CN1157602C - 荧光偏振法检测样品的方法及其中使用的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分析样品中检测对象的荧光偏振法。所述荧光偏振法包括以下步骤：(a)提供蛋白与荧光染料共价结合的荧光标记蛋白，其中所述蛋白能够特异结合所述检测对象；(b)使所述荧光标记蛋白和所述检测对象结合；和(c)检测在所述荧光标记蛋白中由于它与所述检测对象结合而产生的荧光偏振度的变化。

Description

荧光偏振法检测样品的方法及其中使用的试剂
技术领域
本发明涉及分析样品中检测对象的荧光偏振法。尤其是，本发明涉及用于分析样品中细菌或病毒的荧光偏振法。本发明适合用于下述技术领域：医疗诊断、环境检测和与食物中毒和传染病有关的食物控制。
技术背景
本领域已知的荧光偏振法是作为检测样品中物质的方法。所述方法是建立在下述原理的基础上，即当用线性偏振光激发荧光标记的化合物时，从所述化合物发射出的荧光有一定程度的偏振，所述偏振和该化合物分子重量成正比。
作为已经利用的荧光偏振法，它是以抗原-抗体反应为基础的荧光偏振免疫测定法。
例如第4,902,630号美国专利公开的检测方法(图8是显示检测原理的原理图)，其中将包含CRP(5)的一种体液作为检测对象(尤其是血液)加入到混合的溶液中，所述溶液包含：通过将作为荧光素的一种荧光染料与C-反应蛋白(CRP)结合而获得的“示踪物”(6)；和特异结合CRP的抗体(4)。在混合溶液中以所述示踪物(6)和CRP(5)之间对抗体(4)的竞争为基准，检测样品中的CRP(5)。因为这个检测系统是以竞争反应为基准，所以它需要两步结合反应，因此使检测操作复杂化。此外，在所述检测中使用的荧光素荧光寿命短，因此对于高分子量物质在检测中难以使用荧光素。
日本专利申请第62-38363号公开了利用免疫反应检测抗原或抗体的免疫分析测定仪。其中讲到在所述检测中可以使用荧光标记抗体。然而，所述申请没有描述所述检测的特定实施例。作为检测对象，所述申请只考虑了诸如存在于血液中的治疗药物(例如洋地黄毒苷)的物质，它的分子量明显比共存蛋白的分子量低。
因此，需要研究检测反应系统简单和检测操作容易的荧光偏振法，具体地说是适合于检测高分子量物质的方法。
发明概述
本发明的一个目的是提供通过测量检测对象的荧光偏振度的变化分析包含在样品中的检测对象的荧光偏振法，尤其是适合于检测高分子量物质的方法。本发明的另一个目的是提供利用荧光偏振法分析包含在样品中的检测对象的试剂。
本发明涉及分析样品中的检测对象的荧光偏振法，所述方法包括以下步骤：(a)提供蛋白与荧光染料共价结合的荧光标记蛋白，其中所述蛋白是能够特异结合所述检测对象的抗体、受体或抑制剂；(b)使所述荧光标记的蛋白和所述检测对象结合；和(c)测量在所述荧光标记蛋白中由于它与所述检测对象结合而产生的荧光偏振度的变化。
在上述方法中，能够特异结合所述检测对象的所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、Fab抗体或(Fab)2抗体。
在上述方法中，所述检测对象可以是生物物质、包括细菌的微生物；病毒；药物；环境污染物或滥用药物。所述生物物质可以是肽、蛋白、脂质、糖或核酸。作为生物物质的所述蛋白的分子量可以是500,000或更高。
作为生物物质的所述蛋白可以是抗体、激素、炎症标记、凝固因子、载脂蛋白、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、糖基化白蛋白、糖基化血红蛋白、血红蛋白、癌症标记或酶。
所述激素可以是绒膜促性腺激素、促甲状腺激素、孕酮、滤泡形成激素、促甲状旁腺激素、促肾上腺皮质激素或胰岛素。
所述炎症标记可以是C-反应蛋白(CRP)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、 α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1-X)、α1-酸性糖蛋白(α1-AG)、触珠蛋白(Hp)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体的第9个元件(C9)、补体的第4个元件(C4)、补体的第3个元件(C3)、补体因子B(B)、血纤蛋白原(Fbg)、血清淀粉样A(SAA)、C1抑制剂(C1I)、唾酸糖蛋白(即与唾液酸结合的糖蛋白)、酸溶蛋白(ASP)或免疫抑制剂酸性蛋白(IAP)。
本发明也涉及在分析样品中检测对象的荧光偏振法中使用的试剂，所述试剂包括蛋白与荧光染料共价结合的荧光标记蛋白，其中所述蛋白是能够特异结合所述检测对象的抗体、受体或抑制剂。
本发明还涉及分析样品中细菌或病毒的荧光偏振法，所述方法包括以下步骤：(a)提供抗体与荧光染料共价结合的荧光标记抗体，其中所述抗体能够特异结合所述细菌或病毒；(b)使所述荧光标记的抗体和所述细菌或所述病毒结合；和(c)测量在所述荧光标记抗体中由于它与所述细菌或病毒结合而产生的荧光偏振度的变化。
在上述方法中，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、Fab抗体或(Fab)2抗体。
在上述方法中，所述细菌可以从下述物质组成的基团中选择：红螺菌科、染色质科、氯新生霉菌科、粘球菌科、弓形血管科、囊状细菌科、多血管科、硫细菌科、沙门氏菌科、白细胞三烯科、色素缺乏科、反线虫科、螺旋体科、螺菌科、假单胞杆菌科、固氮菌科、根瘤菌科、甲基单胞菌科、盐细菌科、肠细菌科、弧菌科、类菌体科、奈瑟菌科、韦永氏球菌科(Veillonellaceae)、氧化氮或亚硝酸盐生物、可代谢硫和硫化合物生物、沉淀氧化铁和/或氧化锰的生物、铁辣椒科(Siderocapsaceae)、甲烷细菌科、需氧和/或兼性厌氧微球菌科、链球菌科、厌氧胨化菌科、杆菌科、乳杆菌科、细菌的棒杆菌基团、丙酸菌科、放线菌科、皮肤真菌科、诺卡菌科、链球真菌科、微单孢子菌科、立克次氏体科、巴尔通氏体科、边虫菌科、衣原体科、支原体科和无胆甾原体科。
在上述方法中，所述病毒可以从下述物质组成的基团中选择：肠病毒、心脏病毒、鼻病毒、口疮病毒(Aphthovirus)、杆状病毒、环状病毒、呼肠弧病毒、轮状病毒、冷杉双RNA病毒(Abibirnavirus)、鱼食双RNA病毒、昆虫双RNA病毒、α病毒、红玉病毒(Rubivirus)、鼠疫病毒、黄病毒、流感病毒、肺病毒、副粘病毒、麻疹病毒、水泡性病毒、狂犬病病毒、冠状病毒、布尼奥病毒(Bunyavirus)、沙粒病毒、人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。
在本发明所述荧光偏振法中，荧光染料可以有可以结合初级、二级或三级氨基基团、羧基团、巯基团、苯基团、苯酚基团或羟基团的官能团。所述荧光染料的荧光寿命可以在10纳秒至200纳秒的范围内。所述荧光染料可以有罗丹明、芘、二烷基氨基奈或花色素苷的骨架结构。
本发明也涉及在分析样品中细菌或病毒的荧光偏振法中使用的试剂，所述试剂包括抗体与荧光染料共价结合的荧光标记抗体，其中所述抗体能够特异结合所述检测对象。
附图的简要说明
图1是本发明的原理图，在此使用的是荧光标记抗体。
图2是琥珀酰亚胺酰(succinimidyl)-1-芘丁酸的合成流程图。
图3是用标记荧光染料标记抗体的原理图。
图4是本发明所述荧光偏振法对C-反应蛋白(CRP)的检测结果图。
图5是本发明所述荧光偏振法对高密度脂蛋白(HDL)的检测结果图。
图6是本发明所述荧光偏振法对低密度脂蛋白(LDL)的检测结果图。
图7是本发明所述荧光偏振法对E.coli O157的检测结果图。
图8是常规荧光偏振法的检测原理图。
实现本发明的最好模式
在本发明所述方法的检测系统中，用荧光物质标记蛋白，其中所述蛋白是能够特异结合检测对象的抗原、受体或抑制剂。通过将所述荧光标记蛋白和所述检测对象混合，可以证实所述检测对象的存在。图1显示了本发明的原理，其中使用的是荧光标记抗体。通过混合荧光标记抗体和检测对象(3)，证实了所述检测对象(3)的存在，所述荧光标记抗体通过用荧光染料(2)对能够特异结合检测对象的抗体(1)进行标记而获得。因为所述检测需要的反应是单步反应，因此可以简化所述反应系统，由于检测操作的简化，也就缩短了检测时间。
在本发明所述检测系统中，伴随荧光标记蛋白与所述检测对象结合，测量分子量的变化，以作为分子定向随时间的改变。因此，通过考虑所述结合前后分子量的变化来选择荧光染料，可以检测各种各样的高分子量(大约500,000或更高)的检测对象，例如一个尺寸等于或大于病毒的检测对象(大约20纳米(nm)或更象微粒)。对具有不同分子量的各种检测对象可以使用相同类型的荧光染料，只要所述荧光染料的荧光期限与结合前后分子量的变化相应。
下面将对本发明进行更详细的叙述。
用本发明所述荧光偏振法，可以基于上述的荧光偏振法的原理，对样品中的检测对象进行分析(即定量、检测或鉴别)。
通过使蛋白与荧光染料共价结合，可以提供本发明所述方法中适用的荧光标记蛋白，其中，所述蛋白分成抗体、受体或者抑制剂，并且能够特异结合所述检测对象(在下文被称为“特异结合蛋白”)。
所述特异结合蛋白对所述检测对象具有所需要的结合特性。所述特异结合蛋白是分成抗体、受体或抑制剂的任何一种的蛋白，只要它具有便于结合所述荧光染料的官能团。尤其优选的抗体是出于其应用的广谱性。所述抗体类型包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、Fab抗体和(Fab)2抗体。本发明所述方法可以使用任何类型的抗体。当所述检测对象作为受体的配体起作用时，在此情况下可以使用所述受体。例如当所述检测对象是酶时，在此情况下可以使用抑制剂。
关于所述荧光染料，使用那些其官能团可以共价结合所述特异结合蛋白的官能团(典型的，初级、二级或三级氨基基团、羧基团、巯基团、苯基团、苯酚基团或羟基团)的荧光染料。特别地，在使用诸如抗体的蛋白作为特异结合蛋白的情况下，根据结合效率，要求荧光染料具有活性官能团(例如卤代磺酰基团、琥珀酰亚胺羰基基团或异硫氰酸初级氨基基团)。
可以任意改变与所述标记对象(即所述特异结合蛋白)的一个分子结合的荧光染料分子的数目。优选的结合数目是结合2或更多的荧光染料分子，以增加检测的灵敏度。然而，当结合的荧光染料分子比需要的多时，可能反向影响所述特异结合蛋白的性质。例如，它可以降低抗体的亲和性、可溶性等等。所以，上述结合数目优选为10或更少，更优选为1。
当选择使用的荧光染料的骨架结构时，激发波长、荧光波长、Stokes频移和荧光的寿命很重要。优选地，或者激发波长，或者荧光波长，或者二者都存在于可见光的波长范围内(即300nm至700nm)。所述激发波长和所述荧光波长在波长上的差异(即所述Stokes频移)，优选为至少20nm或更大。一般从大约10纳秒至大约1000纳秒的范围内选择荧光染料的寿命(荧光扫描时间)，优选的，从大约10纳秒至大约200纳秒的范围内选择。具有超过1000纳秒的超长荧光寿命的荧光染料不是优选的，因为无论所述检测对象怎样大，由于寿命长，偏振度几乎不能保持。在选择荧光寿命时，考虑了由于结合所述检测对象而发生的所述荧光标记蛋白的分子量的变化。这是因为从结合所述检测对象的荧光标记蛋白发射出的荧光的偏振度和分子的大小有正比关系。
特别地，当分子量的变化在大约5,000至50,000之间时(即当检测对象的分子量为几千至几万时)，优选的荧光染料的荧光寿命为大约1至大约15纳秒。这种荧光染料的例子包括花色素苷和罗丹明。当分子量的变化是大约50,000至500,000之间时(即当检测对象的分子量为几万至几十万时)，优选的荧光染料的荧光寿命为大约10纳秒至大约150纳秒。这种荧光染料的例子包括二烷基氨基萘和芘衍生物。当分子量的变化在大约500,000至5,000,000之间时(即当检测对象的分子量为几十万至几百万时)，优选的荧光染料的荧光寿命为大约100纳秒至大约1000纳秒。这种荧光染料的例子包括芘衍生物和金属络合物。
从上述观点看，荧光染料的优选例包括具有罗丹明、芘、二烷基氨基萘、花色素苷等骨架结构的荧光染料。更为优选的荧光染料可以是具有二烷基氨基萘或芘骨架结构的荧光染料。
可以按照本领域技术人员熟知的那些条件进行所述特异结合蛋白和荧光染料之间形成共价键的反应。当所述特异结合蛋白有初级、二级或三级氨基基团、羧基团、巯基团、苯基团、苯酚基团或羟基团时，一般可以在室温下通过所述特异结合蛋白和具有活性官能团的荧光染料反应几小时形成共价键。所述反应结束后，可以通过普通方法(例如凝胶过滤或透析)轻易除去未反应的荧光染料。所述特异结合的蛋白和所述荧光染料可以直接结合，或者可以通过二官能链接分子或者其它方法间接结合。
使用上述荧光标记蛋白，可以用如下的方法分析样品中的检测对象。
包含所述检测对象和所述荧光标记蛋白的样品在溶液中互相混合，以便检测混合溶液中所述荧光标记蛋白的荧光偏振度。如果需要，在没有所述检测对象时也可以检测所述荧光标记蛋白的荧光偏振度。可以使用任何偏振测量工具检测荧光偏振度。在适中的温度(大约10℃至大约40℃)下进行所述检测，优选是在恒温下。
荧光偏振度的测量可以通过在混合检测对象和荧光标记蛋白的一个预定时间之后测量荧光偏振度，或者通过测量单位时间内荧光偏振度的变化来进行。通过在检测对象和荧光标记蛋白结合完全结束时进行检测，可以得到的可重复性更好的检测值。通过在检测对象和荧光标记蛋白的结合过程中的单位时间内进行荧光偏振度变化的检测，从另一方面，检测可以较快。为了鉴别所述检测对象，将已知标准样品的荧光偏振度检测值同样品中未知的检测对象的检测值对比。为了给包含在样品中的检测对象定量，提供一个使用包含已知浓度检测对象的溶液测量荧光偏振度的标准曲线，以便和样品中的检测值对比。
用本发明所述荧光偏振法，可以对高分子量，尤其是分子量约为1,000,000或更高的蛋白，和过去难以检测的细菌或病毒进行快速检测。所以本发明所述方法特别适用于检测一个对象，尤其是那些高分子量的检测对象。本发明所述荧光偏振法的特别有用之处在于，它可能鉴别出细菌或病毒的类型。
本发明所述方法倾向于使用的样品是一种材料，所述材料包括在任何技术领域中希望分析的检测对象，所述技术领域包括医疗诊断、环境检测和食品控制。用于医疗诊断的典型样品包括体液，所述体液包括血液、淋巴和组织液。用于环境检测的典型样品包括由土壤、河流、空气等收集的材料。用于食品控制的典型样品包括从基本肉类(ground meat)的提取物和从砧板的提取物。所述样品可以是任何形式，以便将其用于本发明所述方法。
本发明所述方法的检测对象包括但不限于：生物物质、微生物、病毒、药物、环境污染物和滥用药品。优选的检测对象是具有大约20,000至30,000或更高分子量的高分子量物质，更优选的为大约100,000至200,000或更高，愈加优选的为大约500,000或更高，最优选的为大约1,000,000或更高。换句话说，优选的检测对象是大约2nm或更大，更优选为大约10nm或更大，最优选为大约20nm或更大。
所述生物物质指在人或哺乳动物机体内存在的任何有机或无机物。生物物质的典型例子包括肽、蛋白、脂质、糖和核酸。在本文中作为生物物质的所述肽是指那些分子量少于大约1,000的物质。作为生物物质的所述蛋白是指那些分子量大约1,000或更高的物质。所述蛋白的例子包括抗体、激素、炎症标记、凝固因子、载脂蛋白、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、糖基化白蛋白、糖基化血红蛋白、血红蛋白、癌症标记或酶。癌症标记的例子包括但不限于：甲种胎儿球蛋白(AFP)、CEA、CA19-9、铁蛋白、免疫抑制酸蛋白(IAP)、β2-小球蛋白(BMG)、TPA、聚酰胺、聚酰胺组分、碱性胎蛋白(BFP)、SCC抗原、神经特异烯醇化酶(NSE)、唾酸Le-i抗原(SLX)、CYFRA21-1、CA15-3、BGA225、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PgR)、5’-核苷酸磷酸二酯酶同工酶-V(5’-NPD-V)、维生素K缺乏蛋白II(PIVKA-II)、CA19-9、弹性蛋白酶I、CA50、Span-1、DUPAN-2、KMO I、NCC-ST-439、CA125、CA130、CA72-4、唾酸Tn抗原(STN)、SP4、fee-HOG-β、PAP、PA、γ-甘露蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)等等。
所述微生物包括细菌、真菌和原生动物。作为检测对象,所述细菌可能很重要，肠细菌科和弧菌科可能更重要，而沙门氏菌和属于肠细菌科的肠出血性大肠杆菌和属于弧菌科的侧溶血性弧菌可能尤其重要。所述病毒包括细菌病毒、植物病毒和动物病毒。作为检测对象，人免疫缺陷病毒(AIDS病毒)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒可能更加重要。所述药物包括任何用于治疗或诊断人或其它哺乳动物的介质。所述环境污染物包括任何产生环境污染的物质，所述环境污染物可以从土壤、河流、空气等检测出。所述滥用药物是指法律或条例限制人服用的和违反所述限制使用的药物。
本发明也提供适合用于上述方法的包括荧光标记蛋白的试剂。可以以各种形式提供所述荧光标记蛋白，诸如固态、其中所述蛋白溶于缓冲溶液中的液态等等。
下述实施例是用来说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例
在下文描述了按照本发明检测高分子量检测对象的结果：C-反应蛋白(CRP；分子量：120,000)；高密度脂蛋白(HDL；分子量：大约400,000)；低密度脂蛋白(LDL；分子量：大约3,000,000)和肠出血性大肠杆菌O157(E.coliO157；尺寸：2μm)。在检测中使用各自以芘衍生物标记的抗-CRP多克隆抗体、抗-HDL多克隆抗体、抗-LDL多克隆抗体、抗-E.coli O157多克隆抗体。所述芘衍生物是荧光寿命大约50纳秒至大约500纳秒的荧光涂料，所述荧光寿命是与大约100,000至大约5,000,000的分子量变化相对应。使用日立公司生产的F-4000作为检测荧光偏振度的工具。
(实施例1)
合成琥珀酰亚胺酰-1-芘丁酸(SPB)
按照图2所示合成流程制备SPB。在20ml二甲基甲酰胺(DMF)中溶解2.25克1-芘丁酸(7.8mmol：由Molecular Probes，Inc.获得)和1.2克N-羟基琥珀酰亚胺(10.4mmol：由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.获得)。溶液混合后冷却至0℃，向其加入2.69克1，3-二氯己基碳二亚胺。然后于0℃边搅拌边使混合物反应24小时。用0.45μm滤器过滤反应的溶液后，收集滤过液并用蒸发器干燥。然后，在95％乙醇中重结晶所述滤过液，从而得到1.88g琥珀酰亚胺酰-1-芘丁酸(产量：70％)。
用IR分光光度计和NMR分析得到的SPB。羰基基团(1692cm-1)的红外吸收消失，而二酰亚胺基团(1783cm-1，1785cm-1，和1817cm-1)的红外吸收出现。从NMR对1H和13C的结果也鉴别出所述产品为SPB。
(实施例2)
制备芘标记的多克隆抗体
如下所述制备芘标记的多克隆抗体，将上述实施例1合成的SPB同抗-CRP多克隆抗体(由Bio Reactive获得)、抗-HDL多克隆抗体(由Cosmo Bio Co.，Ltd.获得)、抗-LDL多克隆抗体(由Cosmo Bio Co.，Ltd.获得)和抗-E.coli0157多克隆抗体(由Funakoshi获得)一起使用。
将溶解在pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的包含2.0mg/ml每种多克隆抗体的各自溶液(1000μl)同溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的包含1.29mg/mlSPB(5倍量的抗体)的溶液(20μl)混合。在室温下边搅拌边使这些混合的溶液反应4小时。将所述反应溶液每个上Sephadex G-25凝胶过滤柱(Pharmacia)(尺寸：10×60mm，流速：大约2ml/分钟)处理。除去未反应的SPB，收集包含芘标记的多克隆抗体的组分。
用所述收集的组分计算标记量和判断制备的芘标记的多克隆抗体的荧光偏振特性。
用紫外/可见分光光度计(由Shimadzu Corp.生产的UV-1600PC)检测标记量，证实标记为：每一分子抗-CRP多克隆抗体1.1个芘；每一分子抗-HDL多克隆抗体0.9个芘；每一分子抗-LDL多克隆抗体0.5个芘；每一分子抗-E.coli0157多克隆抗体1.2个芘。图3显示了芘同抗体结合的图像。
用荧光分光光度计(由Shimadzu Corp.生产的RF-5300PC)检测标记量，发现同每个标记抗体结合的芘的荧光性质是这样的：当激发波长是330nm时，引起的荧光波长是373nm和397nm。因为荧光强度在397nm时较大，所以确定使用330nm的激发波长和397nm的荧光波长作为所述荧光偏振法使用的条件。
(实施例3)
用芘标记的抗-CRP多克隆抗体检测CRP
将包含400μg/ml的抗-CRP多克隆抗体的溶液(700μl)放入小池(5×5mm)中，以便于检测荧光偏振度。以下是检测芘标记的抗-CRP多克隆抗体的条件：35℃的检测温度、330nm的激发波长、397nm的荧光波长和0.942的G因子。
制备CRP浓度为0-50mg/dl(由0.E.M.Concepts，Inc.获得)的CRP溶液。互相混合上述抗体溶液(700μl)和所述CRP溶液(30μl)，并于35℃搅拌0.5分钟，之后在上述条件下检测荧光偏振度0.5分钟，由此检测荧光偏振度的变化。结果发现可以检测的CRP浓度最高达30mg/dl。在图4中显示了所述结果。
(实施例4)
用芘标记的抗-HDL多克隆抗体检测HDL
将包含400μg/ml的抗-HDL多克隆抗体的溶液(700μl)放入小池(5×5mm)中，以便于检测荧光偏振度。以下是检测芘标记的抗-HDL多克隆抗体的条件：35℃的检测温度、330nm的激发波长、397nm的荧光波长和0.943的G因子。
制备HDL浓度为0-500mg/dl(由Cosmo Bio Co.，Ltd.获得)的HDL溶液。互相混合上述抗体溶液(700μl)和所述HDL溶液(5μl)，并于35℃搅拌0.5分钟，之后在上述条件下检测荧光偏振度0.5分钟，由此检测荧光偏振度的变化。结果发现可以检测的HDL浓度最高达500mg/dl。在图5中显示了所述结果。
(实施例5)
用芘标记的抗-LDL多克隆抗体检测LDL
将包含400μg/ml的抗-LDL多克隆抗体的溶液(700μl)放入小池(5×5mm)中，以便于检测荧光偏振度。以下是检测芘标记的抗-LDL多克隆抗体的条件：35℃的检测温度、330nm的激发波长、397nm的荧光波长和0.943的G因子。
制备LDL浓度为0-1650mg/dl(由Cosmo Bio Co.，Ltd.获得)的LDL溶液。互相混合上述抗体溶液(700μl)和所述LDL溶液(5μl)，并于35℃搅拌0.5分钟，之后在上述条件下检测荧光偏振度0.5分钟，由此检测荧光偏振度的变化。结果发现可以检测的LDL浓度最高达1000mg/dl。在图6中显示了所述结果。
(实施例6)
用芘标记的抗-E.coli O157多克隆抗体检测E.coli O157
将包含400μg/ml的抗-E.coli O157多克隆抗体的溶液(700μl)放入小池(5×5mm)中，以便于检测荧光偏振度。以下是检测芘标记的抗-E.coli O157多克隆抗体的条件：35℃的检测温度、330nm的激发波长、397nm的荧光波长和0.942的G因子。
将E.coli O157(由Funakoshi获得)溶液加入到上述抗体溶液中(700μl)，以使E.coli O157最终浓度为0-1.2×109细胞/ml。于35℃搅拌所述混合溶液0.5分钟，之后在上述条件下检测荧光偏振度0.5分钟，由此检测荧光偏振度的变化。结果发现可以检测的E.coli O157浓度最高达1.0×108细胞/ml。在图7中显示了所述结果。
工业适用范围
本发明所述方法提供了一个检测反应系统简单和检测操作容易的荧光偏振法，尤其是适合检测高分子量物质的方法。

Claims (18)

1.一种分析样品中的检测对象的荧光偏振法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供蛋白与荧光染料共价结合的荧光标记蛋白，其中所述荧光染料具有罗丹明、芘、二烷基氨基萘或花色素苷的骨架结构，其中所述蛋白是能够特异结合所述检测对象的抗体、受体或抑制剂；
(b)使所述荧光标记蛋白和所述检测对象结合；和
(c)检测在所述荧光标记蛋白中由于它与所述检测对象结合而产生的荧光偏振度的变化。
2.根据权利要求1所述的荧光偏振法，其特征在于，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、Fab抗体或(Fab)2抗体。
3.根据权利要求1所述的荧光偏振法，其特征在于，所述检测对象可以是生物物质、微生物、病毒、药物、环境污染物或滥用药物。
4.根据权利要求3所述的荧光偏振法，其特征在于，所述生物物质可以是肽、蛋白、脂质、糖或核酸。
5.根据权利要求4所述的荧光偏振法，其特征在于，所述蛋白的分子量为500,000或更高。
6.根据权利要求4所述的荧光偏振法，其特征在于，所述蛋白可以是抗体、激素、炎症标记、凝固因子、载脂蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、糖基化白蛋白、糖基化血红蛋白、血红蛋白、癌症标记或酶。
7.根据权利要求6所述的荧光偏振法，其特征在于，所述激素可以是绒膜促性腺激素、促甲状腺激素、孕酮、滤泡形成激素、促甲状旁腺激素、促肾上腺皮质激素或胰岛素。
8.根据权利要求6所述的荧光偏振法，其特征在于，所述炎症标记可以是C-反应蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体的第9个元件、补体的第4个元件、补体的第3个元件、补体因子B、血纤蛋白原、血清淀粉样A、C1抑制剂、唾酸糖蛋白、酸溶蛋白或免疫抑制剂酸性蛋白。
9.根据权利要求1所述的荧光偏振法，其特征在于，所述荧光染料有可以结合初级、二级或三级氨基基团、羧基团、巯基团，苯基团、苯酚基团或羟基团的官能团。
10.根据权利要求1所述的荧光偏振法，其特征在于，所述荧光染料的荧光寿命是在10纳秒至200纳秒的范围内。
11.一种在分析样品中检测对象的荧光偏振法中使用的试剂，其特征在于，所述试剂包括蛋白与荧光染料共价结合的荧光标记蛋白，
其中所述蛋白是能够特异结合所述检测对象的抗体、受体或抑制剂，
其中所述荧光染料具有芘的骨架结构，且所述蛋白通过肽键结合到所述荧光染料上。
12.一种分析样品中细菌或病毒的荧光偏振法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供抗体与荧光染料共价结合的荧光标记抗体，其中所述荧光染料具有罗丹明、芘、二烷基氨基萘或花色素苷的骨架结构，其中所述抗体能够特异结合所述细菌或病毒；
(b)使所述荧光标记抗体和所述细菌或病毒结合；和
(c)检测在所述荧光标记抗体中由于它与所述细菌或病毒结合而产生的荧光偏振度的变化。
13.根据权利要求12所述的荧光偏振法，其特征在于，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、Fab抗体或(Fab)2抗体。
14.根据权利要求12所述的荧光偏振法，其特征在于，所述细菌可以从下述物质组成的基团中选择：红螺菌科、染色质科、氯新生霉菌科、粘球菌科、弓形血管科、囊状细菌科、多血管科、硫细菌科、沙门氏菌科、白细胞三烯科、色素缺乏科、反线虫科、螺旋体科、螺菌科、假单胞杆菌科、固氮菌科、根瘤菌科、甲基单胞菌科、盐细菌科、肠细菌科、弧菌科、类菌体科、奈瑟菌科、韦永氏球菌科、氧化氮或亚硝酸盐生物、可代谢硫和硫化合物生物、沉淀氧化铁和/或氧化锰的生物、铁辣椒科、甲烷细菌科、需氧和/或兼性厌氧微球菌科、链球菌科、厌氧胨化菌科、杆菌科、乳杆菌科、细菌的棒杆菌基团、丙酸菌科、放线菌科、皮肤真菌科，诺卡菌科、链球真菌科、微单孢子菌科、立克次氏体科、巴尔通氏体科、边虫菌科、衣原体科，支原体科和无胆甾原体科。
15.根据权利要求12所述的荧光偏振法，其特征在于，所述病毒可以从下述物质组成的基团中选择：肠病毒、心脏病毒、鼻病毒、口疮病毒、杆状病毒、环状病毒、呼肠弧病毒、轮状病毒、冷杉双RNM病毒、鱼食双RNA病毒、昆虫双RNA病毒、α-病毒、红玉病毒、鼠疫病毒、黄病毒、流感病毒、肺病毒、副粘病毒、麻疹病毒、水泡性病毒、狂犬病病毒、冠状病毒、布尼奥病毒、沙粒病毒、人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。
16.根据权利要求12所述的荧光偏振法，其特征在于，所述荧光染料可以有可以结合初级、二级或三级氨基基团、羧基团，巯基团、苯基团、苯酚基团或羟基团的官能团。
17.根据权利要求12所述的荧光偏振法，其特征在于，所述荧光染料的荧光寿命是在10纳秒至200纳秒的范围内。
18.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述检测对象是细菌或病毒，而所述特异结合的蛋白是抗体。
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