片12上可以同时粘附多个生物组织，使得每个生物组织冻存容器可以同时冻存更多的生物组织。

当需要大量冻存或解冻组织时，只需要打开或封闭一个生物组织冻存容器便能将多个生物组织保存在其内或者一次性对保存在其中的多个生物组织进行处理，从而提高了冻存或解冻的效率，节省了对生物组织的处理时间。

根据具体情况，生物组织冻存容器的容器本体9的内底面还可以设有两排或者三排以上的固定槽，使得一个生物组织冻存容器能够同时安放两片或者三片以上承载片12，从而使一个生物组织冻存容器能冻存多个生物组织，有助于降低冻存的成本和提高冰冻切片效率。

实施例五

实施例四采用设置在生物组织冻存容器的容器本体内底面的固定槽来固定承载片，然而，也可以在生物组织冻存容器的内侧壁上设置卡合部，通过卡合部来固定承载片的侧边部。

如图9所示，生物组织冻存容器的容器本体14的内侧壁15上设有三个用于固定承载片的侧边部的卡合部16。该卡合部16为卡槽，三个卡槽呈平行排列。如图10所示，卡槽的槽口宽度等于所述承载片17的侧边部的厚度，使承载片17能够很好地被卡槽约束而不致发生移位现象。

根据具体情况，也可以在生物组织冻存容器的容器本体的内侧壁上设有两个或者三个以上卡合部。多个卡合部可以呈平行排列，也可以不呈平行排列，只要保证每个卡合部均能固定一片承载片而不发生相互影响即可。

实施例六

实施例五的卡合部为卡槽，其仅设置在生物组织冻存容器的内侧壁的一边，每个卡槽只能固定承载片的其中一个侧边部，而承载片的另外一个侧边部则处于自由状态。如果承载片的宽度较大，则承载片的未被固定的侧边部可能容易发生移位现象，从而影响到粘附在其上的生物组织的形态的稳定性。

如图11所示，为了避免上述情况，本实施例的生物组织冻存容器的容器本体19的内侧壁20上设有三个用于固定承载片的侧边部的卡合部18，每个卡合部18均包括两个对向设置的卡槽21。如图12所示，卡槽21的槽口宽度等于所述承载片22的侧边部的厚度，使承载片22能够很好地被卡槽21约束而不致发生移位现象。两个对向设置的卡槽21的槽口的间距L₁应该小于承载片22的宽度W₁，从而使承载片22的两个侧边部均能嵌合入两个对向设置的卡槽21中。

如图13所示，粘附有生物组织23的承载片22的两个侧边部分别嵌合入两个对向设置的卡槽21中，使承载片22的两个侧边部能够同时被固定在卡槽21中，更有利于避免承载片22在生物组织冻存容器内部可能发生的移位现象。

根据具体情况，也可以在生物组织冻存容器容器本体的内侧壁上设有两个或者三个以上卡合部，从而使一个生物组织冻存容器能冻存多个生物组织。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种生物组织的冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：

将分离后的生物组织置于承载片的表面；

将粘附有所述生物组织的承载片沿生物组织冻存容器的长轴方向放置于所述生物组织冻存容器中；

密封所述生物组织冻存容器并置于低温下冻存；

其中，所述生物组织包括人体组织或哺乳动物器官组织；

所述承载片为软木片，所述软木片含有软木脂45±5wt％、木质素27±3wt％、纤维素12±3wt％、丹宁酸6±3wt％、蜡状物5±1wt％和杂质成分5±1wt％，软木脂、木质素、纤维素、丹宁酸、蜡状物和杂质成分的重量百分比之和为100wt％；

所述低温为-20℃以下。

2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于：所述软木片含有软木脂45wt％、木质素27wt％、纤维素12wt％、丹宁酸6wt％、蜡状物5wt％和杂质成分5wt％。

3.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于：所述软木片的抗拉强度为770N/mm²，维氏硬度为240HV，布氏硬度为228HB，洛氏硬度为20.3HRC。

4.一种实现如权利要求1至3任一项所述的冻存方法的生物组织冻存容器，包括：容器本体和与所述容器本体可拆卸连接的密封盖，其特征在于：还包括至少一个用于承载分离后的生物组织的承载片，所述承载片沿所述容器本体的长轴方向可分离地置于所述容器本体内；

所述承载片为软木片，所述软木片含有软木脂45±5wt％、木质素27±3wt％、纤维素12±3wt％、丹宁酸6±3wt％、蜡状物5±1wt％和杂质成分5±1wt％，软木脂、木质素、纤维素、丹宁酸、蜡状物和杂质成分的重量百分比之和为100wt％。

5.根据权利要求4所述的生物组织冻存容器，其特征在于：所述软木片的厚度为6±2mm。

6.根据权利要求4或5所述的生物组织冻存容器，其特征在于：所述容器本体的内底面设有至少一条用于固定所述承载片的端部的固定槽，所述固定槽的槽口宽度等于所述承载片的端部的厚度。

7.根据权利要求4或5所述的生物组织冻存容器，其特征在于：所述容器本体的内侧壁设有至少一个用于固定所述承载片的侧边部的卡合部。

8.根据权利要求7所述的生物组织冻存容器，其特征在于：所述卡合部为卡槽，所述卡槽的槽口宽度等于所述承载片的侧边部的厚度。

9.根据权利要求7所述的生物组织冻存容器，其特征在于：所述卡合部包括两个对向设置的卡槽，所述卡槽的槽口宽度等于或大于所述承载片的侧边部的厚度。