JP4864088B2 - 標識不使用下での結合検出と蛍光増幅を組合せた格子に基づくセンサー及びセンサー用読取システム - Google Patents

Description

この出願は、次の米国仮特許出願に基づき、米国特許法（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．）第１１９条（ｅ）による優先権の利益を請求する出願であって、これらの出願の全開示内容も本願明細書の一部を成すものである：Ｎｏ．６０／７０７５９７（出願日：２００５年８月１１日）、Ｎｏ．６０／７１３６９４（出願日：２００５年９月２日）、Ｎｏ．６０／７７８１６０（出願日：２００６年２月２８日）、Ｎｏ．６０／７９０２０７（出願日：２００６年４月７日）。

本発明は、一般的には、格子（grating）に基づく生化学的センサー装置、及び該装置の検出装置に関する。格子に基づくセンサーは、一般的には、生物学的物質（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、ウイルス及び細胞等）、低分子量物質又は化学薬品の該センサー装置の表面又は内部への吸着を光学的に検出するために使用されている。本発明によるセンサーは、次の２種の異なる用途に適用できるように構成される格子構造（grating structure）を有する：i）標識不使用（label-free）条件下での結合の検出、及びii）蛍光の検出（例えば、試料が蛍光体に結合するか、又は天然の蛍光を発生する場合の蛍光の検出）。

１．標識不使用検出センサー
格子に基づくセンサーは、１００ｎｍ未満の精度で被処理物の正確な沈着と腐食を可能にする半導体製造装置の最近の発達によって開発された新規な光学的装置群である。

光子的結晶（photonic crystal）のいくつかの特性に起因して、該結晶は、格子型光学的バイオセンサーとしての用途に対して理想的な候補となっている。第１に、光子的結晶の反射／透過挙動は、生物学的物質（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、細胞、ウイルス粒子及びバクテリア等）の該結晶上への吸着によって容易に調整することができる。検出することができるその他のタイプの生物学的物質には、小さな低分子量分子（即ち、分子量が１０００ダルトン（Ｄａ）未満及び１０００Ｄａ〜１００００Ｄａの物質）、アミノ酸、核酸、脂質、炭水化物、核酸ポリマー、ウイルス粒子、ウイルス成分、及び細胞成分（例えば、特に限定的ではないが、ベシクル、ミトコンドリア、構造的特徴成分、周辺質又は細胞抽出物等）等が含まれる。これらのタイプの物質を用いた研究により、次のことが証明されている。即ち、該結晶は、該結晶を通過する光の光学距離を限定された誘電率によって変化させる特性を有する。

第２に、光子的結晶の反射／透過スペクトルは非常に狭いので、簡単な照明装置と検出装置を使用する場合でも、生化学的結合に起因する該結晶の光学的特性のシフトを高分解能で決定することが可能となる。第３に、光子的結晶構造を、電磁場伝搬を高度に局現化させるように設計することができるので、単一の光子的結晶表面を使用することによって、多数の生化学的結合現象を、３〜５ミクロンよりも狭い隣接領域間の光学的干渉を伴うことなく同時に測定することが可能となる。

さらに、高い表面／体積比を有すると共に、生化学的試験試料と接触する領域へ電磁場強度を集中させる機能を有する実用的な光子的結晶装置を形成させるためには、広範囲の材料と製造法が利用できる。製造材料と製造法は、プラスチックに基づく材料を用いる大容量装置の製造又は半導体材料を用いる高感度性能を最適化するように選択することができる。

従来技術における格子型バイオセンサーの代表的な例は下記の文献に開示されている：
１）Ｂ．Ｔ．カニングハム、Ｐ．リ、Ｂ，リン及びＪ．ペパー、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ Ｂ、第８１巻（２００２年）、第３１６頁〜第３２８頁（「直接的な生化学的アッセイ法としての熱量測定による共鳴反射」）、
２）Ｂ．Ｔ．カニングハム、Ｊ．キュウ、Ｐ．リ、Ｊ．ペパー及びＢ．フー、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ Ｂ、第８５巻（２００２年）、第２１９頁〜第２２６頁（「標識の介在しない生化学的相互作用の多重同時検出のための熱量測定によるプラスチック製共鳴光学的バイオセンサー」）、及び
３）Ａ．Ｊ．ヘス及びＲ．Ｐ．Ｖ．ドゥイン、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー、第１２４巻（２００２年）、第１０５９６頁〜第１０６０４頁（「ナノスケールの光学的バイオセンサー：三角形状の銀ナノ粒子の局存化表面プラスモン共鳴スペクトロスコピーに基づくアプローチの感度と選択度」）。

光子的結晶バイオセンサーが併有する上記の利点は、標識が介在しないその他のバイオセンサー技術によって凌駕されない。感度が高く、小型で、多数の同時検出が可能な安価なバイオセンサー及び簡単で、小型で、耐久性がある読み出し型の装置の開発が可能となれば、従来は経済的な観点から適合できなかった用途において、薬学的発見、診断試験、環境関連試験、及び食品の安全性の分野におけるバイオセンサーの利用を可能とする。

光子的バンドギャップ装置をバイオセンサーとして機能するように適合させるためには、その構造の一部を液状の試験試料と接触させなければならない。生体分子、細胞、タンパク質、又はその他の物質は光子的結晶の一部へ導入され、局部的に制限された電磁場の強度が最大になる部位において吸着される。この結果、結晶内への光の共鳴カップリングが改変され、反射／透過出力（即ち、ピーク波長）が同調される（即ち、シフトする）。反射出力のシフト度は、センサー上に存在する被検試料の量と関連する。センサーは照明／検出装置と併用され、該装置は偏光をセンサー内へ方向付けると共に反射光又は透過光を捕獲する。反射光又は透過光は、ピーク波長を測定するスペクトロメーターへ送られる。

高い品質係数（Ｑ）、共鳴光カップリング、高い電磁エネルギー密度及び密閉した光学的閉じ込めをもたらす光子的結晶の機能を利用することによって、感度の高い生化学的センサーを製造することができる。この場合、Ｑは、共鳴周波数におけるピーク波長の鋭敏さの尺度である。光子的結晶のバイオセンサーは、液状の試験試料が周期的格子を透過し、生体分子又は細胞の結合による結晶の表面誘電率の改変によって光学的共鳴カップリング条件を同調させるように設計される。共鳴の高いＱ値及び結合電磁場と表面結合物質との強い相互作用に起因して、報告されている最高感度を有するいくつかのバイオセンサー装置が光子的結晶から誘導されている（クニングハムらによる前記の論文参照）。

この種の装置が、２００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する分子を高い信号対雑音の許容範囲で検出する機能及び個々の細胞を検出する機能を有していることは証明されている。光子的結晶内において共鳴的に結合した光は空間的に効果的に閉じ込めることができるので、光子的結晶表面は、アレイ形式による多数の同時におこなわれる生化学的アッセイを可能にする。この場合、相互に約１０μｍ以内の隣接領域は独立して測定することができる。この点に関しては次の文献を参照されたい：Ｐ．リ、Ｂ．リン、Ｊ．ゲルステンマイヤー及びＢ．Ｔ．クニングハム、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ Ｂ、２００３年（「生体分子の相互作用の標識を介在させないイメージングに関する新規な方法」）。

光子的結晶構造に基づく標識不使用バイオセンサーには多くの実用的な利点がある。蛍光団、放射リガンド又は二次的レポーターを使用しない生化学的な細胞性結合の直接的検出法は、実験上の不正確さ、即ち、分子のコンフォメーションに対する標識の効果、活性な結合性エピトープの遮断、立体障害、標識サイトへの不到達性、又は実験における全ての分子に対して同等に機能する適当な標識を見出すことができないことによってもたられる不正確さの問題を除去する。標識を使用しない検出法は、アッセイ法の開発に要する時間と労力を著しく単純化すると共に、失活、貯蔵寿命及び背景（background）蛍光のための必要な実験的道具を必要としない。

標識を使用しないその他の光学的バイオセンサーに比べて、光子的結晶の機能は、広帯域の光源（例えば、白熱電球又はＬＥＤ）から垂直の入射角で光を照射し、反射される色彩のシフトを測定することによって容易に調べることができる。簡単な励起／読み出しスキームの利用により、実験室用器具に使用するのに適した安価で小型の強靱なシステム、及びケア医療用診断法や環境の監視に使用される手持ちの携帯システムを得ることが可能となる。光子的結晶自体は電力を消費しないので、この種の装置は、種々の液体状又は気体状のサンプリングシステム内へ容易に埋設することができる。あるいは、この種の装置は、単一の照明／検出基地によって建物内の何千ものセンサーの状態が追跡される光学的ネットワーク中に配置させることができる。

光子的結晶のバイオセンサーは広範囲の材料と方法によって製造することができるが、連続的なフィルム状シートを用いておこなうプラスチックに基づく製法によれば、高感度の構造体が得られることが判明している。従来はその他のバイオセンサーに対しては経済的に不適当とされていたプラスチックに基づく設計と製法によれば、低コスト／アッセイが要求される用途において使用されるべき光子的結晶バイオセンサーが得られる。

本発明の譲受人は、光子的結晶バイオセンサー及び標識不使用下での結合の検出ためのこれに関連する検出装置を開発した。このセンサーと検出装置は次の特許文献に記載されている：米国特許出願公報２００３／００２７３２７号、同２００２／０１２７５６５号、同２００３／００５９８５５号及び同２００３／００３２０３９号。共鳴ピーク波長のシフトの検出法は、米国特許出願公報２００３／００７７６６０号に教示されている。これらの特許文献に記載されているバイオセンサーは、プラスチック製のフィルム又は基体の連続的シート上へ適用された一次元的又は二次元的な周期的構造化表面を含む。この結晶の共鳴波長は、垂直入射におけるピーク反射率を、０．５ピコメーターの波長分解能が得られるスペクトロメーターを用いて測定することによって決定される。三次元的なヒドロゲル表面の化学的性質を利用しないで得られた質量検出感度（１ｐｇ／ｍｍ^２）よりも小さな値は、その他の市販のバイオセンサーによっては証明されていない。

前記の特許出願の明細書に記載されているバイオセンサー装置の基本的な利点は、プラスチック材料を用いる連続的な工程（１〜２フィート／分）によって大量生産できることである。このようなセンサーを大量生産する方法は、米国特許出願公報２００３／００１７５８１号に記載されている。

図１に示すように、バイオセンサー１０の周期的表面構造体は低屈折率を有する材料１２から形成されており、該材料は、より屈折率の高い材料１４によって被覆される。低屈折率材料１２は基体１６と結合される。この表面構造体は、ポリエステル製の基体１６の表面上での連続的製膜法を用いることによって、シリコンウェーハ「マスター」金型（即ち、所望の複製構造体のネガティブ）からの硬化エポキシ層１２の内部で複製される。液状のエポキシ１２をマスター格子の形態に適合させ、次いで紫外線の照射によって硬化させる。好ましくは、硬化エポキシ１２は、ポリエステル製のシート状の基体１６と接着させ、シリコンウェーハから剥離させる。センサーの製造工程は、屈折率の高い材料である酸化チタン（ＴｉＯ_２）を硬化エポキシ１２の格子表面上へスパッター法により１２０ｎｍの厚さで沈着させることによって完結する。酸化チタンを沈着させた後、マイクロプレートの切片（３×５インチ）をセンサーのシートから切り取り、該切片を、底のない９６個のウェル及び３８４個のウェルを具有するマイクロタイタープレート（microtiter plate）の底部へエポキシを用いて結合させる。

図２に示すように、マイクロタイタープレートのウェルを規定するウェル２０は液状試料２２を保有する。底のないマイクロプレートとバイオセンサー構造体を組み合わせたものは集合的にバイオセンサー装置２６として図示する。この方法によれば、非常に低いコストで、光子的結晶のセンサーを平方ヤードの規模で大量生産することができる。

光子的結晶のバイオセンサー用の検出装置は、構造が簡単で、安価で、消費電力が少なく、強靱である。このシステムの模式図を図２に示す。反射される共鳴を検出するためには、白色光源からの光を、光ファイバー３２（直径：１００μｍ）とコリメーターレンズ３４を通して、通常はマイクロプレートの底部を垂直の入射角で通過させることによってセンサーの表面領域（直径が約１ｍｍの領域）へ照射する。検出ファイバー３６は、スペクトロメーター３８を用いる分析用の反射光を集めるための照射ファイバー３２を用いて束ねられる。８個の一連の照明／検出ヘッド４０は直線上に配置されるので、反射スペクトルは、マイクロプレートの一列内の８個の全てのウェルから一度に集められる（図３参照）。

マイクロプレート＋バイオセンサー１０は、Ｘ−Ｙ軸方向でのアドレスで呼び出せる作動段階（motion stage）にあるので（図２には図示せず）、マイクロプレート内の各々のウェル列は順次アドレス指定することができる。測定時間は、作動段階の速度によって制限されるが、この装置を使用する場合には、９６個の全てのウェルに関する測定は約１５秒間でおこなわれる。図２及び図３に示すシステムの構成に関するさらに詳細な説明は、米国特許出願公報２００３／００５９８５５号に記載されている。

下記の説明と議論は、ＢＩＮＤ技術として先に説明した標識を使用しない技術に関する。「ＢＩＮＤ」は、本願の譲受人であるＳＲＵバイオシステム社の商標である。

２．蛍光増幅センサー
米国特許第６７０７５６１号明細書には、当該分野においてはしばしば「エバネッセント共鳴（ＥＲ；evanescent resonance）」と呼ばれている格子に基づくバイオセンサー技術が記載されている。この技術においては、サブミクロンスケール（sub-micron scale）の格子構造体を使用して蛍光信号を増幅させた後、格子表面上に結合した分子であって蛍光性標識を保有する１つの分子へ結合させる。ＥＲ技術は、非増幅アッセイに比べて著しく低い濃度の被検体の結合検出を可能にする蛍光体に基づくアッセイの感度を増大させる。

ＥＲ技術においては、光学的共鳴を発生させる格子を使用することによって、結合がおこなわれる格子表面上へレーザー光を集める。実際は、レーザースキャナーが、一般的には格子の表面からの入射角（θ）の一部においてセンサーを掃引する。一方、検出器はセンサーの表面からの光学的波長の長い蛍光を検出する。設計により、ＥＲ格子の光学的特性によってほぼ１００％の反射（共鳴として知られている反射）を特定の入射角とレーザー波長（λ）においてもたらすことができる。格子構造体によるその内部へのレーザー光の閉じ込めによって、消失場の範囲内（一般的には１〜２ｎｍ）に結合した蛍光体からの発光を増幅させる。従って、共鳴においては、透過光の強度はゼロ近くまで低下する。

前述のように、先に言及した特許出願の明細書に記載されている標識を含まないバイオセンサーにおいては、サブミクロンスケールの格子構造体が使用されるが、該格子構造体は、ＥＲ用の格子に比べて、幾何学的形態と使用目的の点で著しく相違する。実用に際しては、標識を使用しない技術とＥＲ技術は、共鳴に近い光学的特性に関して異なる要求を有する。共鳴現象におけるスペクトルの幅と位置が主として相違する。共鳴幅は、波長に対して反射率又は透過率としてプロットされる共鳴特性の波長尺度での半極大における全幅に関する。また、該共鳴幅は前記のＱ因子とも呼ばれている。共鳴幅は、入射角（θ）の関数として反射率又は透過率を表示する曲線上にプロットされる共鳴特性の幅（度）にも関する。

所望により、標識を含まない格子に基づくセンサーからできるだけ幅の狭い共鳴ピークを発生させることによって、結合性の低いことを示すピークの位置の小さな変化の検出を促進させることができる。標識を含まないセンサーは、より多くの試料を結合させるために大きな格子表面積を有するという利点を有する。現在の実用化においては、より大きな表面積は、他の方法も存在するが、格子をより深くすることによって得られる。現在市販されている標識を含まないセンサーによれば８５０ｎｍ近くで共鳴が得られるので、標識を使用しないＢＩＮＤ計測器はこの波長を読み取るように最適化されている。

これとは反対に、実用的なＥＲ格子センサーは、固定された波長のレーザー光を使用すると共に、物理的な可変因子（例えば、格子上に蓄積する試料の種類やセンサーの製造条件の相違等）の存在下での固定入射角において共鳴が発生することを保証するために、比較的幅広い共鳴が利用できるように設計されている。一般に、場の強度は共鳴幅に伴って低減するので、実用的なＥＲセンサーの設計には共鳴幅における調和が要求される。適当な共鳴幅を選択することによって、ＥＲ信号の利得を保持すると共に、アッセイ、測定器具及びセンサーの可変範囲にわたって一定の増幅度が得られる。典型的な用途においては、Ｃｙ５として知られているような常套の蛍光性染料を励起させるために６３３ｎｍの波長が使用される。一部のＥＲ掃引性計測器によれば、最大のレーザー／蛍光体カップリング（coupling）に対して共鳴を同調させるように入射角を調整することが可能である。しかしながら、このような実用的態様には、適切な調整手段を採用しない限り、許容できない変化をもたらす要因が含まれる。

既知のＥＲ設計においては、標識を使用しない最適設計に比べて浅い深さを有する格子が採用されている。例えば、米国特許第６７０７５６１号明細書においては、「透明層」（即ち、屈折率の大きな被覆層）の厚さに対する格子の深さの比は１未満（好ましくは０．３〜０．７に規定されている。標識を使用しない最適な設計においては、同様に規定される比が１よりも大きな値（好ましくは１．５よりも大きな値）の格子が採用されている。標識を使用しない設計においては、格子の深さは、一般的には格子の線幅又は半周期によって定義される。例えば、現在実用化されている市販の標識不含センサーの半周期は２７５ｎｍであり、格子の深さは約２７６ｎｍであり、幾何学的比は１：１である。この同じセンサーの設計においては、格子の上部面上には大きな屈折率を有する酸化物被覆層（厚さ：約９０ｎｍ）が形成される。従って、米国特許第６７０７５６１号明細書に記載の定義によれば、このセンサーにおける格子の深さ：酸化物層の厚さは約３：１である。

本発明は、従来の上記問題点を解決するためになされたものであって、単一の装置内において２種の検出方式（標識不使用方式及び蛍光増幅方式）に対して最適化できるように設計され、単一の製品によって可能となる用途の多様性を著しく増大させる格子に基づく新規なセンサーを提供する。

上記の全ての引用技術は、本願明細書の一部を構成するものである。
下記の実施態様とこれらの特徴は、範囲を制限しない例示的なシステム、装置及び方法によって例証的に説明するものである。種々の実施態様においては、前述の１又は複数の問題点を軽減又は解消し、また、その他の実施態様は別の改良に向けられたものである。

本発明の１つの観点においては、ＥＲ方式と標識を使用しない検出方式の実施に適合された格子に基づくセンサーが開示される。この種のセンサーは、小さな入射角（θ）において広帯域の共鳴をもたらし、常套のＥＲ方式による格子型バイオセンサーの場合と類似の性能曲線を示すと共に、標識を使用しない検出方式における鋭い共鳴ピークを保持する。いくつかの典型的な実施態様を開示する。第１の実施態様は、空気試料媒体中において光（格子に対して垂直な光）のＴＭ偏光を伴うＥＲ方式に対して最適化される。第２の実施態様は、液状試料媒体中においてほぼ垂直な入射角、６３３ｎｍ励起及びＴＥ偏光を伴うＥＲ方式に対して最適化される。これらの実施態様のコンピュータによるモデリング（modeling）によれば、各々の実施態様が、標識を使用しない検出方式において鋭いピーク波長共鳴（高いＱ因子）を維持することが示される。

１つの配置態様においては、バイオセンサーは１次元又は２次元の周期的表面格子構造を有している。この場合、該周期的表面格子構造は、エバネッセント共鳴（ＥＲ）検出方式における第１光源からの光によるバイオセンサーの光学的質問（optical interrogation）を最適化するように構成されると共に、標識を使用しない検出方式における第２光源からの光によるバイオセンサーの光学的質問を最適化するように構成される。１つの可能な実施態様においては、格子は２次元的格子の形態を有しており、該格子は相互に直交する第１方向と第２方向において周期的である。別の実施態様においては、格子は１次元的格子の形態を有しており、第１の方向（例えば、Ｘ方向）においては周期的であるが、第２の方向においては周期的ではない。

バイオセンサーにおいて標識を使用しない検出方式の利点は、より大きな表面積をもたらすより深い格子に起因し、これによってより多量の試料の付着が可能となる。より多くの付着試料は、ピーク波長値のより大きなシフトをもたらすより多くの信号を発生させる。従来のＥＲ格子は、標識を使用しない本発明による格子センサーと同等な標識不使用感度をもたらすのに十分な表面積（深さ）を有していない。従って、最大の表面積（この場合には大きな格子深さに起因する）をもたらすと共に、所望のレーザー励起波長と小さな入射角（好ましくは１０度未満、より好ましくは５度未満）において広い共鳴曲線をもたらすバイオセンサーを設計することができる。代表的な１次元態様におけるＥＲと標識不使用性能に対する要求を満たすバイオセンサーにおいては、半周期に対する格子深さの比は約０．６〜約１．２である。約１６０ｎｍ〜約２１０ｎｍの格子深さは特に要請される。もちろん、これらのパラメーターは、ＥＲ又は標識不使用性能を重要視するための特定のセンサーの性能目的に対応させるために変化させてもよく、あるいは、例えば、本明細書に記載のような２次元的格子においては変化させてもよい。

当業者であれば、本明細書に開示される教示内容による格子の設計をコンピューターでシミュレーションすることにより、該教示内容による別の格子であって、先に例示した非制限的な第１実施態様と第２実施態様の詳細な事項とは相違する格子の設計を開発することができる。別の観点においては、ＥＲと標識不使用検出の２つの用途に供されるバイオセンサーの設計方法が、コンピュータによるモデリング技法によって開示される。

ＥＲと標識不使用検出の両方に適した２次元的な直交格子構造を有する格子に基づくセンサーも開示され、該センサーは一部の機器においては好ましいものである。２次元的格子はワッフル（waffle）（ホール）、ワッフルアイロン（waffle iron）（ポスト）、又は２方向において大領域と小領域が交互に出現するチェス盤のような形態を有していてもよい。２次元的な格子はＸ方向とＹ方向において異なる周期を有していてもよい。このような形態的特徴を有する格子はＺ方向において種々の側面、例えば、傾斜状側面又は湾曲状側面等を有していてもよい。従って、ワッフル状形態の場合、キャビティ又はウェルは正方形よりも長方形の形態を有していてもよい。実用上、これらの形態はＸ方向とＹ方向において丸みを帯びていてもよい（即ち、鋭利な角を有していなくてもよい）。従って、「正方形」又は「長方形」という用語は全体的な形態について使用するものであり、このような形態は丸みを帯びていてもよい。２次元的格子によってもたらされる付加的な融通性を利用することにより、標識不使用検出とＥＲ検出の両方に関する共鳴の位置が異なる波長において出現するように調整することができる。このような可能性により、既存の標識不使用検出機器との適合性を維持すると共に、ＥＲを異なる波長での共鳴に調整できるという重要な利点が得られる。例えば、Ｘ方向の周期性は、Ｃｙ３蛍光体（緑色光）又はＣｙ５蛍光体（赤色光）を励起するように調整された波長の光の入射角が垂直又はほぼ垂直になる条件下において広帯域共鳴をもたらすことができ、一方、Ｙ方向の周期性は、現在市販されている標識不使用センサーの場合と同様に、８２０ｎｍ〜８５０ｎｍ（近赤外）において鋭敏な標識不使用共鳴をもたらすことができる。

ＥＲ検出と標識不使用検出の両方に対して良好な性能を発揮するように構成されて配置される格子に基づくバイオセンサーの別の実施態様として、２次元的な２段状（two-level）格子構造体も開示される。

別の観点においては、次の過程（i）を含む少なくとも１種の試料の分析方法が開示される：（i）エバネッセント共鳴（ＥＲ）検出方式におけるバイオセンサーの光学的質問に対して対応できるような構造に設計されると共に、標識不使用検出方式におけるバイオセンサーの光学的質問を最適化する周期的な表面格子構造を有する支持体を具備するバイオセンサー上に少なくとも１種の試料を載置させる。この分析方法にはさらに次の過程（ii）及び（iii）が含まれる：（ii）ＥＲ検出方式用に設計される少なくとも１つの光源からの光を用いて読取検出器（readout detection instrument）内のバイオセンサーを照射すると共に、標識不使用検出方式用に設計される該光源（又は第２光源）を用いて該バイオセンサーを照射し、次いで（iii）バイオセンサーからの反射光を分析する。試料の分析過程には、試料中の成分の結合性、例えば、バイオセンサーの表面上への試料中の成分の結合性又は第１成分（例えば、タンパク質）への第２成分（例えば、蛍光体、抑制剤又は標識等）の結合性等を検出する過程が含まれていてもよい。

１つの実施態様においては、読取り系は２つの光源を含んでいてもよい。即ち、第１光源はＢＩＮＤ用光源（例えば、白色光源又は発光ダイオード）であり、第２光源はＥＲ測定用光源（例えば、レーザー等）である。しかしながら、別の実施態様においては、単一の光源（例えば、キセノン放電ランプ及び波長可変レーザー等）が使用され、２つ又はそれよりも多くの帯域通過フィルターを用いて２種の検出方式に対して適当な照射波長がもたらされるように光源のサンプリングがおこなわれる。

１つの可能な実施態様においては、試料は空気媒体中に存在し、第１光源からの光は、格子構造に対して垂直な偏光を含む。別の可能な実施態様においては、試料は液状媒体中に存在し、第１光源からの光は格子構造に対して平行な偏光を含む。１つの可能な実施態様においては、第１光源からの光は、試料に結合される蛍光体を活性化させるように選択される波長を有する。別の可能な実施態様においては、第１光源からの光は、試料の天然の蛍光を活性化させるように選択される波長を有する。さらに別の実施態様においては、試料の一部は、結合蛍光体を含んでいてもよい抑制剤と結合する。試料は、例えば、タンパク質等であっってもよい。

本発明によるバイオセンサー用の読取／検出装置のいくつかの代表的な態様についても説明する。１つの実施態様においては、読取／検出装置は下記の構成要素 i）〜 v）を具備する：
i）バイオセンサーからＥＲ検出データを得るために適合した第１光源、
ii）標識不使用検出データを得るために適合した第２光源、
iii）第１光源からの光と第２光源からの光を合成することによって、バイオセンサーを照射するための照射ビームを発生させる光学系、
iv）バイオセンサーからの反射光を検出するための少なくとも１つの検出器、及び
v）少なくとも１つの検出器からのデータを使用することによって試料からＥＲデータと標識不使用データを得るための分析モジュール。

検出器は結像検出器、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤイメージャー（imager））等であってもよい。別のタイプの検出器、例えば、光検出器若しくは分光器であってもよく、又はこれらを併用し、一方の検出器によってＥＲデータを入手し、他方の検出器によってＢＩＮＤデータを入手してもよい。

別の代表的な態様においては、光学系は、単一光源からの光を用いてバイオセンサーを選択的に照射する。バイオセンサーは多数の検出サイト又はウェルを有していてもよく、また、上記の装置は、光源に対して検出サイトを連続的に移動させることによって全ての検出サイトからＥＲデータと標識不使用データを連続的に入手できるようにする可動性ステージ（motion stage）を具備していてもよい。

要約すれば、本明細書の開示内容においては、高い蛍光能を有する光子結晶に基づく標識不使用バイオセンサーを単一装置内で組み合わせる新規な検出／定量化プラットホームが記載される。標識不使用技術とＥＲ技術は単独でも非常に有用である。これらの２種の検出技術の組合せが可能となることにより、生物学的物質、例えば、細胞、タンパク質及び低分子等の相互作用を一般的に検出して選択的に測定するための強力なアプローチ手段がもたらされる。本明細書に開示される組み合わされたバイオセンサーは、広範囲にわたる生物学的試料又は化学的試料の検出において有用である。

検出することができる試料群には、分子量が小さいか又は比較的小さい分子（即ち、１０００Ｄａ未満の分子量を有する物質及び１０００〜１００００Ｄａの分子量を有する物質）、アミノ酸、核酸、脂質、炭水化物、核酸ポリマー、ウイルス粒子、ウイルス成分、細胞成分（例えば、特に限定的ではないが、ベシクル、ミトコンドリア、構造的特徴成分、周辺質又はこれらの抽出物等が例示される）等が含まれる。

一般液には、本発明によるバイオセンサーを用いて検出してもよい特異的に結合する物質（試料）には下記のものが含まれる：ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（scFv）、F(ab)フラグメント、F(ab')2 フラグメント、Fv フラグメント、有機低分子、細胞、ウイルス、バクテリア、ポリマー、ペプチド溶液、タンパク質溶液、化学的化合物ライブラリー（library）の溶液、単鎖ＤＮＡ溶液、二重鎖ＤＮＡ溶液、単鎖ＤＮＡ溶液と二重鎖ＤＮＡの溶液との組合せ、ＲＮＡ溶液、及び生物学的試料。

この種の生物学的試料は、例えば、下記の群から選択される試料であってもよい：血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジェネート、滑液、大便、唾液、痰、シスト液、羊水、髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙及び前立腺液。

本明細書に開示されるバイオセンサーは、次の結合性（ａ）〜（ｃ）を検出するために使用してもよい：（ａ）上記のいずれかの種類の試料成分とバイオセンサー表面との結合性、（ｂ）試料と試料中の別成分（例えば、試料中の蛍光体）との結合性、及び（ｃ）試料又は試料成分と、該試料中に添加される第２試料との結合性。結合性（ｂ）の場合、センサーの表面は、試料中の一部の成分（例えば、ストレプタビジン−ビオチン又は６Ｈｉｓ）と結合してよく、また、バイオセンサーは、試料中の結合成分と試料中の付加的な成分群（例えば、ポリメラーゼ錯体）との相互作用を検出するために使用してもよい。結合性（ｃ）の場合、試料は、バイオセンサーの表面に結合した成分、及びバイオセンサー上に存在する第２試料からの他の成分と特異的に結合／付着した別の成分を含んでいてもよい。

本明細書に開示されるセンサーは、結合又は相互作用する物質の量の定量化のために使用してもよい。

以下の一般的な例は、本明細書に開示される格子に基づくセンサーの併用によって可能となる新規な有用性の全てを挙げるものではなく、また、該有用性はこれらに限定されるものではない。
１）２つの技術の結合により、混合試料の母集団（population）中に存在する蛍光体で標識化された物質の百分率が識別される。標識の存在しないシグナルは、センサーに結合したマス全体の定量的な尺度を提供する。一方、ＥＲシグナルは、標識の存在を定量化する。
２）これらの技術の結合は、異種源からの２つの結合シグナルを提供することによって、細胞、タンパク質及び小さな分子間における相互作用の測定における統計的厳密性も高める。

３）フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）原理を利用することにより、センサーの併用によって、２つの標識度の異なる蛍光分子間の距離又は同一分子の２つの標識化度の異なる部分間の距離の測定が可能となる。
４）２つの技術の結合により、付加的な情報を提供することができる。標識のないシグナルは細胞の付着を定量化することができ、発光シグナルは、細胞に結合した蛍光体標識化リガンドの量を定量化することができる。もちろん、上述のような標識のない生物学的物質及び標識化した生物学的物質が本発明によるバイオセンサーにおいて検出される場合には、その他の方法も可能である。
５）２つの技術の結合により、結合した全マスと分子数を識別することによって分子量の測定をおこなってもよい。
６）さらに、結合されたバイオセンサーは、抑制結合の研究のような他の方法を実施するための相互に独立した２種の定量試験を可能とする。さらに、抑制剤リガンドの結合性の直接的定量化能を含むタンパク質と支持体との間の抑制結合相互作用に関するより完全な理解と特徴付けが可能となる。付加的な例としては、バイオセンサーが非常に強い結合性相互作用に関する研究であって、弱い結合親和性を有する既知の競合性抑制剤を使用することによって、より強い結合性物質の摂動と観察をおこなう該研究を促進することが挙げられる。

７）組み合わされたＥＲ／標識不使用バイオセンサーは、生物学的分子の天然の蛍光を利用することによって（即ち、結合蛍光標識の使用を必要としない）、活性、例えば、他の生物学的分子と小さな被験分子との相互作用における折畳み（folding）、積重ね（stacking）及び変化並びにこれらへの変化速度等）の生物理学的特徴の測定をおこなうアッセイに対して特に有用である。このような特徴の測定は、結合蛍光標識を用いておこなうことができるが、この種の結合標識は必ずしも必要ではなく、特に固有の蛍光特性を有する生物学的物質に対してはそうである。この点に関しては次の文献を参照されたい：チャールズＲ．カントン及びポールＲ．シンメル、第１部〜第３部 バイオフィジカル・ケミストリー：生物学的分子の挙動と研究、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨーク（１９８０年）、第４４３頁、表８−表２（該表には、タンパク質と核酸の構成成分及び補酵素の蛍光特性、これらの吸収スペクトルと発光スペクトル及び感度が記載されている）。天然蛍光を用いるこの技法は、核酸ポリマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）（蛍光ヌクレオシド）の積重ねとハイブリッド形成、タンパク質（蛍光アミノ酸フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び脂質膜（これらの異なる区画へ蛍光体を組み入れたときの発光の強化効果と抑制効果）に関して特に重要である。１つの実施態様においては、標識を使用しないＢＩＮＤの特徴により、試料又は試料に結合したリガンドの量を定量することができ、また、ＥＲの特徴により、天然の蛍光の検出と生物理学的変化の高感度追跡が可能となる。

例示的な実施態様を添付図に基づいて説明する。これらの実施態様及び添付図は、本願発明を例示的に説明するためのものであって、本願発明を限定するものではない。本発明の範囲に関連する全ての疑問は特許請求の範囲に基づいて回答されるべきである。以下において、添付図面について簡単に説明する。

図１は、従来技術によるバイオセンサーの部分的な模式的断面図である。
図２は、従来技術によるバイオセンサー／検出システムであって、該バイオセンサーを照明すると共に、該バイオセンサーからの反射光のピーク波長のシフトを測定するための該システムの模式図である。
図３は、底のないマイクロタイタープレートの基底部へ固定された図１に示す構造を有するバイオセンサー装置のウェルの全列を読み取る８個の照明ヘッドを具備する装置の模式的構成図である。
図４は、ＥＲ／標識不使用混成検出バイオセンサーの第１態様の断面図である。
図５は、ＥＲ／標識不使用混成検出バイオセンサーの第２態様の断面図である。

図６は、従来技術によるＥＲバイオセンサー（「ノヴァチップ（NovaChip）」）における入射角θの関数としての透過率を比較するグラフである。この場合、乾燥媒体（空気）環境下におけるＥＲ検出に使用した図４に示す態様のコンピュータシミュレーションを用いた。
図７は、水性媒体環境下における標識不使用検出方式による図４に示す態様に対する波長の関数としての反射率を比較するグラフである。この場合、該グラフは、図４に示す態様のコンピュータシミュレーションから得られたものである。
図８は、標識不使用検出方式による図４に示す態様に対する波長の関数としての反射率のグラフを示す。該グラフは、表面への質量付加（例えば、バイオセンサーへの試料の添加による質量付加）に応答するピーク波長値のシフトを示す。この場合、該グラフは、図４に示す態様のコンピュータシミュレーションから得られたものである。
図９は、標識不使用／ＥＲ検出方式による図５に示す態様に対する共鳴ピークを示す波長の関数としての反射率のグラフを示す。この場合、該グラフは、図５に示す態様のコンピュータシミュレーションから得られたものである。

図１０は、図５に示す態様に対するθの関数としての透過率のグラフである。該グラフは、ＥＲセンサーの例である従来技術による「ノヴァチップ」の透過率曲線と比較される。
図１１Ａ及び図１１Ｂは、専らＥＲ検出用に設計された一次元的な直線状格子構造体であって、ブダハらによる従来技術文献に開示されているＥＲチップとほぼ類似するようにモデル化された格子構造体の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。
図１２Ａ及び１２Ｂは、波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角の関数としての反射効率のグラフをそれぞれ示す。これらのグラフは、Ｘ軸方向へ偏光された光を図１１Ａと図１１Ｂに示す構造体上へ入射させたときに得られたグラフである。
図１３Ａ〜図１３Ｃは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す構造体（Ｚ＝１４０ｎｍ）の下部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。図１３Ｄ〜図１３Ｆは、図１３Ａ〜図１３Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。
図１４Ａ〜図１４Ｃは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す構造体（Ｚ＝１１０ｎｍ）の上部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。図１４Ｄ〜図１４Ｆは、図１４Ａ〜図１４Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。

図１５Ａ及び図１５Ｂは、格子構造中の周期的なホールによって特徴付けられる２次元的格子の形態の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。この場合、該格子構造は、Ｘ軸方向の偏光によって照射されたときの水環境内でのＢＩＮＤ（標識不使用）検出に対して最適化されると共に、Ｙ軸方向の偏光によって照射されたときの空気環境内でのＥＲ検出に対して最適化された構造である。
図１６及び図１７は、Ｙ軸方向の偏光を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体上へ入射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角（６３２．５ｎｍ）の関数としてのグラフをそれぞれ示す。これらの図はＥＲ様式の有用性を例証する。
図１８Ａ〜図１８Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体（Ｚ＝７８ｎｍ）の下部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２．５ｎｍ）。図１８Ｄ〜図１８Ｆは、図１８Ａ〜図１８Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２．５ｎｍ）。

図１９Ａ〜図１９Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体（Ｚ＝４３３ｎｍ）の上部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２．５ｎｍ）。図１９Ｄ〜図１９Ｆは、図１９Ａ〜図１９Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。
図１９Ｇは、Ｘ軸方向の偏光を図１５に示す構造体上へ照射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフを示す。この共鳴ピークは標識を使用しない検出に使用される。
図２０Ａ及び図２０Ｂは、格子構造中の周期的なポストによって特徴付けられる２次元的格子の形態の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。この場合、該格子構造は、Ｘ軸方向の偏光によって照射されたときの水環境内でのＢＩＮＤ（無標識）検出のための１つの方向に対して最適化されると共に、Ｙ軸方向の偏光によって照射されたときの空気環境内でのＥＲ検出に対して最適化された構造である。

図２１Ａ及び図２１Ｂは、Ｙ軸方向の偏光を図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体上へ入射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角（波長：６３３ｎｍ）の関数としてのグラフをそれぞれ示す。これらの図はＥＲ方式の有用性を例証する。
図２２Ａ〜図２２Ｃは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体（Ｚ＝７０ｎｍ）の下部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３３ｎｍ）。図２２Ｄ〜図２２Ｆは、図２２Ａ〜図２２Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３３ｎｍ）。
図２３Ａ〜図２３Ｃは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体（Ｚ＝４３０ｎｍ）の上部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３３ｎｍ）。図２３Ｄ〜図２３Ｆは、図２３Ａ〜図２３Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。

図２４は、Ｘ軸方向の偏光を図２０に示す構造体上へ照射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフを示す。この共鳴ピークは標識を使用しない検出に使用される。
図２５は、ＥＲ方式と標識不使用方式を組み合わせた格子に基づくセンサーに関する画像読取りシステムの模式図である。
図２６は、ＥＲ様式と無標識様式を組み合わせた格子に基づくセンサーに関する第２の画像読取りシステムの模式図である。
図２７は、図２６に示す実施態様のより詳細な模式図である。
図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＥＲ様式と無標識様式を組み合わせたセンサーのさらに別の実施態様における２段型の二次元的格子構造体を示す３種の単位セルの斜視図である。

図２９は、図２８Ａ〜図２８Ｃに示す構造体のコンピュータシミュレーションによって得られた反射スペクトル（反射光の波長の関数としての相対強度）のグラフである。
図３０は、ＥＲとＢＩＮＤを組み合わせた格子に基づくセンサーの断面図である。この場合、ＵＶ−硬化プラスチック製格子層及びセンサーの上部表面を形成する高屈折率層との間には、中間のＳｉＯ_２層が介在する。
図３１は、格子に基づくセンサー（該センサーは、ＥＲ測定とＢＩＮＤ測定の両方に対して最適化させていてもよく、あるいは最適化されていなくてもよい）上に沈着されたスポットの微小配列の画像を示す。
図３２は、センサー上に載置されたＤＮＡ試料の存在に起因する図３１に示すスポットの１つに関するピークシフトを示すグラフである。
図３３は、位置の関数としてのピーク波長値のｎｍ単位のシフト（該シフトはスポット中に含まれるＤＮＡの量と定量的に関連づけられる）及び消失スポト（スポット列の暗い位置）を示すスポット列を表示するグラフである。この場合、消失スポットはグラフの下部領域に示す。

周期的な格子構造を有する格子に基づくバイオセンサーが開示される。該格子構造は、液状環境又は乾燥環境下でのＥＲ検出、及び標識の不存在下での検出の両方に対して最適化されており、これらの検出に対して有用である。該バイオセンサーを用いる用途に適合する読取りシステムも開示される。また、本発明によるバイオセンサーを用いる試料の試験方法も開示される。

第１の実施態様
図４は、格子に基づくセンサーのＥＲ検出と標識不使用検出に対する商業的な要求に適合することが期待される格子構造１００を有する一次元的センサーの第１の実施態様を示す模式的断面図である。図４は、一次元又は一方向に延びる格子構造１００の１つの周期を示す。図４においては、寸法の尺度は一定ではない。図４に示す格子構造１００は積層状態で透明な材質、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）若しくはその他のプラスチック、ガラス又はその他の材質から成る基材シート（図示せず）へ接合される。

格子構造は、周期的に反復される材料１０２から成る。好ましくは、該材料はＵＶ−硬化性材料（例えば、エポキシ）を含有する。該硬化性材料は格子のマスターウェーハ（master wafer）（図示せず）を用いて塗布され、これによって、支持体層の下方に位置するＰＥＴ材料製の基材シート上に格子パターンが複製される。ＵＶ硬化材料１０２はＰＥＴシートのような支持体シート上に適用される。支持体材料はポリカーボネート又は環状オレフィンポリマー、例えば、「ゼアノール（Zeanor）」（登録商標）等も含むことができる。構造化層１０２のその他の製造法には、ポリマー支持体中への直接的な熱的型押法が含まれる。中間材１０４は、スパッター法によって形成される高屈折率を有する酸化物（例えば、ＴｉＯ_２又はＴａ_２Ｏ_５）の被覆層を示す。最上部の材料１０６は、試料用媒体を示す。通常は、該媒体は水性緩衝液（標識不使用検出方式の場合）又は空気（ＥＲ検出方式の場合）である。図４に示すように、この格子構造は周期的な層状構造と水平方向の遷移点を有する。もちろん、図示するデザインの特徴は、標識不使用検出方式とＥＲ検出方式の両方に対して良好な性能を保持した状態で変化させてもよい。

図４に示すデザインの開発とその性能設計は、コンピュータとソフトウェアプログラム「G-Solver」（グレイチング・ソルバー・デベロップメン社、アレン、テキサス；www.gsolver.com）を用いておこなわれた。種々の幾何学的な寸法とパラメーター、間隔、ウェルの深さ、材料及び該材料に関連する屈折率に関するデータを用いることにより、検討すべきデザインをコンピュータ上でおこなうことができ、また、シミュレーションによって透過率対θ曲線及び波長曲線の関数としての反射を予測することができる。このようなシミュレーションは、試料が乾燥状態にある条件下、及び試料が水又は屈折率が既知のその他の液状媒体中に懸濁された条件下でおこなうことができる。このようなシミュレーションにより、デザイナーは、ＥＲ検出方式と標識不使用検出方式の両方に対する要求を満たすように、種々のデザイン上のパラメーター（例えば、厚さ、透過率、及び周期等）を最適化させる（即ち、変化させる）ことができる。

従来のＥＲ技術においては、格子に平行な偏光入射光によって誘発される共鳴方式を採用しており、本明細書においては、該技術をＴＥ方式又は偏光として定義する。標識不使用検出技術においては、一般的には、格子に垂直な偏光入射光によって誘発される共鳴方式を採用しており、本明細書においては、該技術をＴＭ方式又は偏光として定義する。この方式は、試料を液状媒体中へ懸濁させたときに、最も狭い共鳴をもたらす。

図４に示す第１の実施態様においては、格子バイオセンサーのデザインであって、液中へ懸濁させた試料の標識不使用検出及び空気環境下（乾燥環境下）でのＥＲ検出の両方に対してＴＭ偏光を利用する該デザインが記載されている。格子上の媒体を水から空気へ変換することによって、共鳴特性の変化、即ち、標識不使用検出方式に対して有用な共鳴特性から６３３ｎｍでの励起に応答する染料のＥＲ増幅に対して有用な共鳴特性への変化がもたらされる。図４に示すバイオセンサーのデザインは、水中でのＥＲ検出方式に対して特に最適なものではなく、また、水中でのＥＲ方式に対して許容できるように作動しないかもしれない。しかしながら、多くのＥＲ検出アッセイは空気環境下でおこなわれるので、図４に示すデザインはＥＲ検出に対して非常に有用である。

図６は、従来技術によるＥＲ装置「ノヴァチップ」（ノヴァルチス社製）と図４に示す第１のデザイン「コンバインド４００エア（ComBIND 400 Air）」に関するコンピュータによるシミュレーション又はモデルにおける透過率とθとの関係を示すグラフを比較するものである。「ノヴァチップ」に関するデータは次の文献に記載されている：１）ブダッハら、「高感度の蛍光に基づくマイクロアレイ用変換器及び遺伝子発現プロファイリングへの応用」、アナリティカル・ケミストリー、２００３年、及び２）ノイシェファーら、「エバネッセント共鳴器チップ；蛍光に基づくマイクロアレイ用の高感度万能プラットホーム」、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニックス、第１８巻（２００３年）、第４８９頁〜第４９７頁。曲線１１０及び１１２は類似の形状を示しており、このことは、シミュレートされた装置（コムバインド４００エア）がＥＲ装置と同等に機能することを示すものである。ノヴァチップのＴＥ共鳴は、垂直入射から約２度のところで発生する。図４に示す第１のデザインは約３度のところでＴＥ共鳴をもたらす。このθ値の相違は、入射光の角度が調整できることを考慮するならば、非常に小さな相違であると考えられる。この点に関しては、この開示内容の後に記載するセンサー用の読取り／検出装置に関する説明を参照されたい。

図７に示すグラフは、「コムバインド４００エア」デザイン（図４）において、シミュレートされた反射率を波長に対してプロットしたものである。６２８ｎｍ付近に中心が位置する幅広い反射率ピークは、前記の透過率対θ曲線において約３度のところで発生するＥＲ−空気方式に対応する。標識化された「水」に関する狭いピークは、標識不使用検出方式に利用される。この場合、ピーク１１４が非常に鋭いことに注目すべきである。このことは、図４に示すデザインのバイオセンサーが水環境下での標識不使用検出に対して十分に機能することを示す。

標識不使用検出方式による検出過程においては、生物学的分子はＴｉＯ_２被覆層上に付着し、その光学的厚さを効果的に増加させる。この結果、共鳴のピーク波長値（ＰＷＶ）はシフトする。一定量の試料に対するＰＷＶのシフトが大きいほど検出感度はより高くなる。コンピュータによるシミュレーションにおいて格子のデザインを比較するときには、付加的な生物学的物質のシミュレーションは、仮想的な生物学的層を付加するよりも、ＴｉＯ_２層の厚さを増加させることによってモデル化することができる。この方法は、その他の格子デザインの実行においても有効であることが証明された。

図８は、一定量の模擬マス（図４に示すＴｉＯ_２層１０４の厚さを増大させることによってシミュレートされたマス）の添加の前後における水環境中でのＰＷＶをプロットしたグラフを示す。ピークの位置は、標識が存在しないバイオセンサーの操作において予想されるように、高波長側へシフトする。模擬マスに対する波長シフトの比は、本件出願人による市販のバイオセンサーの対応する値と同等である。従って、図４に示す格子は、現在使用されている標識不使用バイオセンサーの格子の場合と同等の標識不使用検出性能をもたらすことが期待される。

要約すれば、図４に示す格子デザインに対する二用途能はシミュレ−ションによって予測される。乾燥条件下においては、該格子デザインは、エバネッセント共鳴（ＥＲ）として知られている技術に従って、蛍光性の結合信号を増幅させることができる。湿潤条件下においては、格子は、導波モード共鳴検出として知られている技術による標識不使用検出器、又は本件出願の譲受人であるＳＲＵバイオシステムズ社の市販品「バインド（ＢＩＮＤ）」（ＳＲＵバイオシステムズ社の商標）としても機能する。

第２の実施態様
図５は第２の実施態様の模式的断面図である。この図においては、一次元の格子構造の１つの周期並びにＵＶ硬化層１０２、高屈折率層１０４及び試料媒体１０６の構造を示す。この図には寸法と遷移点も示すが、寸法の目盛りは示さない。図５に示すデザインは、図４に示すデザインに比べて、いくつかの点で相違する。
ａ）格子の周期がより短い。
ｂ）格子の溝又は窪みがより狭い。図５における装荷率（duty cycle）（単位セル中の上部面における格子の百分率）は８８％である（０〜０．８５及び０．９７〜１．０）。装荷率が７０％〜９５％の狭い溝は、狭い溝の実施態様の例示である。一般的には、狭い溝は良好な標識不存在下での検出結果をもたらす。狭い溝の特徴は、ＴＥ共鳴ピークの幅を狭めることであり、このことは場の強度を高めることを示す。ＥＲ効果の実用的な用途に対しては十分に広い共鳴が必要であるが、過度に広い共鳴は、有用な蛍光信号の増幅をもたらすには不十分な場の強度を示す。
ｃ）半周期に対する格子深さの比は１：１である。

図５に示すデザインは、水又は緩衝液の環境下での標識不存在下での操作及びＥＲ操作の両方を可能にする一次元的センサーを例示する。この点は、図４に示すデザイン、即ち、空気中でのＥＲ操作及び水中での標識不存在下での操作のためのデザインとは対照的である。図９のグラフは、図５に示すデザインに関する水環境下におけるＥＲ（ＴＥ偏光）スペクトル共鳴特性と比較的狭い標識不存在（ＴＭ偏光）スペクトル共鳴特性を示す。このグラフは、図５に示す実施態様のコンピュータシミュレーションから得られたものである。

図１０のグラフは、図５に示すデザイン（「コムバインド ３７０」）に関するＴＥ角共鳴（励起波長：６３３ｎｍ）を従来技術による「ノヴァチップ」の場合と比較するものである。この場合、シミュレートされた最小透過率１１６は、入射角が５度未満のときに出現し、この値は、現存するノヴァチップＥＲ装置の場合に近接する。入射角、周期、励起波長、高屈折率材料の厚さ、格子の装荷率、及び格子の深さは全て相互に関連する。市販の蛍光体の励起波長は知られており、検討することができる。２５度未満の入射角は許容されるべきであるが、垂直に近い角度（θは０に近い）が好ましい。角度と波長を狭い範囲に制限することにより、機能的で商業上有用なＥＲ性能と標識不使用性能を備えた格子を設計するためには、標識不使用検出の用途に対しては、格子の周期、装荷率及び深さ、並びに質量付着に応答して大きなＰＷＶシフトをもたらす高屈折率材料の厚さを決定しなければ成らず、また、ＥＲ方式に対しては、特定の蛍光体又は染料の励起波長における高い表面場を決定しなければならない。

さらに、このデザインによって、できるだけ狭いスペクトル幅を伴う標識不使用下での共鳴がもたらされると共に、測定用の実用的パラメーターのウィンドウ（window）をもたらすのに十分な角度幅を伴うＥＲ共鳴が維持されるようにしなければならない。このデザインに相殺性能を組み入れてもよい。例えば、ＥＲ性能の最適化には、信号の増幅をもたらす場の強度とセンサー、測定器及びアッセイの変数の許容範囲との間で相殺がおこなわれる。一般的には、より狭いＥＲ共鳴はより高い場の強度を示し、より広いＥＲ共鳴は高い測定許容度をもたらす。典型的には、標識不使用性能とＥＲ性能の最適化には、標識不使用性能を高める格子の深さとＥＲ共鳴幅との間の別の相殺が含まれる。例えば、図５に示すデザインの場合、格子の深さの増大により、ＴＥ／ＥＲ共鳴幅は最適幅を超えて広くなる。装荷率の増大（溝を狭くすることに対応する）により、共鳴は最適値に向けて狭くなり、ＥＲの場の強度は保持される。

従って、ＥＲ検出方式と標識不使用検出方式の両方に適用される二用途格子構造を見出すための１つの好ましい方策には、半周期に対する深さの比が約０．６から約１．２又はこれよりも大きな値の範囲にある格子であって、所望の励起波長（例えば、６３３ｎｍ）と２５度未満の共鳴角の条件下において空気環境下でのＴＭ方式、空気環境下でのＴＥ方式又は水環境下でのＴＥ方式において広い角共鳴をもたらす格子を見出すことが含まれる。好ましくは、この広い共鳴は１度〜１０度の角度幅を有し、５ｎｍ〜３０ｎｍのスペクトル幅を有する。このようなデザインを得るための操作は、コンピュータ内において、例えば「Ｇソルバー・ソフトウェア」を使用することによって容易に実行することができる。より直接的には、「Ｒ−ソフト」（Ｒソフト・デザイン・グループ社の市販品；www. rsoftdesigngroup.com）のようなソフトウェアを使用することによって、格子表面上において場の強度を比較的容易にモデル化することができる。

１００ｎｍ〜６００ｎｍの格子の深さ及び３００ｎｍ〜６００ｎｍの格子の周期は例示的な値である。本発明の開示内容の利点を理解する当業者であれば、潜在的に使用可能な格子のデザインをコンピュータ上においてモデル化し、本発明による適当なデザインに到達することができる。

二次元的格子
ＥＲ方式と標識不使用方式の両方に対して適した二次元的（２−Ｄ）格子構造の可能性も考慮することができ、このような構造は好ましいものである。二次元的格子は、二次元において高い領域と低い領域が交互に配列されたチェス盤、ワッフル（ホール）又はワッフル焼き型（ポスト）のような形態を有する。二次元的格子は、Ｘ方向とＹ方向において異なる周期を有する。このような特徴を有する格子はＺ方向において種々の側面（例えば、段状側面又は湾曲状側面等）を有する。ワッフル状パターンの場合、窪み又はウェルは正方形の形態よりも長方形の形態を有していてもよい。これによって付与される可撓性に基づいて、標識不使用検出方式及びＥＲ検出方式に対する共鳴位置が異なる波長において発生するように調整することができる。また、この可撓性は、ＥＲ共鳴を異なる励起波長に対して発生するように調整することができると共に、現存する標識不使用検出の計測系との適合性を維持することができるという重要な利点をもたらす。例えば、Ｘ方向の周期性は、ＣＹ３蛍光体（緑色光）又はＣＹ５蛍光体（赤色光）を励起するように調整される波長を有する垂直入射角又はこれに近い入射角における共鳴をもたらし、Ｙ方向の周期性は、８２０ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲（近赤外領域）に固定される共鳴をもたらす。

本明細書に記載の２−Ｄバイオセンサーの構造例は、市販のソフトウェアパッケージ（Ｒソフト社製）を用いるコンピュータシミュレーションと厳密結合波分析（ＲＣＷＡ；Rigorous Coupled Wave Analysis）によって開発されたものである。装置のデザイナーはこのコンピュータシミュレーションを用いることにより、装置の物理的パラメーター（屈折率、厚さ、幅、高さ、構造形態）を変化させることによって、１）装置の内部及び周辺部における電磁場分布、２）光の入射角と波長の関数としての反射率又は透過率の挙動、及び３）バイオセンサーの表面上への生体分子の付着による反射スペクトル又は透過スペクトルの変化挙動を決定することができる。

本明細書に記載の２−Ｄバイオセンサ−の特定の実施態様は、単一の装置内においてＢＩＮＤ法とＥＲ法との併用検出法に対して最適化される。この場合、バイオセンサーは、ＢＩＮＤ測定中は水と接触し、ＥＲ測定中においては空気と接触する。ＢＩＮＤ法とＥＲ法に対する乾式法と湿式法のいずれの組合せ方式も同様にして最適化させることができる。例えば、ＢＩＮＤ法による測定とＥＲ法による測定の両方を湿式方式によっておこなうことができる。

ＥＲ法とＢＩＮＤ法（標識不使用法）を組み合わせた二次元的装置によってもたらされる利点をさらに詳細に評価するために、最初に、ＥＲのみに対して最適化された線状（一次元的）構造に関する図１１〜図１４に基づいて説明する。最初に、ＥＲのみの構造に関してシミュレーションをおこなった。この構造は、ブダハらによって公表されている従来のＥＲチップにほぼ対応するもので、これに関しては次の文献を参照されたい：「蛍光に基づく高感度マイクロアレイ用タイプの変換器及び該変換器の遺伝子発現プロファイリングへの応用」、Anal. Chem.、第７５巻（２００３年）、第２５７１頁〜第２５７７頁。ブダッハらによる格子は線状格子であり、本明細書で用いる用語によれば、１−Ｄ構造である。ブダッハらによる文献に記載されている比較的厚いＴａ_２Ｏ_５層に比べて薄い高屈折率材料（ＴｉＯ_２）層（図１１Ａ及び図１１Ｂ）は、この２種の材料の異なる屈折率を考慮することにより、等価な光学的厚さを有する装置をもたらす。図１１Ａ及び図１１Ｂに示すモデルはブダッハらによるものを正確に複製したものでなないが、ほぼこれに対応する。

Ｃｙ５染料のＥＲ強化用の代表的な装置に対する角度と波長の関数としての反射率及び電磁場分布を決定するためにシミュレーションをおこなった。原則的には、図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＥＲ検出のみのために設計された一次元的な線状格子構造の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。図示するように、この構造は、３０ｎｍ隆起したリッジ２０１及び該リッジを被覆するＴｉＯ_２層２０３（厚さ：１１０ｎｍ）から成る線状の格子状側面を有する。周期性は、Ｙ方向において３５６ｎｍ毎に繰り返すリッジ２０１である。

図１２Ａ及び図１２Ｂは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す構造における波長の関数としての反射効率及び入射角の関数としての反射効率をそれぞれ示すグラフである。これらのグラフはＲＣＷＡによって測定したデータに基づく。垂直入射の場合には、ピーク波長（図１２Ａにおける６３２ｎｍ）はＣｙ５の励起波長に対応し、また、入射光を格子のライン又はリッジ２０１に関して平行な方向に回転させるときには、６３２ｎｍの波長における高い反射効率を伴う広い範囲の角度が存在する（図１２Ｂ）。

図１３Ａ〜図１３Ｃは、図１０Ａ及び図１０Ｂに示す構造の下部表面に対応するＸＹ面内の電界強度のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（Ｚ＝１１０ｎｍ、入射波長：６３２ｎｍ）。図１３Ｄ〜図１３Ｆは、図１３Ａ〜図１３Ｃに示す同じＸＹ面における磁界強度のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。

図１３のプロットは、装置の下部の暴露表面上のＸＹ面内の位置の関数としての電界ベクトルの３つの成分（Ｅｘ、Ｅｙ及びＥｚ）及び磁界ベクトルの３つの成分（Ｈｘ、Ｈｙ及びＨｚ）の強度を示す。この場合、構造２００の上部の暴露部分は陰影で表示されている。これは、上部表面が、下部表面とは異なる水平面内に位置するからである。コンピュータによるシミュレーションにおいては、センサーには、共鳴波長において１Ｖ／ｍの電界の大きさ及び１Ａ／ｍの磁界の大きさを有する光源からの光が照射される。従って、１よりも大きな場の強度の値は、共鳴から得られるセンサー表面における場の強度の濃度を示す。電磁場の力は、ＥとＨの場の成分のクロス乗積によって計算される。構造体の表面上の所定の位置における場の力は、センサーの表面に接合された蛍光体を励起させるために利用できるエネルギーを規定する。理論的には、この力が強いほど、より強い蛍光発光がもたらされる。図中に示すプロットは、電場と磁場（従って、場の力）が構造体の表面上に均等に分布しないことを示す。しかしながら、平均的な力よりも大きな力を示す場所（カラー図面の２０２において示される赤色とオレンジ色の領域）及び平均的な力よりも小さな力を示す場所（カラー図面の２０４において示される紫色又は青色の領域）が存在する。

図１４Ａ〜図１４Ｃは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す構造体の上部表面に対応するＸＹ面内の電界強度のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（Ｚ＝１４０ｎｍ、入射波長：６３２ｎｍ）。図１４Ｄ〜図１４Ｆは、図１４Ａ〜図１４Ｃに示す同じＸＹ面における磁界強度のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。

図１４のプロットは、装置の上部の暴露表面上のＸＹ面内の位置の関数としての電界ベクトルの３つの成分（Ｅｘ、Ｅｙ及びＥｚ）及び磁界ベクトルの３つの成分（Ｈｘ、Ｈｙ及びＨｚ）の強度を示す。この場合、２００において示されるように、構造体の下部の暴露部分は陰影で表示されている。これは、上部表面が、下部表面とは異なる水平面内に位置するからである。図１３のプロットの場合のように、コンピュータによるシミュレーションにおいては、センサーには、共鳴波長において１Ｖ／ｍの電界の大きさ及び１Ａ／ｍの磁界の大きさを有する光源からの光が照射される。従って、１よりも大きな場の強度の値は、共鳴から得られるセンサー表面における場の強度の濃度を示す。前記のように、ＥとＨの場の成分のクロス乗積は、蛍光体を励起させるために利用できる共鳴波長における瞬間的な力の分布を示す。

Ａ．ホールの実施態様例
複合バイオセンサーの２−Ｄ「ホール（hole）」の実施態様の特定の実施例を図１５〜図１９に基づいて説明する。このセンサーは、単一の装置を用いるＥＲ方式と標識不使用方式（ＢＩＮＤ）の両方による検出に対して最適化されるように二次元的に設計されたものである。

図１５Ａ及び図１５Ｂは、格子構造における周期的なホール２１０によって特徴付けられる二次元的な格子デザイン用の単位セルの斜視図及び断面図をそれぞれ示す。この格子デザインは、水環境下でのＢＩＮＤ（標識不使用）方式による検出及び空気環境下でのＥＲ方式による検出に対して最適化されている。この装置は、上部のＴｉＯ_２層１０４（厚さ：７８ｎｍ）、及び基材の支持体シート上へ適用された格子パターンを有するＵＶ硬化材料製の下部の支持体層１０２を含む。

図１５Ａ及び図１５Ｂに示す二次元的な単位セルは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す一次元的な線状格子デザインとは相違する。図１５Ａと図１５Ｂに示す構造体は、図示するように、Ｘ軸に対して垂直方向に偏光された入射光がＢＩＮＤ信号を発生すると共に、Ｙ軸に対して垂直方向に偏光された入射光がＥＲ測定を可能にするように設計されている。この設計方法を使用することによって、特定の入射角（好ましくは垂直に近い入射角）におけるＢＩＮＤとＥＲの共鳴波長は相互に独立して選定してもよいので、ＢＩＮＤとＥＲの各々の共鳴波長は非常に異なる値であってもよい。この実施態様において記載したＢＩＮＤとＥＲの組合せ構造を最適化することによって、近赤外波長（約８００〜９００ｎｍ）領域においてＢＩＮＤ共鳴を発生させると共に、ＥＲ共鳴は、Ｃｙ５蛍光体を励起させるための６３２．５ｎｍにおいて発生させることができる。この実施例におけるデザインは、ＢＩＮＤ測定中におけるセンサー上の環境としては水を想定しており、また、ＥＲ測定中におけるセンサー上の環境としては空気を想定している。

ＥＲとＢＩＮＤに対して異なる波長が要求される場合には、矩形状の「ホール」（２１０）を有する単位セル（unit cell）が選択される。従って、この単位セルはＸ方向とＹ方向において異なる寸法を有する。例えば、ＢＩＮＤ波長に対するＸ方向の周期は５５０ｎｍであるが、低波長のＥＲ共鳴に対して必要とされるＹ方向の周期は４３２ｎｍである。製造法によって、高屈折率の誘電体の厚さをＸ方向とＹ方向において同一にすることができる。製造法を簡単化するためには、このデザインも均一な格子深さを有するようにする。また、この製造法はホールの角に丸みをもたらすが、デザインの主要な機能は維持される。当業者であれば次のことを理解することができる。即ち、図１５Ａと図１５Ｂに示すようなデザインをコンピュータを用いて創作して該デザインを試験する場合、デザイナーは単位セル、格子の深さ及び被覆層の特定の寸法を変化させることによって、場の強度、ピーク波長、θの関数としての反射率及びその他の試験のシミュレーションを実行し、また、許容される結果を達成すると共に、その他の寸法を選択してもよい。従って、図１５Ａと図１５Ｂに示す実施例は例示的な実施態様であって、本発明の範囲を限定するものではない。

図１６及び図１７は、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造に対する波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角の関数としての反射効率のグラフをそれぞれ示す。この場合、光照射は、Ｙ軸に沿って偏光された光を用いておこなった。これらのグラフはＲＣＷＡによって作成したものであって、ＥＲ方式における操作を示す。図１７は、共鳴波長における入射角の関数としての反射強度が、有意なＥＲ効果を誘発する光に対して許容される角度をもたらすことを示す。物理的測定においては、図１６に示すプロットにおけるピーク間の伏角と二重ピークは分割しない。

上述の１Ｄ実施例の場合と類似の方法により、ＲＣＷＡによる計算を使用することによって、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造に対するＥＲ共鳴波長における電界成分（Ｅｘ、Ｅｙ及びＥｚ）及び磁界成分（Ｈｘ、Ｈｙ及びＨｚ）の振幅の空間的分布を決定してもよい。図１８Ａ〜図１８Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体の下部表面に対応するＸＹ面内の電界強度のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（Ｚ＝７８ｎｍ；入射波長＝６３２．５ｎｍ）。図１８Ｄ〜図１８Ｆは、図１８Ａ〜図１８Ｃに示すＸＹ面内の磁界強度のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長＝６３２．５ｎｍ）。これらの電界と磁界の振幅の分布は、Ｘ方向とＹ方向において反復する単位セルのホール内の下部のＴｉＯ_２表面に対する分布である。前述のように、電界と磁界の成分ＥとＨのクロス乗積は、下部表面における蛍光励起に起因する瞬間的な電流密度分布を示す。１Ｖ／ｍの電界と１Ａ／ｍの磁界における共鳴波長での平面波を照射源として使用した。

同様にして、単位セルの上部のＴｉＯ_２表面に対する電界と磁界の分布を計算することができる。図１９Ａ〜図１９Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体の上部表面に対応するＸＹ面内の電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（Ｚ＝４３３ｎｍ；入射波長＝６３２．５ｎｍ）。図１９Ｄ〜図１９Ｆは、図１９Ａ〜図１９Ｃに示す同じＸＹ面内の磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長＝６３２ｎｍ）。これらのプロットの説明文に示すように、各々の場の成分の最大振幅が、従来技術によるデザインの場合に比べて実質上大きいことに注目すべきである。このことは、より大きな電流密度がこの装置の表面上で得られることを示す。特に、従来技術による１ＤデザインのＥｚ振幅とは対照的に、実質的に大きなＥｚ成分が出現するということに注目すべきである。

図１９Ｇは、Ｘ軸に対して平行に偏光された入射光を用いてモデル化された波長の関数としてプロットした反射効率を示す。図１５に示すデザインの構造体上へ入射するＸ軸に関する偏光は、標識を使用しない検出に対して有用な共鳴であって、最大値が８３０ｎｍ付近に現れる幅が約１２．５ｎｍの共鳴を発生させる。シミュレーションによって、バルクの屈折率のシフト係数を予測することができる。この係数はδ（ＰＷＶ）／δ（ｎ）によって定義される。ここで、δ（ＰＷＶ）は、センサーの上方の環境中の屈折率の変化δ（ｎ）によって誘発されるピーク波長値のシフトを示す。この数量は、格子表面上への試料の結合に関するセンサーの感度を示す。図１５Ａと図１５Ｂに示す「ホール」デザインの構造体の予測されたバルクの屈折率のシフト係数は２００であり、このことは該構造体が、標識を使用しない高感度性能をもたらすことを示す。

Ｂ．ポスト実施態様の実施例
ポスト（post）によって特徴付けられる反復単位セルを用いる二次元的格子構造について、図２０〜図２４に基づいて説明する。図２０Ａ及び図２０Ｂは、センサーの表面上に形成された周期的なポスト２２０によって特徴付けられる二次元的格子デザインを有する単位セルの斜視図及び断面図をそれぞれ示す。各々の単位セルは１つのポスト２２０を有する。ポスト２２０は、基材シート（図示せず）上に塗布された支持体材料１０３（例えば、ＵＶ硬化ポリマー）内に隆起した突起である。これらの図に示すように、高い屈折率を有する被覆層（例えば、ＴｉＯ_２）が該突起と支持体上に形成される。図示される構造体は、Ｘ方向に偏光された光を用いる水環境下でのＢＩＮＤ（標識不使用）検出方式、及びＹ方向に偏光された光を用いる空気環境下でのＥＲ検出方式に対して最適化されている。

図２０に示すデザインについて、ＲＣＷＡコンピュータシミュレーションを用いて検討した。図１５に示す前述の構造体の単位セルは、Ｚ方向においてより高い面における領域によって包囲された「ホール」領域を含んでいるが、図２０に示す格子構造体は、Ｚ方向においてより低い面における領域によって包囲された中央部の「ポスト」領域を含む。上述のように、図２０に示すデザインは、ＢＩＮＤ／ＥＲ組合せ構造体であって、近赤外波長領域（約８００〜９００ｎｍ）においてＢＩＮＤ共鳴をもたらすと共に、Ｃｙ５蛍光体を励起させる６３２ｎｍにおいてＥＲをもたらすように最適化された構造体である。この実施例においても、当該デザインは、ＢＩＮＤ測定中におけるセンサー上の水環境、及びＥＲ測定中のセンサー上の空気環境を想定している。ＥＲとＢＩＮＤに対するこれらの異なる波長に関する要求を満たすために、矩形状の「ポスト」状単位セルが選択された。従って、この単位セルはＸ方向とＹ方向において異なる寸法を有していてもよい。例えば、ＢＩＮＤ波長に関しては、Ｘ方向の周期は５３０ｎｍとし、より低波長のＥＲ共鳴に対して要求されるＹ方向の周期は４１４ｎｍにしてもよい。製造法によって、高屈折率の誘電体の厚さをＸ方向とＹ方向において同一にすることができる。製造法を簡単化するためには、このデザインも均一な格子深さを有するようにする。また、この製造法はポストの角に丸みをもたせてもよいが、デザインの主要な機能は維持される。図２０に示す実施例は例示的な実施態様であって、本発明の範囲を限定するものではない。もちろん、特定の寸法は変化させることができる。

図２１Ａ及び図２１Ｂは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造に対する波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角の関数としての反射効率のグラフをそれぞれ示す。この場合、光照射は、Ｙ軸に沿って偏光された光を用いておこなった。これらのグラフはＲＣＷＡによって作成したものであって、ＥＲ方式における操作を示す。図２１Ａは、６３３ｎｍにおける共鳴ピークの最大反射を示し、また、図２１Ｂは、６３３ｎｍで照射したときの入射角の範囲にわたる共鳴を示す。

ＲＣＷＡコンピュータシミュレーションを使用することによって、ＥＲ共鳴波長における電界成分（Ｅｘ、Ｅｙ及びＥｚ）及び磁界成分（Ｈｘ、Ｈｙ及びＨｚ）の振幅の空間的分布を決定してもよい。図２２Ａ〜図２２Ｃは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体の下部表面に対応するＸＹ面内の電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（Ｚ＝７０ｎｍ；入射波長＝６３３ｎｍ）。図２２Ｄ〜図２２Ｆは、図２２Ａ〜図２２Ｃに示す同じＸＹ面内の磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長＝６３３ｎｍ）。図２２に示すように、これらの電界と磁界の振幅の分布は、Ｘ方向とＹ方向において反復する単位セルのポストを包囲する下部表面に対する分布である。前述のように、電界と磁界の成分ＥとＨのクロス乗積は、下部表面における蛍光励起に起因する瞬間的な電流密度分布を示す。１Ｖ／ｍの電界と１Ａ／ｍの磁界における共鳴波長での平面波を照射源として使用した。

同様にして、単位セルの上部のＴｉＯ_２表面に対する電界と磁界の分布を計算することができる。図２３Ａ〜図２３Ｃは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体の上部表面に対応するＸＹ面内の電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（Ｚ＝４３０ｎｍ；入射波長＝６３３ｎｍ）。図２３Ｄ〜図２３Ｆは、図２３Ａ〜図２３Ｃに示す同じＸＹ面内の磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長＝６３２ｎｍ）。各々の場の成分の最大振幅が、従来技術によるデザイン（図１０）の場合に比べて、各々の場の成分に対して実質上大きいことに注目すべきである。このことは、潜在的により大きな電流密度がこの装置の表面上で得られることを示す。

図２４は、Ｘ軸に対して平行に偏光された入射光を用いてモデル化された反射効率を示す。図１５に示すデザインの構造体上へ入射するＸ軸に関する偏光は、標識不使用検出方式に対して有用な共鳴であって、反射の最大値が８０５ｎｍ付近に現れる幅が約８ｎｍの共鳴を発生させる。このシミュレーションによってもたらされる前述のシフト係数は９０である。図２０に示す実施態様においても、図１５に示す実施態様の場合よりは低いかもしれないが、標識を使用しない高感度性能がもたらされることが期待される。２種類の２Ｄデザインに関する振幅値とシフト係数を比較することにより、次のことが提案される。即ち、格子構造体のさらなる最適化によって、一方の検出方式の性能は他方の検出方式における低い性能を相殺する。

ＥＲ検出の増幅量は、蛍光体の励起波長内において、装置の構造からセンサー表面上に分布される蛍光体へ移動する電力に関連する。共鳴波長が励起波長の範囲内にあるという条件下においては、共鳴波長におけるセンサー表面上の出力密度分布は、異なるデザインのＥＲ装置の感度を比較する手段をもたらす。場の力（field power）又は「増幅因子（magnification factor）」として、クロス乗積Ｅ（max）×Ｈ（max）を定義することができる。構造体の上部、底部及び側部からのエバネッセント場の強度分布のより厳密な分析、及び高出力領域と低出力領域との間の差を明らかにするための出力密度の詳細な積分によれば、一方の装置が他方の装置よりも効率的に機能するかどうかということをより正確に予測することができ、また、Ｅ成分の最大振幅と垂直なＨ成分との積によって、デザインを比較するための非常に簡単で大雑把な方法がもたらされる。装置の露出された上部面と下部面に関するＲＣＷＡ分析によれば、図１１Ａと図１１Ｂに示す従来技術によるデザインについてのＥ×Ｈ増幅因子は１４４であった。一方、図１５Ａと図１５Ｂに示す「ホール」型の単位セルについてのＥ×Ｈ増幅因子は６２１７であり、また、図２０Ａと図２０Ｂに示す「ポスト」型の単位セルについてのＥ×Ｈ増幅因子は５１８０であった。この大雑把な分析に基づけば、図１５と図２０に示すデザインの２Ｄ格子のＥＲ方式によって、図１０に示すデザインの線状格子よりも潜在的により高い感度のＥＲ性能がもたらされる。さらに、コンピュータシミュレーションに基づくことにより、図１５と図２０に示すデザインによれば、前述のように、標識不使用検出方式に対して優れた感度がもたらされることが期待される。従って、単一の装置内におけるＥＲ検出方式と標識不使用検出方式の有用な組合せは、上述の２Ｄ格子の実施態様によって達成される。

Ｃ．二段型の２−Ｄ格子
図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＥＲと標識不使用（ＢＩＮＤ）の組合せ検出用に設計されて製造されたバイオセンサー用の単位セル５００の別の実施態様を示す３つの斜視図である。この構造のいくつかの特徴を理解するためには、エバネッセント共鳴（ＥＲ）センサーと標識不使用（ＢＩＮＤ）センサーに適合したデザインの観点について概括することが有用である。この種のセンサーは３つの基本的なデザインの観点、即ち、共鳴波長、共鳴幅及び格子の深さの観点から相違する。

共鳴波長
ＥＲセンサーは、励起波長の数（約＋／−２）ｎｍ内で共鳴を発生することが好ましい。励起光が一般的にレーザーから発生されてその帯域が非常に狭い場合には、この要件は、ＥＲ共鳴の波長位置に関して高い特異性となる。操作のＢＩＮＤ方式にはこの制限がないので、別の波長（例えば、外部の周辺光の波長の範囲）で共鳴するという利点があり、また、ＢＩＮＤ信号をＥＲ励起源からスペクトル的に分離させることによって潜在的な検出の重なりによる矛盾を回避することができる。

共鳴幅
ＥＲセンサーは、可変因子（例えば、生物学的被覆物の厚さ及び照射の開口数）の存在下で励起波長に重なるのに十分な共鳴幅を有していなければならない。実際上は、ＥＲ共鳴は、約５ｎｍ未満、より好ましくは１０〜１５ｎｍ未満の半値全幅（ＦＷＨＭ）を有しているべきではない。一方、ピークの幅が狭くなるとピーク位置の不確定性が低減するので、ＢＩＮＤの感度は約１／sqrt（ＦＷＨＭ）増大する。

格子深さ
ＢＩＮＤセンサーは、格子上により多くの生物学的物質が付着すると、より大きな共鳴波長シフトを示す。より深い格子は、生物学的物質の結合に対して、より大きな表面積を提供する。ＥＲの格子深さが深くなると、ＥＲ効果は必ずしも改善されず、低減するかもしれない。

先に説明した２−Ｄデザインの格子の深さ（例えば、ポストの実施態様の場合のポストの高さ、または、ホールの実施態様の場合のホールの深さ）は均一である。単一の格子深さを選択することには、ピーク幅と表面積の両方に関するＢＩＮＤとＥＲ性能の妥協（即ち、ＢＩＮＤのＰＷＶシフト）が含まれる。

図２８Ａ〜図２８Ｃに示すバイオセンサーのデザインは、二段型の二次元デザインである。このデザインの特性については、以下において詳述する。このデザインは、狭いＴＭ ＢＩＮＤ共鳴と高いＢＩＮＤシフト性能を保持すると共に、より広いＴＥ ＥＲ共鳴をもたらす。先に説明した二次元的デザインの場合と同様に、ＢＩＮＤ格子とＥＲ格子は異なる周期を有することができるので、相互に独立して決定される共鳴波長を有することができる。

図２８Ａ〜図２８Ｃに示す「二段型」の「comＢＩＮＤ」は多数の反復単位セル５００を含んでおり、各々の単位セルにおいては、Ｘ方向に延びる比較的浅いＥＲ格子５０２が、Ｙ方向に延びる比較的深いＢＩＮＤ格子５０４に積み重ねられる。図２８Ａ〜図２８Ｃは、このデザインの１つの「単位セル」５００を示しており、該単位セルをＸＹ面上で複製させることによって完全な格子が形成される。

単位セル５００はＵＶ硬化ポリマー層５２４から成り、該ポリマー層はマスター格子ウェーハを用いて基材支持体シート、例えば、ＰＥＴフィルム（図示せず）上に塗布される。ポリマー層５２４はＢＩＮＤ格子５０４の構造、即ち、底部領域と高部領域がＹ方向に交互に延びた構造を有する。Ｘ方向においても、格子は交互に延びる低部領域と高部領域を有するが、Ｘ方向におけるＵＶ硬化ポリマー５２４の低部領域に対する高領域の相対的な高さは、Ｙ方向における場合よりも低い。

ＵＶ硬化ポリマー層上にはＴｉＯ_２又はＳｉＯ_２若しくはＴａ_２Ｏ_５の層５２２が沈着される。図示する実施態様においては、この層は均一な厚さを有する。層５２２は上部の反復表面５０６、５０８、５１０及び５１２並びに下部の反復表面５１４、５１６、５１８及び５１９を有する。下部の反復表面５１４、５１６、５１８及び５１９はＵＶ硬化ポリマー層の上部表面上に配置される。空気又は水の試料媒体５２０は、ＴｉＯ_２又はＳｉＯ_２若しくはＴａ_２Ｏ_５の層５２２の上部の反復表面５０６、５０８、５１０及び５１２上に接触して存在させる。

図２８Ａ〜図２８Ｃから理解されるように、二段型の二次元的格子構造体は、Ｙ方向に延びた比較的深いＢＩＮＤ格子５０４であって、上部の表面５０６／５０８と下部の表面５１０／５１２によって特徴付けられる該格子を具備する。従って、単位格子のＢＩＮＤの観点によれば、より多くの試料物質を付与してより多くの物質を格子に付着させることによって、より大きな共鳴シフトをもたらすことができる。ＢＩＮＤ（Ｙ方向）における格子の深さが深いほど、生物学的物質を結合させるための表面積はより大きくなる。

逆に、Ｘ方向に延びるＥＲ格子５０２は、高部領域５０６と低部領域５０８並びに高部領域５１０と低部領域５１２を含む比較的狭い格子パターンから成る。この格子は良好なＢＩＮＤ検出能をもたらすことに加えて、同時に、最適な幅を有する広いＴＥ ＥＲ共鳴をもたらす。

図２８Ａ〜図２８Ｃに示すデザインの明らかな利点は、ＥＲ構造体とＢＩＮＤ構造体が相互に独立して作動することである。ＥＲ検出とＢＩＮＤ検出のそれぞれに対して最適化された構造の寸法は、図２８Ａ〜図２８Ｃに示すＥＲ／ＢＩＮＤセンサーの組合せに対しても適合すべきである。図２８Ａ〜図２８Ｃに示す単位セルを有する構造体の特定の寸法はもちろん可変的であるが、１つの代表的な実施態様においては、ＢＩＮＤ格子５０４の周期は約２６０ｎｍ〜約１５００ｎｍであり、また該格子の深さ（表面５０６と表面５１０との間の距離）は１００ｎｍ〜約３０００ｎｍである。ＥＲ格子５０２においては、周期は約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍであり、また深さ（表面５０６と表面５０８との間のＺ方向の距離及び表面５１０と表面５１２との間のＺ方向の距離）は１０ｎｍ〜約３００ｎｍである。

図２８Ａ〜図２８Ｃに示す構造体のコンピュータによるシミュレーションを、ＲＣＷＡを用いておこない、ＥＲ格子構造をＸ方向に加える場合と加えない場合におけるシミュレート化反射スペクトルを得た。図２９は、Ｘ方向にＥＲ格子５０２を含まない場合のＢＩＮＤ格子スペクトル（曲線５９２）及びＥＲ格子とＢＩＮＤ格子が組み合わされた格子スペクトル（曲線５９０）を示す。両方のスペクトルのシミュレーションには、バイオセンサーの表面上の水が含まれる。ＢＩＮＤ格子上へＥＲ格子を加えた場合のスペクトル（曲線５９０）においては、ＣＹ５蛍光体のＥＲ励起に対して適当な幅と位置を有する付加的な共鳴ピーク（６００及び６０２）が出現する。ＥＲ格子５０２（図２８Ａ〜図２８Ｃ）及び曲線５９０は全表面積を増大させるので、ＢＩＮＤシフトの改良の可能性をもたらす。ＢＩＮＤピーク波長値は図２９におけるピーク６０６及び６０４に示す。

抑制剤を使用するＥＲ＋ＢＩＮＤバイオセンサーに対する別の用途
以下に説明する抑制剤結合シナリオについて検討した。次式に示すように、このシナリオにおいては、被検出物（例えば、タンパク質）の一部を格子の支持体（標識不存在）上へ直接結合させ、タンパク質の別の一部を、蛍光性標識を有する抑制剤へ結合させる。式中、Ｋ_ｓ及びＫ_ｉは支持体及び抑制剤に対する平衡結合定数をそれぞれ示す。

上記の典型的な抑制剤結合シナリオにおいては、濃度と平衡結合定数（Ｋ）に関する値と関係式を規定する下記の数学的方程式（１）及び（２）を定立することができる。

Ｋ_ｓ＝［タンパク質〜支持体］／［タンパク質］×［支持体] （１）
Ｋ_ｉ＝［タンパク質〜抑制剤］／［タンパク質］×［抑制剤] （２）

上記の２つの方程式を組合せて書き直すことによって、支持体へ結合した一部のタンパク質に関しては、容易に次の方程式を得ることができる：

式中、Ｘ＝（Ｋ_ｓ＋（Ｋ_ｓ／Ｋ_ｉ）^＊Ｉ＋Ｓ＋Ｐ）であり、Ｋ_ｉは抑制剤結合定数を示し、Ｋ_ｓは支持体結合定数を示し、また、Ｐ、Ｓ及びＩはタンパク質、支持体及び抑制剤をそれぞれ示す。

新たな抑制剤に対する試験反応の準備に際しては、一般にオペレーターは結合した支持体の量のみを、例えば蛍光性標識を用いることによって測定するが、同時に抑制剤リガンドの結合性又はＫ_ｉを直接的に定量化することはできず、該結合性は推論される。本明細書に開示されるＥＲと標識不使用方式が組み合わされたバイオセンサーによって提供される２つの相互に独立した定量化法と簡単な試験を実行することによって、上記の結合シナリオに関する全ての変数の値を知ることができる。換言すれば、このような結合特性のより完全な理解と特性決定は、本発明によるＥＲ／標識不存在センサーを用いる単一の試験法を実行することによっておこなうことができる。

蛍光性標識は格子の支持体表面上に存在させることができ、あるいは抑制剤上に存在させることができる。このことは、支持体と抑制剤のいずれか一方には標識を含めないことができるということを意味する。好ましい実施態様においては、第１の結合性分子（例えば、バイオセンサーの支持体であってもよい）と第２の潜在的な結合性分子（例えば、抑制剤分子）を使用する。この場合、第２の結合性分子は、生物学的物質（例えば、タンパク質）と第１の結合性分子との結合に影響を及ぼすか、又は該結合と競合してもよい。

標識存在／標識不存在バイオセンサーにおける結合反応に影響を及ぼす抑制剤を使用する方法は、非常に強い相互作用を包含するように拡張することができ、この場合、より弱い結合親和性を有する既知の競合性抑制剤の使用によって、より強い結合性物質の摂動／観測が可能となる。

一般に、本発明によるバイオセンサーを用いて検出してもよい特異的な結合性物質としては、下記のものが例示される：核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（scFv）、F(ab)フラグメント、F(ab')2 フラグメント、Fv フラグメント、有機低分子、細胞、ウイルス、バクテリア、ポリマー、ペプチド溶液、タンパク質溶液、化合物ライブラリーの溶液、単鎖ＤＮＡ溶液、二重鎖ＤＮＡ溶液、単鎖ＤＮＡ溶液と二重鎖ＤＮＡの溶液との組合せ、ＲＮＡ溶液、及び生物学的試料。生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織又は腫瘍のホモジェネート、滑液、大便、唾液、痰、シスト液、羊水、髄液、腹膜液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙及び前立腺液等を含むことができる。

本明細書に記載のバイオセンサーは、ａ）これらのタイプのいずれかの試料の成分のバイオセンサー表面への結合、ｂ）試料中の別の成分、例えば、試料中の蛍光体等への試料の結合、及びｃ）試料中へ添加される第２試料への当該試料又は試料成分の結合を検出するために使用してもよい。結合ｂ）の例として、センサー表面は試料中の一部の成分（例えば、ストレプタビジン−ビオチン又は６His）と結合させてもよく、また、バイオセンサーは、試料中の結合成分と該試料中の付加的な成分群（例えば、ポリメラーゼ錯体）との相互作用を検出するために使用してもよい。結合ｃ）の後者の例においては、試料は、バイオセンサーの表面上へ付着した成分、及びバイオセンサー上に存在する第２試料からの特異的に結合／付着する別の成分を含有していてもよい。

天然の蛍光を使用する実施態様
別の実施態様として、ＥＲと標識不使用方式を組み合わせたバイオセンサーは、生物学的分子の有する天然の蛍光を利用するアッセイ（即ち、結合された蛍光性標識の使用を必要としないアッセイ）であって、他の生物学的分子や低分子量の被験分子との相互作用に際してのこれらの折り畳み、積み重ね及び変化と変化速度に関する生物物理学的特性決定測定をおこなうアッセイに対して特に有用である。このような特性決定測定は結合した蛍光性標識を用いておこなうことはできるが、この種の結合標識は必ずしも必要ではなく、特に固有の蛍光特性を有する生物学的分子に対しては不要である。

タンパク質、核酸成分及び補酵素の蛍光特性を以下の表１に示す。表中の^ΦＦに示す値は、通常観測される最大値である。所定の場合、実際の値はかなり小さい。なお、この表のデータは次の文献から得た：チャールズ・Ｒ・キャントール及びポール・Ｒ・シンメル著、「バイオフィジカル・ケミストリー：生物学的分子の挙動と研究」、第１部〜第３部、第４４３頁、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（ニューヨーク）発行、１９８０年。

この技術は、核酸ポリマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）（蛍光性ヌクレオシド塩基）の積み重ねとハイブリッド形成、タンパク質（蛍光性アミノ酸であるフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び脂質膜（蛍光体を異なる区画内へ組み入れたときの増強効果と消光効果をもたらす）を用いる場合に特に重要である。１つの実施態様においては、標識を使用しないＢＩＮＤの特徴によって、試料物質又はこれに結合したリガンドの量の定量化が可能となり、また、ＥＲの特徴によって、生物物理学的変化の高感度追跡が可能となる。

背景蛍光を低減させるための付加的な低蛍光性ＳｉＯ _２ 層を具備するＥＲ／ＢＩＮＤバイオセンサー
本明細書に開示されるＥＲとＢＩＮＤを組み合わせたセンサーを結合蛍光体からの蛍光又は天然蛍光を検出するために使用する場合、バイオセンサーの構成物質の内部から放出される背景蛍光を低減させることは有用であり、これによって、信号対雑音比のより高い条件下での蛍光測定が可能となる。これを達成するための１つの方法は、付加的な低蛍光性ＳｉＯ_２層をＵＶ−硬化ポリマー層上へ沈着させた後、ＳｉＯ_２層上にさらに屈折率の高い物質（例えば、ＴｉＯ_２）から成る最上層を沈着させる。この種のバイオセンサーの断面図を図３０に示す。このバイオセンサーは、ＵＶ−硬化ポリマー層５２４（該層は図示されていない支持体シート上に結合されている）、中間のＳｉＯ_２層７００及び上部のＴｉＯ_２層５２２を具備する。空気又は水に基づく媒体中の試料はＴｉＯ_２層上に存在させる。付加的なＳｉＯ_２層の厚さは、格子の装荷率や要求される背景蛍光レベル等の要因によって左右されるが、一般的には、５００〜５０００Åである。

好ましくは、ＳｉＯ_２層７００は、バイオセンサーに問い合わせをするために使用される光源からの入射光に応答して低い天然蛍光を示す。ＳｉＯ_２層中の蛍光レベルは該酸化物の調製法によって左右され、また、該酸化物の構造（非晶質構造及びナノ結晶質構造）もこれに影響を及ぼす役割を果たしてもよい。所謂「ＳｉＯ_１．９５」に比べた場合のＳｉＯ_２層中のＳｉＯ_２分子の完全な酸化も、蛍光性の低い層を形成させるために重要である。好ましくは、ＳｉＯ_２層は、比較的低い天然蛍光性をもたらすような調製法によって調製され、また、このような天然蛍光性を示す構造を有する。

中間のＳｉＯ_２層の１つの使用例は、図２８Ａ〜図２８Ｃに示す構造体中における使用である。この場合、上部のＴｉＯ_２層５２２の下部においては、低蛍光性のＳｉＯ_２層がＵＶ−硬化ポリマー層上に形成される。中間のＳｉＯ_２層は、Ｘ方向とＹ方向において均一な厚さを有する。

蛍光性の低い付加的なＳｉＯ_２層は、本明細書において先に説明した他のセンサー中に存在させてもよい。

図２８と図３０及び高屈折率を有する上部層を示すその他の図において、上部層５２２に対してＴｉＯ_２は必須の物質でなない。Ｔａ_２Ｏ_５（五酸化タンタル）も機能を果たすことができる。高屈折率層としてＴｉＯ_２が一般的に使用されている理由は、Ｔａ_２Ｏ_５に比べてＴｉＯ_２がより高い屈折率を有するからである。Ｔａ_２Ｏ_５を使用する場合、同じ光学的厚さを達成するためには、より大きな物理的厚さを必要とする。本明細書に記載の実施例においては、上部層５２２の厚さは、ＴｉＯ_２又はＴａ_２Ｏ_５を使用する場合、約７０ｎｍ〜２５０ｎｍである。

１つの別の可能な実施態様においては、高屈折率層として、ＴｉＯ_２又はＴａ_２Ｏ_５の代わりに酸化ハフニウム被覆層がバイオセンサーへ塗布される。赤外波長と可視波長においては、ＴｉＯ_２又はＴａ_２Ｏ_５は吸収性を示さないが、低波長になると、これらの酸化物は吸収性を示し始め、これらの吸収性は波長の低下に伴って増大する。このような挙動は共鳴装置においては問題となる。何故ならば、吸収性は共鳴の低減効果（即ち、ピークが測定されなくなるか、又はピークが小さくなる）をもたらすからである。酸化ハフニウムは、４００ｎｍのような低い波長においても吸収性を示さない。酸化ハフニウム被覆層の厚さと格子の寸法は、関心のあるＵＶ波長において共鳴がもたらされるように選択される。

時間分解蛍光（ＴＲＦ）と蛍光偏光（ＦＰ）測定のためのＥＲセンサーの使用
本発明によるＥＲ／ＢＩＮＤセンサーの新規な用途の１つの別の実施例は、時間分解蛍光（ＴＲＦ）と蛍光偏光（ＦＰ）を測定するための該センサーの使用である。ＴＲＦとＦＰは、本明細書に開示された標識不使用装置とＥＲを組み合わせた装置から誘導だれる増強信号から大きな利点をもたらす２つの方法である。これらの２つの方法は、背景信号及び結合事象に関与しない分子からの結合事象に関する特定のＥＲ信号の分離に対して有用である。蛍光体は、センサーの波長増強能に適合させる必要がある。

ＥＲとＦＰ及び／又はＴＲＦを使用する方法の発明は、結合事象に含まれる蛍光体の存在を正確に検出する機会をユーザーに付与すると共に、このような検出を背景又は非関与分子から非常に高い感度で識別することを可能にする。

ＦＰ及びＴＲＦは、診断と薬学的試験に関連するタンパク質／化合物のスクリーニングの産業分野において広範囲に使用されている技術である。この点に関しては次の米国特許文献を参照されたい：第６４３２６３２号、第６２０７３９７号、第６１５９７５０号、第６４４８０１８号、第６４５５８６１号、第６５６６１４３号、第５５０４３３７号。これらの特許文献の開示内容も本願明細書の一部を成すものである。また、ブダッハらによる米国特許第６８７０６３０号と銅第６７０７５６１号及びノイシェファーらによる米国特許第６０７８７０５号と同第６２８９１４４号の開示内容も参照されたい。このような方法は、望ましくない信号、例えば、背景や非結合分子からの結合信号の識別を可能にするために一般的に使用されている。本発明方法は、信号対雑音比（感度）を改善し、試薬の消費量の低減化を可能にする。このような改善は、感度と試薬が制限される「プロテオミクス（proteomics）」として知られている研究分野において特に有用である。さらに、一般的な生物物理学的決定法の分野（折り畳み、他の分子への接近、サイズ等）においても感度の増大がもたらされる。

結合相互作用の決定における５０〜１００倍の潜在的な感度増大に起因して、このような技術はいくつかの商業的な利点（例えば、試薬の消費量の低減化及び低信号における信頼性の限界の拡大等）ももたらす。

清浄な底部プレートの下面からのＦＰを測定するために使用できるいずれの装置も、本明細書記載のＥＲ／ＢＩＮＤバイオセンサーのために機能させることができる。ＦＰとＴＲＥの両方を測定できる市販の装置、例えば、モレキュラー・デバイシス社製の「スペクトラマックス Ｍ５」装置等が知られている。しかしながら、ＦＰ測定を検出するための装置は、ＴＲＦ測定を可能にする装置と同じ装置である必要はない。信号対雑音比を大幅に改善することによってＦＰ又はＴＲＦ測定に対してより多くの利点をもたらすＥＲバイオセンサーの物理的特徴は、増大信号に対して共鳴効果をもたらす本明細書において詳述したバイオセンサーの格子構造である。ＦＰとＴＲＦは薬学的なスクリーニング活性に対して推薦される方法である。この理由は、これらの方法によれば、スクリーニングに供される化合物の天然蛍光から望ましくない信号（即ち、これらの化合物を用いるときのより高い雑音／背景）をユーザーが回避できるからである。

ＥＲとＢＩＮＤセンサーを用いる試料量の調節とスポット形成過程
本発明によるバイオセンサーの１つの可能な用途においては、ＥＲとＢＩＮＤセンサーを使用することによって、多数の位置における試料の分析がおこなわれる。この場合、各々の位置は、直径が約１０〜５００ミクロンのスポット（spot）のマイクロアレイ（microarray）を規定する。

「スポット」という用語は、バイオセンサーの表面上載置された少量の試料物質を意味する。このようなスポットは、試料を含有する標的溶液の小滴をバイオセンサーの表面上へ沈着させた後、該小滴を乾燥させることによって形成される。小敵の大きさはスポットの大きさを決定する。このような小滴を沈着させる方法としては別の方法も知られており、この種の技術は当該分野においては一般的に知られている。１つの可能な実施方法においては、センサーの表面は多くのスポットのアレイ（即ち、スポットのマイクロアレイ）を保有し、大部分のこれらのスポットは異なる組成を有する。

次いで、種々の複雑な組成を有する共通の試験物質を全アレイへ適用する。１つの実施例においては、この試験物質は蛍光的に標識化された試験物質を含有する。次いで、光を用いてセンサーに対して、試験物質とスポットとの間の結合に関して問い合わせをする。多数のスポットのマイクロアレイを保有するバイオセンサーを分析するために、全スッポトを示すバイオセンサーの画像を得た後（後述する図２５に示す実施態様における画像読取り装置参照）、画像分析法又は各々のスポットからの分光データを別々に捕獲する方法を利用することによって、各々のスポットからの信号（ピーク波長値の強度とシフト）を決定する。各々のスポットは１つのデータ点を与える。画像は、スポットのサイズよりも小さな分解能ディメンジョン[ピクセルサイズ（pixel size）］を有していなければならない。

アッセイ表面上への試料物質のスポット形成（例えば、ＤＮＡのスポット形成）中の過程の可変性によって、その後の試験試料の結合に対して不確定な結果がもたらされる。試料物質の密度とスポット間の調節できない可変性によって、蛍光信号による試験物質の結合頻度がかなり妨げられる。第２標識を適用することによる試料物質の定量化は一般的には実用的ではない。

本明細書に開示されるＥＲ方式と標識不使用方式を組み合わせたバイオセンサーはこのような問題を解決する。特に、ＢＩＮＤ信号は、スポット中の試料物質の量を非破壊的な方法で迅速に定量するために使用される。この場合、蛍光体又はその他の添加標識を必要としない。ＢＩＮＤ測定は、蛍光体で標識化された試験物質に対して試料（スポット）を曝す前におこなわれる。ＥＲ測定は、蛍光体で標識化された試験物質に対して試料を曝した後でおこなわれる。ＢＩＮＤ測定によって、各々のスポットからの蛍光性信号に対して正規化量がもたらされる。スポットのアレイのＢＩＮＤ画像もスポットの形態に関する情報をもたらし、また、スポット形成過程に対して定性的調節機能を果たす。

１つの代表的な実施態様について、図３１〜図３３に基づいて説明する。図３１は、７ミクロンの分解能を有する格子に基づくセンサー上に沈着されたスポットのマイクロアレイの画像を示す。該センサーはＥＲとＢＩＮＤの両方の測定に対して最適化されていてもよく、あるいは最適化されていなくてもよい。この画像はＣＣＤカメラによって捕獲された（以下において説明する図２５に示す実施態様参照）。ＤＮＡスポットの画像は種々のミクロンオーダー、例えば、７ミクロン、１５ミクロン及び３０ミクロン等の分解能（ピクセルサイズ）で得てもよい。図３２は、センサー上に載置されたＤＮＡ試料の存在に起因する図３１に示すスポットの１つに関するピークシフトのグラフである。このシフトは、ＤＮＡスポットに対してピーク波長値が右側へ移動することを示す。このシフトの度合いは、スポット中に存在するＤＮＡの量を示す定量的尺度である。図３３はスポット列及び該列に沿った位置の関数としてのピーク波長値（ＰＷＶ）のシフト（ｎｍ単位）の対応するグラフを示す。ＰＷＶの変化は、該列のスポット上に位置するＤＮＡ試料の量に関する定量的尺度である。ＤＮＡ試料物質のスポットが存在しないセンサー表面上の領域はスポット列の画像中の暗部で示され、また、消失スポットはグラフの下部領域に示される。従って、図３３に示すグラフは、アレイ中のスポット上に存在するＤＮＡに関する定量的／定性的尺度をもたらす。

この開示内容によるスポット形成によれば、ナノメーターサイズの構造化光学的表面、例えば、標識を使用しないＢＩＮＤ法において使用される光学的表面上のＤＮＡスポット（又は、いずれかの生物学的物質、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、及びペプチド等）の厚さ、均一性及び形態の分析法が提供される。この方法は、ナノメーターサイズの構造化光学的表面、例えば、本明細書に記載のＥＲ方式と標識不使用方式を組み合わせたセンサーの両方を利用するために適している。また、該方法は、１つの技術又は他の技術に対して設計される格子構造体上のスポットの分析にも使用することができる。

印刷されたマイクロアレイの品質の調節は、マイクロアレイのメーカーとユーザーの双方にとって重要である。印刷されたＤＮＡスポットは識別可能な標識又は該スポットに装着されるタグ（tag）（例えば、蛍光、量子ドット、放射能等）を具有しない場合が多い。このため、アッセイを実施する前に、品質保証のための印刷スポットの画像形成を迅速かつ確実に定量的におこなうことは困難である。スポット上に印刷されたＤＮＡの量の変化はハイブリッド形成アッセイの結果に大きな効果をもたらし、特に診断に関連する用途においては重大な影響をもたらす。これらの点を考慮するならば、本明細書に開示される本発明によるスポット形成法によって、ナノメーターサイズの構造化光学的表面（センサー表面）上に印刷されたＤＮＡスポットの画像を非破壊的で非接触的に形成させる方法が提供される。この発明は、ＤＮＡスポットの印刷法の特徴と信頼性を確認して欠陥のあるマイクロアレイを除去することによって、この種のマイクロアレイの製造コストを低減させるために使用することができる。また、この発明は、最初にスポットされた物質の量に関してこれらのチップ（蛍光等を介在させるチップ）を用いておこなわれる標識化アッセイから得られる最終的な結果を正規化させることによって、他の手段によっては従来は得ることができなかった結合の親和性／効率に関する情報を提供するために使用することができる。

本明細書に開示された方法は，好ましくは，非接触的で非破壊的な態様でおこなわれる。即ち、スポットの画像形成は光学的手段を介しておこなわれ、定量的情報と定性的情報は、図３１〜図３３に関連して説明したように、スポットに関連して得られる。この方法は、チップの表面上に存在する単鎖ＤＮＡへ弱く結合した標識化末端（例えば、蛍光性タグ）を有するランダム配列の短鎖オリゴヌクレオチドを使用する従来法よりも優れていると考えられる。結合スポットからの蛍光信号は、該スポット中に存在するＤＮＡの量を示す。これらの方法は、種々の問題の影響を受ける場合が多い。この種の問題としては。ランダム標識化オリゴマー／ＤＮＡ錯体の低融点に起因する室温での解離、ストリーキング（streaking）、スポット形成、基質に対する非特異的結合とこれに伴う背景の増大、及びこれらのＱＣ試験における洗剤の使用に起因して発生することがあるスポットからの結合ＤＮＡの完全な除去等が例示される。パーキン・エルマー社製の反射撮像装置を使用してスポットの存否を非破壊的に測定した。この場合、ＤＮＡスポット中に存在する塩結晶からの反射レーザー光を用いた。この方法は、スポットの存否を測定する完全に定性的な方法であり、また、印刷溶液が塩を含有しない場合や塩結晶がスポットのアレイから洗い流されるときには使用できない。

本明細書に開示されたこの点に関連する画像形成技術の機能的な利点は、構造化光学表面に結合した物質の量の定量的分析法を提供することである。この分析法は、非破壊的な非接触的測定法である。さらに、この発明によれば、マイクロアレイのメーカーとユーザーは、マイクロアレイ表面上のスポットの特性（均一性、スポットの形態及び結合した物質の量）を確認することができる。さらに、この分析においては従来法において必要とされているかなり長い時間は不要であり、分析に要する時間は約１分間である。従って、この分析法によれば、少量の試料に制限されることなく、全てのマイクロアレイにおける分析をおこなうことができる。

標識不使用検出と蛍光増幅（ＥＲ）を組み合わせたバイオセンサー用読取りシステム
ＥＲ法と標識不使用法を組み合わせたバイオセンサーに関する上記の説明を参酌しながら次の実施態様について説明する。即ち、センサーに問い合わせをした後で、検出器上の単一の結合サイトから標識不使用データとＥＲデータの両方を獲得するために有用な読取り／検出システムのいくつかの実施態様について説明する。

読取／検出システム３００の第１の実施態様を図２５に模式的に示す。図２５に示す読取／検出システム３００は画像化（imaging）読取システムである。バイオセンサー１００は、光学スペクトルにおいては標識不使用検出法に対して鋭い共鳴ピークを示すと共に、バイオセンサーのエバネッセント領域においては蛍光信号の顕著な増大に対して高電磁場を発現させるように設計される。この読取りシステムは、これらのバイオセンサーの特性を利用することによって、これらの効果の両方を読み取る。この開示内容によれば、バイオセンサーからの一方又は両方の信号の測定能を有する新規な画像化読取りシステムが提供される。

「comＢＩＮＤセンサー」で示されるバイオセンサー１００は、該バイオセンサーの底部側から光学的に問い合わせを受ける。バイオセンサー１００の上部側においては、該バイオセンサーは水又はその他の液体中に浸漬されていてもよく、あるいは空気に曝されていてもよい。いずれかの分子又は細胞の結合相互作用は、該相互作用を検出できるように設計されたバイオセンサー１００の上部面側でおこなわれる。バイオセンサー１００は、液体保有容器、例えば、各列がウェル（例えば１２個のウェル）を有する８列のウェルを備えたマイクロウェルプレートを具備するより大きなアッセイ装置の一部であってもよい。このバイオセンサーはマイクロアレイのスライド（slide）の構成要素であってもよい。図２５に示す構成態様においては、単一ウェル（検出サイト）３０２は断面図で示されており、この種の検出サイトは数十個、数百個又は数千個存在していてもよい。

画像化読取り／検出システム３００は、レーザー（例えば、ＨｅＮｅレーザー等）形態のＥＲ光源３４０、ハロゲン白色光を含む広帯域スペクトルＢＩＮＤ光源３５０又はＬＥＤ３５２、及び連続的な画像におけるＥＲデータと標識不使用データの両方を捕獲するための共通の検出器として機能するＣＣＤカメラシステム３３８を具備する。該システム３００は、光学ビームを合体させるサブシステムを具備する。該サブシステムは、光源３４０／３５２からバイオセンサーへの入射光の合体と誘導をおこなうダイクロイックミラー（dichroic mirror）３６４／３３０を具備する。ダイクロイックミラー３３０は検出用信号光を捕集し、これをレンズ３３６へ誘導し、該レンズを通過した信号光はＣＣＤカメラ３３８によって撮像される。

バイオセンサー１００の下部に存在する光ビーム３７０は照射光３７２と反射光３７４から成る。反射光３７４は直接反射光の他に、バイオセンサー上に蛍光物質が存在するときには該物質から放射される蛍光を含む。

レンズシステム３３６を通過後にＣＣＤカメラによって検出される信号は、電子的処理又はコンピュータによるアルゴリズムによって処理されてＢＩＮＤ（標識不使用）データ３８０又はＥＲデータ３８２となる。この種のデータは、読取りシステム３００のユーザーにより、分析装置を用いて記憶／表示させて分析してもよい。分析装置としては、図２５に示すような計測化に使用されるコンピュータ又はワークステーション等であって該データ３８２／３８０にアクセスできる装置（図示せず）が例示される。さらに、ユーザーは、ＢＩＮＤデータ３８０とＥＲデータ３８２を組み合わせることによって、新規なバイオセンサー１００による特有の情報であって、結合相互作用又は細胞相互作用に関する情報を得ることが可能となる。

図示する構成態様においては、光学的構成要素３４０／３５０／３３０は、入射される単一ビーム３７２が発生されるように配設され、バイオセンサーはＸ方向とＹ方向に移動し、これによって、バイオセンサー１００の表面上に存在する全てのウェル３０２又は結合サイトからデータを連続的に得ることができる。このようなバイオセンサーの移動は、当業者には周知の手法、即ち、Ｘ方向とＹ方向に移動可能なステージ（図示せず）上にバイオセンサーを載置させる手法を用いておこなってもよい。所定のウェル又は結合サイト３０２がビーム３７２に適合するように配設される場合の１つの実施態様においては、光源３４０／３５０を連続的に（又はバイオセンサー上への直接的放射を可能とするように選択的に）作動させ、第１画像と第２画像（一方の画像はＥＲ画像であり、他方の画像はＢＩＮＤ画像である）をＣＣＤカメラによって捕獲する。ＣＣＤ画像の連続的捕獲は、ビーム選択機構３６０（例えば、シャッター）を使用することによって促進させることができる。該ビーム選択機構は光源３４０又は光源３５０からの光を選択的に通過させて該光をダイクロイックミラー３３０へ誘導させた後、バイオセンサー上へ反射させる。ビームの選択も電子的におこなうことができる。例えば、光源３４０／３５０の作動時間と停止時間を電子的に制御することによっておこなうことができる。あるいは、両方の光源を同時に作動させ、ビーム選択機構３６０を両方のビームが通過するように作動させることによって、入射ビームが両方の光源からの光を含むようにしてもよい。この場合、ＣＣＤカメラ３３８はＥＲ情報とＢＩＮＤ情報を含む単一画像を捕獲する。ＣＣＤカメラ３３８から得られる画像を画像処理法により処理することによって、複合画像の中からＢＩＮＤ成分とＥＲ成分が抽出される。

ＥＲ光源３４０はレーザー、例えば、ヘリウム／ネオン（ＨｅＮｅ）レーザー等であってもよい。レーザービーム３４１はさらにビーム調整装置３４２、例えば、ビーム拡大器等を通過させる。ビーム拡大器３４２は小さな直径を有するレーザービームを大きな直径を有するレーザービームへ拡大させる。出力ビーム３４３は平行化された後、直線状に偏光される。バイオセンサーは、特定の偏光における入射光に応答してＥＲ効果をもたらす。偏光は、直線状に偏光された出力レーザービームを発生するように設定されたレーザーを用いておこなってもよい。

ＢＩＮＤ（標識不使用）光源３５０は、ハロゲン又はＬＥＤ光源３５２、及び波長調整機構３５６を有するモノクロメーター３５４から成っていてもよい。光源３５２から放射される光ビーム３５３は本来的に広帯域であり、モノクロメーター３５４のの出口部における光ビーム３５５は単色性である。

モノクロメーター３５４からの出力光ビーム３５５はビーム調整装置３５８によって調整される。該ビーム調整装置はコリメーターであってもよい。ミラー３６５は、ビーム調整装置３５８の出力からダイクロイックミラーへの光ビーム３４９を検出する。光源３４０／３５０からの合成光３６６はビームの分割／合成アセンブリー３３０へ誘導された後、バイオセンサー１００の底部表面上へ誘導される。

ＢＩＮＤ光源３５０は波長可変レーザーから成っていてもよい。この場合、ビーム調整装置３５８はビーム拡大器である。ＢＩＮＤ測定とＥＲ測定の両方に対して波長可変レーザー又は閃光電灯（flash lamp）を単一の照射源として使用してもよいことに留意すべきである。

さらに、偏光はＢＩＮＤ信号の検出を促進するので、光源３５２の内部に偏光子を設置することによって、光３６３を直線状に偏光させてもよい。あるいは、光検出素子３６５は偏光ビームのスプリッターであってもよく、これにより、ランダム偏光３５９を直線状偏光３６３へ変換させてもよい。

レーザーで励起された蛍光信号を検出するためには、一組の光学フィルター３３２／３３４をビームの分割／合成アセンブリー３３０に組み入れてもよい。フィルター３３２はダイクロイックフィルターであり、該フィルターはレーザー光を反射させると共に、試料からの蛍光を透過させる。フィルター３３２はＢＩＮＤ波長範囲内においてビームスプリッターとしても機能する。１つの好ましい設計における該波長範囲は８３０ｎｍ〜９００ｎｍである。フィルター３３４は２つの波長範囲（レーザーで励起された蛍光とＢＩＮＤの波長範囲）において光の透過のみをおこなう。結像レンズ３３６を使用することによって、バイオセンサー表面上の蛍光を捕獲し、該蛍光をＣＣＤカメラ３３８の焦点面上へ集束させてもよい。

図２５に示す設計態様には、ＥＲ検出をおこなうために、入射ビーム３７２に対してバイオセンサーを回転させる回転装置も配置させる。１つの可能な実施態様においては、回転装置３３１はビームの分割／合成アセンブリー３３０へ装着され、該アセンブリーを図中の矢印で示す方向に回転させ、これによって、入射ビームを約θの角度で回転させる。別の実施態様においては、回転装置３３１は省略され、その代わりに、回転装置３３３がＸＹ方向への移動ステージに装着される。図２６の回転装置３３３の左側の矢印で示すように、該回転装置はＸＹ方向への移動ステージとこれに装着されたバイオセンサー１０を固定された入射ビーム３７２に対して回転させる。

所望の性能を達成するために、付加的なレンズ、ミラー及び光学フィルターを上記の読取りシステムへ組み入れてもよい。適当に設計された光学フィルターを使用することによって、ＢＩＮＤ検出とＥＲ検出との間の望ましくないクロストーク（cross-talk）を排除してもよい。さらに、電子的又は機械的なシャッター３６０の形態のビーム選択機構を使用することによって、２つのチャンネルの検出と光照射を適当に同期させてもよい。この結果、１つの光源のみを用いてバイオセンサーを所定時間照射することによってクロストークを排除することができる。

図２５に示すバイオセンサーの読取りシステムの重要な利点は、同じバイオセンサーの位置においてＢＩＮＤのデータとＥＲのデータを同時に又は立て続けに入手できることである。高分解能画像形成法は多量のバイオアッセイ、例えば、セルに基づくアッセイ又はマイクロアレイを用いるアッセイに対して有用である。

積分型の単一点検出器によってＣＣＤカメラ３３８を置き換えてもよい。この場合、該システムは、検出器の出力を伴う入射放射線３７２の位置にわたって、センサーの動きを同期することによって画像をもたらす。

バイオセンサーからＥＲのデータを得るためにＣＣＤカメラを使用することに関するさらに詳細な事項は、例えば、下記のような技術文献に記載されており、この文献の開示内容も本明細書の一部を成すものである：ディーター・ノイシェファー及びウォルフガング・ブダッハら、「バイオセンサーズ＆バイオエレクトロニックス」、第１８巻、２００３年、第４８９頁〜第４９７頁。

読取り／検出装置３００の第２の実施態様を図２６に示す。図２５に示す実施態様は画像化読取りシステムであるのに対して、図２６に示す実施態様は画像化システムではない。前述のように、バイオセンサー１００は、標識を使用しない検出のための光学スペクトルにおいて鋭い共鳴ピークを示すと共に、蛍光信号を著しく増大させるためのバイオセンサーのエバネッセント領域において高い電磁場を示すように設計される。バイオセンサーのこのような特性に起因して、これらの効果の両方を読取るシステムが必要となる。図２６には、バイオセンサーからの一方又は両方の信号を測定する別の新規な読取りシステムを示す。

バイオセンサー１００に対しては、結合サイト（例えば、ウェル３０２）の位置における底部側から光学的な問い合わせがなされる。バイオセンサー１００の上部は水又はその他の液体中に浸漬されていてもよく、あるいは空気に曝されていてもよい。バイオセンサーによって検出されるいずれかの生体分子又は細胞の結合性の相互作用はバイオセンサーの上部においておこなわれる。ここに記載されたいずれの測定システムも、必要な場合には適当な集束装置を用いてバイオセンサー１００を上部（結合側）から読取る。

先に言及したように、センサー１００は、液体保有容器（例えば、マイクロウェル具有プレート）を具備するより大きなアッセイ装置の一部であってもよい。また、バイオセンサーは、マイクロアレイ具有スライドの構成要素であってもよい。

読取りシステム３００はＢＩＮＤ光源４０２、ＢＩＮＤ検出器４００、ＥＲ光源４０６及びＥＲ検出器４０４を具備する。光学システム４３０は、光源４０６／４０２からの光を合成し、該合成光を入射ビームとしてバイオセンサー１００の底部表面上へ誘導する。光学システム４３０は、バイオセンサーからの反射光４５２をさらに捕集し、該反射光を検出器４００／４０４へ誘導する。光学システム４３０は４つの光ビーム分割／合成装置４３２／４３４／４３６／４３８から成り、装置４３２はＢＩＮＤ検出器用の装置であり、装置４３４はＢＩＮＤ光源用の装置であり、装置４３６はＥＲ検出器用の装置であり、また装置４３８はＥＲ光源用の装置である。バイオセンサーの下方に存在する光ビーム４５０は入射光４５２と反射光４５４から成る。反射光４５４は反射光の他に、バイオセンサー上に蛍光性物質が存在する場合には該物質が発光する蛍光も含む。

ＢＩＮＤ（標識不使用）検出器４００によって検出される信号は電子的に処理されるか、又はコンピュータによる演算によってＢＩＮＤデータ３８０へ変換され、該データは、当該読取りシステムを操作するユーザーにより、コンピュータへ記憶されて表示／解析される。同様に、ＥＲ検出器４０４によって検出された信号は、ユーザーのために処理されてＥＲデータ３８２へ変換される。さらに、ユーザーは、ＢＩＮＤデータ３８０とＥＲデータ３８２を組み合わせることによって、当該新規なバイオセンサーに特有の情報である結合性相互作用又は細胞相互作用に関する情報を得ることができる。

図２６に示す実施態様においても、入射光ビーム４５２をバイオセンサー１００に対して回転させるための回転装置３３１又はＸＹステージとバイオセンサー１００を入射光４５２に対して回転させるための回転装置３３３が含まれる。回転装置３３１は、アセンブリー４３０の全体の回転がもたらされるように配置してもよい。

図２７においては、図２６に示すシステムと類似する読取りシステムを、図２６の場合よりもより詳細に示す。ＢＩＮＤ光源４０２はタングステンハロゲン電球であってもよく、あるいは発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。ＥＲ検出器４０４は光検出器、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）を具有していてもよい。ＥＲ光源４０６は、好ましくは、バイオセンサーと共に使用される蛍光体の励起帯域内の波長を有するビームを発生するレーザーである。例えば、ＣＹ５蛍光体の励起に対してはヘリウム／ネオン（ＨｅＮｅ）である。

ＢＩＮＤ光源４０２からの光ビーム４５６は、ＢＩＮＤ信号を検出するための平行光である。従って、光源４０２はコリメーターレンズを具有していてもよい。さらに、ＢＩＮＤ信号の検出は偏光の使用によって改善されるので、光源４０２は、光４５６を偏光させる偏光子を具有していてもよい。あるいは、ビームスプリッター４３４は偏光性のビームスプリッターであってもよく、これによってランダム偏光４５６を直線状の偏光に変換させてバイオセンサー１００の底部へ入射させることができる。

レーザー４０６からの光ビーム４５８は平行ビームである。レーザービームが直線状に偏光されると、ＥＲ性能が改善される。直線状の偏光をもたらすように設計されたレーザーを使用して偏光を達成してもよい。

バイオセンサー１００からのレーザーで励起された蛍光信号を検出するためには、一組の光学フィルター４７２／４７４／４７６をビーム分割／合成アセンブリー４３６に組み入れてもよい。フィルター４７２はレーザー源４０６からの入射レーザービーム４５８のビーム分割／合成アセンブリー４３６内の透過を可能にする。フィルター４７６はダイクロイックフィルターであり、該フィルターは、光源４０６からのレーザー光を透過させると共に、バイオセンサー１００からの蛍光を光検出器４０４の方向へ反射させる。フィルター４７４は、蛍光を透過させて光検出器４０４へ誘導する。結像レンズ４７８を使用することによって、バイオセンサー表面上からの蛍光をより効果的に捕集してもよい。

所望の性能を達成するために、付加的なレンズ、ミラー及び光学フィルターを上記の読取りシステムへ組み入れてもよい。適当に設計された光学フィルターを使用することによって、ＢＩＮＤ検出とＥＲ検出との間の望ましくないクロストークを排除してもよい。さらに、電子的又は機械的なシャッターを使用することによって、２つのチャンネルの検出と光照射を適当に同期させてもよい。この結果、１つの光源のみを用いてバイオセンサーを所定時間照射することによってクロストークを排除することができる。

図２５に示す実施態様においては、図２６と図２７に示す光学的構成要素は、１つの位置において入射するビーム４５２が発生すると共に、ＸＹ方向への移動ステージがバイオセンサーをＸ方向とＹ方向へ移動させることによって、バイオセンサー１００の表面上に存在する全てのウェル３０２又は結合サイトからデータが連続的に得られるように構成して配置させることができる。１つの実施態様においては、光源４０２／４０６を連続的に作動させることによって、ビーム４５２が照射される所定のウェル又は結合サイト３０２からのデータを検出器４００／４０４において連続的に発生させる。ＥＲデータとＢＩＮＤデータの連続的な捕集は、シャッターのようなビーム選択機構（図２６には示されていない）の使用又は光源４０２／４０６の電子的制御によって促進させることができる。あるいは、両方の光源を同時に作動させることによって、入射ビーム４５２が両方の光源からの光を含むようにすることができる。この場合、検出器４００／４０４はデータを同時に得る。

ここに示すバイオセンサーの読取りシステムの重要な利点は、同じバイオセンサーの位置においてＢＩＮＤのデータとＥＲのデータを同時に又は立て続けに入手できることである。ＢＩＮＤ検出器４００とＥＲ検出器４０４は、１つの結合サイト又はウェルあたりの単一点からのデータを比較的広い領域にわたって得る積分型検出器、又はユーザーによって規定される分解能における画素単位のデータを捕集する画像化検出器（例えば、ＣＣＤ検出器）であってもよい。高分解能画像化法は多量のバイオアッセイ、例えば、セルに基づくバイオアッセイ又はマイクロアレイを用いるバイオアッセイに対して有用である。

さらに、図２５〜図２７に示す光学的構造体は、例えば、図３に示す態様を利用することにより、バイオセンサー１００上に存在する多数のウェル又は結合サイトに対して同時に問い合わせをしてデータが得られるように反復して配設させることができる。

単一光発生源を備えた読取りシステム
図２５に示す実施態様と図２６に示す実施態様においては次の点に留意すべきである。即ち、前者においては、ＢＩＮＤ測定用光源３５０とＥＲ測定用光源３４０が別々に配設されており、後者においては、ＢＩＮＤ測定用光源４０２とＥＲ測定用光源４０６が別々に配設されている。１つの可能な変形態様においては、ＢＩＮＤ測定とＥＲ測定の両方に対して単一光源を使用してもよい。このような光源としてはいくつかの光源が使用可能であり、例えば、波長可変レーザー、又は広帯域スペクトルを示す高強度閃光電灯等が挙げられる。光源からの出力は所望により平行化し、ビーム拡大器を用いて拡大し（光源として波長可変レーザーを使用する場合）、モノクロメーター又はフィルターを通過させ（閃光電灯を使用する場合）、次いでバイオセンサーの表面上へ誘導される。ＥＲ信号とＢＩＮＤ信号を検出するために使用される光学装置（optics）は図２５〜図２７に示す態様及び前述の態様の装置であってもよい。

１つの実施態様においては、バイオセンサー中の所定の結合サイトからＢＩＮＤデータとＥＲデータの両方を得るために、光源を２回作動させることにより、照射用の異なる波長範囲を選択することができる。即ち、一方の波長範囲はＢＩＮＤ測定用であり、他方の波長範囲はＥＲ測定用である。例えば、光源の第１活性化においてはＢＩＮＤ検出器によってＢＩＮＤデータが得られ、一方、光源の第２活性化においてはＥＲ検出器によってＥＲデータが得られる。

１つの可能な変形態様においては、広帯域光源（例えば、キセノン閃光電灯）を使用する場合、広帯域スペクトルを用いてバイオセンサーを照射し、反射信号を分割して２つの異なるフィルターを通過させて方向転換させることによって、ＢＩＮＤデータとＥＲデータを同時に捕集することができる。ＢＩＮＤ／ＥＲに係る同時の照射とデータ捕集を実施するためには、プレート面に対する入射角に多少の差異を設けて照射をおこなう必要がある。鏡面からの直接的な反射成分はＢＩＮＤピークを含んでおり、該ピークのスペクトル位置はモノクロメーターによって決定される。入射角以外の角度で表面から離反する光のみを集めるレンズ系又は積分球は、問題となる蛍光体の発光の範囲を選択するフィルター又はモノクロメーターを通過した後、比較的鮮明な信号をもたらす。

上記の説明においては、例示的な観点と実施態様について議論したが、当業者であれば、これらに関連する特定の修正、変更、追加及び下位概念的組合せが上記の開示内容に包含されることを認識できる。従って、特許請求の範囲によって規定される技術的思想と技術的範囲にはこれらの全ての修正、変更及び下位概念的組合せも包含される。

特許請求の範囲において使用される「エバネッセント共鳴（ＥＲ）検出」又は「エバネッセント共鳴（ＥＲ）検出方式」という用語には、蛍光、燐光、化学発光、電界発光及び、例えば、次の特許文献に記載されているようなその他のタイプの発光の検出が包含される：ブダッハら、米国特許第６７０７５６１号。この種の発光は、試料物質の天然発光又は結合物質（例えば、蛍光標識）、あるいは量子ドット（発光性金属）に起因する。この種の結合物質は被験試料、バイオセンサーの表面又はこれらの双方に結合していてもよい。

図１は、従来技術によるバイオセンサーの部分的な模式的断面図である。 図２は、従来技術によるバイオセンサー／検出システムであって、該バイオセンサーを照明すると共に、該バイオセンサーからの反射光のピーク波長のシフトを測定するための該システムの模式図である。 図３は、底のないマイクロタイタープレートの基底部へ固定された図１に示す構造を有するバイオセンサー装置のウェルの全列を読み取る８個の照明ヘッドを具備する装置の模式的構成図である。 図４は、ＥＲ／標識不使用混成検出バイオセンサーの第１態様の断面図である。 図５は、ＥＲ／標識不使用混成検出バイオセンサーの第２態様の断面図である。 図６は、従来技術によるＥＲバイオセンサー「ノヴァチップ」における入射角θの関数としての透過率を比較するグラフである。 図７は、水性媒体環境下における標識不使用検出方式による図４に示す態様に対する波長の関数としての反射率を比較するグラフである。 図８は、標識不使用検出方式による図４に示す態様に対する波長の関数としての反射率のグラフを示す。 図９は、標識不使用／ＥＲ検出方式による図５に示す態様に対共鳴ピークを示す波長の関数としての反射率のグラフを示す。 図１０は、図５に示す態様に対するθの関数としての透過率のグラフである。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、専らＥＲ検出用に設計された一次元的な直線状格子構造体であって、ブダハらによる従来技術文献に開示されているＥＲチップとほぼ類似するようにモデル化された格子構造体の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。 図１２Ａ及び１２Ｂは、波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角の関数としての反射効率のグラフをそれぞれ示す。 図１３Ａ〜図１３Ｃは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す構造体（Ｚ＝１１０ｎｍ）の下部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示し（入射波長：６３２ｎｍ）、また、図１３Ｄ〜図１３Ｆは、図１３Ａ〜図１３Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。 図１４Ａ〜図１４Ｃは、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す構造体（Ｚ＝１１０ｎｍ）の上部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示し（入射波長：６３２ｎｍ）、また、図１４Ｄ〜図１４Ｆは、図１４Ａ〜図１４Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、格子構造中の周期的なホールによって特徴付けられる２次元的格子の形態の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。 図１６は、Ｙ軸方向の偏光を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体上へ入射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフを示す。 図１７は、Ｙ軸方向の偏光を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体上へ入射させたときに得られたグラフであって、入射角（６３２．５ｎｍ）の関数としてのグラフを示す。 図１８Ａ〜図１８Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体（Ｚ＝７８ｎｍ）の下部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示し（入射波長：６３２．５ｎｍ）、または、図１８Ｄ〜図１８Ｆは、図１８Ａ〜図１８Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２．５ｎｍ）。 図１９Ａ〜図１９Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す構造体（Ｚ＝４３３ｎｍ）の上部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示し（入射波長：６３２．５ｎｍ）、また、図１９Ｄ〜図１９Ｆは、図１９Ａ〜図１９Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。 図１９Ｇは、Ｘ軸方向の偏光を図１５に示す構造体上へ照射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフを示す。 図２０Ａ及び図２０Ｂは、格子構造中の周期的なポストによって特徴付けられる２次元的格子の形態の斜視図及び断面図をそれぞれ示す。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、Ｙ軸方向の偏光を図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体上へ入射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフ及び入射角（波長：６３３ｎｍ）の関数としてのグラフをそれぞれ示す。 図２２Ａ〜図２２Ｃは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体（Ｚ＝７０ｎｍ）の下部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示し（入射波長：６３３ｎｍ）、または、図２２Ｄ〜図２２Ｆは、図２２Ａ〜図２２Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３３ｎｍ）。 図２３Ａ〜図２３Ｃは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示す構造体（Ｚ＝４３０ｎｍ）の上部表面に対応するＸＹ平面における電界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示し（入射波長：６３３ｎｍ）、また、図２３Ｄ〜図２３Ｆは、図２３Ａ〜図２３Ｃに示す同じＸＹ平面における磁界振幅のＸ成分、Ｙ成分及びＺ成分のプロットを示す（入射波長：６３２ｎｍ）。 図２４は、Ｘ軸方向の偏光を図２０に示す構造体上へ照射させたときに得られたグラフであって、波長の関数としての反射効率のグラフを示す。 図２５は、ＥＲ方式と標識不使用方式を組み合わせた格子に基づくセンサーに関する画像読取りシステムの模式図である。 図２６は、ＥＲ方式と標識不使用方式を組み合わせた格子に基づくセンサーに関する第２の画像読取りシステムの模式図である。 図２７は、図２６に示す実施態様のより詳細な模式図である。 図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＥＲ方式と標識不使用方式を組み合わせたセンサーのさらに別の実施態様における２段型の二次元的格子構造体を示す３種の単位セルの斜視図である。 図２９は、図２８Ａ〜図２８Ｃに示す構造体のコンピュータシミュレーションによって得られた反射スペクトル（反射光の波長の関数としての相対強度）のグラフである。 図３０は、ＥＲとＢＩＮＤを組み合わせた格子に基づくセンサーの断面図である。 図３１は、格子に基づくセンサー上に沈着されたスポットの微小配列の画像を示す。 図３２は、センサー上に載置されたＤＮＡ試料の存在に起因する図３１に示すスポットの１つに関するピークシフトを示すグラフである。 図３３は、位置の関数としてのピーク波長値のｎｍ単位のシフト及び消失スポトを示すスポット列を表示するグラフである。

符号の説明

１０ バイオセンサー
１２ 低屈折率材料
１４ 高屈折率材料
２０ ウェル
３０ 照明装置
３２ 光ファイバー
３４ コリメーターレンズ
１００ バイオセンサー
２００ ポスト
２１０ ホール
３００ 読取り検出システム
３３８ ＣＣＤカメラ
４００ ＢＩＮＤ検出器
４０４ ＥＲ検出器
５００ 単位セル

Claims (10)

1. センサー上に載置される試料を検査するためのセンサーであって、下記の光照射１）及び２）の両方に対して対応できるように、周期と深さを含む格子パラメーターを有する構造に設計された周期的な表面格子構造を有する支持体を具備し、
   （i）該格子構造が二次元的な周期的格子構造を含み、該周期的格子構造が第１次元と第２次元において周期的であり、これらの次元が相互に直交し、
   （ii）該周期的格子構造の第１次元が標識不使用検出用に設計される格子構造を含み、該周期的格子構造の第２次元がＥＲ検出用に設計される格子構造を含み、第１次元における格子構造の深さが、第２次元における格子構造の深さよりも実質上大きい深さである該センサー：
   １）エバネッセント共鳴（ＥＲ）検出方式において、該センサーから応答を得るための該センサーへの光照射、及び
   ２）標識不使用検出方式において、該センサーから応答を得るための該センサーへの光照射。
2. 格子構造が積層体をさらに具備し、該積層体が支持体、該支持体に結合される格子構造を有する層、格子構造を有する該層上に沈着されるＳｉＯ_２層、及び該ＳｉＯ_２層上に沈着される比較的高い屈折率を有する屈折物質の層を具有する請求項１記載のセンサー。
3. 第１次元における格子構造が、２６０ｎｍ〜１５００ｎｍの周期及び１００ｎｍ〜３０００ｎｍの格子深さを有し、第２次元における格子構造が、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの周期及び１０ｎｍ〜３００ｎｍの格子深さを有する請求項１記載のセンサー。
4. ＳｉＯ_２層が、５００Å〜５０００Åの厚さを有する層を含む請求項２記載のセンサー。
5. 高屈折率を有する屈折物質層に結合される発光性物質をさらに含む請求項２記載のセンサー。
6. 格子構造が、２段状の２次元的形態を有する単位セルのアレイを含む請求項１記載のセンンサー。
7. 格子構造が単位セルのアレイを含み、各々の単位セルが、標識不使用検出方式用に設計される構造で第１次元方向へ延びる交互の高い領域と低い領域を有する第１の周期的格子構造、及びＥＲ検出方式用に設計される構造で該第１次元方向に対して直交する第２次元方向へ延びて第１の周期的格子構造上に重ね合わされる交互の高い領域と低い領域を有する第２の周期的格子構造を含む２段状の２次元形態を有する請求項１記載のセンサー。
8. 直交する第１次元と第２次元内の格子構造が第１次元と第２次元において異なる周期性を有し、第１次元における周期性が、試料と結合する蛍光体を励起させるように同調される波長を有して第１光源から直角又はほぼ直角に入射する入射光に対して広域共鳴をもたらすように調整され、第２次元における周期性が、スペクトルの近赤外領域の第２光源からの光照射に対して鋭い共鳴をもたらすように調整される請求項１記載のセンサー。
9. 下記の過程（i）〜（iii）を含む少なくとも１種の試料の分析方法：
   （i）１）エバネッセント共鳴（ＥＲ）検出方式において、バイオセンサーから応答を得るための該バイオセンサーへの光照射及び２）標識不使用検出方式において、バイオセンサーから応答を得るための該バイオセンサーへの光照射の両方に対して対応できるように、周期と深さを含む格子パラメーターを有する構造に設計された周期的な表面格子構造を有する支持体を具備するセンサーであって、該格子構造が２次元的格子構造を含み、周期的な格子構造の第１次元が標識不使用検出用に設計される格子構造を含み、周期的格子構造の第２次元がＥＲ検出用に設計される格子構造を含む該センサー上に少なくとも１種の試料を載置させ、
   （ii）ＥＲ検出方式用に設計される少なくとも１つの光源からの光を用いて読取検出器内の試料を照射すると共に、標識不使用検出方式用に設計される少なくとも１つの光源を用いてセンサーを照射し、次いで
   （iii）センサーからの反射光を分析する。
10. 第１次元における格子構造が、２６０ｎｍ〜１５００ｎｍの周期及び１００ｎｍ〜３０００ｎｍの格子深さを有し、第２次元における格子構造が、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの周期及び１０ｎｍ〜３００ｎｍの格子深さを有する請求項９記載の方法。

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