JP2010068755A

JP2010068755A - 細胞培養基板、その製造方法、細胞培養方法

Info

Publication number: JP2010068755A
Application number: JP2008239786A
Authority: JP
Inventors: Yasutaka Hanada; 修賢花田; Koji Sugioka; 幸次杉岡; Katsumi Midorikawa; 克美緑川
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2008-09-18
Filing date: 2008-09-18
Publication date: 2010-04-02

Abstract

【課題】透明フッ素系樹脂基板に簡便な表面処理を施すことによって細胞培養に適した培養基板を得る。
【解決手段】屈折率１．３３以上１．３４以下の可視光領域において透明なフッ素系樹脂基板２１を酸素を含有しない雰囲気中に保持し、基板表面にＦ₂レーザーのレーザー光をアブレーション閾値以下のレーザーフルエンスで照射して親水性を付与する。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞培養用の透明基板、その製造方法、及び透明基板上への選択的な細胞培養方法に関する。

近年、光学顕微鏡を利用した細胞観察に関する研究分野において、個々の細胞をそれぞれの状態に応じてきめ細かく操作・分析する手法へのニーズが高まっている。こうした研究分野の研究現場では、血球細胞などの浮遊性の細胞に関しては、細胞を個別操作する技術が既に用いられ、フローサイトメトリーや磁気細胞分離システム(ＭＡＣＳ)が細胞操作技術の地位を確立している。

一方で、一般的に接着状態で生理機能を維持する非浮遊性の細胞に関しては、細胞培養基板(主にガラスやＰＤＭＳなどのポリマー)をレジスト処理により親水・疎水性の部分に分ける方法（非特許文献１）や、微細周期構造を基板上に作製する方法（非特許文献２）を用いて、選択的に細胞を固定化することが行われている。また、特許文献１には、水と同程度の屈折率を有する透明フッ素樹脂の表面の粗度を変化させて、標本を培養するためのコラーゲンを定着可能にした顕微鏡観察用培養基板が記載されている。

特開２００３−１７７３３１号公報 H. Liu and Y. Ito: Lab chip. 2 (2002) 175. M. Ochsner, M. R. Dusseiller, H. M. Grandin, S. L. Morris, M. Textor, V. Vogel and M. L. Smith: Lab Chip. 7 (2007) 1074.

選択的に細胞を固定化するために培養基板をレジスト処理により親水・疎水性の部分に分ける方法や、基板上に微細周期構造を作製する方法は、処理工程が複雑であるとともに工程数が多いといった問題がある。また、基板と培養液となる水との間に屈折率差があるため、基板面に対して垂直上方からの顕微鏡観察には適するが、横からの観察に対しては像がぼやけてしまうといった問題、細胞が周期構造に密着し、細胞自身の形状が本来の形状と異なってしまうといった問題がある。

特許文献１では、フッ素系樹脂を水に浸し、紫外線光源としてＡｒＦエキシマレーザーを、エネルギー密度２０ｍＪ／ｃｍ²、繰り返し周波数３０Ｈｚで２５，２００ショット照射して、フッ素系樹脂の表面の粗度を変化させている。この方法によって処理された培養基板は、表面が平坦でないため、細胞によっては(細胞によって大きさが異なるため)細胞自身の形状が本来の形状と異なってしまうという問題があり、形質の変化は場合によっては細胞自滅を招く恐れがある (参考文献：C. S. Chen, M. Mrksich, S. Huang, G. M. Whitesides and D. E. Ingber: Science. 276 (1997) 1425.) 。更に、引用文献１は、透明フッ素系樹脂にコラーゲン等の塗布を可能にするものであり、培養基板に直接細胞を付着させて培養することについては記載されていない。

本発明は、透明フッ素系樹脂基板に簡便な表面処理を施すことによって細胞培養に適した培養基板を得ることを目的とする。

本発明は、屈折率が水とほぼ等しく可視領域において透明なフッ素樹脂基板にＦ₂レーザーを照射して表面改質を行い、基板上のレーザー照射領域のみに細胞を固定化する。このとき、レーザーフルエンスをアブレーション閾値以下とし、基板の表面粗さをレーザー照射によって大きくしない。

本発明による細胞培養基板は、可視光領域において透明な屈折率１．３３以上１．３４以下のフッ素系樹脂からなり、レーザーフルエンスがアブレーション閾値以下の紫外線レーザー照射によって、表面に親水性領域が形成された基板である。親水性領域は、表面の二乗平均粗さが基板本来の粗さと同等の２．６ｎｍ以下である。この程度の表面粗さであれば、そこに付着した細胞が変形したり、観察に影響を及ぼすことはない。細胞が付着可能な親水性領域は、特定のパターンに従って形成してもよい。フッ素系樹脂は一例として化学式[CF₂=CFOCF₂CF₂CF=CF₂]_nで表される樹脂であり、紫外線レーザーは一例としてＦ₂レーザーである。

本発明による細胞培養基板の製造方法は、可視光領域において透明な屈折率１．３３以上１．３４以下のフッ素系樹脂基板を酸素を含有しない雰囲気中に保持する工程と、前記基板の表面に波長が基板の光吸収端波長より短い２００ｎｍ以下のレーザー光をアブレーション閾値以下のレーザーフルエンスで照射して親水性を付与する工程とを有する。

また、本発明による細胞培養方法は、可視光領域において透明な屈折率１．３３以上１．３４以下のフッ素系樹脂基板からなる基板を酸素を含有しない雰囲気中に保持する工程と、前記基板の表面に波長が基板の光吸収端波長より短い２００ｎｍ以下のレーザー光をアブレーション閾値以下のレーザーフルエンスで照射して親水性を付与する工程と、親水性を付与された基板上に直接細胞を培養する工程とを有する。

細胞の選択培養では、レーザー照射領域のみが親水性になることから、レーザー照射領域のみに強く細胞が培養される。よって、本発明はＦ₂レーザーを照射するだけ、という簡単な工程で、かつ、少ない工程数により、細胞を屈折率が水とほぼ等しく可視領域において透明なフッ素樹脂基板上に選択培養できる。この基板は水と屈折率がほぼ等しいことから、細胞観察の際にあらゆる角度から細胞観察をすることが可能である。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
以下に示す実施例では、細胞培養液の屈折率、すなわち水の屈折率１．３３３と同程度の屈折率を有する可視光領域において透明なフッ素系樹脂として、屈折率が１．３３〜１．３４であるＣＹＴＯＰ（商品名、旭硝子株式会社）を用いた。ＣＹＴＯＰの化学構造は図１に示すとおりである。また、ＣＹＴＯＰは高い疎水性を有し、その光学的特性、化学的特性、電気的特性は以下のとおりである。
・光学的特性
透過限界波長：＞９５％（２００ｎｍ＜λ＜２０００ｎｍ、厚さ２００μｍ）
屈折率：１．３４（λ＝５８９ｎｍ）
アッベ数：９０
・化学的特性
耐酸性・耐アルカリ性、有機溶媒には反応なし
・電気的特性
誘電率：２．１
体積固有抵抗値：１０¹⁷Ω・ｃｍ
絶縁破壊電圧：１１ｋＶ／０．１ｍｍ
耐アーク性：１８０ｓ

図２は、高い疎水性を有するＣＹＴＯＰ基板の表面改質に用いた装置の概略図である。ＣＹＴＯＰ基板２１は、ＸＹステージ２２上に保持されて窒素ガスで満たされた試料室２３に配置されている。波長１５７ｎｍ、パルス幅２０ｎｓのＦ₂レーザー２４から３０Ｈｚの周期で発生されたレーザー光は、４×４ｍｍのアパーチャ２５を通って減衰板２６で照射エネルギーを調整され、シャッター２７を通り、ＣａＦ₂製の対物レンズ２８で集光されてＣＹＴＯＰ基板２１上にスポット径５０μｍ−１０ｍｍで照射される。照射エネルギーは、パワーメーター２９によって計測し、減衰板２６により調整することができる。レーザーフルエンスはアブレーション閾値以下（４ｍＪ／cm²）とし、本実施例ではレーザーショット数は３００shotとした。

なお、試料室２３中の雰囲気は酸素を含有していなければ良く、真空雰囲気であっても良い。ここでレーザー光源としてＦ₂レーザーを用いたのは、波長が２００ｎｍ以下の１５７ｎｍであり、フッ素樹脂基板の光吸収端波長よりも短いためである。この条件を満たせば、Ｆ₂レーザー以外のレーザーを用いてもよい。また、レーザーフルエンスをアブレーション閾値以下としたのは、アブレーションにより加工痕が形成された場合、細胞は加工痕内に吸着されるが、加工痕の形状によって、細胞の形が制限されてしまうのを防ぐためである。ＣＹＴＯＰ基板の場合、アブレーション閾値は３２ｍＪ／ｃｍ²のため、レーザーフルエンスを４ｍＪ／ｃｍ²とした。

図３は、Ｆ₂レーザー照射による表面改質の前と後に、ＣＹＴＯＰ基板の表面に付着させた水滴の状態を示す図である。図３（ａ）は表面改質前に付着させた水滴の状態を示し、図３（ｂ）は表面改質後に付着させた水滴の状態を示す。水滴の接触角は、表面改質前には１１０度であったが、表面改質後には７３度と９０度より小さくなっており、ＣＹＴＯＰ基板の表面はＦ₂レーザーをアブレーション閾値以下のエネルギーで照射することにより親水性が付与されることが確認できる。

図４は、レーザーショット数に対する接触角依存性の実験結果を示す図である。図４から、レーザーフルエンスが４ｍＪ／ｃｍ²の条件では、ショット数が３００〜５００程度のとき接触角低下の効果が著しく、それより大幅にショット数を増した場合には親水性改善の効果が低減することが分かる。

本発明のＦ₂レーザー照射による表面処理の場合、Ｆ₂レーザー照射前後においてＣＹＴＯＰの透過率特性に変化はなく、基板表面の平坦性も失われない。

図５に、Ｆ₂レーザー照射前後のＣＹＴＯＰ基板表面のＡＦＭ像を示す。図５（ａ）はＦ₂レーザー照射前のＣＹＴＯＰ基板表面ＡＦＭ像、図５（ｂ）はＦ₂レーザーを３００ショット照射した後のＣＹＴＯＰ基板表面ＡＦＭ像、図５（ｃ）はＦ₂レーザーを１５００ショット照射した後のＣＹＴＯＰ基板表面ＡＦＭ像である。二乗平均粗さ（ＲＭＳ）は、Ｆ₂レーザー照射前が２．５１ｎｍであり、３００ショット照射後に２．５７ｎｍ、１５００ショット照射後に６．０６ｎｍであった。

これより、Ｆ₂レーザーを３００ショット照射したことによる改質後の基板のＲＭＳは培養した細胞の形状に影響を与えない基板本来の粗さと同等の２．６ｎｍ以下であることから、使用した細胞（HeLa細胞）の大きさに比べると、形質の変化や、観察時に影響を与えることがない。また、Ｆ₂レーザー照射前と、３００〜５００ショットのＦ₂レーザー照射後におけるＣＹＴＯＰ基板表面の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）の変化は２％以下であり、ＣＹＴＯＰ基板表面の平坦性はＦ₂レーザー照射による表面改質前後で保たれていることが確認できる。但し、本実施例の実験条件ではショット数が１０００ショットを超えるとアブレーションが起こり始め、また親水性が落ちる。

図６（ａ）にＦ₂レーザー未照射、図６（ｂ）に３００ショット照射後、図６（ｃ）に１５００ショット照射後のＣＹＴＯＰ基板の透過率特性を示す。Ｆ₂レーザー照射による表面改質前後でＣＹＴＯＰが有する透過率特性が維持されていることが確認できる。

次に、Ｆ₂レーザー照射によって表面改質を行った本発明のＣＹＴＯＰ基板にHeLa細胞を培養した。比較のため、レーザー未照射のＣＹＴＯＰ基板にもHeLa細胞を培養した。ここで、図７に、ＣＹＴＯＰ基板の表面改質から細胞培養までの処理手順を示す。最初に、大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍ×５００μｍ程度のＣＹＴＯＰ基板を用意し、それを図２に示した装置に装着して表面改質を行った（Ｓ１１）。レーザースポット径は１０ｍｍである。レーザーフルエンスは上記同様、アブレーション閾値以下（４ｍＪ／ｃｍ²）とし、レーザーショット数は３００とした。次に、基板を７０％エチルアルコールによって洗浄した（Ｓ１２）。次に、洗浄したＣＹＴＯＰ基板にHeLa細胞を培養した（Ｓ１３）。

図８に、細胞培養の結果を示す。図８（ａ）は表面改質を行った本発明のＣＹＴＯＰ基板上に培養されたHeLa細胞を示し、図８（ｂ）はＦ₂レーザー未照射のＣＹＴＯＰ基板上に培養されたHeLa細胞を示す。図８（ａ）より、本発明のレーザー改質を行ったＣＹＴＯＰ基板では、細胞が紡錘状に伸び、基板に強く密着しているのが確認できる。一方、レーザー改質を行わないＣＹＴＯＰ基板の場合には、図８（ｂ）に示すように、基板表面が疎水性であることからその上の細胞は球状であり、また基板に密着しない。

次に、Ｆ₂レーザー光を更に絞り、スポット径５０μｍとし、ＣＹＴＯＰ基板上でスキャンさせてＣＹＴＯＰ基板表面を部分的に改質処理し、その後、そのＣＹＴＯＰ基板上にHeLa細胞培養を行った。実験条件は、レーザーフルエンス：４ｍＪ／ｃｍ²、レーザースキャン速度：１μｍ／秒、レーザー照射幅：５０μｍである。図９に、細胞培養の結果を示す。図９より、HeLa細胞はレーザー照射された幅５０μｍの直線状の領域のみに吸着し、細胞が線上に配列しているのが確認できる。ここではＣＹＴＯＰ基板表面に細い直線状の改質領域を選択的に形成したが、改質領域を他のパターン形状に従って選択的に形成することも適宜可能である。例えば、細胞が吸着できる改質領域を三角や円の形にパターン化して形成できる。

また、従来法による細胞の培養では、ガラスやＰＤＭＳなどといった透明材料が培養基板として用いられているが、これらの透明材料は水との屈折率差が大きく、細胞の三次元顕微鏡観察には適さない。しかしながらＣＹＴＯＰの屈折率は水の屈折率とほぼ同じであることから、細胞の３次元顕微鏡観察に適している。図１０（ａ）にＣＹＴＯＰ基板上に細胞を培養した場合の細胞の３次元顕微鏡観察像を、図１０（ｂ）にガラス基板上に細胞を培養した場合の細胞の３次元顕微鏡観察像を示す。これらの図を比較すると、細胞を横から観察した際に、ＣＹＴＯＰ基板を使用した場合には、その形状を鮮明に確認できるが、ガラス基板を使用した場合には、鏡像が現れる。また、細胞と基板との境界面は、ＣＹＴＯＰ基板の場合には鮮明に映るが、ガラス基板を使用した場合、像がぼやけて見える。よって細胞を培養したＣＹＴＯＰ基板の３次元顕微鏡観察は従来法に比べて有効であると。

本発明は、Ｆ₂レーザーを紫外透過性フッ素樹脂基板（ＣＹＴＯＰ）に照射するだけ、という簡単な工程で、基板表面の選択的改質が可能であり、その改質した領域に細胞を選択的に固定化できる。また、ＣＹＴＯＰは水と屈折率がほぼ等しいことから、鮮明な細胞の顕微鏡観察用マイクロチップとして機能する。

なお、以上の説明では、水の屈折率１．３３と同程度の屈折率を有する可視光領域において透明なフッ素系樹脂としてＣＹＴＯＰを例にとって説明したが、同様の性質を持つ材料であればＣＹＴＯＰ以外の材料を用いてもかまわない。

ＣＹＴＯＰの化学構造を示す図。基板の表面改質に用いた装置の概略図。Ｆ₂レーザー照射による表面改質の前と後にＣＹＴＯＰ基板の表面に付着させた水滴の状態を示す図。レーザーショット数に対する接触角依存性の実験結果を示す図。Ｆ₂レーザー照射前後のＣＹＴＯＰ基板表面のＡＦＭ像を示す図。Ｆ₂レーザー未照射及び照射後のＣＹＴＯＰ基板の透過率特性を示す図。ＣＹＴＯＰ基板の表面改質から細胞培養までの処理手順を示す図。細胞培養の結果を示す図。細胞培養の結果を示す図。細胞の３次元顕微鏡観察像を示す図。

符号の説明

２１ＣＹＴＯＰ基板
２２ＸＹステージ
２３試料室
２４Ｆ₂レーザー
２５アパーチャ
２６減衰板
２７シャッター
２８対物レンズ
２９パワーメーター

Claims

可視光領域において透明な屈折率１．３３以上１．３４以下のフッ素系樹脂からなり、
レーザーフルエンスがアブレーション閾値以下の紫外線レーザー照射によって、表面に親水性領域が形成されたことを特徴とする細胞培養基板。
請求項１記載の細胞培養基板において、前記親水性領域の表面の二乗平均粗さが２．６ｎｍ以下であることを特徴とする細胞培養基板。
請求項１又は２記載の細胞培養基板において、所定のパターンに従って前記親水性領域が形成されていることを特徴とする細胞培養基板。
請求項１−３のいずれか１項記載の細胞培養基板において、前記フッ素系樹脂は化学式[CF₂=CFOCF₂CF₂CF=CF₂]_nで表される樹脂であり、前記紫外線レーザーはＦ₂レーザーであることを特徴とする細胞培養基板。
可視光領域において透明な屈折率１．３３以上１．３４以下のフッ素系樹脂基板を酸素を含有しない雰囲気中に保持する工程と、
前記基板の表面に波長が基板の光吸収端波長より短い２００ｎｍ以下のレーザー光をアブレーション閾値以下のレーザーフルエンスで照射して親水性を付与する工程とを有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
請求項５記載の細胞培養基板の製造方法において、前記フッ素系樹脂は化学式[CF₂=CFOCF₂CF₂CF=CF₂]_nで表される樹脂であり、前記レーザーはＦ₂レーザーであることを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
請求項５又は６記載の細胞培養基板の製造方法において、前記親水性が付与された領域は表面の二乗平均粗さが基板本来の粗さと同等の２．６ｎｍ以下であることを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
請求項５−７のいずれか１項記載の細胞培養基板の製造方法において、前記レーザー光照射の前後における表面の二乗平均粗さの変化が２％以下であることを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
可視光領域において透明な屈折率１．３３以上１．３４以下のフッ素系樹脂基板からなる基板を酸素を含有しない雰囲気中に保持する工程と、
前記基板の表面に波長が基板の光吸収端波長より短い２００ｎｍ以下のレーザー光をアブレーション閾値以下のレーザーフルエンスで照射して親水性を付与する工程と、
前記親水性を付与された基板上に細胞を培養する工程とを有することを特徴とする細胞培養方法。
請求項９記載の細胞培養方法において、前記フッ素系樹脂は化学式[CF₂=CFOCF₂CF₂CF=CF₂]_nで表される樹脂であり、前記レーザーはＦ₂レーザーであることを特徴とする細胞培養方法。
請求項９又は１０記載の細胞培養方法において、前記親水性が付与された領域は表面の二乗平均粗さが基板本来の粗さと同等の２．６ｎｍ以下であることを特徴とする細胞培養方法。
請求項９−１１のいずれか１項記載の細胞培養方法において、前記レーザー光照射の前後における表面の二乗平均粗さの変化が２％以下であることを特徴とする細胞培養方法。