JP7432961B2 - サンプルホルダーアセンブリ - Google Patents

Description

本開示は、試験化合物などの第１のリガンドと標的分子などの受容体との間の相互作用を決定する方法に関する。本開示はまた、前記方法で使用するためのサンプルホルダーアセンブリに関する。

バイオセンサは、結合キネティクスデータを生成するための創薬で使用され、これは、化合物最適化プロセス中の構造とキネティクスとの関係の理解を深めるために使用できる。最適化された流体工学と高いサンプリングレートにより分子の会合および解離のプロセスを正確に説明できるため、キネティクス情報は、表面プラズモン共鳴
（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）などのマイクロ流体工学ベースのバイオセンサプラットフォームを通じて推測されることがよくある。拡張された解離プロセスに関する情報は、最終的には化合物の有効性および安全性を高める可能性を提供するため、対応する薬物動態学的特徴と相関する場合、治療の成功を確実にするのに役立つ可能性がある。

すべての光学バイオセンサプラットフォームは、１つの相互作用パートナー、通常は薬物標的タンパク質、オリゴヌクレオチド、または細胞全体をバイオセンサ表面に付着させることにより、同じガイド原理に従う。続いて、直接結合情報を取得するため、または細胞システムで作業する際の結合の生物学的結果を研究するために、修飾された表面を、試験化合物を含有する溶液で試験する。このアッセイ構成は、直接結合アッセイ（Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ：ＤＢＡ）と呼ばれる。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および光導波路（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ：ＯＷＧ）は、エバネッセント波現象を利用しているため、センサ表面の分子量の変化に比例する屈折率の変化を測定できる。対照的に、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）は、センサと直接接触しているレイヤーの有効光学的厚さの変化を監視できる干渉パターンの分析を通じて機能する。すべてのプラットフォームに共通しているのは、特にマイクロ流体工学ベースのシステムを使用している場合の結合相互作用の時間分解測定機能である。光学バイオセンサシステムは使用済み試薬のラベリングを必要としないため、ターゲットまたは化合物のいずれかを標識することによって導入される可能性のあるアッセイアーティファクトの数を減らすことを目的としたラベルフリー技術と呼ばれることがよくある。

マイクロ流体工学ベースのバイオセンサプラットフォームの１つの一般的な特性は、２つの別々の実験の必要性である。まず、センサ表面を分析物と接触させる。これにより、反応速度が測定され、この反応速度は、最も単純なケースでは、会合の速度定数である
ｋ_ｏｎと、解離の速度定数であるｋ_ｏｆｆとの畳み込みである。通常この反応は、センサ表面の平衡被覆率に達するまで観察され、その被覆率は平衡解離定数Ｋ_ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎによって決定される。続いて、センサ表面は、解離反応のみを監視することを目的として、分析物を含まない溶液にさらされ、そこからｋ_ｏｆｆを直接推定することができる。

このタイプのバイオセンシングには、特に標的分子が膜タンパク質である場合、多くの欠点がある。承認されたすべての薬物標的の約６０％が膜タンパク質であると推定されている。特に膜タンパク質の場合、成功率は約３０％と低くなっている。

多くの薬物標的、特に膜タンパク質は、センサ表面での固定化と互換性がない。したがって、時間およびリソースを大量に消費する変更を標的に導入する必要がある。

信号の振幅は固定化された標的の数に比例するため、表面に高密度の薬物標的が必要である。

これらのシステムは、表面での正味の変化のみを検出できる。したがって、それらは平衡状態での結合および非結合のダイナミクスを棚に上げる。

これらのセンサプラットフォームは、非常に限られた数のセンサ表面を提供する。ＳＰＲシステムには通常、３～４個の個別のセンサ表面がある。これは、標的が機能しなくなると、センサが「失われる」ことを意味する。センサコストの次に、デバイスはその特定の表面のそれ以上のデータを記録できない。これにより、スループットが大幅に制限される。

新しい分析を開始し得る前に、センサ表面に試験化合物が含まれていない必要がある。滞留時間が長い化合物の場合、これは困難な場合があり、表面再生がスループットを制限することがよくある。

感度は、バイオセンサプラットフォームの技術的特徴によって制限される。

標的の固定化の問題を軽減する１つの方法は、薬物標的を溶液中に保つことである。標的を固定化する代わりに、いわゆるツール化合物が固定化され、浮遊標的が特定の方法で相互作用することが知られている。試験化合物を機器の外側の標的に加えて、標的分子および試験化合物分子を反応させ、その後、得られた溶液を固定化されたツール化合物の上に注入する。この技術は、一般に溶液アッセイにおける阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：ＩＳＡ）と呼ばれる。したがって、試験化合物の異なる濃度がツール化合物への標的の結合にどのように影響するかを調査することにより、薬物標的への試験化合物の平衡解離定数Ｋ_ｄを決定することができる。非特許文献１は、このタイプのアッセイを開示している。従来の標識フリー技術の場合、固定化されたツール化合物は、薬物標的からゆっくりと解離する必要がある。このようなツール化合物を入手することは困難である。

ＤＢＡとは対照的に、標識フリー技術の構成では、ＩＳＡと組み合わせた結合キネティクスの測定、すなわち会合速度定数ｋ_ｏｎおよび解離速度定数ｋ_ｏｆｆを使用できない。非特許文献２は、非標識フリー技術が競合実験によって非常に限られた範囲でキネティクスを測定できることを開示し、２つのリガンドが標的への結合を競合している場合に結合キネティクスがどのように変化するかを数学的に説明している。リガンドのうちの１つのキネティクスがわかっていて（リガンドＡ）、このリガンドがラベル付けされていて、他のリガンド（リガンドＢ）と区別できる場合、リガンドＢの結合キネティクスは、リガンドＡの結合キネティクスを記録することによって決定できる。非特許文献３は、これらのアッセイには、標的に高い親和性で結合する標識されたツール化合物が必要であることを開示している。

非特許文献４は、高感度で溶液アッセイにおいて阻害を実行できる単一分子ベースのＩＳＡ（ＳＭＭ－ＩＳＡ）を開示している。この方法では、標的は表面に固定化されないが、代わりに、脂質環境に蛍光色素を運ぶ浮遊自由拡散リポソーム内で／において固定化される。表面には、標的に結合できるツール化合物が固定化される。変更された表面は、全反射蛍光（Ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＩＲＦ）顕微鏡で画像化される。ＴＩＲＦは、表面に近いリポソーム（１００ｎｍのカップル）のみを励起する励起光のエバネッセント場を生成する。リポソームの濃度を低く保つことにより、表面に結合し、表面から解離する単一のリポソームを画像化することができる。上記の従来の方法とは対照的に、高感度の単一分子アッセイにより、薬物標的に対するツール化合物の親和性を桁違いに低くすることができる。さらに、標的含有リポソームの濃度は、従来のＩＳＡよりも桁違いに低くなる可能性がある。

ただし、ＳＭＭ－ＩＳＡに関する最初のレポートでは、決定できるのは標的と表面固定化されたツール化合物間の結合キネティクスのみであり、標的と試験化合物との間の重大な相互作用の動的キネティクスパラメーター（結合速度定数（ｋ_ｏｎ）および解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ））ではなかった。追加の欠点は、スループットが低く、手作業が大量に行われることであった。これにより、コスト効率、再現性、ひいては信頼性が制限されるため、業界の要件を満たさない。

非特許文献５は、全反射蛍光顕微鏡を使用して、炎症反応に関与するＧＰＣＲであるＣＸＣＲ３と、そのケモカインリガンドの２つであるＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１との間のキネティクスを特徴付けることを開示している。膜タンパク質自体ではなく、ＧＰＣＲを含有する天然小胞の脂質膜の蛍光標識および表面への対応するリガンドの固定化により、単一の分子平衡変動分析を使用した溶液中の受容体とリガンドとの間の解離定数の決定を可能にする。ＣＸＣＲ３とケモカインリガンドＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１との間の相互作用は、停滞液体条件下で行われた。

非特許文献６は、単一結合事象の平衡変動分析から、膜受容体へのリガンド結合のキネティクスを開示している。停滞液体条件を使用し、各会合および解離事象をマイクロウェル形式のＴＩＲＦ顕微鏡法によって経時的に監視した。

Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（２０１３）、５６、３２２８～３２３４ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８４）、２５、１－９ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７５）、４６８、４２－４９ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１５）、８７、４１００－４１０３ Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１５，３１（３９），ｐｐ１０７７４－１０７８０ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１、１３３、１４８５２－１４８５５

上記の問題のいくつかを克服すること、または少なくとも軽減することが、本願の目的である。さらに本願の目的は、これまでに知られている技術によって提供されない利点および／または態様を提供することにある。

本願発明は、第１のリガンドと受容体との間の相互作用を決定する方法であって、次の一連の方法工程：
ａ）第１のリガンドを含まず、濃度Ｃ_ｉの受容体を含む第１の溶液を提供する工程と、
ｂ）時間間隔ｔ_１の間の受容体と第２のリガンドとの間の結合事象の数を記録しながら、第１の溶液と第２のリガンドで機能化された試験ウェル壁とを接触させる工程と、
ｃ）時間間隔ｔ_２の間の第２の溶液中の第２のリガンドと受容体との間の結合事象の数の記録を継続しながら、受容体を含まず、濃度Ｃ_ｎの第１のリガンドを含む試験溶液を第１の溶液に添加して、第２の溶液を提供する工程と、を含む、方法を提供する。

重要なことに、本明細書に記載の方法における結合事象の数の記録は、第１のリガンドを含む試験溶液の添加中、すなわち工程ｃ）に行われ、第１のリガンドの添加直後に第２の溶液が平衡に到達する前に開始され得る。これは、結合事象の記録が第１のリガンドの添加後にのみ行われ、第１のリガンドと受容体との間の結合が平衡または準平衡に達した停滞条件とは対照的である。したがって、本明細書に記載の方法は、非停滞液体条件などの非停滞条件を使用する。結果として、第１のリガンドと受容体との間の相互作用の決定は、第１のリガンドと受容体との間の平衡結合の前に行われる。本明細書に記載の方法の重要な利点は、測定を行うための合計時間を長くする平衡に、第１のリガンドおよび受容体が達するか、または実質的に達するのを待つ必要がないことである。代わりに、本明細書に記載の方法は、測定が実行されるときに高速スループットを可能にする。もちろん、これはスクリーニング用途で特に有利である。

工程ｂ）における結合事象の記録は任意であることが理解されよう。一例では、工程ｂ）における結合事象の記録は、工程ｃ）の直前など、工程ｃ）の前に行われないか、または行われる。したがって、工程ｂ）が以下である、本明細書に記載の方法が提供される：
ｂ）時間間隔ｔ１の間の受容体と第２のリガンドとの間の結合事象の数を記録するか、または記録せずに、第１の溶液と第２のリガンドで機能化された試験ウェル壁とを接触させる工程。

本明細書に記載の方法のさらなる利点は、第２のリガンドと受容体との間の結合キネティクスが既知または決定する必要がないことである。

時間間隔ｔ_２は、第１のリガンドと受容体との間の結合反応の少なくとも１／ｋ_ｏｂｓである。したがって、時間間隔ｔ_２は、第１のリガンドと受容体との間の結合反応が
１／ｋ_ｏｂｓ以上であり得る。ｋ_ｏｂｓは、本明細書に記載されているように測定および計算することができる。

一例では、第２のリガンドと受容体との間の結合事象の記録が、第１のリガンドおよび受容体が平衡結合に達するまで行われる。さらなる例では、第２のリガンドと受容体との間の結合事象の記録が、第１のリガンドおよび受容体が平衡結合に達するまでおよびその後に行われる。

本明細書に記載の方法は、受容体と第２のリガンドとの間の結合事象の記録が工程ｂ）と工程ｃ）との間で中断されないように、すなわち記録が連続的に行われるように実施され得ることが理解される。さらに、時間間隔ｔ_１は、工程ｂ）で受容体を添加することから、工程ｃ）で第１のリガンドが添加されるまでの時間範囲を意図している。さらに、時間間隔ｔ_２は、工程ｃ）において試験溶液に第１のリガンドを添加することから、少なくとも第１のリガンドおよび受容体が本明細書に記載の平衡結合に達するか、または少なくとも１／ｋ_ｏｂｓになるまでの時間範囲を意図している。

本明細書に記載の平衡結合は、準平衡、すなわちほぼ平衡または実質的に平衡で結合し得る。

本明細書に記載の方法は、工程ｄ）をさらに含み得る：
ｄ） 工程ｂ）および工程ｃ）で記録された結合事象に基づいて、第１のリガンドと受容体との間の相互作用を決定する工程。

この文書では、第１のリガンドは試験化合物である場合がある。「第１のリガンド」および「試験化合物」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、この文書では、「受容体」という用語は、薬物標的などの標的であり得る。「受容体」および「標的」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、この文書では、第２のリガンドはツール化合物である場合がある。「第２のリガンド」および「ツール化合物」という用語は、交換可能に使用され得る。

本明細書に記載の方法の一連の方法工程は、複数の試験ウェルのそれぞれにおいて完全に実行され得る。

各方法工程は、各試験ウェルで同時に実行することができ、すなわち、最初の工程を各試験ウェルで同時に実行することができ、次に、各連続工程を各試験ウェルで同時に実行することができる。あるいは、方法工程は、試験ウェルにおいて異なる時間に実施され得る。

試験壁に結合する受容体の数は、第１のリガンドの添加の前後に記録され得る。これらの記録された結合事象は、複数の試験ウェルについて合計され得る。第１のリガンドの添加前の結合事象の数は、本明細書に記載されるように、時間間隔ｔ_１の間に記録され得る。第１のリガンドの添加後の結合事象の数は、本明細書に記載されるように時間間隔ｔ_２の間に記録され得る。時間間隔ｔ_１およびｔ_２は、それぞれ、同じであっても異なっていてもよい。試験化合物の添加前の合計された記録された結合事象、および試験化合物の添加後の合計された記録された結合事象は、それぞれ、その後、第１のリガンドと受容体との間の相互作用を決定するために使用され得る。各試験ウェルで方法工程が同時に実行されない場合、これを考慮して、複数の試験ウェルにおける結合事象を正しく合計する必要がある。

さらに、一連の方法工程は、試験溶液中のいくつかの異なる濃度Ｃ_ｎの第１のリガンドに対して実行され得る。従って本明細書に記載の方法は、工程ｅ）を備えてもよい。
ｅ）試験溶液中の第１のリガンドの濃度Ｃ_ｎを増加させて工程ｃ）を繰り返すこと。

重要なことに、本明細書に記載の方法の試験溶液は受容体を含まず、第１の溶液に添加される。したがって、第１のリガンドおよび受容体は、第１の溶液に試験溶液を加える前に反応することを許されない。これらの特徴により、本明細書に記載の方法を、機能化表面に添加する前に反応させることができる受容体および試験化合物の両方を試験溶液が含む溶液アッセイにおける阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：ＩＳＡ）と区別する。

本明細書に記載の試験ウェル壁は、単一の試験ウェルまたは複数の試験ウェルの試験ウェル底壁であり得る。試験ウェルの壁は、試験ウェルの内部に面する第２のリガンドで機能化され、それによって第２のリガンドが固定化される。試験ウェル壁の機能化は、当技術分野で知られている技術を使用して行うことができる。例えば、試験ウェル壁はピラニア溶液で処理され、続いて試験ウェル壁が機能化され得る。

受容体は、そのまま使用することも、ビヒクルと組み合わせて使用することもできる。受容体および／またはビヒクルは、標識されていても、標識されていなくてもよい。標識は、フルオロフォアを含み得る。一例では、フルオロフォアを含むビヒクルが提供される。受容体とビヒクルとの組み合わせは、受容体構造に悪影響を与えることなく、または実質的に悪影響を与えることなく、受容体を固定化することを可能にする。さらに、ビヒクルは、特にそれが膜受容体である場合、その本来の環境を表すまたは模倣する環境を受容体に提供することができる。固定化された受容体は、選択された溶媒もしくはビヒクル、またはビヒクルと溶媒との組み合わせに可溶性または実質的に可溶性であり得る。

受容体を固定化するために使用できるビヒクルの例としては、リポソーム、リポソーム、デンドリマー、デンドロン、錯化ランタニド、量子ドット、ナノダイヤモンド、脂質ディスクのうちの少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。

第１のリガンドおよび第２のリガンドは、同じであっても異なっていてもよい。したがって、表面に結合した第２のリガンドからの受容体の解離速度を既知または測定する必要がある方法とは対照的に、第１および第２のリガンドは互いに異なる可能性がある。

受容体は、医薬品受容体であり得る。例えば、受容体は、トロンビンを含むか、またはトロンビンからなり得る。追加的または代替的に、第１のリガンドおよび／または第２のリガンドは、医薬品であり得る。例えば、医薬品はメラガトランであり得る。

本明細書に記載の方法の工程ｂ）および／または工程ｃ）は、顕微鏡の使用を含み得る。多くの場合、顕微鏡の使用は、受容体と第２のリガンドと間の結合事象の数を記録するのに適している。本開示の方法と併せて使用することができる適切な技術の例としては、画像分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）、導波路イメージング、干渉散乱、ライトフィールド顕微鏡法、落射蛍光顕微鏡法、レーザー走査顕微鏡法、軌道走査顕微鏡法、局所増強顕微鏡法、構造化照明顕微鏡法、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法、空間変調照明、遍在局在顕微鏡法、および／またはＸ線顕微鏡法が挙げられる。

本明細書に記載の方法は、すなわち、観察された速度定数ｋ_ｏｂｓ、会合速度定数ｋ_ｏｎ、解離速度定数ｋ_ｏｆｆ、平衡解離定数Ｋ_ｄ、部分占有率(fractional occupancy)のうちの１つ以上のうちの少なくとも１つを第１のリガンドについて決定することを、できるようにする、および／または含んでもよい。

速度定数ｋ_ｏｂｓは、受容体が第１のリガンドで占有される速度を特徴付ける。これは、式１に示すように、会合速度定数ｋ_ｏｎ、解離速度ｋ_ｏｆｆ、および試験化合物の濃度Ｃ_ｎに依存する。

第１のリガンドによって結合された受容体は、もはや第２のリガンドに結合することができないか、または固定化された第２のリガンドに異なって結合する。単位時間あたりの結合事象の数はα（ｔ）と呼ばれ、以下の式２で与えられる。

Ｃ_{ｉ，ｆｒｅｅ}（ｔ＜ｔ_ｉｎｈ）は、第１のリガンド（阻害剤）が添加される時間（すなわち、ｔ_ｉｎｈ）よりも短い時間ｔにおいて、第１のリガンドまたは固定化された第２のリガンドによって結合されない受容体の濃度であることが理解されよう。さらに、ｋ_ｏｎ，Ｖは、受容体への第１のリガンドの会合速度定数であり、受容体は、ビヒクルなどのビヒクルに結合する。

濃度Ｃ_ｎを有する第１のリガンドを添加すると、以下の式３に示すように、Ｃ_{ｉ，ｆｒｅｅ}（ｔ＜ｔ_ｉｎｈ）はＣ_{ｉ，ｆｒｅｅ}（ｔ）に変わる。

式３および式４で、β（ｔ）は、時間ｔで第１のリガンドと複合体を形成している受容体の割合を表す。β（ｔ）は０から１の間の値、つまり０＜β（ｔ）＜１であり得る。β（ｔ）は、以下の式４に示すように決定され得る。

本明細書に記載されるように、Ｃ_ｎは第１のリガンドの濃度であり、Ｋ_ｄは平衡定数であり、ｋ_ｏｂｓは観察された速度定数であり、ｔは測定が行われる時間であり、ｔ_ｉｎｈは第１のリガンド（阻害剤）が添加される時間である。

第１のリガンドの平衡解離定数Ｋ_ｄは式５で表され、ここで、［Ｌ］は第１のリガンドの濃度、［Ｒ］は受容体の濃度、［ＬＲ］は試験化合物に結合する受容体の濃度である。

Ｋ_ｄは、式６に示すように、解離定数ｋ_ｏｆｆと会合定数ｋ_ｏｎとの比率として表すこともできる。

部分占有率(fractional occupancy)は、式７に示すように、受容体－リガンド複合体の量を受容体の初期量で割ったものであり、ここで、
[Ligand Receptor]は平衡状態で受容体に結合する第１のリガンドの濃度、
[Total Receptor]は受容体の初期濃度である。

部分占有率(fractional occupancy)は式８のように表すこともでき、ここで、
[Ligand]は結合反応の平衡状態での遊離の第１のリガンドの濃度であり、
Ｋ_ｄは本明細書に記載のとおりである。

本発明の方法が複数の試験ウェルで実施される場合、これらは、マイクロタイタープレートなどのサンプルホルダーアセンブリの一部を形成し得る。したがって、サンプルホルダーアセンブリは、マイクロタイタープレートを含むか、またはそれからなることができる。このようなサンプルホルダーアセンブリは、時間およびコスト効率の高い方法で多数の実験を実施することを可能にする。さらに、複数の試験ウェルでこの方法を実施することにより、試験ウェルで記録された結合事象の数を合計して、より多くのデータポイントを提供できるため、感度を高めることができる。

有利には、本明細書に記載の複数の試験ウェルの使用は、リガンドが非常に少ないのに受容体結合スポットが多すぎるためにリガンドが枯渇する場合に起こり得る、いわゆるリガンド枯渇を回避することを可能にする。リガンドの枯渇を避けるために、受容体濃度を下げる必要がある。ただし、結合アッセイの信号強度は通常、受容体の濃度に比例するため、これにより信号強度が低下する。本明細書に記載の方法における複数の試験ウェルの使用は、いくつかの試験ウェルからのデータポイントを合計することを可能にすることによって、不十分な信号強度を補償する。

ＴＩＲＦは、本明細書に記載の方法と組み合わせて使用するのに適した技術であることが見出された。したがって、サンプルホルダーアセンブリが、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡と組み合わせて使用されるように構成されると共に、
－ 複数の底なし試験ウェルを含むサンプルホルダープレートと、
－ 接着剤などの付着手段などの材料によってサンプルホルダープレートに取り付けられ、それによって複数の試験ウェルのウェル底壁を形成する底プレートと、
を含み、
接着剤などの付着手段などの材料は、底プレートの屈折率Ｎ_ｇよりも低い屈折率Ｎ_ａを有する、
ところの本明細書に記載の方法が提供される。

従来、ＴＩＲＦ光源は、サンプルホルダーアセンブリの底プレートの下から提供される。ＴＩＲＦ光源を動かす必要があるため、これは複数のウェルで時間がかかる。代わりに、ＴＩＲＦ光源は、光ビームが底プレート全体に伝播するように配置することができる。ただし、これはまた、光ビームが例えば試験ウェル底壁に漏れないことを必要とする。さらに、接着剤などの付着手段は、組み立てられたときにサンプルホルダーアセンブリの壁に確実かつ迅速に付着できる必要があり、サンプルホルダーウェルに添加された溶液および試薬などの化学物質にも耐えられる必要がある。

例えば、付着手段は接着剤であり得る。有利には、本明細書に記載の接着剤は、ＵＶ硬化性であり得、および／または緩衝液に対して耐性であり得る。ＵＶ硬化性により、機能化された試験ウェル壁をサンプルホルダープレートの壁に便利かつ迅速に取り付けることができる。緩衝液に対する耐性により、機能化された試験ウェル壁がサンプルホルダープレートから外れるのを防ぐ。

接着剤は、アルキルシラン、アミノシラン、エポキシシラン、ヒドロシル、メルカプトシラン、メタクリルシランのうちの少なくとも１つからのシランを含み得る。

ＴＩＲＦ光源からの光ビームが、サンプルホルダーの底プレートなどの隣接する媒体に漏れることなく底プレート全体に伝播できるようにするには、底プレートの屈折率Ｎ_ｇよりも低い屈折率Ｎ_ａを有する接着剤を選択する必要がある。このようにして、エバネッセント波が機能化された試験ウェル壁の内面に近接して作成される。次に、蛍光受容体または受容体を固定化する蛍光ビヒクル、すなわちフルオロフォアが励起され、表面の近くで蛍光を発する。このように、測定された蛍光は、表面に近接したフルオロフォアからのみ発生し、表面からさらに離れたフルオロフォアは蛍光を発しない。

したがって、本願開示は、サンプルホルダーアセンブリが、光ビームをウェル底壁に提供するように構成されたＴＩＲＦ光源と組み合わされ、これにより、光ビームがウェル底壁全体に伝搬することにより、複数のウェルにエバネッセント場を作り出す、本明細書に記載の方法を提供する。

サンプルホルダーアセンブリは、目的の用途に合わせて事前に準備することができる。例えば、サンプルホルダーアセンブリの底プレートは、特定の用途のために表面改質によって調製され、次いで、本明細書に記載の付着手段の助けを借りて、サンプルホルダーアセンブリの残りの部分に付着され得る。

さらに、本開示は、第２のリガンドを変化させることなく、２つ以上の異なる第１のリガンドと受容体との間の結合キネティクスを評価する、本明細書に記載の方法の使用を提供する。

本開示はまた、ＴＩＲＦ顕微鏡と組み合わせて使用されるように構成されるサンプルホルダーアセンブリであって、
－ 複数の底なし試験ウェルを含むサンプルホルダープレートと、
－ 接着剤などの付着手段などの材料によってサンプルホルダープレートに取り付けられ、それによって複数の試験ウェルのウェル底壁を形成する底プレートと、
を含み、
接着剤は、底ガラスプレート（３）の屈折率Ｎ_ｇよりも低い屈折率Ｎ_ａを有する、サンプルホルダーアセンブリを提供する。
接着剤などの付着手段などの材料は、ＵＶ硬化性であり得、および／または緩衝液に耐性であり得る。サンプルホルダープレートは、マイクロタイタープレートを含むか、またはそれからなることができる。

本明細書で開示されるサンプルホルダーアセンブリは、光ビームをウェル底壁に提供するように構成されたＴＩＲＦ光源と組み合わされてもよく、これにより、光ビームがウェル底壁全体に伝搬することにより、複数のウェルにエバネッセント場を作り出す。

メラガトランの添加前後のリポソーム固定化トロンビンの時間の関数としての結合事象の数を示すグラフである。 リポソーム固定化トロンビンに添加されたメラガトランの用量反応曲線を示すグラフである。 添加されたメラガトラン溶液の濃度の関数として観察された結合速度ｋ_ｏｂｓ、およびメラガトランとトロンビンの間のｋ_ｏｎを提供する線形回帰を示すグラフである。 メラガトランの添加前後のリポソーム固定化トロンビンの時間の関数としての単一の試験ウェルにおける結合事象の数を示すグラフである。 メラガトランの添加前後のリポソーム固定化トロンビンの時間の関数としての２つの試験ウェルにおける結合事象の数を示すグラフである。 メラガトランの添加前後のリポソーム固定化トロンビンの時間の関数としての１００個の試験ウェルにおける結合事象の数を示すグラフである。 接着剤によってマイクロタイタープレートに取り付けられた機能化された底部プレートを含む複数の試験ウェルを含むマイクロタイタープレートの断面図である。

［好ましい実施形態の詳細な説明］
図７は、複数の底なし試験ウェル２を含むサンプルホルダープレート１と、接着剤４によってサンプルホルダープレート１に取り付けられ、それによって、複数のウェル２のウェル底壁５を形成する底プレート３と、を含むサンプルホルダーアセンブリ１００の断面図を示す。接着剤は、底プレート３の屈折率Ｎ_ｇよりも低い屈折率Ｎ_ａを有する。

本明細書で説明するように、接着剤４は、底プレートなどの隣接する媒体に漏れることなく、ＴＩＲＦ光ビームが、底プレート全体に伝播できるようにするように選択され得る。それにより、エバネッセント波が底プレートの近くに生成され、これは、本明細書に記載されるような結合事象の検出に使用され得る。

ウェル底壁５は、本明細書に記載されるようなツール化合物で機能化され得る。

更なる（発明的）項目
本開示は以下の項目を提供する。

項目１：
第１のリガンドと受容体との間の相互作用を決定する方法であって、次の一連の方法工程：
ａ）第１のリガンドを含まず、濃度Ｃ_ｉの受容体を含む第１の溶液を提供する工程と、
ｂ）時間間隔ｔ_１の間の受容体と第２のリガンドとの間の結合事象の数を記録しながら、第１の溶液と第２のリガンドで機能化された試験ウェル壁とを接触させる工程と、
ｃ）時間間隔ｔ_２の間の第２の溶液の第２のリガンドと受容体との間の結合事象の数を記録しながら、受容体を含まず、濃度Ｃ_ｎの第１のリガンドを含む試験溶液を第１の溶液に添加して、第２の溶液を提供する工程と、を含む、方法。

項目２：
一連の方法工程が、複数の試験ウェルのそれぞれにおいて完全に実行される、項目１に記載の方法。

項目３：
一連の方法工程が、試験溶液中のいくつかの異なる濃度Ｃ_ｎの第１のリガンドに対して実行される、項目１または２に記載の方法。

項目４：
工程ｄ）を更に備える、項目１または２に記載の方法。
ｄ）試験溶液中の第１のリガンドの濃度Ｃ_ｎを増加させて工程ｃ）を繰り返すこと。

項目５：
受容体が、リポソーム、デンドリマー、デンドロン、錯化ランタニド、量子ドット、ナノダイヤモンド、または脂質ディスクなどのビヒクルと組み合わされて、固定化された受容体を提供する、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。

項目６：
ビヒクルがフルオロフォアを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。

項目７：
第１のリガンドおよび第２のリガンドが同じまたは異なる、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。

項目８：
受容体が医薬品受容体であり、および／または、
第１のリガンドおよび／または第２のリガンドが医薬品である、
項目１から７のいずれか一項に記載の方法。

項目９：
工程ｂ）および／または工程ｃ）が顕微鏡の使用を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。

項目１０：
観察された速度定数ｋ_ｏｂｓ、会合定数ｋ_ｏｎ、解離定数ｋ_ｏｆｆ、平衡解離定数Ｋ_ｄ、部分占有率の少なくとも１つを第１のリガンドについて決定することを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。

項目１１：
複数の試験ウェルが、マイクロタイタープレートなどのサンプルホルダーアセンブリの一部を形成する、項目２から１０のいずれか一項に記載の方法。

項目１２：
サンプルホルダーアセンブリが、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡と組み合わせて使用されるように構成され、
－ 複数の底なし試験ウェル（２）を含むサンプルホルダープレート（１）と、
－ 接着剤（４）によってサンプルホルダープレート（１）に取り付けられ、それによって複数のウェル（２）のウェル底壁（５）を形成する底プレート（３）とを含み、
接着剤（４）は、底プレート（３）の屈折率（Ｎ_ｇ）よりも低い屈折率（Ｎ_ａ）を有する、項目１１に記載の方法。

項目１３：
接着剤（４）がＵＶ硬化性であり、および／または緩衝液に対して耐性である、
項目１０から１２のいずれか一項に記載の方法。

項目１４：
ＴＩＲＦ顕微鏡と組み合わせて使用されるように構成されるサンプルホルダーアセンブリ（１０）であって、
－ 複数の底なし試験ウェル（２）を含むサンプルホルダープレート（１）と、
－ 接着剤（４）によってサンプルホルダープレート（１）に取り付けられ、それによって複数のウェル（２）のウェル底壁（５）を形成する底プレート（３）と、
を含み、
接着剤（４）は、底ガラスプレート（３）の屈折率（Ｎ_ｇ）よりも低い屈折率（Ｎ_ａ）を有する、サンプルホルダーアセンブリ（１０）。

項目１５：
サンプルホルダーアセンブリ（１０）が、光ビームをウェル底壁（５）に提供するように構成されたＴＩＲＦ光源と組み合わされ、これにより、光ビームがウェル底壁（５）全体に伝搬することにより、複数のウェル（２）にエバネッセント場を作り出す、
項目１１に記載の方法、又は項目１４に記載のサンプルホルダーアセンブリ。

［略語］
ＣＨＥＳ Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸
ＨＢＳ Ｈｅｐｅｓ緩衝液
ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）
ＬＥＤ 発光ダイオード
ＮＨＳ Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド
μｌ マイクロリットル
Ｌ リットル
ＬＯＤ 検出下限
ｎｍ ナノメートル
ｎＭ ｎａｎｏＭｏｌａｒ（ナノモル）
ｍｇ ミリグラム
ｍｌ ミリリットル
ｍＭ ミリモル
ＰＢＳ リン酸緩衝液
ＰＥＧ４ ポリエチレングリコール、Ｈ－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_４－ＯＨ
ＰＣ ホスファチジルコリン
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ ポリ－Ｌ－リジン・グラフト化ＰＥＧ
ＲＴ 室温
ｓｅｃ 秒
ＵＶ 紫外線
Ｖ／Ｖ 体積百分率

［材料および方法］
すべての脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社から購入した。
ＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ（１１３５４－Ｘ＝２００－２０００－３．５％）およびＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ－ビオチン（１１８３５－Ｘ＝２００－３４００－３．５％）はＮａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入した。
トロンビン結合ペプチドは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより顧客の指定に基づいて合成された。メラガトラン(Melagatran)はＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
Ｄｙｍａｘ３０２５は、Ｄｙｍａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社の製品である。
他のすべての化学物質は、特に明記されていない限り、Ｓｉｇｍａ社から購入した。すべての化学物質は分子生物学の目的に適していた。

［リポソームの調製］
直径が約１００ｎｍのリポソームを生成するために、最初に必要な脂質をクロロホルムに溶解して混合した。合計５ｍｇの２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、０．０１ｍｇの１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル、および０．００５ｍｇの１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）を一緒に混合した。脂質混合物を一晩真空乾燥させた。乾燥した脂質を１ｍＬのＨＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で穏やかに撹拌しながら水和させた。脂質懸濁液を、孔径１００ｎｍのＰＣ膜から１１回押し出した。リポソームの濃度は、５４４ｎｍでの光吸収によって決定され、リポソーム溶液の濃度は、２．５ｍｇ／ｍＬに調整された。これは、約３０ｎＭのリポソーム濃度に等しい。

［タンパク質の調製］
クリックケミストリーを介してリポソームにトロンビンを固定化するために、ＮＨＳカップリングを介してアジド基をトロンビンに導入した。したがって、２ｍｇ／ｍＬの１００μＬのヒトトロンビンを２００μＬの高塩ＰＢＳバッファー（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、４００ｍＭのＮａＣｌ＋３３．５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｖ／ｖ）（ｐＨ７．４）、および１０ｍＭの１３μＬのＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ）と混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートした。５００μＬの高塩ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、４００ｍＭ ＮａＣｌ＋３３．５％グリセロール（ｖ／ｖ）、ｐＨ６．６）を添加して、反応を停止した。

［タンパク質の固定化］
１．５μＬのトロンビンアジドを４８．５μＬの氷冷ＣＨＥＳバッファー（２０ｍＭのＣＨＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）とｐＨ８．５で混合し、続いて５０μＬのリポソーム溶液を添加した。この混合物は氷上で少なくとも３０分間保存された。１０μＬの反応混合物を９９０μＬの氷冷ＣＨＥＳバッファー（２０ｍＭ ＣＨＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）でｐＨ８．５に希釈した。

［表面の準備］
厚さ０．１７ｍｍのガラスプレートをベースピラニア溶液中で、３７３ケルビンで３０分間インキュベートした。洗浄したガラスプレートを水ですすぎ、乾燥させた。ＵＶ硬化性接着剤（Ｄｙｍａｘ３０２５）には、約１％（ｖ／ｖ）（３－アミノプロピル）－トリエトキシシランが追加された。接着剤混合物は、底なしマイクロプレートの下側に薄く広げられた。ガラスプレートは底なしマイクロプレートの上に配置され、底を形成した。接着剤を完全に広げた後、製造元の指示に従って硬化させた。硬化後、マイクロプレートの各ウェルに、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ－ビオチンを含有する１０μＬの溶液を加える。プレートを穏やかな軌道撹拌下で少なくとも１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルをＨＢＳバッファーで１０回洗浄した。すべての洗浄工程の希釈率は少なくとも１：１０であった。洗浄後、各ウェルに１００μｇ／ｍＬのニュートラアビジンを含有する１０μＬの溶液を添加した。これを穏やかな軌道撹拌下で少なくとも４時間インキュベートした。すべてのウェルを前述のように洗浄し、１０ｕｇ／ｍＬのビオチンに結合したトロンビン結合ペプチド（ＧＶＧＰＲＳＦＫＬＰＧＬＡ－Ａｉｂ－ＳＧＦＫ－ＰＥＧ_４－ビオチン）を含む１０μＬの溶液をすべてのウェルに添加した。マイクロプレートを穏やかな軌道撹拌下で少なくとも１時間インキュベートした。ペプチドは、小胞に固定化されたトロンビンに結合するためのツール化合物であった。
最後に、マイクロプレートを前述のように洗浄し、各ウェルの残留バッファー量は３０μＬである。

［顕微鏡のセットアップ］
単一分子顕微鏡は、Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｅベースに基づいた。落射蛍光用の光源として、ＬＥＤ白色光源を使用する。対物レンズは６０倍のＡＰＯ ＴＩＲＦ対物レンズであった。画像は浜松ホトニクスＯｒｃａ－ＦＬＡＳＨ４．０Ｖ２ ｓＣＭＯＳカメラで記録される。サンプルステージは電動式で、マイクロウェルホルダーを備えていた。
顕微鏡の上に液体処理ロボットが設置された（Ａｎｄｒｅｗ、Ａｎｄｒｅｗ Ａｌｌｉａｎｃｅ）。

［メラガトラン希釈シリーズ］
１．６ｕＭ／Ｌから始まるメラガトランの８回の１：３希釈シリーズ。希釈シリーズのバッファーは、ｐＨ９．５のＣＨＥＳバッファー（２０ｍＭのＣＨＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）であった。

［実施例１］
３８４個のウェルを含むマイクロウェルプレートを、顕微鏡のマイクロウェルプレートホルダーに配置した。その後、測定が開始され、完全に自動的に実行された。

単一分子の測定には、各ウェルで次の工程が含まれていた。
１．上に示したように準備された適切なマイクロウェルを対物レンズの上に置き、その焦点面がマイクロウェルの内面に置かれるように対物レンズを調整した。
２．ウェルをｐＨ９．５の７０μＬのＣＨＥＳバッファー（２０ｍＭ／ＬのＣＨＥＳ、１５０ｍＭ／ＬのＮａＣｌ）で洗浄した。
３．ＣＨＥＳバッファーおよびトロンビンが付着したリポソームを含有する５μＬの溶液をウェルに添加し、ウェルの内容物を混合した。
４．９０１枚の画像と１０秒^－１の取得速度でタイムラプス動画の取得を開始した。
５．取得の２０秒後、適切な濃度のメラガトランおよびＣＨＥＳバッファーを含有する５μＬの溶液を添加し、ウェルの内容物を急速に混合した（＜０．５秒）。
６．画像データの取得は、９０１フレームが記録されるまで続けた。

メラガトランの意図された濃度ごとに、工程１～６を３回繰り返した。メラガトランの８つの濃度、すなわち２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ、０．８ｎＭ、０．３ｎＭ、および０．１ｎＭを試験した。メラガトランの試験濃度ごとに、上記の工程１～６を各ウェルで完全に実施した。各方法工程は、各ウェルで同時に実行し、すなわち、工程１を各ウェルで同時に実行し、次に、各連続工程を各ウェルで同時に実行した。

記録された画像データは、各ウェルに新たに結合したリポソームの数を決定する目的で分析された。第１の工程では、各ウェルの参照オブジェクトと形状が類似しているすべてのオブジェクトが検出された。

第２の工程では、どのオブジェクトが表面に結合しているかを決定した。オブジェクトが表面に結合されていることを示すものとして、その移動度を分析した。移動度が閾値を下回った場合（オブジェクトが１ピクセル（ここでは２つの連続するフレーム間で２１５～３０４ｎｍ）を超えて移動していない場合）、オブジェクトは不動であると見なされ、したがって表面に結合される。結合したリポソームの数、すなわち結合事象の数を記録した。すべてのウェルの結合事象の数を、メラガトランの添加の前後にそれぞれ合計して、結合事象の累積数を提供した。これは、メラガトランの各濃度に対して行われた。

図１に示すように、メラガトランの添加前後の結合リポソームの累積数を時間に対してプロットした。図Ａ（図１）では、メラガトランの濃度は２００ｎＭで、トロンビンの濃度は１５ｐＭであった。図１では、ｔ_ｉｎｈは、リポソーム固定化トロンビンを含有する溶液にメラガトランの溶液を添加した時間であり、
ｃｕｍｓｕｍ ｏｎ－ｅｖｅｎｔｓ［＃］は記録された結合事象の数である。

試験化合物メラガトランを添加する前に、表面へのリポソームの結合速度が経時的に一定であることが観察された。時間に対する結合事象の累積数をプロットすると、勾配が結合速度に等しい線形関数であることが判明した。試験化合物の注入および混合中に、表面への結合速度が増加した。短い平衡時間の後、結合速度は再び正規化された。この混合期間中に取得されたデータは、分析には使用されなかった。本明細書に記載されるように結合事象の累積数を分析し、観察された結合速度定数ｋ_ｏｂｓを抽出した。メラガトランのトロンビンへの結合が平衡に達すると、図１に示すように、時間に対する結合事象の累積数は再び直線的に増加した。

初期勾配と最終勾配の比率を計算した。これをメラガトランの各濃度に対して３回繰り返した。この比率は、それぞれの濃度でのメラガトランによるトロンビンの部分占有率(fractional occupancy)に等しくなる。次に、平衡解離定数Ｋ_ｄを以下の式から計算し、ここで、[melagatran]_０は、添加されたメラガトランの濃度である。

平衡解離定数Ｋ_ｄは、図２に示すように、部分占有率をメラガトランの添加濃度に対してプロットした用量反応曲線から得られ、Ｋ_ｄ値は約３ｎＭであった。

図３は、添加した試験化合物メラガトランの濃度の関数としてプロットされた、観察された結合速度定数ｋ_ｏｂｓを示している。観察された速度ｋ_ｏｂｓ対メラガトランの濃度の線形回帰により、メラガトランとトロンビンとの間の会合速度ｋ_ｏｎの計算が可能になり、これは２１μＭ^－１秒^－１であることが見出された。

平衡解離定数Ｋ_ｄは、解離速度ｋ_ｏｆｆを会合速度ｋ_ｏｎで割ったものに等しいので、２１μＭ^－１秒^－１のｋ_ｏｎ値を３ｎＭのＫ_ｄ値で乗じることによりｋ_ｏｆｆを計算することができ、これにより、約０．０６秒^－１のＫ_ｏｆｆ値を提供した。

本明細書に記載の方法は、試験化合物のｋ_ｏｂｓ、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ、およびＫ_ｄ、ならびに試験化合物による受容体の部分占有率を決定することを可能にすると結論付けた。したがって、本明細書に記載の方法は、試験化合物と受容体との間の相互作用キネティクスを決定することを可能にする。

［実施例２］
この例では、実施例１に記載の方法工程が、単一のウェル、２つのウェルのそれぞれ、および１００個のウェルのそれぞれで完全に実施された。トロンビン濃度は１ｐＭであった。メラガトラン濃度は７．４ｎＭであった。

最初に、実験は単一のウェルで実施された。図４に示すように、結合事象の数を時間の関数としてプロットした。結合事象の数が少ないため、観察された速度定数ｋ_ｏｂｓを確実に適合させることができなかった。したがって、結合事象の数は、２つのウェルについて、それぞれメラガトランの添加の前後に収集および合計された。結果を図５に示し、
ｋ_ｏｂｓは、０．４３秒^－１のｋ_ｏｂｓ値を提供するように適合できることがわかった。２つのウェルの実験と同様にさらなる実験を実施したが、２つのウェルの代わりに１００個のウェルを使用した。結果を図６に示し、ｋ_ｏｂｓは、０．２２秒^－１のｋ_ｏｂｓ値を提供するように適合できることがわかった。図４、図５、および図６では、ｔ_ｉｎｈは、リポソーム固定化トロンビンを含有する溶液にメラガトランの溶液を添加した時間であり、
ｃｕｍｓｕｍ ｏｎ－ｅｖｅｎｔｓ［＃］は記録された結合事象の数である。

本明細書に記載の方法の感度は、複数のウェルで方法工程を実施し、試験化合物の添加前後のウェルの記録された結合事象の数を合計することによって増強されると結論付けられた。

また、本明細書に記載の方法は、（ｉ）アッセイを操作するために必要な受容体の材料の量、および（ｉｉ）高親和性試験化合物に関する緊密な結合レジームを定義する全体的な平均方法のＬＰＤに対応する最低濃度よりも低い受容体濃度などの低い受容体濃度について観察された速度定数ｋ_ｏｂｓの信頼できる測定を可能にすると結論付けられた。

［参考文献］
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２． Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｈａｎ，Ｌ．Ｃ．（１９８４）．質量作用の法則によって予測される競合放射性リガンド結合のキネティクス。Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５，１－９．
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５． Ｏｌａ Ｗａｈｌｓｔｅｎ，Ａｎｄｅｒｓ Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｌｉｓａ Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ Ｎｙｓｔｒｏｅｍ，Ｈｕｄｓｏｎ Ｐａｃｅ，Ｓｔｅｆａｎ Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄｎｅｒ，ａｎｄ Ｆｒｅｄｒｉｋ Ｈｏｅｏｅｋ．天然脂質小胞における天然リガンドと単一Ｇタンパク質共役受容体との間の相互作用研究のための平衡変動分析。Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１５，３１（３９），ｐｐ１０７７４－１０７８０．
６． Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄｅｘｌｉｎ，Ｌ．，Ｗａｌｌｉｎ，Ｐ．；Ｓｖｅｄｈｅｍ，Ｓ．，Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｐ．，Ｗｉｎｇｒｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｈｏｅｏｅｋ，Ｆ．（２０１１）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３，１４８５２－１４８５５．

図１，４，５，６において、ｃｕｍｓｕｍ ｏｎ－ｅｖｅｎｔｓ［＃］とは、記録された結合事象の数。

Claims (11)

1. ＴＩＲＦ顕微鏡と組み合わせて使用されるように構成されたサンプルホルダーアセンブリ（１００）であって、
   － 複数の底なし試験ウェル（２）を含むサンプルホルダープレート（１）と、
   － 接着剤である材料（４）によって前記サンプルホルダープレート（１）に取り付けられ、それによって前記複数の試験ウェル（２）のウェル底壁（５）を形成する底ガラスプレート（３）と、
   を備えており、
   前記接着剤である材料（４）は、前記底ガラスプレート（３）の屈折率（Ｎ_ｇ）よりも低い屈折率（Ｎ_ａ）を有することを特徴とする、サンプルホルダーアセンブリ。
2. 前記材料がＵＶ硬化性である、および／または、緩衝液に対して耐性である、請求項１に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
3. 前記材料がＵＶ硬化性であり、且つ、緩衝液に対して耐性である、請求項２に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
4. 前記材料がＵＶ硬化性である、請求項２に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
5. 前記材料が緩衝液に対して耐性である、請求項２に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
6. 当該サンプルホルダーアセンブリが、マイクロタイタープレートを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
7. 当該サンプルホルダーアセンブリが、マイクロタイタープレートからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
8. 前記サンプルホルダーアセンブリ（１００）が、光ビームを前記ウェル底壁（５）に提供するように構成されたＴＩＲＦ光源と組み合わされており、その結果、前記光ビームが前記ウェル底壁（５）全体に伝搬することにより、前記複数の試験ウェル（２）にエバネッセント場を作り出す、請求項１～７のいずれか一項に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
9. 前記ウェル底壁（５）は、試験ウェル（２）の内部に面する第２のリガンドで機能化され、当該第２のリガンドが固定化されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
10. 前記ウェル底壁（５）は、リガンドで機能化されている、請求項１に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
11. 前記リガンドは医薬品である、請求項１０に記載のサンプルホルダーアセンブリ。
    

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