KR100859506B1 - 프롤린 수산화반응에 의한 ｈｉｆ―1 펩타이드와 ｖｂｃ단백질과의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로분석하는 방법 - Google Patents

프롤린 수산화반응에 의한 ｈｉｆ―1 펩타이드와 ｖｂｃ단백질과의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광편광도를 이용하여 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 분석하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 1) 형광물질이 부착된 하이드록시프롤린(hydroxyproline)기를 포함하는 HIF-1 펩타이드에 형광물질을 부착하여 형광 프로브를 제조하는 단계; 2) 상기 형광 프로브를 VBC 단백질과 반응시키는 단계; 3) 상기 반응물의 형광편광도를 측정한 후 형광 프로브 자체의 형광편광도와 비교하여 형광편광도의 변화를 관찰함으로써 HIF-1-VBC 단백질 결합체의 형성을 정량적으로 분석하는 방법; 상기 방법을 이용하여 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 방해하는 물질을 검색하는 방법; 및 상기 방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제(prolyl hydroxylase)의 활성을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분석방법은 결합유무에 따른 형광편광도의 변화로 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 간단히 분석할 수 있어 웰 플레이트를 이용한 초고속 검색에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

프롤린 수산화반응에 의한 ＨＩＦ―1 펩타이드와 ＶＢＣ 단백질과의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로 분석하는 방법{METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROLINE HYDROXYLATION-INDUCED INTERACTIONS BETWEEN HIF-1 AND VBC PROTEIN COMPLEX USING FLUORESCENCE POLARIZATION}
도 1은 F-P564 및 F-HyP564 펩타이드 각각을 VBC 단백질과 반응시킨 후 결합체 형성 유무를 형광편광도의 변화로 조사한 결과이고,
도 2a는 F-HyP564 펩타이드를 VBC 단백질의 농도를 증가시키면서 반응시킨 후 결합체 형성 유무를 형광편광도의 변화로 조사한 결과이고,
도 2b는 도 2a에서 형성된 F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합체의 결합상수를 칼레이다그래프 (KaleidaGraph) 프로그램을 이용하여 분석한 결과이고,
도 3a는 F-HyP402 펩타이드를 VBC 단백질의 농도를 증가시키면서 반응시킨 후 결합체 형성 유무를 형광편광도의 변화로 조사한 결과이고,
도 3b는 도 3a에서 형성된 F-HyP402 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합체의 결합상수를 칼레이다그래프 프로그램을 이용하여 분석한 결과이고,
도 4a는 F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질의 반응시 저해제 후보물질들 각각을 첨가 한 후 결합체의 형성 유무를 형광편광도의 변화로 조사한 결과이고,
도 4b는 도 4a에서 저해제로 확인된 HyP564 펩타이드의 50% 저해농도를 칼레이다그래프 프로그램을 이용하여 측정한 결과이고,
도 5a는 F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질의 반응시 결합부위를 확인하기 위하여 저해제인 HyP564 펩타이드의 각종 단편을 첨가한 후 형광편광도의 변화를 측정한 결과이고,
도 5b는 도 5a에서 저해효과를 보이는 HyP564 펩타이드의 N-단편 펩타이드의 50% 저해농도를 칼레이다그래프 프로그램을 이용하여 측정한 결과이고,
도 6a는 F-P564 펩타이드를 프롤릴 하이드록실라제로 처리한 후 상기 펩타이드의 수산화반응 여부를 질량분석기(mass spectrometry)로 확인한 결과이고,
도 6b는 F-P564 펩타이드와 프롤릴 하이드록실라제의 효소 반응물을 VBC 단백질과 반응시킨 후 형광편광도를 측정하여 F-P564 펩타이드 또는 F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질의 결합에 따른 형광편광도의 변화와 비교한 결과이다.
본 발명은 하이드록시프롤린을 포함하는 HIF-1 펩타이드에 형광물질을 부착한 프로브와 VBC 단백질의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로 분석하는 방법, 상기 방법을 이용하여 이들간의 상호작용을 저해하는 저해제를 검색하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제의 활성을 분석하는 방법에 관한 것이다.
HIF-1 (hypoxia inducible factor-1; 저산소 유도인자)은 에너지 대사, 혈관운동 제어, 신혈관 형성 및 세포사멸 (apoptosis)에 관여하는 유전자의 발현조절을 비롯하여 저산소 상태에 대한 다양한 세포반응에 있어서 중요한 역할을 하는 단백질이다. 특히, HIF-1α (alpha)는 정상 산소 상태에서는 프로테오솜 (proteosome)에 의해 분해되지만 저산소 상태에서는 안정화되는데, 이러한 조절기전은 pVHL (von Hippel-Lindau tumour suppressor) 단백질과 HIF-1α와의 상호작용에 의해 일어난다. HIF-1α와 pVHL간의 상호작용을 억제하면 저산소 상태에서 세포주기의 진행이 촉진되거나 혈관형성의 항진 또는 세포 생존기능이 항진되기 때문에 관상동맥부전, 뇌부전 및 혈관부전과 같은 허혈 상태의 치료에 바람직하다 (US 6,787,326 B1). 반면, 이들간의 상호작용을 촉진시키는 경우에는 정상 산소 상태에서 혈관형성의 억제를 통해 암 조직의 성장을 억제할 수 있어 암 치료 연구에 매우 유용하다 (Amato G. et al., Nature Reviews 2: 1-9, 2003).
VHL 단백질과 인간 HIF-1α의 결합은 HIF-1α의 아미노산 서열 중 402 또는 564번째에 위치한 하이드록시프롤린기에 의존하는데, 프롤릴 하이드록실라제라는 효소에 의해서 HIF-1α 단백질의 특정 프롤린기가 수산화되어 VHL 단백질과의 상호작용이 조절된다 (Masson N. and Ratcliffe P.J., Journal of Cell Science 116: 3041-3049, 2003). 특히, 프롤릴 하이드록실라제-2 효소는 산소, 철 및 보조인자 (cofactor)인 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 존재하에서 반응이 진행되는데, 이때 효소 자체가 스스로 산화됨으로써 빠른 속도로 비활성화되는 것을 막기 위해서는 아스크로브산염(ascorbate)이 요구된다 (Ivan M. et al., PNAS 99(21): 13459-13464, 2002). 이러한 수산화반응을 통해 전사와 단백질 가수분해 (proteolytic destruction)를 조절하는 메카니즘을 형성함으로써 여러 가지 병적 기전 연구에 도움을 주게 된다.
VHL 단백질은 약 100 개의 아미노산을 갖는 β 영역 (β domain)과 약 35 개의 아미노산으로 이루어진 α 영역 (α domain)으로 구성된다. 이 중 β 영역은 Elongin C 단백질과 결합하여 VHL-Elongin C 복합체를 형성하고, 상기 복합체의 Elongin C 부분에 Elongin B 단백질이 결합하게 됨으로써 VBC 단백질을 형성한다. 상기 VBC 단백질의 나머지 α 영역에 HIF-1α가 결합하게 되는데, 이때 VHL 단백질의 115번째 His기, 111번째 Ser기와 HIF-1α의 564번째 수산화-Pro기와의 수소결합이 중요한 역할을 담당한다 (Min J.H. et al., Science 296: 1886-1889, 2002).
이러한 VHL 단백질과 HIF-1α과의 상호작용을 관찰하기 위해 많은 생화학적 또는 면역학적 방법들이 사용되고 있다. 우선, 2종의 단백질들간의 상호작용을 연구하기 위해 널리 사용되고 있는 2종-혼성화 분석법(two-hybrid assay)을 이용하는 경우, 효모 GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인 (DNA binding domain, DBD)은 VHL 단백질에, 전사 활성화 도메인 (transcriptional activation domain, TAD)은 HIF-1α에 각각 융합시켜 두 단백질이 결합해야만 전사를 활성화시킬 수 있는 특징을 이용한다. 이때, GFP (green fluorescent protein), 루시퍼라제 (luciferase), β-갈락 토시다제 (β-galactosidase) 등과 같은 리포터 (reporter) 유전자를 이용하면 상기 두 단백질의 결합으로 인한 전사활성을 손쉽게 추적할 수 있다. 즉, VHL 단백질과 HIF-1α 단백질이 결합하면 리포터 유전자가 활성화되어 두 단백질간의 상호작용 유무를 관찰할 수 있다 (US 6,787,326 B1).
다른 방법으로는, VHL 단백질과 HIF-1α 단백질 중 한 단백질은 검출가능한 물질로 표지시키고, 나머지 단백질은 고체 담체에 고정시켜 두 단백질의 상호작용을 측정하는 방법이 있다. 검출가능한 표지로는 재조합에 의해 생산되는 단백질에 도입할 수 있는 35S-메치오닌 (35S-methionine), HA 표지 (tag), GST 표지, 히스티딘 표지 등이 있다 (US 6,787,326 B1). 이 중 HIF-1α에 GST를 표지시키고 VHL 단백질에 35S를 표지시켜서 전기영동 (SDS-PAGE)과 자기방사법 (autoradiography)을 이용하여 상호작용을 관찰하는 방법이 보편적으로 이용되고 있다 (Yu F. et al., PNAS 98(17): 9630-9635, 2001). 그러나, 이 방법은 대량의 시료를 요구하고 과정이 복잡하여 실험 소요시간이 길어지며 방사성 동위원소를 사용해야 하는 단점이 있다
이 밖에도 VHL 단백질과 특정한 부분의 HIF-1α를 함께 면역침강(coimmunoprecipitation)시키는 방법이 VHL 단백질과 상호작용하는 HIF-1α의 부분을 스크리닝하는데 이용되고 있다 (Yu F. et al., Cancer Research 61: 4136-4142, 2001). 또한, 표적 화합물에 방사능을 표지하여 단백질이 결합할 때 신틸레이션 (scintillation)이 일어나는 것을 감지하는 신틸레이션 근접 분석법 (scintillation proximity assay)도 이용되고 있다 (US 6,787,326 B1).
그러나, 상기와 같은 생화학적 또는 면역학적 방법이나 방사능을 표지하는 방법들은 과정이 복잡하고 비용이 많이 드는 단점이 있기 때문에, VHL 단백질과 HIF-1α의 결합에 관련된 특성을 관찰하기 위한 보다 간단한 분석법의 개발이 요구되고 있다. 이러한 연구의 일환으로 방사선 원소를 사용하지 않고 단시간에 HIF와 VBC 단백질간의 결합과 수산화반응의 특성을 관찰할 수 있는 96-웰 플레이트 (well plate)를 이용한 분석법이 개발되었다 (F. Oehme 등, Analytical Biochemistry 330: 74-80, 2004). 상기 방법은 바이오틴 (biotin)이 표지된 HIF-1α (biotinyl-HIF-1α)와 VBC 복합체를 반응시킨 후 아비딘 (avidin)이 코팅된 플레이트에 넣은 다음 450 ㎚ 파장에서 OD값을 측정하여 정량하는 방법이다. 이 방법은 수십 나노 몰 수준의 농도범위에서도 HIF의 수산화반응을 관찰하고 간단하게 측정할 수 있다는 장점이 있으나, 고가의 아비딘이 코팅된 플레이트를 반드시 사용해야 한다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 용이하게 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 하이드록시프롤린을 포함하는 HIF-1 펩타이드에 형광물질을 부착한 프로브와 VBC 단백질의 상호작용 여부를 형광편광도의 변화를 이용하여 정량적으로 분석하는 방법을 개발하였다. 본 발명에 따른 분석방법은 결합체를 따로 분리하지 않아 기존의 방법들에 비해 과정이 단순하고 웰 플레이트를 이용한 자동화가 가능하여 분석비용을 극히 절감할 수 있으므로 HIF-1-VBC 단백질의 결합체 형성에 기여하는 펩타이드 단편을 분석하거나, 이들간의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하거나 HIF-1을 수산화시키는 프 롤린 하이드록실라제의 활성을 분석하는데 매우 유용하게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 프롤린 수산화반응에 의한 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질와의 상호작용을 간단하게 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광편광도를 이용하여 프롤린 수산화반응 여부에 따라 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분석방법을 이용하여 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 방해하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 분석방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제(prolyl hydroxylase)의 활성을 분석하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하이드록시프롤린기 (hydroxyproline)를 포함하는 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 분석방법은
1) 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드에 형광물질을 부착하여 형광 프로브를 제조하는 단계;
2) 상기 형광 프로브를 VBC 단백질과 반응시키는 단계; 및
3) 상기 반응물의 형광편광도를 측정한 후 형광 프로브 자체의 형광편광도와 비교하여 형광편광도의 변화를 관찰하는 단계를 포함한다.
단계 1)에서 형광 프로브는 공지된 HIF-1 단백질의 아미노산 서열 중에서 VBC 단백질에 결합하는 것으로 알려진 부위를 대상으로 특정 펩타이드 서열을 선정하여 합성한 후 합성된 펩타이드의 N-말단에 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)를 붙이고 그 끝에 형광물질을 표지시켜 준비한다. 이와 같이 준비된 펩타이드 서열 중 특정 프롤린 잔기를 수화시켜 형광 프로브가 하이드록시프롤린기를 포함하도록 한다.
본 발명에서 펩타이드에 표지될 수 있는 형광물질로는 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 및 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으며, 특정 프롤린 잔기의 수산화는 수산화된 프롤린 아미노산의 첨가(Merck 사의 HyP amino acid를 합성할 때 첨가하여 사용)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 GenBank 등재번호: (U22431)의 HIF-1α 아미노산 서열 중에서 556 내지 575 a.a.에 해당하는 부위와 390 내지 417 a.a.에 해당하는 부위를 선정한 후 각각의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성한다. 합성된 펩타이드의 N-말단에 아미노카프로산 링커를 연결시키고 연결된 링커의 반대쪽에 FITC를 표지하여 서열번호: 1로 기재되는 20개의 아미노산을 갖는 F-P564 및 서열번호: 2로 기재되는 28개의 아미노산을 갖는 F-P402 펩타이드를 제조한다. 상기 F-P564 및 F-P402 펩타이드의 각각 야생형 HIF-1α의 564번째 아미노산에 상응하는 프롤린 (서열번호: 1에서 12번째 아미노산)과 야생형 HIF-1α의 402번째 아미노산에 상응하는 프롤린 (서열번호: 2에서 16번째 아미노산)을 수산화된 프롤린 아미노산의 첨가에 의해 수화시켜 서열번호: 3 및 4로 기재되는 F-HyP564 및 F-HyP402 펩타이드를 합성한다.
단계 2)는 단계 1)에서 준비된 형광 프로브를 VBC 단백질과 반응시키는 단계로, VBC 단백질은 통상적인 유전자 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다.
일반적으로, VBC 단백질은 먼저 VHL 단백질의 β 영역에 Elongin C 단백질을 결합시켜 VHL-Elongin C 복합체를 형성하고, 상기 복합체의 Elongin C 부분에 Elongin B 단백질을 결합시켜 형성된다. VHL, Elongin C 및 Elongin B 유전자는 각각 GenBank에 등재번호 (NM000551), (NM007108) 및 (NM005648)로 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 VHL 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현벡터, Elongin C 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현벡터, 및 Elongin B 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 발현벡터를 제조한 후 이들을 적당한 숙주세포에 동시에 형질전환시켜서 숙주세포내에서 VHL, Elongin C 및 Elongin B 단백질이 하나로 연결된 복합체 형태로 발현시키고, 숙주세포로부터 이를 분리한다. 숙주세포에서 발현된 VBC 단백질은 배양된 세포 또는 배양 용액으로부터 추출하여 분리, 정제할 수 있다. VBC 단백질의 분리, 정제는 많은 공지의 방법에 따라 실시할 수 있는데, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-PAGE와 같은 분자량의 차이를 이용한 방법, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용한 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같이 친수성의 차이를 이용한 방법을 사용할 수 있다.
상기와 같이 제조된 형광 프로브가 부착된 펩타이드와 VBC 단백질을 적당한 완충용액 상에서 25℃에서 1:1 에서 1:14의 비율로 혼합하여 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 상호작용을 유도한다.
단계 3)에서는 형광편광기를 이용하여 반응이 완료된 단계 2)의 반응물의 형광편광도를 측정한 후 측정된 반응물의 형광편광도 값을 형광 프로브 자체의 형광편광도 값과 비교하여 그 변화를 관찰한다. HIF-1 펩타이드에 형광물질이 부착된 형광 프로브는 상대적으로 작은 값의 형광편광도를 갖지만, 이 형광 프로브가 분자량이 큰 VBC 단백질과 결합하여 결합체를 형성하게 되면 형광편광도가 현저히 증가하게 된다. 따라서, 형광 프로브와 VBC 단백질간의 반응 전후의 형광편광도 값의 변화를 관찰하여 형광편광도에 별다른 변화가 없는 경우에는 이들간의 상호작용이 일어나지 않은 것이고, 형광편광도가 현저히 증가한 경우에는 이들간의 상호작용으로 인해 결합체가 형성된 것으로 판단할 수 있다.
상기 방법에 따라 단계 1)에서 제조된 하이드록시프롤린기를 포함하는 F-HyP564 및 F-HyP402 형광 프로브와 하이드록시프롤린기를 포함하지 않는 F-P564 및 F-P402 형광 프로브를 대상으로 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합유무와 특성을 분석하였다.
먼저, 프롤린 수산화반응에 따라 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합양상이 달라지는 알아보기 위하여 F-P564 및 F-HyP564 펩타이드를 각각 VBC 단백질과 25℃에서 반응시킨 후 형광편광도를 측정한 결과, F-P564 펩타이드와 VBC 단백질의 반응물은 F-P564 펩타이드 자체의 형광편광도와 유사한 값을 나타낸 반면, F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질의 반응물은 F-P564 펩타이드 자체보다 현저하게 증가된 형광편광도를 나타내어 하이드록시프롤린기를 갖는 HIF-1 펩타이드가 VBC 단백질과 결합하고 이들의 결합을 형광편광도의 변화로 용이하게 분석할 수 있음을 확인하였다 (도 1 참조).
또한, VBC 단백질의 농도를 증가시키면서 F-HyP564 펩타이드와 반응시킨 결과, 용액상의 VBC 단백질의 농도가 증가함에 따라 형광편광도가 증가하여 (도 2a 참조) F-HyP564 펩타이드가 VBC 단백질의 농도에 의존적 양상으로 상호작용함을 알 수 있었다. 이때, F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합상수는 138.1 nM이었다(도 2b 참조)
다른 프롤린 수산화반응 부위로 알려진 402번째 프롤린에 대한 F-HyP402 펩타이드 형광 프로브에 대해서도 상기와 동일하게 실험한 결과, VBC 단백질의 농도가 증가함에 따라 F-HyP402 펩타이드와 VBC 단백질 반응물의 형광편광도가 증가하는 것으로 나타나 (도 3a 참조), VBC 단백질의 농도에 의존적으로 F-HyP402 펩타이드-VBC 단백질의 결합체가 증가하는 것으로 확인되었다. 이때의 결합상수는 337.79 nM로 나타나 (도 3b 참조) 564번째 프롤린의 수산화반응이 402번째 프롤린의 수산화반응보다 더 강한 VBC 단백질과의 결합을 유발함을 알 수 있었다.
상기 결과들로부터 본원 발명의 분석방법이 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 상호작용에 의한 결합체 형성 유무를 결합체를 따로 분리하지 않고서도 형광편광도를 이용하여 간단하게 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 분석방법을 이용하여 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
상기 검색방법은 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드 형광 프로브와 VBC 단백질의 반응용액에 저해제 후보물질을 첨가하여 반응시킨 후 반응용액의 형광편광도를 측정하여 저해제 후보물질의 첨가여부에 따른 형광편광도의 변화를 관찰한다. 이때, 저해제 후보물질의 첨가에 의해 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 반응물의 형광편광도가 감소된다면, 이 물질은 HIF-1 펩타이드와 서로 경쟁적으로 VBC 단백질에 작용하여 결합체를 형성하는 저해제임을 알 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 이와 같은 경쟁반응을 이용하여 F-HyP564 펩타이드-VBC 단백질의 결합체 형성을 저해하는 물질을 검색하는 가능성을 시험하기 위해 F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질의 반응액에 HyP564 펩타이드의 농도를 증가시키면서 반응시킨 후 형광편광도를 측정한 결과, 일정량의 VBC 단백질에 대해 F-HyP564 펩타이드와 HyP564 펩타이드가 서로 경쟁적으로 작용하여 HyP564 펩타이드-VBC 단백질의 결합체 형성이 증가함에 따라 F-HyP564 펩타이드-VBC 단백질의 결합체 형성은 저해되어 형광편광도가 감소함을 확인하였다 (도 4a 및 4b 참조). 따라서, 본 발명에 따른 형광편광도 분석방법에 이러한 경쟁반응을 적용하면 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질와의 결합을 억제하는 물질을 용이하게 검색할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 형광편광도를 이용한 분석방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제(prolyl hydroxylase)의 활성을 분석하는 방법을 제공한다.
프롤릴 하이드록실라제는 HIF-1의 특정 프롤린기를 수산화시키는 효소로, 상기 방법은 하이드록시프롤린기를 포함하지 않는 HIF-1 펩타이드에 이 효소를 처리하면 특정 프롤린기가 수산화되어 VBC 단백질과 결합할 수 있는지 여부를 분석하는 방법이다.
하이드록시프롤린기를 포함하지 않는 F-P564 펩타이드에 프롤릴 하이드록실라제를 처리한 후 효소 반응물의 질량을 분석하여 F-P564 및 F-HyP564 펩타이드와 비교한 결과, 프롤릴 하이드록실라제의 작용에 의해 F-P564의 564번째 프롤린기가 수산화되었음을 확인하였다 (도 6a 참조). 또한, 형광편광도 분석방법으로 효소 반응물의 VBC 단백질 결합체에 대한 반응 여부를 확인하기 위해 F-P564, F-HyP564 펩타이드 및 효소 반응물 각각을 VBC 단백질과 반응시킨 후 형광편광도를 측정한 결과, 효소 반응물의 형광편광도가 F-HyP564 펩타이드의 경우와 비슷하게 증가됨을 확인하고 (도 6b 참조), 프롤릴 하이드록실라제의 활성에 의해 F-P564 펩타이드가 F-HyP564 펩타이드로 전환되어 VBC 단백질과 결합체를 형성할 수 있고, 이러한 상호작용을 본 발명의 분석방법에 따라 형광편광도의 변화를 관찰함으로써 용이하게 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 형광편광도를 이용하여 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 분석하는 방법을 이용하면 하이드록시프롤린을 지닌 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 정량적으로 평가할 수 있고 HIF-1-VBC 단백질의 결합을 저해하는 물질을 용이하게 검색할 수 있을 뿐만 아니라 프롤릴 하이드록실라제의 활성을 간편하게 측정할 수 있다. 또한, 상기 방법들은 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합체를 따로 분리할 필요가 없어 공정이 간단하고 웰 플레이트상에 적용되어 초고속 검색에 이용할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> VBC 단백질의 제조
인간 폰 히펠-린다우 (Human von Hippel-Lindau) 유전자 단편 (GenBank 등재번호: NM000551 의 아미노산 서열중 54 내지 213 a.a.에 해당)과 인간 Elongin B 단편 (GenBank 등재번호: NM007108 의 아미노산 서열중 1 내지 118 a.a.에 해당)이 pGEX-4T-1의 변형된 벡터에 삽입된 플라스미드(pGEX4T-VHL-EB)와 인간 Elongin C 단편 (GenBank 등재번호: NM005648 의 아미노산 서열중 17 내지 112 a.a.에 해당)이 pET29b의 벡터에 삽입된 플라스미드(pDEV-EC)(Novagen)를 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에 동시에 형질전환하여 대량 발현시켰다.
형질전환된 세포를 37℃에서 50 ㎍/㎖의 암피실린 (ampicillin)을 함유한 LB 배지에 접종하여 흡광도가 0.8 내지 0.9가 될 때까지 배양한 후, 0.5 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)로 발현을 유도하여 18℃에서 15시간 동안 배양하였다. 10 mM 인산염 완충용액 (phosphate based saline buffer; PBS, pH 7.4, 110 mM NaCl 및 1 mM DTT [dithiotheitol])에 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)와 라이소자임 (lysozyme)을 최종 농도가 각각 0.2 mM 및 1 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 후, 원심분리에 의해 회수된 세포를 상기 완충용액에 현탁하고 4℃에서 초음파 처리로 파괴하였다. 세포 추출물에 2% 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 첨가하여 잘 섞어준 후 10분간 얼음에 두었다가 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 이로부터 분리된 상층액에 1 mM DTT를 첨가하여 글루타치온-세파로스 (glutathione-sepharose) 4B 수지 (Bio-Rad)와 혼합한 후 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응된 수지 혼합액에 10배 부피의 인산염 완충용액을 첨가하여 2,100 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 위와 같은 과정을 3회 반복하여 반응되지 않은 상층액을 제거하였다.
바이오스핀 디스포저블 크로마토그래피 컬럼 (Bio-Spin® Disposable Chromatography Columns, Bio-Rad)에 반응된 수지 혼합물을 넣어서 5 ㎖의 PBS로 여과시키고 2 ㎖의 1 M NaCl 용액으로 여과시킴으로써 불필요한 반응물들을 제거하였다. 상기 컬럼을 10 mM 글루타치온 (GSH)으로 용리시켜 GST-VBC 단백질을 회수하였다. 회수된 단백질은 SDS-PAGE로 확인하였고 BCA 단백질 분석법 (Pierce)으로 정량하였다.
< 실시예 2> 형광표지된 HIF -1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합력 분석
<2-1> 형광표지된 HIF -1 펩타이드의 제조
HIF-1α (hypoxia-inducible factor)의 형광 프로브를 제작하기 위하여, HIF-1α 단백질 중 VBC 단백질과 결합하는 것으로 알려진 부분(Min J.H. et al., Science 296: 1886-1889, 2002)의 아미노산 서열중 556 내지 575번째 아미노산 부위와 390 내지 417번째 아미노산 부위를 대상 서열로 선정하고, 그의 N-말단에 아미노카프로산 링커 (aminocaproic acid linker)를 붙이고 그 끝에 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 형태로 펩타이드를 설계한 후 합성하였다 (Anygen, Korea). 이와 같이 합성된 형광 프로브들을 각각 F-P564 및 F-P402 펩타이드로 명명하였고 이들은 서열번호: 1 및 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.또한, 상기 F-P564 및 F-P402 펩타이드 각각의 야생형 HIF-1α의 564번째 아미노산에 상응하는 프롤린 (서열번호: 1에서 12번째 아미노산)과 야생형 HIF-1α의 402번째 아미노산에 상응하는 프롤린 (서열번호: 2에서 16번째 아미노산)이 수화된 F-HyP564 및 F-HyP402 펩타이드를 합성하였고 (Anygen, Korea), 이들은 각각 서열번호: 3 및 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.
실시예 1에서 제조된 VBC 단백질과 상기와 같이 합성된 펩타이드를 사용하여 단백질-리간드의 복합체 형성시 변화하는 형광편광도를 측정함으로써 이들간의 결합유무와 결합특성을 하기와 같이 분석하였다. 이때, 형광편광도는 형광분석기 (fluorometer, Perkin-Elmer)를 이용하여 측정하였고, 슬릿의 크기는 5 ㎚, 적분 시간은 5초로 설정하였다. 50 mM Tris 및 120 mM NaCl을 포함하고 pH가 8.0으로 조정된 완충용액에 NP-40 (nonidet P40)을 0.5%가 되도록 실험하기 전에 첨가하여 결합 실험에 사용하였다.
<2-2> 형광표지된 HIF -1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합 분석
상기 실시예 <2-1>에서 합성된 펩타이드 형광 프로브가 VBC 단백질과 결합하는지 여부를 형광편광도의 변화로 분석하기 위하여, 상기에서 미리 준비한 완충용액에 F-P564 펩타이드와 F-HyP564 펩타이드를 각각 100 nM 농도로 용해시킨 후 800 nM VBC 단백질을 첨가하고 25℃에서 혼합하였다. 혼합 후 형광편광도를 측정한 결과, 하이드록시프롤린기를 포함하지 않는 F-P564 펩타이드의 형광편광도는 0.066인 반면, 하이드록시프롤린기를 포함하는 F-HyP564 펩타이드의 형광편광도는 0.324로 증가하였다 (도 1). 이러한 결과는 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드가 분자량이 큰 VBC 단백질과의 상호작용에 의해 결합체를 형성함으로써 형광편광도가 현저히 증가한 것이고, 이러한 결합체의 형성을 형광편광도의 변화로 간단하 게 분석할 수 있음을 나타내는 것이다.
<2-2> VBC 단백질의 농도 변화에 따른 형광표지된 HIF -1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합 분석
F-HyP564 펩타이드에 VBC 단백질의 농도를 0 에서 1400 nM로 증가시키면서 상기 실시예 <2-2>와 동일한 조건에서 반응시킨 후 형광편광도의 변화를 측정한 결과, 용액상의 VBC 단백질의 농도가 증가함에 따라 형광편광도 역시 비례적으로 증가하여, F-HyP564 펩타이드-VBC 단백질의 결합체 형성이 VBC 단백질의 농도에 따라 증가하는 것이 확인되었다 (도 2a).
도 2a의 결과로부터 F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합상수를 구하기 위해 하기 반응식 1 및 2를 사용하여 칼레이다그래프 (KaleidaGraph) 프로그램으로 계산한 결과, F-HyP564 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합상수는 138.1 nM이었다 (도 3b).
반응식 1
FP: 시료의 형광편광도,
FP0: [VBC]=0일 때의 형광편광도,
FPmax: F-HyP564 펩타이드가 모두 VBC 단백질과 결합체를 형성했을 때의 형광편광도,
[VBC]0: 시료중의 VBC 단백질 농도,
[F-HyP564]0: 시료중의 F-HyP564 펩타이드의 농도,
Kd: VBC 단백질과 F-HyP564 펩타이드 사이의 결합상수
반응식 2
[HyP564]: 시료중의 HyP564 펩타이드의 농도
KD: VBC와 HyP564 펩타이드 사이의 결합상수
또한, 다른 프롤린 수산화반응 부위로 알려진 402번째 프롤린을 대상으로 한 F-HyP402 펩타이드에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 VBC 단백질의 농도를 증가시키면서 반응시킨 후 형광편광도를 측정한 결과, F-HyP402 펩타이드의 경우에도 VBC 단백질의 농도가 증가할수록 형광편광도가 증가하였다 (도 3a). 반응식 1 및 2를 이용하여 칼레이다그래프 프로그램으로 계산한 결과, F-HyP402 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합상수는 337.79 nM이었다 (도 3b).
상기 결과로부터, HIF-1 단백질의 564번째 프롤린의 수산화반응이 402번째 프롤린의 수산화반응보다 더 강한 VBC 단백질과의 상호작용을 유발하며, 이러한 상호작용에 의해 형성된 결합체의 형성을 형광편광도의 변화로 간편하게 분석할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 3> F- HyP564 펩타이드 - VBC 단백질 결합체 형성의 저해물질 검색
상기 실시예 2에서 검증된 형광편광도 분석방법을 이용하여 경쟁반응으로 F-HyP564 펩타이드-VBC 단백질 결합체의 형성을 저해하는 물질을 검색할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여 형광물질이 표지되지 않은 HyP564 펩타이드를 저해제로 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 2와 동일한 완충용액에 100 nM의 F-HyP564 펩타이드와 500 nM의 VBC 단백질을 첨가한 후 여기에 HyP564 펩타이드의 농도를 0 에서 500 μM로 증가시키면서 25℃에서 혼합하였다. 상기 반응액의 형광편광도를 측정한 결과, HyP564 펩타이드를 첨가하지 않은 경우에 비하여 첨가한 경우에 형광편광도가 감소하였고 (도 4a), 이때 HyP564 펩타이드와 VBC 단백질간의 결합상수는 3.71 μM이었다 (도 4b). 상기 결과는 HyP564 펩타이드가 VBC 단백질에 대하여 F-HyP564 펩타이드와 서로 경쟁적으로 작용하기 때문에 HyP564 펩타이드-VBC 단백질 결합체의 형성이 증가함에 따라 F-HyP564 펩타이드-VBC 단백질 결합체의 형성이 저해된 것이고, 이를 이용하면 HIF-1-VBC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 용이하게 검색할 수 있음을 나타내는 것이다.
< 실시예 4> F- HyP564 펩타이드 - VBC 단백질 결합체의 형성에 결정적인 부위 확인
F-HyP564 펩타이드에서 VBC 단백질과 특이적으로 결합하는 부분을 결정하기 위하여, 서열번호: 1로 기재되는 아미노산 서열 중에서 N 단편 (아미노산 서열 ALAPYPA)과 C 단편 (아미노산 서열 DDDFQLR), 및 N 단편의 프롤린기가 수산화된 Hy-N 단편 펩타이드 (아미노산 서열 ALAHyPYPA)를 합성하였다 (Anygen, Korea).
상기 실시예 <2-2>와 동일한 조건으로 100 nM의 F-HyP564 펩타이드와 500 nM의 VBC 단백질을 포함하는 시료를 제조하고 여기에 P564 펩타이드, N, C 및 Hy-N 단편 각각의 농도를 0 에서 500 μM로 증가시키면서 첨가하여 혼합 후 이들의 형광편광도 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, P564 펩타이드, N 단편 및 C 단편이 첨가된 시료에서는 미미한 형광편광도의 감소만이 높은 농도의 펩타이드에서 관찰되어 경쟁반응에 의해 HyP564 펩타이드-VBC 단백질 결합체의 형성이 별로 저해되지 않았음을 알 수 있었다. 반면, Hy-N 단편 펩타이드가 첨가된 시료에서는 이의 농도가 증가함에 따라 형광편광도의 급격한 감소를 보였는데, 상기 펩타이드에 의한 저해효과를 반응식 1 및 2를 이용하여 칼레이다그래프 프로그램으로 정량 분석한 결과 20 μM의 결합상수를 얻었다 (도 5b).
이로부터 F-HyP564 펩타이드에서 VBC 단백질과의 상호작용에 중요한 역할을 담당하는 부위가 하이드록시프롤린기를 포함하는 부위임을 확인하였다.
< 실시예 5> 형광편광도 측정을 통한 프롤릴 하이드록실라제 활성 분석
HIF-1α의 특정 프롤린기를 수산화반응시키는 효소로 알려진 HIF-1α 특이적인 프롤릴-4-하이드록실라제-2 (prolyl-4 hydroxylase-2, PHD-2)로 F-P564 펩타이드를 처리한 후 이 펩타이드가 VBC 단백질과 결합하는지 여부를 형광편광도를 이용하여 조사하였다.
먼저, 인간 림프구 cDNA 라이브러리 (human lymphocyte cDNA library)로부터 클로닝한 인간 PHD2 유전자(GenBank 등재번호: AJ310543)를 pET21b 벡터(Novagen)에 클 로닝하여 얻은 플라스미드 pET21b-PHD2를 대장균에 형질전환시킨 후 대량 발현시켰다. 상기 대장균 형질전환체로부터 대량 발현된 PHD2 단백질을 히스티딘-표지 (Histidine-tag)를 이용하여 니켈-친화성 크로마토그래피 (Ni-affinity chromatography)와 겔-여과 (gel-filtration)로 정제한 후, 초원심분리 (ultracentrifugation)로 농축하여 얻은 프롤릴 하이드록실라제를 이후의 분석에 이용하였다.
프롤린 수산화반응 분석을 위해서 최종 농도가 2 mM 아스코르브산 (ascrobic aicd), 5 mM α-케토글루타레이트 (α-ketoglutarate) 및 100 μM 염화 제2철 수화물 (Iron (Ⅱ) Chloride Hydrate)이 되도록 완충용액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5% NP-40)에 분석 직전에 첨가하였다. 여기에 상기에서 정제된 4 ㎍ 프롤린 하이드록실라제와 16 μM F-P564 펩타이드를 혼합한 후 30℃에서 90분간 반응시켰다. 반응 후 F-P564, F-HyP564 펩타이드 및 효소 반응물을 MALDI 질량분석기 (mass spectrometry)로 분석하여 F-P564 펩타이드의 프롤린기가 수산화되었음을 확인하였다 (도 6a).
상기 실시예 <2-2>와 동일한 완충액 및 반응조건에서 F-P564, F-HyP564 펩타이드 및 효소 반응물(F-P564 : 100 nM, F-HyP564 : 100 nM, 효소반응물 : 500 nM) 각각을 500 nM VBC 단백질과 25℃에서 혼합 후 형광편광도를 측정하였다. 그 결과, F-P564 펩타이드를 첨가한 경우에 비하여 효소 반응물을 첨가한 경우의 형광편광도가 F-HyP564 펩타이드를 첨가한 경우와 비슷한 수준으로 현저하게 증가되었음을 확인하였다 (도 6b).
이로부터 하이드록시프롤린기를 포함하지 않는 HIF-1 펩타이드가 프롤릴 하이드록실라제에 의해 특정 프롤린기가 수산화되어 VBC 단백질과 결합할 수 있음을 형광편광도의 변화로 간단하게 확인할 수 있으며, 이를 이용하여 프롤릴 하이드록실라제의 활성 또한 분석할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 분석법을 이용하면 하이드록시프롤린을 지닌 HIF-1 펩타이드에 형광물질을 부착한 프로브와 VBC의 결합을 정량적으로 평가할 수 있고 HIF-1-VBC 결합을 저해하는 물질의 검색 및 프롤릴 하이드록실라제 효소의 활성을 간편하게 측정할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형광편광도를 이용하여 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 결합양상을 분석하는 방법은 HIF-1-VBC 단백질 결합체를 따로 분리하는 과정없이 간단하게 형광편광도의 증감을 통해 분석할 수 있으며, 상기 분석방법은 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하고 프롤릴 하이드록실라제의 활성을 분석하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROLINE HYDROXYLATION-INDUCED INTERACTIONS BETWEEN HIF-1 AND VBC PROTEIN COMPLEX USING FLUORESCENCE POLARIZATION <130> 06-27 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F-P564 peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> labeled with FITC <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> aminocaproic acid linker <400> 1 Ala Cys Ala Asp Leu Asp Leu Glu Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Ala 1 5 10 15 Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg 20 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F-P402 peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> labeled with FITC <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> aminocaproic acid linker <400> 2 Ala Cys Ala Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn Asp 20 25 30 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F-HyP564 peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> labeled with FITC <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> aminocaproic acid linker <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> hydrpxylation <400> 3 Ala Cys Ala Asp Leu Asp Leu Glu Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Ala 1 5 10 15 Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg 20 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F-HyP402 peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> labeled with FITC <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> aminocaproic acid linker <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> hydroxylation <400> 4 Ala Cys Ala Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn Asp 20 25 30

Claims (10)

1) 서열번호: 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 플루오레신 이소티오시아네이트(이하, FITC)가 HIF(Hypoxia-inducible factor)-1 펩타이드에 부착된 형광 프로브를 제조하는 단계;
2) 상기 형광 프로브를 인간 폰 히펠-린다우 단백질(Human von Hippel-Lindau protein(NM000551))과 엘론긴 B(Elongin B)(NM007108) 및 엘론긴 C(Elongin C)(NM005648) 복합체(이하 VBC라 함) 단백질과 반응시키는 단계; 및
3) 상기 반응물의 형광편광도를 측정한 후 형광 프로브 자체의 형광편광도와 비교하여 형광편광도의 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 프롤린 수산화반응에 따른 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로 분석하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)에서 형광 프로브는 HIF-1 단백질의 아미노산 서열(GenBank 등재번호 : U22431) 중에서 VBC 단백질에 결합하는 것으로 알려진 부위인 아미노산 서열중 556 내지 575번째 아미노산 부위(서열번호: 1) 또는 390 내지 417번째 아미노산 부위(서열번호: 2)로 구성되는 HIF-1 펩타이드를 합성하고, 합성된 펩타이드의 N-말단에 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)를 붙이고, 그 끝에 FITC를 표지시킨 후 특정 프롤린 잔기를 수화시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 특정 프롤린 잔기는 야생형 HIF-1의 아미노산 서열 564번과 402번의 프롤린인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 단계 2)에서는 FITC가 부착된 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질을 완충용액 상에서 25℃에서 1:1 에서 1:14의 비율로 혼합하여 즉시 측정 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)에서 측정된 단계 2) 반응물의 형광편광도가 형광 프로브의 형광편광도보다 증가된 경우에는 형광 프로브와 VBC 단백질이 결합체를 형성한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
1) 서열번호: 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 FITC가 HIF(Hypoxia-inducible factor)-1 펩타이드에 부착된 형광 프로브와 VBC 단백질의 반응용액에 저해제 후보물질을 첨가하여 반응시키는 단계;
2) 상기 반응용액의 형광편광도를 측정하여 저해제 후보물질의 첨가여부에 따른 형광편광도의 변화를 관찰하는 단계; 및
3) 저해제 후보물질의 첨가에 의해 하이드록시프롤린기를 포함하는 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질의 반응물의 형광편광도가 감소된 경우에 상기 후보물질을 저해제로 판정하는 단계를 포함하는 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법.
삭제
1) 하이드록시프롤린기를 포함하지 않는 서열번호: 1 또는 2로 기재되는 HIF-1 펩타이드에 FITC가 부착된 형광프루브에 프롤릴 하이드록실라제(prolyl hydroxylase)를 처리하는 단계;
2) 상기 효소 반응물을 VBC 단백질과 반응시킨 후 형광편광도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 측정된 형광편광도를 하이드록시프롤린기를 포함하는 서열번호: 3 또는 4로 기재되며 FITC가 부착된 HIF-1 펩타이드와 VBC 단백질 결합체의 형광편광도와 비교하는 단계를 포함하는 프롤릴 하이드록실라제의 활성을 분석하는 방법.
삭제
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