KR20120126459A - 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법 - Google Patents

다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종류가 다른 두 개 이상의 고정분자나 물질을 하나의 바이오칩 기질 위에 배열하고 이들 분자나 물질과 상호작용을 하는 유전자, 단백질, 세포 등을 단일분자수준에서 동시에 검출함으로써 분석결과의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있는 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다중색-전반사 형광검출기술을 이용하여 다양한 표적성분이나 분자를 동시에 하나의 칩 기질 위에서 각각의 분자나 성분에 따라 각기 다른 형광색으로 나타내어 여러 물질들을 손쉽게 구분함으로써 실시간 측정이 가능한 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법을 제공한다.

Description

다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법{High sensitive combined-nanobiochip for simultaneous detection of multi-biomolecule markers and using the same information providing method of disease diagnosis}
본 발명은 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 하나의 칩에서 질병의 보다 정밀한 진단을 위해 유전자, 단백질, 세포 등을 동시에 검출할 수 있는 다중-전반사형광검출 기술을 이용함으로써 동시에 다양한 지표(혹은 표적)성분을 하나의 기질 위에서 단일분자 수준까지 초고감도로 검출할 수 있는 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법에 관한 것이다.
나노바이오칩(nanobiochip)이란 바이오칩에 나노기술이 접목된 것이다. 나노바이오칩 기술은 나노기술(NT)과 생명공학기술(BT)을 결합하여 극미량의 혈액이나 뇨, 타액 등과 같은 실질적인 생체시료로 여러 유전자(DNA, RNA), 단백질, 세포 및 다양한 대사물질을 칩 상에서 여러 센서와 다양한 전처리 기능으로 직접 감지하여, 보다 빠르고 정확한 질병 진단을 가능케 함으로써 인류의 질병퇴치와 건강한 삶의 질적 향상에 혁신적으로 기여할 수 있다. 이러한 나노바이오칩은 마이크로-바이오칩(micro-biochip)에 비해 상대적으로 초소형, 저가격, 고성능, 고집적, 저전력화는 물론 적은 시료의 양과 빠른 반응 시간과 분석시간이 가능하다는 장점을 가지고 이어 차세대 바이오칩으로 주목을 받고 있으며, 생명과학, 의학, 약학, 임상 등 다양한 분야에 혁신적인 변화를 일으킬 것으로 기대되어 빠르게 성장하고 있다.
나노어레이 바이오칩은 잉크젯 나노프린팅 기술이나 전자빔 식각(e-beam lithography) 기술과 원자힘현미경-디펜나노식각(atomic force microscope-dip pen nanolithography, AFM-DPN)기술 등과 같은 다양한 나노식각(nanolithography)기술 등을 이용하여 하나의 칩 기질 위에 다양한 물질을 수-수백 나노미터의 크기로 나열/배열하여 제작할 수 있다.
하지만, 초소형의 칩과 극미량의 분석물질을 사용하는 만큼 분석 물질이나 표적(target) 혹은 표지(marker) 분자를 간단하고 빠르게 고감도로 검출할 수 있는 새로운 검출방법이나 검출기의 개발이 요구되고 있는 상황이다.
또한, 최근 바이오칩을 포함한 바이오센서의 개발은 단일시료에 있는 다양한 분석물질을 구별하는 것이 주요한 연구의 목표로 수행되고 있다. 비록 많은 바이오센서가 하나의 분석물질을 성공적으로 검출하고 있지만, 동시에 다중의 분석물질 혹은 분자를 감지하는 것은 여전히 도전되고 있는 상황이다. 그렇지만 최근에 개발된 많은 바이오센서들은 기존의 분석방법에 비해 단순성과 쉬운 사용방법, 적은 시료의 사용과 비용, 한번에 폭넓은 범위의 응용성(예, 의학분석, 환경분석, 품질관리 등) 등이 개발의 중요한 요건이 되고 있다. 따라서, 분석시간을 줄일 수 있는 시료 전처리 단계의 축소나 생략은 바이오센서 연구개발에 또 다른 목표가 되고 있다.
전술된 바에 따라 한국생명공학연구원 바이오나노연구센터에서는 세계에서 가장 작은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 바이오칩 분석시스템을 개발하였다. 일반적으로 대학, 연구소 및 제약회사에서 사용되고 있는 SPR 분석시스템은 부피가 크고 고가인데 비해 최소형 SPR 바이오칩 분석시스템은 손바닥만한 크기로 휴대가 간편하여 현장 진단/분석(point-of-care-test; POCT)용으로 활용이 가능함을 제시하였다.
국내 벤처기업인 나노엔텍의 경우, 10-20 μL 혈액을 채혈해 심혈관 질환 여부를 5분 이내 판별할 수 있는 "심혈관 진단용 키트"를 개발하여 2008년도부터 상용화하기 시작하였다. 이는 기존의 100-150 μL의 혈액을 채취, 약 60분 가량의 분석시간이 소요되었던 과거의 분석법에 비해 미량의 채혈로 간편하면서도 신속하게 심혈관 질병 결과를 받아보는 장점이 있다.
2000년 하버드대학의 연구팀의 경우, 1 만개 이상의 단백질을 1개의 슬라이드 글라스 위에 고정시켜 단백질 상호작용을 분석할 수 있는 단백질 마이크로-어레이 기술을 최초로 소개하였다. 예일(Yale) 대학의 연구팀은 5,000 개 이상의 효모 단백질의 기능성을 대량으로 분석함으로써 단백질칩의 실용화 가능성을 높였다. 또한, 2003년에는 4,300 개의 단백질이 심어진 효모 프로테옴 칩(yeast proteome chip)을 개발하여 시판에 들어갔다. 또한, 미국 텍사스대학의 생화학 교수는 신용카드 크기 만한 나노바이오칩에 타액을 묻혀 심장마비 증세를 파악할 수 있는 키트를 개발하여, 토스터 크기의 판독 분석기에 칩을 넣으면 약 15분 후 결과를 알 수 있었다. 하지만 이러한 방법들은 아직은 단일분자(single-molecule) 수준의 고감도 검출까지는 이루지 못하고 있다.
"기능적 특이성"과 "구조적 특이성"에 의존하여 분석되는 면역분석법은 바이오칩의 연구가 활발히 진행되면서 미세유체칩(마이크로-플루이딕칩)이나 어레이칩을 이용하여 여러 생체표적분자를 한번에 분석할 수 있는 "다중-분석물질 면역분석법(multiple analyte immunoassay, MAI)"시스템이 개발되고 있다. MAI 시스템은 가까운 미래에 의학적 진단과 복합단백질의 분석에 많은 정보를 제공할 것으로 기대되고 있는 분야로 이 방법은 여러 개의 독립적인 생체표적분자(예를 들어, 심장질환 표적분자 : cTnI, myoglobin, CK-MB)를 성공적으로 검출하기도 하였다. 텍사스 대학에서는 심근경색(acute myocardial infarction, AMI) 질병의 현장 진료를 위한 실리콘 기판 위의 다중-랩온어칩(multiplex lab-on-a-chip)을 소개하였다.
또한, 최근 상업적으로 상용화된 란독스사의 "면역분석시스템"은 자동화로 인해 빠른 결과 처리 및 간편성을 제공하였으며, 이는 기존 분석법에 비해 다중의 결합물을 하나의 바이오칩 표면에서 동시에 측정할 수 있음을 보인 것이다. 2004년 울프(Wolf) 그룹은 마이크로-MAI 개발하여 C-반응성 단백질(CRP)과 심장질환 생체지표 물질을 검출하였다.
그러나, 현재 연구되고 있는 대부분의 다중면역센서의 경우 하나의 칩 상에서 다양한 분석물질의 동시 검출이 가능하다 하더라도 그 대상이 단백질(항원-항체)에 한정되어 있다. 이는 변형이 쉬운 단백질에서 얻을 수 없는 정보들을 유전자나 세포에서 얻을 수 있음을 배제한 결과라고 할 수 있다. 또한, 현재 대부분의 바이오칩은 하나의 표적(혹은 타겟)성분이나 분자를 검출하기 위한 전용칩으로 개발되어 왔기 때문에 다양한 지표(표적)물질의 검출에 의한 질병의 보다 정밀하고 정확한 진단을 위해서는 가기 다른 종류의 여러 생체분자들을 각각의 다른 칩을 여러 번 사용하여 분석을 해야 하는 단점이 있다.
더불어, 일반적으로 이용되고 있는 단색 광원 혹은 파장을 이용한 바이오칩의 검출은 복합시료에서 비상보적인 분자로부터 표적분자 (혹은 지표분자나 유전자, 단백질, 세포 등과 같은 생체분자들을 동시에 구분하기 어려우며, 서로 상보적인 결합이 가능한 분자라 할지라도 두 분자 간의 상호작용 및 접근 과정을 쉽게 식별하지 못하는 단점이 있다.
따라서, 이미 표적분자와 상보적인 분자와의 반응이 이루어진 후의 결과만을 검출할 수 있다. 더군다나, 나노어레이칩 상의 고성능 스크리닝 분석의 경우 그 한계는 아주 크다. 이를 보완하기 위한 다중색 광원을 이용한 바이오칩의 분석은 복합시료 내 각각 다른 형광색을 결합한 서로 다른 개별적인 생체-표적(혹은 표지)분자를 동시적으로 영상화할 수 있다. 이러한 영상의 결과는 단일분자 수준에서 개별적인 분자의 특성분석뿐만 아니라 그들의 상보적 결합 및 비상보적 과정의 상호작용을 하나의 칩 상에서 동시 검출에 의해 얻을 수 있다. 아울러, 이러한 결과는 하나의 칩과 하나의 검출기를 사용하여 얻을 수 있으므로 시간의 지연이나 기계적 이탈이 없어 분석결과의 오차를 획기적으로 줄일 수 있는 장점을 가진다.
소아 가와사키병의 경우, 보고 된지 40년이 지난 현재에도 그 원인이 아직 정확히 밝혀지지 않은 상태이지만, 최근 유전적 성향에 대한 연구들이 일부 제시되고 있다. 그 예로, 네이처 제네틱스 저널에 ITPKC 유전자가 가와사키병과 깊은 관련이 있다는 결과가 발표되었으며, 고용량의 정맥용 면역글로불린(intravenous immunoglobulin, IVIG)에 의해 혈소판결합(IgG)의 일부가 가와사키병에 임상증상을 일으키는 원인 단백질이라고 보고되기도 하였다.
맥락막 위축증의 경우는 진단을 위해 단백질 검사를 하는 것을 기본으로 하나 유전변성을 확인하기 위해 이따금씩 유전자 검사를 요구하기도 한다.
갑상선암 검사의 경우, 갑상선 호르몬인 트리요오드사이로닌(triiodothyronine), 티록신(thyroxine)과 갑상선 자극호르몬(thyroid stimulatinghormone : TSH)을 측정하여 진단결과의 신뢰성을 높이기도 한다.
이와 같은 예에서 알 수 있듯이, 질병을 보다 정확하고 정밀하게 진단하기 위해서는 질병의 종류에 따라, 2개 이상의 다른 종류의 생체분자인 유전자, 단백질 더 나아가 세포의 분석결과가 함께 필요하다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 서로 다른 고정분자를 하나의 바이오칩 기질 위에 배열하고 이들 분자나 물질과 상호작용을 하는 유전자, 단백질, 세포 등을 단일분자수준에서 동시에 검출함으로써 분석결과의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있는 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 다중색-전반사 형광검출기술을 이용하여 다양한 표적성분이나 분자를 동시에 하나의 칩 기질 위에서 각각의 분자나 성분에 따라 각기 다른 형광색으로 단일분자수준까지 초고감도로 동시에 검출하는 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명에 따른 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩은 유전자, 단백질 및 세포 중 어느 하나인 표적분자; 상기 표적분자와 특이적 상호반응을 하는 화합물이나 생체분자와 같은 고정분자; 및 상기 고정분자가 위치하는 기질;을 포함하고, 상기 기질 위에 나노패턴이 형성됨에 따라 상기 고정분자는 상기 기질 위에 위치하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 고정분자는 단백질, 유전자, 지질, 효소, 압타머(aptamer) 및 리간드 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기질은 30×30mm 크기 이하의 유리(glass), 용융-실리카(fused-silica), 석영(quartz)이나 폴리다이메틸실록산(PDMS), 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기질은 1mm 이하의 두께를 가지는 빛의 투과가 가능한 유리 및 고분자 재질이고, 그리고 상기 기질 위에 상기 나노패턴의 직경은 500nm 이하로 배열되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 나노패턴은 잉크젯 나노프린팅, 전자빔 식각(e-beam lithography) 및 원자힘현미경-디펜나노식각(atomic force microscope-dip pen nanolithography, AFM-DPN) 등의 나노식각(nanolithography) 기술 중 어느 하나에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 나노패턴의 직경은 0 ~ 500nm 이하의 범위를 갖고, 상기 나노패턴의 간격(pitch)은 10 nm ~ 10 μm의 범위를 갖는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 고정분자에 다른 종류의 상기 표적분자가 상보적으로 결합하여 반응하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 나노바이오칩은 다른 파장에서 발광하는 형광염료가 결합된 검출분자와 반응하는 것을 특징으로 한다.
(a) 상기 나노바이오칩에 배열된 둘 이상의 상기 고정분자가 반응하는 단계; (b) 상기 검출분자를 광다이오드 배열(photodiode arrays, PDA), 전하주입장치(charge-injection, CCD), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD) 등의 다중채널장치들 중 어느 하나에 의해 검출하는 단계; 및 (c) 검출된 검출분자를 통하여 가와사끼병, 맥락막의 위축, 갑상선 등의 질병을 진단하는 단계;를 포함하는 다중 복합-나노바이오칩을 이용한 질병 진단 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기한 바와 같은 본 발명은 서로 다른 고정분자를 하나의 바이오칩 기질 위에 배열하고 이들 분자나 물질과 상호작용을 하는 유전자, 단백질, 세포 등을 단일분자수준에서 동시에 검출함으로써 분석결과의 정확도와 신뢰도의 향상과 함께 물론, 칩의 소모량도 감소하는 경제적인 효과가 발생한다.
또한, 본 발명은 다중색-전반사형광검출 기술을 이용하여 다양한 표적성분이나 분자를 동시에 하나의 칩 기질 위에서 각각의 분자나 성분에 따라 각기 다른 형광색으로 나타내어 여러 물질들을 손쉽게 구분함으로써 실시간 측정을 할 수 있다는 효과가 발생한다.
도 1의 (a)는 하나의 칩에서 하나의 질병을 보다 정확/정밀하게 진단하기 위해 2개의 다른 종류의 표적-생체분자인 유전자와 단백질을 동시에 검출하기 위해 이들과 상호반응을 할 수 있는 고정-분자나 물질을 하나의 칩 위에 동시에 배열한 복합-나노바이오칩의 모식도,
도 1의 (b)는 하나의 칩에서 두 종류의 다른 질병관련 표적-생체분자인 단백질과 세포를 동시에 검출하기 위해 이들과 상호작용할 수 있는 고정-생체분자를 하나의 칩 기질 위에 동시에 배열한 복합-나노바이오칩의 모식도,
도 1의 (c)는 하나의 칩에서 두 개의 다른 표적-생체분자인 유전자와 세포를 동시에 검출하기 위해 이와 반응하는 고정-생체분자를 같은 칩 기질 위에 동시에 배열한 복합-나노바이오칩의 모식도,
도 2는 질병을 보다 정확하고 정밀하게 진단하기 위해 하나의 칩에서 다른 종류의 질병관련 표적-생체분자들인 유전자, 단백질, 세포 등을 동시에 검출하기 위해 이와 반응하는 고정-생체분자를 같은 칩 기질 위에 함께 배열한 다중 복합-나노바이오칩의 모식도,
도 3의 (a)는 유리기질 위에 4×5 배열로 금 500nm 나노 패턴된 미분간섭효과(DIC)의 이미지,
도 3의 (b)는 유리기질 위에 4×5 배열로 금 100nm 나노 패턴된 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM) 이미지,
도 3의 (c)는 유리기질 위에 500nm 나노 금 입자의 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM) 이미지,
도 4의 (a) 내지 (f)는 금-나노어레이 나노바이오칩 상에서 치주질환 관련 항원-항체 반응 및 500 nm의 금-나노어레이 나노바이오칩에서 치주질환 관련 항원-항체 표준시료(TNF-α)를 1.3aM-130pM의 다양한 농도로 희석시켜 프리즘형 전반사 형광현미경으로 검출한 이미지,
도 5의 (a) 내지 (g)는 4×4 바이오틴이 나노 배열된 나노바이오칩 상에서 정상인과 환자의 타액에서 추출된 치주질환 표적분자(TNF-α)를 반응시켜 질병진단에 이용한 결과 이미지,
도 6의 (a)는 상보적 결합을 하는 두 단일 가닥의 반응 후 이미지,
도 6의 (b)는 비상보적인 두 단일 가닥의 반응 후 이미지,
도 7의 (a)는 프리즘형 다중색-전반사 형광현미경(prism-type multi-color TIRFM)의 모식도, 및
도 7의 (b)는 대물렌즈형 다중색-전반사 형광현미경(objective-type multi-color TIRFM)의 모식도이다.
본 발명에 따른 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법의 바람직한 실시 예를 도 1 내지 도 7을 참조하여 설명한다. 이 과정에서 도면에 도시된 선들의 두께나 구성요소의 크기 등은 설명의 명료성과 편의상 과장되게 도시되어 있을 수 있다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 기술되어야 할 것이다.
이하, 도 1 및 도 2를 참조하여 본 발명의 제 1 실시예 내지 제 3 실시예에 따른 다중-표적분자의 동시검출을 위한 고감도 복합-나노바이오칩(100)에 공통적으로 적용되는 구성요소는 유전자, 단백질 및 세포 중 어느 하나인 표적분자(10), 표적분자(10)와 특이적 상호반응을 하는 화합물이나 생체분자와 같은 고정분자(20, 20', 20") 및 고정분자(20, 20', 20")가 위치하는 기질(30)을 포함한다. 이러한 기질(30) 위에는 나노패턴(미도시)이 형성되고 고정분자(20, 20', 20")는 기질(30) 위에 위치한다.
이하, 도 1a, 내지 도 1c를 참조하여 서로 다른 표적분자(10)를 동시에 검출하기 위해 이들과 상호반응을 할 수 있는 고정분자(20, 20', 20")를 하나의 칩 위에 동시에 배열하는 것을 설명할 것이다.
우선, 도 1a에 도시된 바와 같이 표적분자(10)의 유전자군에 속하는 표적 유전자(11), 탐침 유전자(12) 및 고정분자(20)가 결합 되어 있다. 표적 유전자(11), 탐침 유전자(12) 및 고정분자(20)는 서로 특이적 상호반응을 하고, 이러한 표적 유전자(11), 탐침 유전자(12) 및 고정분자(20)는 나노패턴으로 형성되는 유전자 기질(31)에 위치하게 된다.
다음, 도 1b에 도시된 바와 같이 표적분자(10)의 단백질군에 속하는 검출 단백질(13), 표적 단백질(14), 포획 단백질(15) 및 고정분자(20')가 결합 되어 있다. 검출 단백질(13), 표적 단백질(14), 포획 단백질(15) 및 고정분자(20')는 도 1a와 동일하게 서로 특이적 상호반응을 하고, 이러한 검출 단백질(13), 표적 단백질(14), 포획 단백질(15) 및 고정분자(20')는 나노패턴으로 형성되는 단백질 기질(32)에 위치하게 된다.
다음, 도 1c에 도시된 바와 같이 표적분자(10)의 세포군에 속하는 표적 세포(16), 검출분자(17) 및 고정분자(20")가 결합 되어 있다. 표적 세포(16), 검출분자(17) 및 고정분자(20")는 도 1a 및 도 1b과 동일하게 서로 특이적 상호반응을 하고, 이러한 표적 세포(16), 검출분자(17) 및 고정분자(20")는 나노패턴으로 형성되는 단백질 기질(33)에 위치하게 된다.
고정분자(20, 20', 20")는 단백질, 유전자, 지질, 효소, 압타머(aptamer) 및 리간드 중 어느 하나로 구성될 수 있다. 이러한 고정분자(20, 20', 20")에 다른 종류의 상기 표적분자(10)가 상보적으로 결합하여 반응한다.
기질(30)은 30×30mm 크기 이하의 유리(glass), 용융-실리카(fused-silica), 석영(quartz)이나 폴리다이메틸실록산(PDMS), 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다. 이러한 기질(30)은 1mm 이하의 두께를 가지는 빛의 투과가 가능한 고분자 재질을 적용하는 것이 바람직할 수 있으며, 기질(30) 위에 나노패턴의 직경은 500nm 이하로 배열되는 것이 보다 바람직하다.
나노패턴은 잉크젯 나노프린팅, 전자빔 식각(e-beam lithography) 및 원자힘현미경-디펜나노식각(atomic force microscope-dip pen nanolithography, AFM-DPN) 등의 나노식각(nanolithography) 기술 중 어느 하나에 의해 제조되어도 무방하다. 이러한 나노패턴의 직경은 0 ~ 500nm 이하의 범위를 갖고, 나노패턴의 간격(pitch)은 10 nm ~ 10 μm의 범위를 갖는다.
전술한 바와 같은 복합-나노바이오칩(100)은 다른 파장에서 발광하는 형광염료가 결합된 검출분자(17)와 반응한다.
<제 1 실시예 : 금- 나노어레이를 이용한 나노바이오칩의 제작 및 이를 이용한 질병관련 단백질분자의 검출방법>
우선, 바이오칩의 기질(30)을 준비한다. 증류수와 메탄올의 1:1 혼합용액에 커버글라스를 담근 후 1시간 동안 상온에서 초음파세척기를 이용하여 세척한다. 다시 한번 증류수로 세척한 커버글라스는 질소 가스를 이용해 건조시킨다.
다음, 금-나노패턴의 제작하는 것으로서, 보다 구체적으로 기질(30) 위에 500 nm 이하의 직경을 갖는 금 박막 나노어레이 패턴은 나노-전자빔식각기술을 이용해 제작한다. 기질(30)은 5 nm 크롬(순도 99.997%)을 0.1 nm/s 속도로 부착되고, 20 nm 금(순도 99.9997%)을 0.1 nm/s 속도로 반응시킨다.
칩은 아세톤(순도 99.5%)으로 30초 동안 담그고, 이소프로필알코올(순도 99.9%)로 30초 동안 담근다. 금 나노패턴칩은 피라나 용액(1:1 = 황산:30% 과산화수소)으로 30분 동안 불순물을 제거한 후, 증류수로 세척하고, 질소가스로 건조시킨다. 이 칩은 제습기 안에 보관한다.
유리로 적용된 기질(30) 위에 100 nm와 500 nm의 크기를 가지는 금 나노어레이된 바이오칩의 미분간섭효과(DIC)와 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM) 이미지가 도 3의 (a), (b) 및 (c)에 순차적으로 도시되어 있다.
다음, 금-나노어레이 바이오칩을 제작하는 것으로서, 금-나노어레이칩은 다이에틸술폭시화물(dimethy sulfoxide : DMSO)에 희석된 4 mg/mL의 dithiobis(succinimidyl propionate)(DSP)에 30분 동안 담금으로써 반응시킨 후, DMSO 용액과 증류수로 세척하고 건조시킨다.
0.1 mg/mL Protein A/G로 금 나노패턴의 표면을 활성화시키기 위해 1시간 동안 세척하고, 반응되지 않은 분자는 10 mM Tris pH 7.5, 1M 글리신(glycine) 용액으로 30분 동안 세척하여, StabilGuard 용액으로 30분 동안 반응시킴으로써 안정화시킨다.
안정화된 칩은 본격적으로 질병진단에 관련된 표적성분인 질병의 단백질, 유전자, 세포와 상호반응을 할 수 있는 고정-생체분자(단백질, 유전자, 리간드, 효소, 지질 등)를 배열하여 다중 복합-나노바이오칩을 제작한다.
항원-항체반응의 경우, 20 uL의 2 ug/mL 포획항체(capture antibody)로 1시간 반응시키고, 표적항원(target antigen)으로 1시간, 형광염료가 결합된 검출항체(detection antibody)로 1시간씩 반응시킨다. 각 단계마다 pH 7.4의 PBS 용액으로 칩을 세척하고, 고감도 다중색-전반사형광 검출장치를 이용하여 생체분자들을 검출한다.
마지막으로, 복합-나노어레이칩의 초고속 스크리닝하는 것으로서, 도 7a 및 도 7b를 참조한다.
다중색-전반사형광현미경 검출장치(Digital Bio Technology Co., LTD, Seoul, Korea)는 다면의 프리즘을 포함하며, 정립형 올림푸스 현미경(Olympus BX51 microscope, Olympus Optical Co., LTD, Shinjuku-ku, Tokyo, Japen)을 기본으로 한다.
다만, 도립형 올림푸스 현미경 Olympus IX71 inverted microscope을 사용할 경우 전반사형광현미경 전용 대물렌즈(APO 100×/1.65 oil HR)를 이용한다.
오일타입의 100×대물렌즈와 (Olympus UPLFL 100×/1/3 N.A., W.D. 0.1) and 40×대물렌즈(Olympus UPlanApo 40×/0.9 N.A., W.D. 0.18)를 이용한다. CCD 카메라는 (QuantEM 512SC 와 Cascade 512B, Photometrics, Tucson, AZ, USA)를 이용하며, 노출시간은 10-100 m/s로 한다.
레이저는 사용되는 형광염료의 여기 파장에 따라 488 nm 레이저(532-LAP-431-220, Melles Griot, Irvin, CA, USA), 532 nm 레이저(GL532T-50, He-Ne laser, Shanghai Laser Centrury Tech.), 633 nm 레이저(SNF-xxx-635-10-KB, Edmund Industrial Optics)를 이용한다.
포토메트릭스(Dual-ViewTM)의 장착으로 다른 파장에서 발광하는 빛을 동시에 검출한다. 광표백의 영향을 줄이기 위해 기계적 셔터를 장착하고, 데이터의 수집 시에만 열리도록 한다. 데이터의 수집은 메타모프(MetaMorph) 7.0(Universal Imaging Co., Downing town, PA, USA) 소프트웨어를 통해 이루어진다.
도 4는 전술한 바에 따른 결과로서, 보다 구체적으로 금-나노어레이바이오칩에서 488 nm 파장을 광원으로 사용하는 전반사형광 검출장치를 이용하여 치주질환 관련 TNF-α의 항원-항체반응을 관찰한 결과로 조건은 상기 내용과 동일하다.
또한, 실험 결과 항원의 농도에 따라 형광 감도를 측정하여 정량적인 분석이 가능함을 보였으며, 검출한계가 10-18M(aM) 수준임을 증명하였다.
<제 2 실시예 : 바이오틴이 나노어레이된 나노바이오칩의 제작과 이를 이용한 단일생체분자의 검출방법>
우선, 바이오칩의 기질(30)을 준비하는데, 이는 전술하였던 제 1 실시예와 동일하게 진행되므로 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
다음, 바이오틴 분자의 나노패턴 제작하는 것으로서 나노 DPN을 이용하여 바이오틴 분자(고정-생체분자)를 칩의 기질(30) 위에 고정시킨다. 기질(30)과 함께 2 uL 3-메르캅토프로필 트리메톡시실란(3-mercaptopropyl trimethoxysilane : MPTMS) 폴리머 용액을 120℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 증기로 인해 기질(30)은 코팅된다.
증류수로 세척한 후 코팅된 기질은 질소가스로 건조시키고, DPN을 이용하여 바이오틴 분자(maleimide-PEO2-biotin, 1 mg/mL)를 고정시킨다. 10 nm 이하의 곡률반경을 갖는 원자 간격 현미경(atomic force microscope, AFM) 팁(질화층 캔틸레버; 힘의 상수(k), 42 N/m) 또한 2 uL 메타크릴옥시프로필트라이메톡실란(methacryloxypropyltrimethoxysilane, MPTMS)를 가지고 상기와 동일한 법으로 코팅한다. 그리고 10분 동안 바이오틴 분자와 반응시킨다.
DPN 실험은 디지털 인스트루먼트(Digital Instrument) 사의 Bio-AFM(NanoScope IIIacontroller)을 이용한다. 이 기기는 60% 상대 습도를 유지시킨다.
다음, 바이오틴-나노어레이 나노바이오칩에 관한 것으로서, 메타크릴옥시프로필트라이메톡실란이 코팅된 기질(30)은 1 mg/mL mPEG-Maleimide(5K)으로 10분 동안 상온에서 반응시켜 분자의 비특이적 결합을 최소화시킨다. 세척 후 바이오틴과 상호 결합력이 강한 스트렙트아비틴(streptavidin)으로 상온에서 10분 동안 반응시킨다.
PBS-T로 세척 후, 항체의 Fc와 반응을 쉽게 하기 위해 바이오티니레이티드 단백질 G(biotinylated protein G)(Sigma-Aldrich)로 상온에서 1시간 반응시킨다. 안정회된 칩은 본격적으로 단백질, 유전자 세포, 리간드, 효소, 지질 등을 고정-생체시료를 고정시켜 멀티-나노어레이칩을 제작한다.
항원-항체의 반응 경우, 20uL의 2ug/mL 포획항체로 1시간 반응시키고, 표적 항원으로 1시간, 형광염료가 결합된 검출항체로 1시간씩 반응시킨다. 각 단계마다 pH 7.4의 PBS 용액으로 칩을 세척하고, 다중색-전반사형광현미경 검출장치에 의해 검출한다.
다음, 바이오틴-나노어레이 나노바이오칩의 초고속 스크리닝하는 것으로서, 전술한 제 1 실시예와 동일하므로 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
도 5는 전술한 바에 따른 결과로서, 보다 구체적으로 전술한 내용과 동일한 조건의 실험방법으로 TNF-α 항체가 고정된 나노어레이칩 상에 정상인과 환자의 타액으로 반응시킨 결과로 정상인보다 환자의 경우 두 배 이상의 높은 감도를 보임으로써 치주질환이 있음을 진단할 수 있다.
< 실시예 3: 폴리머 코팅된 기질 위에 유전자와 세포가 나노어레이된 나노바이오칩 제작 및 검출방법>
우선, 폴리머 코팅된 기질(30)을 준비하는데, 이는 전술하였던 제 1 실시예와 동일하게 진행되므로 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
다음, 기질(30)의 폴리-L-라이신(poly-L-lysine : PLL) 코팅하는 것으로 0.1% PLL을 깨끗이 세척된 유리 기질(30)(예를 들어, 커버글라스)을 10분 정도 담금으로써 코팅한다. 코팅된 유리 기질(30)은 증류수로 세척하고 질소가스로 건조시킨다.
다음, 유전자와 세포의 나노어레이하는 것으로 폴리-L-라이신은 양이온 작용기를 가지고 있으므로 폴리-L-라이신이 코팅된 기질에 음의 전하를 가지는 유전자와 세포를 배열하기에 용이하다.
다음, 복합-나노어레이 바이오칩의 초고속 스크리닝하는 것으로 이는 전술하였던 제 1 실시예와 동일하므로 이에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
도 6은 전술한 바에 따른 결과로서, 보다 구체적으로 프리즘형 이중색-전반사형 광검출장치를 이용하여 폴리-L-라이신-코팅 커버 글라스 위에 표적유전자(target DNA)는 488mm의 파장에서 들뜨도록 사이아닌(Cyanine, Cy3)와 결합시킨다.
탐침유전자(probe DNA)는 532mm 파장에서 들뜨는 사이아닌(Cyanine, Cy5)와 결합시켜 서로 상보적으로 결합할 경우는 (a)와 같이 두 파장에서 이미지를 모두 얻을 수 있으며, 결합되지 않는 경우에는 (b)와 같이 하나의 파장에서만 이미지를 검출할 수 있다.
이러한 결과는 폴리-L-라이신-코팅 유리기질에서 유전자의 나노어레이 가능성과 다중색-전반사형광현미경 기술을 통한 검출을 할 수 있음을 보여준다.
이하, 도 7a 및 도 7b를 참조하여 전술한 바에 따른 다중-표적분자 동시검출용 고감도 복합-나노바이오칩(100) 및 질병진단 방법을 정리하여 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 다양한 지표분자들을 동시에 분석할 수 있도록 이와 반응하는 다양한 고정물질을 하나의 칩에 배열함으로써, 하나의 질병을 보다 정확하게 진단하기 위한 다중 복합-나노어레이칩을 제작하고, 이를 2개 이상의 다른 파장의 광원을 동시에 사용하여 다양한 질병진단용 지표성분에 대해 각기 다른 고유의 색으로 동시에 단일분자 수준까지 검출할 수 있는 다중색-레이저유발 전반사형광검출기(multi-color laser-induced total internal reflection fluorescence microscope, multi-color TIRFM)를 사용한다.
복합-나노어레이칩의 제작에 있어서, 칩의 기질은 1 mm 이하의 두께를 가지며, 빛이 투과될 수 있는 유리(glass), 용융-실리카(fused-silica), 석영(quartz)이나 polydimethylsiloxane(PDMS), poly(methyl methacrylate)(PMMA) 등과 같은 고분자 재질을 사용하는 것이 바람직하다. 칩의 크기는 30 × 30 mm(가로 × 세로) 이하로 하며, 칩과 프리즘 사이에서 빛의 굴절을 최소화시키기 위한 현미경용 유침(immersion oil)을 선택하는 것이 바람직하다.
두 개 이상의 다른 물질이 나노-배열된 복합-나노어레이칩 상에 검출코자 하는 표적시료(예, 질병진단 지표성분으로 유전자, 단백질, 세포 등)의 농도는 피코몰(pM=10-12M) 이하로 하는 것이 바람직하다.
표적분자(target-molecule)(10) 검출을 위해 사용되는 형광염료(fluorescence dye)는 다중색-레이저유발 전반사 형광검출기(multi-color TIRFM)에서 사용되는 광원의 파장을 고려하여 선택되며, 검출할 2 개 이상의 단일분자나 물질이 서로 다른 방출 형광으로 구별될 수 있도록 각기 다른 파장의 빛을 방출하는 염료를 이용하는 것이 바람직하다.
복합-나노바이오칩이 완성되어 검출단계에 이르면, 광다이오드 배열(photodiode arrays, PDA), 전하주입장치(charge-injection devices, CID), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD) 등의 다중채널장치들을 이용하여 생체분자들을 영상화하고 정성/정량분석을 한다.
전술한 복합-나노바이오칩(100)을 이용한 질병진단의 정보제공방법은 다음과 같다.
(a) 나노바이오칩(100)에 배열된 둘 이상의 고정분자(20, 20', 20")가 반응하는 단계, (b) 검출분자(17)를 광다이오드 배열(photodiode arrays, PDA), 전하주입장치(charge-injection, CCD), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD) 등의 다중채널장치들 중 어느 하나에 의해 검출하는 단계 및 (c) 검출된 검출분자(17)를 통하여 가와사끼병, 맥락막의 위축, 갑상선 등의 질병을 진단하는 단계의 순서대로 진행된다.
이하에서는 도 7의 (a) 및 (b)를 참조하여 다중색-전반사 형광현미경을 이용한 나노바이오칩(100)의 검출에 대해 설명한다.
도 7의 (a)는 프리즘형 다중색-전반사형광현미경(prism-type multi-color TIRFM)의 모식도이고, 도 7의 (b)는 대물렌즈형 다중색-전반사형광현미경(objective-type multi-color TIRFM)의 모식도이다.
이하, 다중색-전반사형광현미경의 작동 원리, 프리즘형 다중색-레이저유발 전반사형광검출기 및 프리즘형 다중색-레이저유발 전반사형광검출기를 설명하면 다음과 같다.
다중색-전반사형광현미경은 단일 생체분자 자체에서 발생하는 고유의 형광 및 인광과 같은 각기 다른 파장의 빛을 이용하거나, 혹은 단일 생체분자 자체가 자연 발광을 하지 않는 경우, 발광을 유발시킬 수 있는 양자 입자, 형광 염료 등을 이용하여 각각의 단일분자들을 염색하고, 하나 또는 2개 이상의 광원에서 유도된 각기 다른 파장의 빛을 광원으로 사용한다. 수은 램프, 아크 램프, 중수소 램프, 형광 램프, 백색광 등에서 원하는 파장을 선택하여 사용하거나, 다양한 종류의 기체 레이저, 반도체 레이저, 레이저 다이오드 등과 같은 고유의 파장을 갖는 레이저를 하나 또는 2개 이상 사용하여 다중 파장의 광원으로 사용한다.
조사한 광원의 입사각을 조절하여 유리나 프리즘 표면에서 전반사형광을 유발하거나 전반사형광현미경용 대물렌즈를 사용하여 유발되는 전반사형광에서 용액 내에 있는 단일분자의 에너지 상태를 들뜨게 하여 그 결과 발광되는 서로 다른 파장의 빛을 이용하여 단일분자의 이미지나 분자 상호 간의 반응 또는 생체 내에서의 단일분자들을 실색 실시간으로 검출한다.
TIRF에 의해 유도된 용액 내 50 ~ 400nm의 EFL(Evanescent Field Layer)에서 각기 다른 파장의 빛을 내는 단일분자를 포토메트릭스(Dual-viewTM, Quad-viewTM)와 같은 광학 장치나 도구를 사용하여 검출함으로써 CCD(Charged Couple Device), PMT(Photo Multiplier Tube) 등으로 이미지를 촬영한다. 그 결과, 유전자, 단백질 등과 같은 생체분자의 실색, 실시간 검출 및 분자 상호 간의 다이나믹스, 특성 등의 실시간 측정이 가능하다.
전술한 바에 따라 복합-나노바이오칩(100)은 다른 파장에서 발광하는 형광염료가 결합된 검출분자(17)와 반응하고, 반응한 물질을 검출한다. 여기서, 다중색-레이저유발 전반사형광검출기(multicolor TIRFM)를 이용하여 검출하게 되며, 이러한 다중색-레이저유발 전반사형광검출기(multicolor TIRFM)는 조사한 광원의 입사각을 임계각 이상으로 조절해줌으로써 유도된 전반사(total internal reflection, TIR)에 의한 칩 기질 위에 생성되는 일명 "속히 사라지는 층(evanescent field layer, EFL)"에서 표적물질이나 생체분자들의 상호작용 및 반응 적합성을 실색으로 실시간으로 단일분자 수준에서 검출한다.
복합-나노바이오칩의 중앙부분에 배열된 단일생체분자(스팟)를 카메라로 쉽게 찾기 위해 기질 위에 표시를 함으로써 배열된 부분을 찾는데 시간을 절감할 수 있다. 여기서, 칩 위에 표시된 곳이나 구조물은 노마스키-미분간섭효과(Nomarski-differential interference contrast, Nomarski-DIC)를 이용한 검출기술을 이용하는 것이 바람직하다.
복합-나노바이오칩(100)에서 생체-표적분자를 검출하는 단계에서, 다중색-레이저유발 전반사형광검출기(multi-color TIRFM)의 경우 대물렌즈형과 프리즘형의 전반사형 광검출 기술이 모두 사용가능하나, 프리즘형 다중색-레이저유발 전반사 형광검출기(200)의 경우에 광원으로 사용되는 파장의 종류, 칩 기질의 형태, 나노점(nano-spot)의 공간적 위치 및 지점을 손쉽게 알아내는 것이 필요하다.
따라서, 구조물의 위치나 이미지를 얻을 필요성이 있을 경우, 사용되는 프리즘은 모든 면이 빛이 투과되는 면을 가지고 그 형태는 직각(right angle), 마름모(dove type), 지붕(roof type), 오면체(penta) 모양의 다면 프리즘을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 다중 파장 TIRF를 한 영역에 유도하기 위하여, 빔 스플릿터, 거울 등 2개 이상의 광학 장치를 이용하거나, 또는 2면 이상의 다면 프리즘을 사용한다. 또한, 웨이브 가이드를 유도할 수 있는 유리 또는 투명한 재질의 폴리머, 다중색-레이저유발 전반사형광검출용 대물 렌즈를 사용할 수 있다. 대물렌즈형 다중색-레이저유발 전반사형광검출기(300)를 사용하는 경우는 다양한 이색성 거울, 빔 스플릿터 등과 같은 광학 장치나 다양한 종류의 필터를 2개 이상 사용하는 것이 바람직하다. TIRF를 유도하기 위해 도입되는 광원 앞에 기계식 혹은 전자식 셔터를 장착하여, 측정 시에만 셔터를 열어주어 빛에 의한 광표백 효과를 최소화하는 것이 바람직하다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 이하의 특허 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
10 : 표적분자
11 : 표적 유전자
12 : 탐침 유전자
13 : 검출 단백질
14 : 표적 단백질
15 : 포획 단백질
16 : 표적 세포
17 : 검출분자
20, 20', 20" : 고정분자
30 : 기질
31 : 유전자 기질
32 : 단백질 기질
33 : 세포 기질
100 : 복합-나노바이오칩
200 : 프리즘형 다중색-레이저유발 전반사형광검출기
300 : 대물렌즈형 다중색-레이저유발 전반사형광검출기

Claims (9)

  1. 유전자, 단백질 및 세포 중 어느 하나인 표적분자;
    상기 표적분자와 특이적 상호반응을 하는 고정분자; 및
    상기 고정분자가 위치하는 기질;을 포함하고,
    상기 기질 위에 나노패턴이 형성됨에 따라 상기 고정분자는 상기 기질 위에 위치하는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 고정분자는 단백질, 유전자, 지질, 효소, 압타머(aptamer) 및 리간드 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 기질은 유리(glass), 용융-실리카(fused-silica), 석영(quartz)이나 폴리다이메틸실록산(PDMS), 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 기질은 0 ~ 1mm의 두께 범위로 빛의 투과가 가능한 유리 및 고분자 재질이고, 그리고
    상기 기질 위에 상기 나노패턴의 직경은 0 ~ 500nm의 범위 내로 배열되는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노패턴은 잉크젯 나노프린팅, 전자빔 식각(e-beam lithography) 및 원자힘현미경-디펜나노식각(atomic force microscope-dip pen nanolithography, AFM-DPN) 등의 나노식각(nanolithography) 기술 중 어느 하나에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 나노패턴의 직경은 0 ~ 500nm 이하의 범위를 갖고, 상기 나노패턴의 간격(pitch)은 10 nm ~ 10 μm의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 고정분자에 다른 종류의 상기 표적분자가 상보적으로 결합하여 반응하는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 나노바이오칩은 다른 파장에서 발광하는 형광염료가 결합된 검출분자와 반응하는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩.
  9. (a) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 상기 나노바이오칩에 배열된 둘 이상의 상기 고정분자가 반응하는 단계;
    (b) 제 8 항에 따른 상기 검출분자를 광다이오드 배열(photodiode arrays, PDA), 전하주입장치(charge-injection, CCD), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD) 등의 다중채널장치들 중 어느 하나에 의해 검출하는 단계; 및
    (c) 검출된 검출분자를 통하여 가와사끼병, 맥락막의 위축, 갑상선 등의 질병을 진단하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    복합-나노바이오칩 및 이를 이용한 질병진단의 정보제공방법.
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