CN105705626A - 细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具 - Google Patents

细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供玻璃化冷冻保存用工具，使得细胞或组织的玻璃化冷冻作业可以容易且可靠地进行。本发明的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具含有使用折射率为1.45以下的材料形成的多孔质结构体作为玻璃化液吸收体。

Description

细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具
技术领域
本发明涉及在冷冻保存生物的细胞或组织等时使用的玻璃化冷冻保存用工具。
背景技术
在各种各样的产业领域中需要生物的细胞或组织的优质保存技术。例如，在牛的胚胎移植技术中使用的胚胎是配合受体牛(受胚牛)的发情周期进行移植的，为了配合发情周期进行胚胎的移植，将胚胎冷冻保存，配合发情周期，将胚胎融解进行移植。而且，在人的不孕治疗中，在从母体采集卵子或卵巢后，为了配合适合移植的时机而冷冻保存，在移植时融解使用。
一般来说，从活体内采集的细胞或组织，例如即使是在培养液中也会逐渐失去活性，因此，在活体外的细胞或组织的长期培养是不可取的。为此，不损害生物活性的长期保存的技术是重要的。通过优异的保存技术，可以更加正确地分析所采集的细胞或组织。而且，通过优异的保存技术，可以用于在保持更高的生物活性的状态下移植，有望提高移植后的成活率。此外，也可以将在活体外培养的培养皮肤和在活体外构筑的类似于所谓细胞片的移植用的人工组织按顺序生产保存，在必要时使用，不仅在医疗方面、在产业方面也是广泛需求的技术。
作为细胞或组织的保存方法，例如已知有缓慢冷冻法。在此方法中，首先，在使磷酸缓冲生理盐水等的生理溶液中含有冷冻保护剂而得到的保存液中浸渍细胞或组织。作为该冷冻保护剂，使用甘油、乙二醇等化合物。将细胞或组织在该保存液中浸渍后，通过以比较慢的冷却速度(例如0.3～0.5℃/分钟的速度)冷却至-30～-35℃，使细胞内外或组织内外的溶液充分冷却，粘度变高。在这样的状态下，如果将该保存液中的细胞或组织进一步冷却至液氮的温度(-196℃)的话，细胞内或组织内以及其外面的周围的少许溶液均发生变成非晶固体的玻璃化。可以认为，因为通过玻璃化，细胞内外或组织内外固化，实质上分子的运动消失，所以通过将玻璃化的细胞或组织在液氮中保存，可以半永久地保存。
然而，在上述缓慢冷冻法中，因为需要以比较慢的冷却速度冷却，所以为了进行冷冻保存的操作需要时间。而且，还存在需要用于进行温度控制的装置或工具的问题。此外，在上述缓慢冷冻法中，因为在细胞外或组织外的保存液中形成冰晶，所以细胞或组织可能遭受该冰晶造成的物理性损害。
作为解决在上述缓慢冷冻法中的问题点的方法，有人提议玻璃化保存法。玻璃化保存法是利用了通过大量含有甘油、乙二醇、DMSO(二甲基亚砜)等冷冻保护剂降低水溶液的凝固点，使得即使在冰点下也难以形成冰晶的原理的方法。将此水溶液在液氮中急速冷却，可以不形成冰晶直接固体化。将这样的固体化称为玻璃化冷冻。而且，将大量含有冷冻保护剂的水溶液称为玻璃化液。
作为上述玻璃化保存法的具体操作为：在玻璃化液中浸渍细胞或组织，之后，冷却至液氮的温度(-196℃)。因为是如此简便且迅速的步骤，所以在用于冷冻保存的操作中不需要时间，此外，不需要用于温度控制的装置或工具。
使用玻璃化保存法，细胞内外不产生任何冰晶，因此可以避免对于冷冻时和融解时对细胞的物理性伤害(冻害)，然而，玻璃化液中含有的高浓度的冷冻保护剂具有化学性毒性，在细胞或组织的冷冻保存时，玻璃化液不超过必要量以上为好。同时，细胞或组织在玻璃化液中暴露的时间、也就是到达冷冻的时间以短时间为好。进一步地，解冻后需要立即将玻璃化液稀释。
关于使用这些玻璃化保存法的细胞或组织的冷冻保存，有人给出了通过各种各样的方法、使用各种各样的种类的细胞或组织的例子。例如，专利文献1显示，对于动物或人的生殖细胞或体细胞的玻璃化保存法的应用，在冷冻保存、融解后的生存率的方面是极其有用的。
玻璃化保存法主要是用于人的生殖细胞而发展起来的技术，然而，最近也广泛地探讨在iPS细胞和ES细胞上的应用。而且，非专利文献1显示，在果蝇胚胎的保存中玻璃化保存法是有效的。进一步地，专利文献2或非专利文献2显示，在植物培养细胞和组织的保存中，玻璃化保存法是有效的。这样，已经知道玻璃化保存法在大范围的各种各样的种的细胞和组织中是有用的。
作为用于更加有效地进行玻璃化保存法的工具和操作方法，专利文献3等尝试在吸管中充满的玻璃化液中，将卵子或胚胎进行玻璃化冷冻保存，解冻时尽快与稀释液接触提高再生率。
专利文献4提议，将卵子或胚胎与玻璃化液一起放在玻璃化保存液除去材料上，通过从下部吸引除去在卵子或胚胎的周围附着的多余的玻璃化液，以高的生存率冷冻保存的方法。另外，也有记载作为玻璃化保存液除去材料有：金属丝网；由纸等天然物质或合成树脂制成的膜状物且具有贯通孔的材料。
专利文献5提议，通过将卵子或胚胎的周围附着的多余的玻璃化液使用滤纸等吸收体吸收，以高的生存率进行冷冻保存的方法。
专利文献6、专利文献7提议，在人的不孕治疗领域使用的所谓的被称作Cryotop法的方法中，使用作为卵子附着固定用带的长方形的柔性且无色透明的膜，在该膜上将极少量玻璃化液和卵子或胚胎一起在显微镜下使之附着、冷冻保存的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第3044323号公报
专利文献2：日本特开2008-5846号公报
专利文献3：日本特开平10-248860号公报
专利文献4：国际公开第2011/070973号小册子
专利文献5：日本特开2005-40073号公报
专利文献6：日本特开2002-315573号公报
专利文献7：日本特开2006-271395号公报
非专利文献
非专利文献1：Steponkus等，Nature345：170-172(1990)
非专利文献2：酒井昭，低温生物工学会誌42：61-68(1996)
发明内容
发明要解决的技术问题
因为专利文献3提议的方法是在吸管中充满玻璃化液，所以存在到达冷冻的时间长的问题。同时，可以冷冻保存的细胞或组织的大小受到吸管内径的限制，所以保存类似于细胞片的片状组织是困难的。
专利文献4提议的方法是通过除去附着在卵子或胚胎的周围的多余的玻璃化液，提议以高的生存率将这些生殖细胞冷冻保存的方法。然而，专利文献4记载的方法因为在除去多余的玻璃化液时需要从下部吸引操作，所以成为了烦杂的操作，在短时间内进行玻璃化冷冻保存操作的情况下不合适。进一步地，如果从下部的吸引不充分，则存在多余的玻璃化液残存的问题。
专利文献5提议通过将附着在卵子或胚胎的周围的多余的玻璃化液吸收至滤纸等吸收体中，以高的生存性冷冻保存这些生殖细胞的方法。然而，通过Cryotop法，例如在玻璃化保存法应用于人的卵子或胚胎的情况下，特别是以高精度要求卵子或胚胎对吸收体附着确认作业的正确性，然而，因为滤纸全光线透射率低，在一般使用的透过型光学显微镜下观察吸收体上附着的卵子或胚胎是困难的，所以可靠地确认卵子或胚胎的附着是极其困难的。而且，在冷冻保存后的融解作业时，也存在可靠地从吸收体上采集卵子或胚胎存在困难的问题。
专利文献6、专利文献7提议的方法在一定程度解决了专利文献5所提议的方法的不适合的问题。专利文献6、专利文献7所提议的方法操作性好，提供了不占有冷冻保存空间的紧凑的卵冷冻保存用具。该卵冷冻保存用具配备有在显微镜下可以观察人的卵子或胚胎的柔性且无色透明的平坦的膜(卵附着固定用带)，通过在该膜上将极少量(0.1μl)玻璃化液和卵子或胚胎一起滴下附着，可以冷冻保存卵子或胚胎。但是，这些膜的宽度通常为0.5～2mm，如果操作不熟练，将极少量的含卵子或胚胎的玻璃化液正确滴下附着非常困难。实际上众多新手培养人员在卵子或胚胎的冷冻操作上首先受挫的是使用极少量液体将卵子或胚胎放置于载片的操作。进一步地，在大量滴下玻璃化液的情况下，多余的玻璃化液在卵子或胚胎的周围残留，由于玻璃化液自身的毒性，卵子或胚胎的生存性有降低的可能。因此，需要有解决这些操作的难度和烦杂性的方法。
本发明的主要课题是提供可以使细胞或组织的冷冻保存作业容易且可靠地进行的玻璃化冷冻保存用工具。更具体地说，所述课题是提供玻璃化冷冻保存用工具，将细胞或组织在玻璃化液中浸渍，在玻璃化液与细胞或组织一起在玻璃化液吸收体上滴下时，具备为了吸收多余的玻璃化液的优异的吸收性能，可以使用透过型光学显微镜以适宜的可见性(附着确认性)观察玻璃化液吸收体上的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具。并且，本发明除了具有为了吸收多余的玻璃化液的优异的吸收性能以外，其课题进一步提供在冷冻保存后的融解操作时，能够以适宜的可见性观察该玻璃化冷冻保存用工具上所放置的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具。
解决技术问题的手段
本发明者等为了解决上述课题而积极探讨的结果发现，上述各种技术性课题可以通过具有以下构成的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具来解决。
(1)细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，所述玻璃化冷冻保存用工具含有使用折射率为1.45以下的材料形成的多孔质结构体作为玻璃化液吸收体。
(2)如上述(1)所记载的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，其中，所述多孔质结构体的孔径为5.5μm以下。
(3)如上述(2)所记载的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，其中，所述多孔质结构体为氟树脂多孔体。
发明的效果
本发明可以提供细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，当将在玻璃化液中浸渍的细胞或组织与玻璃化液一起放在玻璃化液吸收体上时，因为玻璃化液吸收体吸收在细胞或组织外周附着的多余的玻璃化液，所以并不特别需要为了除去多余的玻璃化液的其他的操作(例如，从玻璃化液吸收体下部的吸引除去操作和使用微吸管等从细胞或组织周围的直接吸引操作)，可以使细胞或组织的冷冻保存作业容易且简便地进行。
并且，本发明的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，在将含有细胞或组织的玻璃化液在玻璃化液吸收体上滴下时，因为在光学显微镜下可以容易地确认玻璃化液吸收体上的细胞或组织，所以使用本发明的玻璃化冷冻保存用工具可以使细胞或组织的玻璃化冷冻作业容易且高精度地有效进行。进一步地，本发明的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具在融解操作时，因为该玻璃化冷冻保存用工具上放置的细胞或组织能够以适宜的可见性进行观察，所以使用本发明的玻璃化冷冻保存用工具可以使冷冻的细胞或组织的融解作业容易且高精度地有效进行。
附图说明
图1是表示本发明的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具的一个例子的立体图。
图2是图1中的玻璃化液吸收体的放大图。
图3是表示将多个细胞或组织在一个该玻璃化冷冻保存用工具上冷冻保存的情况下使用的玻璃化液吸收体的一个例子的示意性立体图。
图4是表示将多个细胞或组织在一个该玻璃化冷冻保存用工具上冷冻保存的情况下使用的玻璃化液吸收体的另一个例子的示意性立体图。
具体实施方式
以下详细说明本发明的“细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具”，然而本发明不限于下述实施方式。本发明的“细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具”含有使用折射率为1.45以下的材料形成的多孔质结构体作为玻璃化液吸收体。
本发明的玻璃化冷冻保存用工具是冷冻保存生物的细胞或组织时使用的工具。本说明书中的细胞不仅指单一的细胞，也包含由多个细胞组成的细胞群。由多个细胞组成的细胞群可以是由单一种类的细胞构成的细胞群，也可以是由多种类的细胞构成的细胞群。而且，组织可以是由单一种类的细胞构成的组织，也可以是由多种类的细胞构成的组织，也可以包含在细胞以外的类似于细胞外基质的非细胞性的物质。本发明的玻璃化冷冻保存用工具优选为用于在玻璃化液吸收体上将细胞或组织与玻璃化液一起附着、将附着了细胞或组织的玻璃化液吸收体浸渍在液氮等冷却物质中使之冷冻的工具。由于具有上述玻璃化液吸收体，可以容易地将细胞或组织与玻璃化液一起保持，进一步还可以使细胞或组织向液氮的浸渍作业也容易进行。可以换而言之，本发明的玻璃化冷冻保存用工具是细胞或组织冷冻保存用具、细胞或组织玻璃化保存用具。
本发明的玻璃化冷冻保存用工具，因为玻璃化液吸收体吸收多余的玻璃化液，所以当将浸渍于玻璃化液中的细胞和组织与玻璃化液一起在玻璃化液吸收体上滴下附着时，即使附着于细胞或组织的玻璃化液的量多，也能实现细胞或组织的极高的生存率。进一步地，这样操作的细胞或组织被极少量的玻璃化液所覆盖，即使在冷冻操作的情况下也能迅速成为冷冻状态。进一步地，可以在冷冻保存的细胞或组织解冻后立即稀释玻璃化液。
本发明的玻璃化冷冻保存用工具是至少含有吸收玻璃化液的玻璃化液吸收体的玻璃化冷冻保存用工具，其特征在于，该玻璃化液吸收体是使用折射率为1.45以下的材料形成的多孔质结构体。从在显微镜下容易确认玻璃化液吸收体上的细胞或组织的观点来看，该材料的折射率优选1.39以下，并且该材料的折射率优选1.30以上。另外，作为玻璃化液吸收体发挥作用的多孔质结构体的材料的折射率，例如，可以使用阿贝折射仪(Na光源，波长：589nm)依据JISK0062、JISK7142基准测定。同时，本发明中的多孔质结构体是在表面有气孔(孔)的结构体，优选在表面和内部具有连续的气孔的结构体。本发明的玻璃化液吸收体也可以不设置支持体，将上述多孔质结构体本身作为玻璃化液吸收体。或者，也可以在支持体上具有以上述多孔质结构体作为玻璃化液吸收层的玻璃化液吸收体。在支持体上设置玻璃化液吸收层的情况下，可以在支持体和玻璃化液吸收层之间设置粘着层。进一步地，在该玻璃化液吸收层和该粘着层以外，例如也可以将在支持体上获得均匀的粘着层作为目的，例如设置内涂层等。
本发明的玻璃化冷冻保存用工具，当包含细胞或组织的玻璃化液在玻璃化液吸收体上滴下时，通过多孔质结构体的表面的孔，玻璃化液迅速地被吸收至玻璃化液吸收体，可以从细胞或组织的周围除去多余的玻璃化液。同时，当被滴下吸收的玻璃化液充填在多孔质结构体的气孔内部时，因为玻璃化液吸收体和玻璃化液的折射率差小(玻璃化液的折射率一般为1.43～1.33)，玻璃化液吸收体的透明性上升，所以可以容易地在透过型光学显微镜下观察在该玻璃化液吸收体上附着的细胞或组织。特别是，当冷冻保存的细胞为人和小鼠的卵子和/或胚胎的情况下，通过专利文献6和专利文献7那样的方法识别玻璃化液中的卵子是困难的，然而，因为本发明的玻璃化冷冻保存用工具所具有的玻璃化液吸收体吸收多余的玻璃化液，所以较容易地识别细胞成为可能。
作为本发明的玻璃化液吸收体的实施方式可以优选使用例如：作为通过拉伸制造的多孔质膜的多孔质结构体、纤维组成的多孔质结构体、具有立体网格构造的多孔质结构体、烧结微粒等组成的多孔质结构体、作为通过相分离法制造的多孔质膜的多孔质体等。
该多孔质结构体能够以下述公知的制造方法为基准的方法制造，例如：日本特公昭42-13560号公报中记载的“多孔性结构体的制造方法，其特征在于，将含有液体润滑剂的未烧结的四氟化乙烯树脂混和物通过挤出或轧制或兼有挤出和轧制的方法成型后，在未烧结状态下至少在一个方向上拉伸的状态下在约327℃以上加热”；日本特开2010-94579号公报中记载的“多孔质氟树脂薄膜的制造方法，其特征在于，将以聚四氟乙烯为主体的氟树脂形成的膜厚为50μm以下的氟树脂薄膜，在具有通过拉伸而伸长的特性的支持体上固定后，在低于30℃拉伸进行多孔质化”；日本特开2012-97363号公报中记载的“无纺布的制造方法，在使至少一部分为熔融状态的氟树脂带电的充电电极与同该充电电极对向配置的集电极之间施加电压，使熔融状态的上述氟树脂纤维化，该纤维在集电极上聚集，其特征在于，在上述充电电极和上述集电极之间施加电压，使上述充电电极成为负极”；日本特开2011-245854号公报中记载的“多个蜂窝单元隔着蜂窝单元壁在长度方向并排设置的柱状蜂窝烧成体、借助粘着材料层将多个蜂窝烧成体捆扎在一起形成陶瓷块、在陶瓷块的周围设置被覆层的蜂窝结构体的制造方法，其特征在于，包括将在外周部形成了蜂窝单元壁的蜂窝成型体挤出成型的成型工序、将上述蜂窝成型体烧成形成蜂窝烧成体的烧成工序、在模具内将多个蜂窝烧成体固定的固定工序、在上述模具和蜂窝烧成体之间的间隙以及蜂窝烧成体之间的间隙中填充密封材料膏的充填工序、以及将上述密封材料膏干燥固化形成粘着材料层和被覆层的干燥工序，上述密封材料膏含有无机粒子和/或无机纤维，在上述模具、上述模具的内面或上述模具的内面侧配置的构件上设置具有空气透过性的通气部，在上述干燥工序中，使上述密封材料膏与上述通气部的至少一部分接触进行该密封材料膏的干燥固化”；日本特开2007-46042号公报等记载的“利用在疏水性有机溶剂溶液中形成的反向胶束的模板形成孔的多孔质结构体的制造方法，包括以下工序：将至少由两亲性物质、具有疏水性的有机聚合物、亲水性液体和溶解该有机聚合物的疏水性有机溶剂组成的溶液搅拌，得到形成反向胶束的疏水性有机溶剂溶液的工序；将上述疏水性有机溶剂溶液在基板上浇铸的工序；以及从上述基板上的疏水性有机溶剂溶液中蒸发疏水性有机溶剂和亲水性液体从而形成多孔质的结构体的工序”等。
加工成为这样的多孔质结构是可能的，且作为折射率为1.45以下的材料，可以列举例如：聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氯三氟乙烯等氟树脂和硅树脂之类的塑料树脂材料；二氧化硅之类的金属氧化物材料；氟化钠、氟化镁、氟化钙之类的无机材料等。而且，也可以使用例如通过日本特开2000-95862号公报所示的方法制成的控制了折射率的高分子材料，日本特开2007-279459号公报所示的由2种以上的高分子混合而成的高分子复合材料组成的材料等。优选为氟树脂多孔体，较优选为聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯，特别优选为聚四氟乙烯。除了上述材料以外，多孔质结构体也可以由含有其他材料的材料形成，然而，优选由上述折射率为1.45以下的材料占85质量％以上、较优选占90质量％以上的材料形成。
为了提高玻璃化液吸收性能，本发明的玻璃化液吸收体的表面优选进行亲水化处理。作为亲水化处理的方法可以使用接枝改性法、使用亲水性高分子化合物等的涂层法、电晕放电、等离子处理、使用准分子激光等各种电子束的通常的表面改性方法。
从玻璃化液的吸收性的观点和在玻璃化液吸收体上是否附着了细胞或组织的可见性(经透过型光学显微镜观察的可见性)的观点来看，本发明的具有玻璃化液吸收体的多孔质结构体优选孔径为0.02～20μm、较优选孔径为0.2～15μm的玻璃化液吸收体。并且，从玻璃化液的吸收性以及当冷冻保存后的融解操作时以适宜的可见性观察融解液中的玻璃化液吸收体上所放置的细胞或组织的观点来看，优选该玻璃化液吸收体所具有的多孔质结构体的孔径为5.5μm以下，较优选为1.0μm以下，更优选为0.75μm以下。
当玻璃化液吸收体所具有的多孔质结构体的孔径在不足0.02μm的范围内时，玻璃化液滴下时的吸收性能不充分，可能存在到达冷冻保存需要花费时间以及多余的玻璃化液在细胞或组织的周围大量地残存的问题。另外，在孔径超过20μm的范围时，细胞或组织被捕捉至表面的孔内，当冷冻后融解操作时，可能存在细胞或组织不容易从玻璃化液吸收体脱离、不能进行适当地进行解冻操作的问题。进一步地，可能存在玻璃化液吸收体表面的孔和在表面附着的细胞或组织的辨别困难的问题，从可见性的观点来看存在问题。
本发明中玻璃化液吸收体所具有的多孔质结构体的厚度优选10μm～500μm，较优选25μm～150μm。而且，该多孔质结构体的空隙率优选为30％以上，更优选为70％以上。本发明的玻璃化液吸收体所具有的多孔质结构体的孔径、厚度、空隙率可以根据所使用的细胞或组织的种类以及与细胞或组织一起滴下的玻璃化液的滴下量等适当设定。
本说明书中，多孔质结构体的孔径是指通过JISK3832所规定的起泡点试验测定的最大孔的直径。同时，空隙率根据以下的公式定义。
在此，空隙容量V可以通过使用压汞仪(测量仪器名称AutoporeII9220，制造商MicromeriticsInstrumentCorporation)测量处理得到的玻璃化液吸收体中的孔半径3nm至400nm的累计孔容积(ml/g)乘以玻璃化液吸收体的干燥固体含量(g/平方米)、作为每单位面积(平方米)的数值求出。而且，玻璃化液吸收体的厚度T可以通过在电子显微镜下拍摄玻璃化液吸收体的截面、测量长度而得出。
P＝(V/T)×100(％)
P：空隙率(％)
V：空隙容量(ml/m2)
T：玻璃化液吸收体的厚度(μm)
本发明的玻璃化液吸收体的面积可以根据与细胞或组织一起滴下的玻璃化液的滴下量等适当设定，没有特别限制，例如，对于每1μl滴下的玻璃化液，本发明的玻璃化液吸收体的面积优选为10mm2以上，较优选为20～400mm2。
在本发明的玻璃化冷冻保存用工具所具有的玻璃化液吸收体具有支持体的情况下，该支持体优选光透过性支持体，较优选全光线透射率为80％以上的光透过性支持体。并且，光透过性支持体的雾度值优选10％以下。作为这样的支持体，可以列举例如各种树脂膜、玻璃、橡胶等。只要能够达到本发明的效果，也可以组合使用2种以上的支持体。其中，从操作性优异的方面来看，适合使用树脂膜。作为树脂膜的具体例子，可以列举由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)等聚酯树脂、丙烯酸树脂、环氧树脂、硅树脂、聚碳酸酯树脂、二醋酸酯树脂、三醋酸酯树脂、聚芳酯树脂、聚氯乙烯树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚酰亚胺树脂、聚酰胺树脂、聚烯烃树脂、环状聚烯烃树脂等制成的树脂膜，其厚度优选为10～1000μm。而且，为了提高与粘着层的粘着强度，也可以在支持体的表面通过电晕放电处理进行易粘着处理。
本发明的玻璃化冷冻保存用工具所具有的玻璃化液吸收体在具有粘着层的情况下，以可以利用使用湿气固化性的粘着物质为代表的瞬间粘着物质、热熔粘着物质、光固化粘着物质等的一般的粘着方法，例如，可以优选利用：聚乙烯醇、羟基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉糊之类的水溶性粘着物质；醋酸乙烯酯系粘着物质、丙烯酸系粘着物质、环氧系粘着物质、聚氨酯系粘着物质、弹性体系粘着物质、氰基丙烯酸酯系粘着物质、氟系粘着物质、硅系粘着物质、硝化纤维素系粘着物质、腈橡胶系粘着物质、苯乙烯-丁二烯系粘着物质、脲树脂系粘着物质、苯乙烯系树脂粘着物质、酚树脂系粘着物质、聚酰亚胺系粘着物质、聚酰胺系粘着物质、聚酯系粘着物质、双马来酰亚胺系粘着物质、烯烃系粘着物质、EVA系粘着物质等非水溶性粘着物质。该粘着层可以含有一种粘着物质，也可以含有多种粘着物质。粘着层的固体含量优选0.01～100g/m2的范围，进一步地较优选0.1～50g/m2的范围。
而且，也可以赋予该粘着层吸收玻璃化液的效果，从这样的观点来看，优选在该粘着层含有聚乙烯醇、羟基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉糊之类的水溶性粘着物质。而且，从支持体与玻璃化液吸收体的粘着强度的观点来看，优选在粘着层使用丙烯酸系粘着物质、环氧系粘着物质、聚氨酯系粘着物质、弹性体系粘着物质、氰基丙烯酸酯系粘着物质。而且，在粘着层可以含有各种消光剂、表面活性剂、pH调节剂等。
以上说明了本发明的玻璃化液吸收体。下面对使用这些玻璃化液吸收体的玻璃化冷冻保存用工具的结构进行说明。本发明的玻璃化冷冻保存用工具只要是具有上述那样的玻璃化液吸收体的工具即可，可以是任何形式，该玻璃化液吸收体也可以连接至手持部。在有手持部的情况下，在冷冻保存作业时和融解作业时的作业性良好，所以优选。
图1是本发明的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具的一个例子的立体图。图1中，玻璃化冷冻保存用工具5由手持部1和玻璃化液吸收体2构成。手持部1优选为耐液氮材料。作为这样的材料，可以适于使用的例如有：铝、铁、铜、不锈钢合金等各种金属、ABS树脂、聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、氟系树脂和各种工程塑料，进一步有玻璃等。而且，为了便于处理，基本上，玻璃化液吸收体2优选为长条状或片状。
图2表示本发明的玻璃化液吸收体的一个例子。图2是图1的玻璃化液吸收体2的放大图。图2的玻璃化液吸收体2a在支持体4上具有玻璃化液吸收层3。图2所示的玻璃化液吸收体2a是在玻璃化液吸收体的整个面上具有玻璃化液吸收层3的实施方式的一个例子。
对图1的手持部1和玻璃化液吸收体2的连接方法进行说明。在手持部1是树脂的情况下，例如，在成型加工时可以通过嵌入成型将玻璃化液吸收体2连接于手持部1。进一步地，可以在手持部1上制作图中未显示的玻璃化液吸收体插入部，通过粘着剂连接玻璃化液吸收体2。粘着剂可以使用各种各样的粘着剂，然而，可以适于使用耐受低温的硅系粘着剂或氟系粘着剂。
在使用本发明的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具长期冷冻保存细胞或组织的情况下，为了安全，可以在图1所示的工具本体上为与外界隔绝而盖上盖子。进一步地，通常液氮是未经杀菌的，在直接接触液氮冷冻的场合下，存在即使玻璃化冷冻保存用工具消毒也不能保证无菌状态的情况。因此，在冷冻前，将附着细胞或组织的玻璃化液吸收体上盖上盖子，可以不直接接触液氮进行冷冻。而且，在美国、EU等海外先进国家，像上述那样不直接接触液氮的冷冻方法正在成为主流。出于这样的理由，盖子优选由作为耐液氮的材料的各种金属、各种树脂、玻璃、陶瓷等制作。作为形状，只要是铅笔帽或圆柱状的吸管帽等与玻璃化液吸收体不接触、可以与外界隔绝的形状即可，可以是任何形状。
图3、图4表示本发明中的玻璃化液吸收体的另一种实施方式的例子。在图1所示的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具中，玻璃化液吸收体也可以是图3、图4所示的玻璃化液吸收体。图3是表示在将多个细胞或组织在一个该玻璃化冷冻保存用工具中冷冻保存的情况下所使用的玻璃化液吸收体2b的一个例子的立体示意图。另外，图4是表示在将多个细胞或组织在一个该玻璃化冷冻保存用工具中冷冻保存的情况下所使用的玻璃化液吸收体2c的另一个例子的立体示意图。在图3和图4中，在支持体4上不连续地配置多个玻璃化液吸收层3。
如上述图2，在玻璃化液吸收层3为连续的形状的情况下，当使多个细胞或组织附着在玻璃化液吸收层3时，因为玻璃化液吸收层在横向和厚度方向扩展，例如当将2个以上细胞或组织附着在玻璃化液吸收层3的情况下，存在玻璃化液的吸收性降低的情况。但是，如图3和图4，当玻璃化液吸收层3在支持体4上不连续地多个设置时，不需要那样的担心，细胞或组织可以与玻璃化液一起在各玻璃化液吸收层3可靠地分别只附着一个。在图3和图4中作为一个例子，配置了多个方格状的玻璃化液吸收层3。图3和图4所示的玻璃化液吸收体2b和玻璃化液吸收体2c也是在支持体上的一部分具有玻璃化液吸收层的玻璃化液吸收体的一个例子。
本发明的玻璃化冷冻保存用工具例如是适于在Cryotop法中使用的工具。当使用本发明的玻璃化冷冻保存用工具时，在细胞或组织冷冻时和融解时，不容易受到在细胞或组织外存在的玻璃化液所引起的损伤，可以将细胞或组织以优异的生存率进行冷冻保存。
使用本发明的玻璃化冷冻保存用工具冷冻保存细胞或组织的方法并没有特别的限定，例如，首先，当在玻璃化液中浸渍的细胞或组织与玻璃化液一起在玻璃化液吸收体上滴下时，附着在该细胞或该组织的周围的玻璃化液被玻璃化液吸收体吸收。然后，通过将上述细胞或上述组织以保持在玻璃化液吸收体上的状态浸渍在液氮等中，可以冷冻细胞或组织。玻璃化液是可以通常用于卵子、胚胎等细胞的冷冻而使用的玻璃化液，例如可以使用上述的含有甘油、乙二醇、DMSO(二甲基亚砜)等各种冷冻保护剂的水溶液。
作为可以使用本发明的玻璃化冷冻保存用工具冷冻保存的细胞，可以列举例如：哺乳类(例如，人(人类)、牛、猪、马、兔、大鼠、小鼠等)的卵子或胚胎、精子等生殖细胞；iPS细胞；ES细胞。而且，可以列举初代培养细胞、继代培养细胞和细胞株细胞等培养细胞。而且，在一个或多个实施方式中，细胞可以列举粘附性细胞，例如，成纤维细胞；来自于胰腺癌、肝癌细胞等癌的细胞；上皮细胞；血管内皮细胞；淋巴管内皮细胞；神经细胞；软骨细胞；组织干细胞；胚性干细胞；以及免疫细胞等。进一步地，作为可以冷冻保存的组织，可以列举由同种或异种细胞组成的组织，例如：卵巢、皮肤、角膜上皮、牙周膜、心肌、软骨等组织。本发明的玻璃化冷冻保存用工具不仅适用于直接从活体采集的细胞或组织，也适用于例如在活体外培养增殖的培养皮肤、在活体外构筑的所谓的细胞片、日本特开2012-205516号公报所记载的具有三维结构的组织模型之类的人工组织的玻璃化冷冻保存。
实施例
以下通过实施例进一步详细明示本发明，对本发明进行具体说明，然而，本发明不限于以下实施例，在不偏离本发明的技术范围的范围内，可以进行各种各样的变形和改变。
实施例1
通过电晕放电处理在表面进行了易粘着处理的厚度250μm、雾度值5.5％、全光线透射率91％的透明PET膜上，作为粘着层，以干燥时质量为10g/m2的量涂布了聚氨酯系粘着物质。在粘着层固化之前，作为多孔质结构体，将通过拉伸制造的多孔质膜的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径0.1μm，膜厚30μm，空隙率80％，经聚乙烯醇进行亲水化处理)叠合在粘着层上干燥，制作了玻璃化液吸收体2。将此玻璃化液吸收体40mm2与ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)树脂制的手持部1接合，通过如图1所示的实施方式制作了实施例1的玻璃化冷冻保存用工具5。
实施例2
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径0.5μm，膜厚35μm，空隙率79％)，此外与实施例1相同，制作了实施例2的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例3
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径1μm，膜厚85μm，空隙率80％)，此外与实施例1相同，制作了实施例3的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例4
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径10μm，膜厚85μm，空隙率80％)，此外与实施例1相同，制作了实施例4的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例5
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚偏二氟乙烯多孔质膜(折射率1.42，孔径0.1μm，膜厚125μm，空隙率70％)，此外与实施例1相同，制作了实施例5的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例6
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚偏二氟乙烯多孔质膜(折射率1.42，孔径0.5μm，膜厚125μm，空隙率70％)，此外与实施例1相同，制作了实施例6的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例7
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚偏二氟乙烯多孔质膜(折射率1.42，孔径5μm，膜厚125μm，空隙率70％)，此外与实施例1相同，制作了实施例7的玻璃化冷冻保存用工具。
比较例1
作为多孔质结构体，使用了醋酸纤维素多孔质膜的日本アドバンテック社制造的醋酸纤维素膜(折射率1.47，孔径0.5μm，膜厚125μm，空隙率68％)，此外与实施例1相同，制作了比较例1的玻璃化冷冻保存用工具。
比较例2
作为多孔质结构体，使用了醋酸纤维素和硝化纤维素制成的多孔质膜的日本アドバンテック社制造的纤维素混合酯膜(折射率1.51，孔径0.5μm，膜厚145μm，空隙率78％)，此外与实施例1相同，制作了比较例2的玻璃化冷冻保存用工具。
比较例3
作为多孔质结构体，使用了亲水化处理的聚乙烯烧结微粒制成的多孔质膜(折射率1.51，孔径43μm，膜厚500μm，空隙率42％)，此外与实施例1相同，制作了比较例3的玻璃化冷冻保存工具。
比较例4
作为多孔质结构体，使用了在PET膜上，将氧化铝微粒(折射率1.65)和聚乙烯醇(PVA，折射率1.52～1.55)制成的粘合剂以90质量％的氧化铝微粒和10质量％的粘合剂的比例混合的涂布层涂布形成的氧化铝多孔质膜(孔径0.08μm，膜厚110μm，空隙率55％)，此外与实施例1相同，制作了比较例4的玻璃化冷冻保存用工具。另外，因为氧化铝多孔质膜的孔径通过起泡点试验无法得到，所以通过水银压入法测定了孔分布，得到累积50％直径。
比较例5
使用了由纤维素纤维制成的滤纸日本アドバンテック社制造的滤纸No.5C(折射率1.50，每平方米的纸重120g/m2，密度0.57g/cm3)作为玻璃化液吸收体，此外与实施例1相同，制作了比较例5的玻璃化冷冻保存用工具。
比较例6
使用了无色透明的膜的透明PET膜(厚度250μm，全光线透射率91％，空隙率0％)作为玻璃化液吸收体，此外与实施例1相同，制作了比较例6的玻璃化保存用工具。
冷冻保存作业时的细胞的可见性的评价
在实施例1～7和比较例1～6的各玻璃化冷冻保存用工具的玻璃化液吸收体上，将含有玻璃珠(直径100μm)作为细胞模拟物的玻璃化液1μl(微升)滴下附着。另外，玻璃化液使用Sigma-Aldrich公司制造的改良TCM199培养基中包含20容积％血清、15容积％DMSO、15容积％乙二醇、0.2容积％蔗糖所组成的玻璃化液。滴下附着后，使用透过型光学显微镜(奥林巴斯(株)制，SZH-121)，将是否可以观察到在玻璃化液吸收体上滴下的细胞模拟物按照以下标准评价。这些结果显示于表1的“冷冻保存作业时的细胞的可见性”的栏目。
细胞的可见性按照以下标准评价。
◎：可以容易地观察细胞模拟物。
○：可以观察细胞模拟物。
×：细胞模拟物的观察困难或不能观察细胞模拟物。
玻璃化液的吸收性的评价1
在实施例1～7和比较例1～6的各玻璃化冷冻保存用工具的玻璃化液吸收体上，将含有玻璃珠(直径100μm)作为细胞模拟物的玻璃化液1μl滴下附着。另外，玻璃化液使用Sigma-Aldrich公司制造的改良TCM199培养基中包含20容积％血清、15容积％DMSO、15容积％乙二醇、0.2容积％蔗糖所组成的玻璃化液。滴下附着后，使用落射型光学显微镜(欧姆龙(株)制，VC4500-S1)观察细胞模拟物周边的玻璃化液被吸收的样子，按照以下标准评价。这些结果显示于表1的“冷冻保存作业时的玻璃化液的吸收性(1)”的栏目。
玻璃化液的吸收性的评价为按照下标准进行评价。
◎：玻璃化液滴下附着后，10秒以内玻璃化液被全部吸收。
○：玻璃化液滴下附着后，10秒后，观察到玻璃化液有残留但被吸收的样子。
×：玻璃化液滴下附着后，几乎看不到、或者完全看不到玻璃化液的吸收。
表1
实施例8
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径0.1μm，膜厚35μm，空隙率71％)，此外与实施例1相同，制作了实施例8的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例9
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径0.2μm，膜厚35μm，空隙率71％)，此外与实施例1相同，制作了实施例9的玻璃化冷冻保存用工具。
实施例10
作为多孔质结构体，多孔质膜的特征与实施例1不同，使用了比聚乙烯醇更亲水化处理的聚四氟乙烯多孔质膜(折射率1.35，孔径0.5μm，膜厚65μm，空隙率79％)，此外与实施例1相同，制作了实施例10的玻璃化冷冻保存用工具。
玻璃化液的吸收性的评价2
在上述实施例3、实施例6、实施例8～10、比较例1、比较例2、比较例5和比较例6的各玻璃化冷冻保存用工具的玻璃化液吸收体上，将含有玻璃珠(直径100μm)作为细胞模拟物的玻璃化液0.2μl(微升)滴下附着。另外，玻璃化液使用在137mM(毫摩尔)的NaCl、2.7mM的KCl、0.9mM的CaCl2·2H2O、0.5mM的MgCl2·6H2O、1.5mM的KH2PO4、8mM的Na2HPO4、5.6mM的葡萄糖、0.3mM的丙酮酸钠、65μg/ml(毫升)的硫酸地贝卡星、1mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮、14.8mM的L-脯氨酸、200mM的海藻糖、30容积％乙二醇、0.5容积％甘油、500mM的蔗糖的组成中，作为pH指示剂含有极低浓度酚红的玻璃化液。滴下附着后，使用落射型光学显微镜观察细胞模拟物周边的玻璃化液被吸收的样子，按照下标准评价。这些结果显示于表2的“冷冻保存作业时的玻璃化液的吸收性(2)”的栏目。
◎：玻璃化液滴下附着后，10秒以内细胞周边的玻璃化液被全部吸收。
○：玻璃化液滴下附着后，10秒后，观察到玻璃化液有残留但被吸收的样子。
×：玻璃化液滴下附着后，几乎看不到、或者完全看不到玻璃化液的吸收。
融解作业时的细胞的可见性
将小鼠胚胎在进行下述记载的平衡处理后，平衡处理后的小鼠胚胎与上述玻璃化液的吸收性的评价2中所使用的玻璃化液一起，在实施例3、实施例6、实施例8～10、比较例1、比较例2、比较例5和比较例6的各玻璃化冷冻保存用工具的玻璃化液吸收体上滴下附着，直接浸渍在液氮中，进行玻璃化冷冻保存。另外，平衡处理为：在137mM的NaCl、2.7mM的KCl、0.9mM的CaCl2·2H2O、0.5mM的MgCl2·6H2O、1.5mM的KH2PO4、8mM的Na2HPO4、5.6mM的葡萄糖、0.3mM的丙酮酸钠、65μg/ml的硫酸地贝卡星、1mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮、14.8mM的L-脯氨酸、200mM的海藻糖的组成中，作为pH指示剂含有极低浓度酚红的玻璃化基础液中，将小鼠胚胎浸渍10分钟后先取出，然后将取出的小鼠胚胎在137mM的NaCl、2.7mM的KCl、0.9mM的CaCl2·2H2O、0.5mM的MgCl2·6H2O、1.5mM的KH2PO4、8mM的Na2HPO4、5.6mM的葡萄糖、0.3mM的丙酮酸钠、65μg/ml的硫酸地贝卡星、1mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮、14.8mM的L-脯氨酸、200mM的海藻糖、7容积％乙二醇、0.5容积％甘油的组成中，作为pH指示剂含有极低浓度酚红的玻璃化前处理液中，进行5分钟浸渍。而且，上述平衡处理后的小鼠胚胎是指从该玻璃化前处理液中取出的小鼠胚胎。之后，将玻璃化冷冻保存的小鼠胚胎与实施例3、实施例6、实施例8～10、比较例1、比较例2、比较例5和比较例6的各玻璃化冷冻保存用工具一起取出，在37℃的融解液中浸渍。另外，融解液使用在137mM的NaCl、2.7mM的KCl、0.9mM的CaCl2·2H2O、0.5mM的MgCl2·6H2O、1.5mM的KH2PO4、8mM的Na2HPO4、5.6mM的葡萄糖、0.3mM的丙酮酸钠、65μg/ml的硫酸地贝卡星、1mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮、300mM的蔗糖的组成中，作为pH指示剂含有极低浓度酚红的融解液。在融解液中，使用透过型光学显微镜观察在玻璃化液吸收体上的小鼠胚胎，小鼠胚胎的可见性按照下标准评价。这些结果显示于表2的“融解作业时的细胞的可见性”的栏目。
◎：可以容易地识别小鼠胚胎。
○：可以识别小鼠胚胎。
×：小鼠胚胎的识别困难或不能识别。
表2
囊胚期胚胎的采集
使8～13周龄的ICR系成熟雌小鼠自然交配，以阴道栓的有无确认交配。对于确认交配的雌小鼠，以交配确认日作为第1天，约77个小时后使用KSOM/aa(含PVP)进行子宫灌注，采集小鼠囊胚期胚胎。
胚胎的玻璃化冷冻保存(实施例3、实施例9的玻璃化冷冻保存用工具)
将如上述采集的小鼠胚胎在作为pH指示剂含有极低浓度酚红的改良磷酸缓冲液(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、0.9mM的CaCl2·2H2O、0.5mM的MgCl2·6H2O、1.5mM的KH2PO4、8mM的Na2HPO4、5.6mM的葡萄糖、0.3mM的丙酮酸钠、65μg/ml的硫酸地贝卡星、1mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮、14.8mM的L-脯氨酸、200mM的海藻糖)中，在15℃的环境下浸渍10分钟。之后，在温度15℃的平衡液(7容积％乙二醇、0.5容积％甘油、92.5容积％上述改良磷酸缓冲液)中浸渍5分钟。然后，浸渍在温度4℃的玻璃化液(30容积％乙二醇、0.5容积％甘油、69.5容积％上述改良磷酸缓冲液、0.5M蔗糖)中。浸渍30秒后，将小鼠胚胎放置在实施例3和实施例9的玻璃化冷冻保存用工具的玻璃化液吸收体上，在显微镜观察下确认小鼠胚胎周边的多余的玻璃化液被吸收之后，在液氮中浸渍，进行玻璃化冷冻。将冷冻的玻璃化冷冻保存用工具在液氮保存容器中保管直到进行融解。使小鼠胚胎放置在玻璃化冷冻保存用工具上时的玻璃化液的液量与所使用的玻璃化冷冻保存用工具的吸收性相适应，在约0.2～1μl的范围内进行。
胚胎的玻璃化冷冻保存(比较例6的玻璃化保存用工具)
将如上述采集的小鼠胚胎在温度15℃的上述改良磷酸缓冲液中浸渍10分钟。此后，在温度15℃的上述平衡液中浸渍5分钟。接着，在温度4℃的上述玻璃化液中浸渍。在浸渍30秒后，将小鼠胚胎放在比较例6的玻璃化冷冻保存用工具的玻璃化液吸收体上，在显微镜观察下尽可能除去小鼠胚胎周边的多余的玻璃化液后，在液氮中浸渍，进行玻璃化冷冻。将冷冻的玻璃化冷冻保存用工具在液氮保存容器中保管直到进行融解。
另外，在使用上述实施例3、实施例9和比较例6的玻璃化冷冻保存用工具的胚胎的玻璃化冷冻保存中，按照北里集团公司的操作规程，将胚胎放在玻璃化液吸收体上到进行玻璃化冷冻的时间在1分钟以内(从小鼠胚胎浸渍在玻璃化液中至进行冷冻在1分钟30秒以内)进行。
胚胎的融解方法
将放置了小鼠胚胎的玻璃化保存用工具从液氮中取出，浸渍在温度37℃的融解液(在上述改良磷酸缓冲液中添加了1M蔗糖的溶液)中。在约1分钟的浸渍后，从融解液中回收小鼠胚胎，接着在温度37℃的稀释液(在上述改良磷酸缓冲液中添加了0.5M蔗糖的溶液)中浸渍小鼠胚胎。对稀释液的浸渍时间为约3分钟。此后，在温度37℃的上述改良磷酸缓冲液中浸渍5分钟。
生存率的评价
将经上述融解方法融解的小鼠胚胎转移至小鼠胚胎用的发育培养基KSOM/aa(含BSA)，在5％CO2、5％O2、90％N2、37℃饱和湿度的条件下进行培养。从培养开始每4小时进行观察，将到达培养后24小时再次形成囊胚腔的胚胎被判定为生存。这样被判定为生存的胚胎的个数的比例为：实施例3的玻璃化冷冻保存用工具为95.4％，实施例9的玻璃化冷冻保存用工具为100％，比较例6的玻璃化冷冻保存用工具为42％。
从以上的结果判断，本发明的玻璃化冷冻保存用工具使得细胞或组织的玻璃化冷冻作业和冷冻后的融解作业容易且可靠地进行成为可能。进一步地，使用本发明的玻璃化冷冻保存用工具可以得到细胞或组织的极高的生存率。
工业实用性
本发明除了用于牛等家畜和动物的胚胎移植及人工授精、对人的人工授精等以外，还可用于iPS细胞、ES细胞、一般使用的培养细胞、从活体采集的检查用或移植用的细胞或组织、在活体外培养的细胞或组织等的冷冻保存。
符号说明
1手持部
2玻璃化液吸收体
2a玻璃化液吸收体
2b玻璃化液吸收体
2c玻璃化液吸收体
3玻璃化液吸收层
4支持体
5玻璃化冷冻保存用工具

Claims (3)

1.细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，所述玻璃化冷冻保存用工具含有使用折射率为1.45以下的材料形成的多孔质结构体作为玻璃化液吸收体。
2.如权利要求1所记载的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，其中，所述多孔质结构体的孔径为5.5μm以下。
3.如权利要求2所记载的细胞或组织的玻璃化冷冻保存用工具，其中，所述多孔质结构体为氟树脂多孔体。
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