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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren
zum Analysieren eines Testobjektes in einer Probe. Besonders bezieht
sich die vorliegende Erfindung auf ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren,
das beim Analysieren von Bakterien oder Viren in einer Probe nützlich ist. Die
vorliegende Erfindung ist nützlich
in den Technikgebieten der medizinischen Diagnose, des Umwelttestes
und der Lebensmittelkontrolle, anwendbar auf Lebensmittelvergiftung
und Infektionserkrankungen.
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Hintergrundtechnik
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Das
Fluoreszenzpolarisationsverfahren ist in der Technik als ein Verfahren
zum Testen einer Substanz in einer Probe bekannt. Das Verfahren
ist auf dem Prinzip basiert, dass, wenn eine fluoreszenzmarkierte
Verbindung durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, die von
der Verbindung emittierte Fluoreszenz einen Polarisationsgrad hat,
der in einem Verhältnis
zu ihrem Molekulargewicht steht.
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Als
ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren, das entwickelt worden ist,
gibt es einen Fluoreszenzpolarisationsimmuntest, der auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion
basiert.
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Zum
Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 4,902,630 ein Testverfahren
(8 ist ein Konzeptdiagramm, das das Testprinzip
zeigt), in welchem eine Körperflüssigkeit
(besonders Blut), die CRP (5), ein Testobjekt, enthält, zu einer
vermischten Lösung
hinzugefügt
wird, welche das Folgende enthält:
einen durch die Bindung von Fluorescein, ein Fluorochrom, an C-reaktives
Protein (CRP) erhaltenen „Tracer" (6); und
einen Antikörper
(4), der spezifisch an CRP bindet. CRP (5) in
der Probe wird untersucht auf der Basis des Wettbewerbs zwischen
dem Tracer (6) und CRP (5) um den Antikörper (4)
in der gemischten Lösung.
Da dieses Testsystem auf einer kompetitiven Reaktion basiert ist,
erfordert es eine 2-Schritt-Bindungsreaktion,
wodurch der Testvorgang verkompliziert wird. Weiterhin hat das in
dem Test verwendete Fluorescein eine kurze Lebensdauer der Fluoreszenz
und folglich ist es schwierig, es in einem Test für eine Substanz
mit einem hohen Molekulargewicht anzuwenden.
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Die
japanische Patentanmeldung Nr. 62-38363 offenbart ein Immuntestgerät für einen
Test eines Antigens oder Antikörpers
unter Nutzung einer Immunreaktion. Es wird gelehrt, dass in dem
Test ein fluoreszenzmarkierter Antikörper verwendet werden kann.
Die Anwendung beschreibt jedoch kein spezifisches Ausführungsbeispiel
des Testes. Über
ein Testobjekt legt es nur Rechenschaft ab über eine Substanz, wie zum
Beispiel ein im Blut existierendes Arzneimittel (z. B. Digoxin),
deren Molekulargewicht deutlich niedriger ist als jenes eines co-existierenden Proteins.
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Folglich
gab es einen Bedarf für
die Entwicklung eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens mit einem
einfachen Testreaktionssystem und einer einfachen Testoperation
und besonders ein Verfahren, das für einen Test einer Substanz
mit hohem Molekulargewicht geeignet ist.
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Offenbarung der Erfindung
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Ein
Ziel der gegenwärtigen
Erfindung ist, ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren zum Analysieren eines
in einer Probe enthaltenen Testobjektes durch Messen einer Änderung
in dem Grad seiner Fluoreszenzpolarisation bereitzustellen, besonders
ein Verfahren bereitzustellen, das geeignet ist für einen
Test einer Substanz mit hohem Molekulargewicht. Ein anderes Ziel
der vorliegenden Erfindung ist, ein Reagenz zum Analysieren eines
in einer Probe enthaltenen Testobjektes unter Ausnutzen eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
bereitzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren
zum Analysieren eines Testobjektes in einer Probe, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte einschließt: (a) Bereitstellen eines
fluoreszenzmarkierten Proteins, in welchem ein Protein kovalent
an ein Fluorochrom(e) gebunden ist, worin das Protein ein Antikörper, ein
Rezeptor oder ein Inhibitor ist, welches in der Lage ist, spezifisch
an das Testobjekt zu binden; (b) es dem fluoreszenzmarkierten Protein
ermöglichen,
an das Testobjekt zu binden; und (c) Messen einer Änderung in
dem Grad der Fluoreszenzpolarisation, welche in dem fluoreszenzmarkierten
Protein durch dessen Bindung an das Testobjekt stattgefunden hat.
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In
dem oben beschriebenen Verfahren kann der Antikörper, der zur spezifischen
Bindung an das Testobjekt in der Lage ist, ein polyklonaler Antikörper, ein
monoklonaler Antikörper,
ein chimärer
Antikörper, ein
Fab-Antikörper
oder ein (Fab)2-Antikörper
sein.
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In
dem oben beschriebenen Verfahren kann das Testobjekt eine biologische
Substanz, ein Mikroorganismus, einschließlich Bakterien, ein Virus,
ein Arzneimittel, ein Umweltschadstoff oder ein missbrauchtes Arzneimittel
sein. Die biologische Substanz kann ein Peptid, ein Protein, ein
Lipid, ein Saccharid oder eine Nukleinsäure sein. Das Protein als eine
biologische Substanz kann ein Molekulargewicht von 500.000 oder
mehr haben.
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Das
Protein als eine biologische Substanz kann ein Antikörper, ein
Hormon, ein Entzündungsmarker,
ein Gerinnungsfaktor, ein Apolipoprotein, ein High-Density-Lipoprotein
(HDL), ein Low-Density-Lipoprotein (LDL), ein glycosyliertes Albumin,
ein glycosyliertes Hämoglobin,
ein Hämoglobin,
ein Krebsmarker oder ein Enzym sein.
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Das
Hormon kann Choriongonadotropin, Thyroid-Stimulierungshormon, Progesteron,
follikelbildendes Hormon, Parathyroid-stimulierendes Hormon, adrenocorticotropes
Hormon oder Insulin sein.
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Der
Entzündungsmarker
kann C-reaktives Protein (CRP), α1-Antitrypsin
(α1-AT), α1-Antichymotrypsin
(α1-X), α1-saures
Glycoprotein (α1-AG), Haptoglobin
(Hp), Ceruloplasmin (Cp), der neunte Komplementfaktor (C9), der
vierte Komplementfaktor (C4), der dritte Komplementfaktor (C3),
Komplementfaktor B (B), Fibrinogen (Fbg), Serumamyloid A (SAA),
C1-Inhibitor (C1I), ein Sialoglycoprotein (d. h. ein Glycoprotein,
an welches eine Sialinsäure
gebunden ist), ein säurelösliches
Protein (ASP) oder ein immunsuppressives saures Protein (IAP) sein.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Reagenz für die Verwendung
bei einem Fluoreszenzpolarisationsverfahren zum Analysieren eines
Testobjektes in einer Probe, wobei das Reagenz ein fluoreszenzmarkiertes
Protein einschließt,
in welchem ein Protein kovalent an ein Fluorochrom gebunden ist,
worin das Protein ein Antikörper,
ein Rezeptor oder ein Inhibitor ist, das in der Lage ist, spezifisch
an das Testobjekt zu binden.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren
zum Analysieren von Bakterien oder Viren in einer Probe, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte einschließt: (a) Bereitstellen eines
fluoreszenzmarkierten Antikörpers,
in welchem ein Antikörper
kovalent an ein Fluorochrom gebunden ist, worin der Antikörper in
der Lage ist, an die Bakterien oder das Virus spezifisch zu binden;
(b) es dem fluoreszenzmarkierten Antikörper ermöglichen, an die Bakterien oder das
Virus zu binden; und (c) Messen einer Änderung in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation,
welche in dem fluoreszenzmarkierten Antikörper durch dessen Bindung an
die Bakterien oder das Virus stattgefunden hat.
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In
dem oben beschriebenen Verfahren kann der Antikörper ein polyklonaler Antikörper, ein
monoklonaler Antikörper,
ein chimärer
Antikörper,
ein Fab-Antikörper
oder ein (Fab)2-Antikörper sein.
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In
dem oben beschriebenen Verfahren können die Bakterien ausgewählt sein
aus der Gruppe, bestehend aus Rhodospirillaceae, Chromatiaceae, Chlorobiaceae,
Myxococcaceae, Archangiaceae, Cystobacteraceae, Polyangiaceae, Cytophagaceae, Beggiatoaceae,
Simonsiellaceae, Leucotrichaceae, Achromatiaceae, Pelonemataceae,
Spirochaetaceae, Spirillaceae, Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae,
Rhizobiaceae, Methylomonadaceae, Halobacteriaceae, Enterobacteriaceae,
Vibrionaceae, Bacteroidaceae, Neisseriaceae, Veillonellaceae, Organismen,
die Ammoniak oder Nitrit oxidieren, Organismen, die Schwefel und
Schwefelverbindungen metabolisieren, Organismen, die Eisen und/oder
Manganoxide abscheiden, Siderocapsaceae, Methanobacteriaceae, aerobe
und/oder fakultativ anaerobe Micrococcaceae, Streptococcaceae, anaerobe
Peptococcaceae, Bacillaceae, Lactobacillaceae, die coryneforme Gruppe
der Bakterien, Propionibacteriaceae, Actinomycetaceae, Mycobacteriaceae,
Frankiaceae, Actinoplanaceae, Dermatophilaceae, Nocardiaceae, Streptomycetaceae, Micromonosporaceae,
Rickettsiaceae, Bartonellaceae, Anaplasmataceae, Chlamydiaceae,
Mycoplasmataceae und Acholeplasmataceae.
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In
dem oben beschriebenen Verfahren kann das Virus ausgewählt sein
aus der Gruppe, bestehend aus Enterovirus, Cardiovirus, Rhinovirus,
Aphthovirus, Calicivirus, Orbivirus, Reovirus, Rotavirus, Abibirnavirus,
Piscibirnavirus, Entomobirnavirus, Alphavirus, Rubivirus, Pestivirus,
Flavivirus, Influenzavirus, Pneumovirus, Paramyxovirus, Morbillivirus, Vesiculovirus,
Lyssavirus, Coronavirus, Bunyavirus, Arenavirus, menschliches Immunschwächevirus,
Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus und Hepatitis-C-Virus.
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In
dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren der vorliegenden Erfindung
kann das Fluorochrom eine funktionelle Gruppe haben, welche an eine
primäre,
sekundäre
oder tertiäre
Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Phenylgruppe,
eine Phenolgruppe oder eine Hydroxylgruppe binden kann. Die Lebensdauer
der Fluoreszenz des Fluorochroms kann in dem Bereich von 10 Nanosekunden
bis 200 Nanosekunden liegen. Das Fluorochrom kann eine Skelettstruktur
von Rhodamin, Pyren, Dialkylaminonaphthalen oder Cyanin haben.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Reagenz für die Verwendung
in einem Fluoreszenzpolarisationsverfahren zum Analysieren von Bakterien
oder eines Virus in einer Probe, wobei das Reagenz einen fluoreszenzmarkierten
Antikörper einschließt, in welchem
ein Antikörper
kovalent an ein Fluorochrom gebunden ist, worin der Antikörper in
der Lage ist, spezifisch an das Testobjekt zu binden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Konzeptdiagramm, welches das Prinzip der vorliegenden Erfindung
in dem Falle zeigt, bei dem ein fluoreszenzmarkierter Antikörper verwendet
wird.
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2 ist
ein Diagramm, das ein Syntheseschema einer Succinimidyl-1-pyrenbutansäure zeigt.
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3 ist
ein Konzeptdiagramm, welches das Markieren eines Antikörpers mit
Fluorochromen zeigt.
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4 ist
eine Graphik, die Messergebnisse des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
der vorliegenden Erfindung für
C-reaktives Protein (CRP) zeigt.
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5 ist
eine Graphik, die Messergebnisse des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
der vorliegenden Erfindung für
ein High-Density-Lipoprotein (HDL) zeigt.
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6 ist
eine Graphik, die Messergebnisse des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
der vorliegenden Erfindung für
ein Low-Density-Lipoprotein (LDL) zeigt.
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7 ist
eine Graphik, die Messergebnisse des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
der vorliegenden Erfindung für
E. coli 0157 zeigt.
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8 ist
ein Konzeptdiagramm, das das Testprinzip eines üblichen Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
zeigt.
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Beste Weise
für die
Durchführung
der Erfindung
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In
einem Testsystem des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird
ein Protein mit einer fluoreszierenden Substanz markiert, worin
das Protein ein Antikörper,
ein Rezeptor oder ein Inhibitor ist, welches in der Lage ist, spezifisch
an das Testobjekt zu binden. Durch Vermischen des fluoreszenzmarkierten
Proteins mit dem Testobjekt kann die Anwesenheit des Testobjektes
bestätigt
werden. 1 zeigt das Prinzip der vorliegenden
Erfindung in dem Falle, in welchem ein fluoreszenzmarkierter Antikörper verwendet
wird. Durch Mischen eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers, welcher
durch Markieren eines Antikörpers
(1), der in der Lage ist, spezifisch an das Testobjekt
zu binden, mit einem Fluorochrom (2) gewonnen wird, mit
dem Testobjekt (3) wird die Anwesenheit des Testobjektes
(3) bestätigt.
Da die für
den Test erforderliche Reaktion eine Ein-Schritt-Reaktion ist, kann
das Reaktionssystem vereinfacht werden, wodurch die Testoperation
vereinfacht wird, ebenso wie die Testzeit verkürzt wird.
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In
dem Testsystem der vorliegenden Erfindung wird eine Änderung
in dem Molekulargewicht begleitend mit der Bindung des fluoreszenzmarkierten
Proteins an das Testobjekt als eine Änderung in der molekularen
Orientierung über
die Zeit gemessen. Folglich ist es möglich durch Auswählen des
Fluorochroms unter Berücksichtigung
der Änderung
in dem Molekulargewicht vor und nach der Bindung, verschiedene Testobjekte
mit hohem Molekulargewicht (ungefähr 500.000 oder mehr) zu untersuchen, z.
B. ein Testobjekt mit einer Größe, die
gleich ist oder größer ist
als ein Virus (ungefähr
20 Nanometer (nm) oder mehr als ein Partikel). Derselbe Fluorochromtyp
kann für
verschiedene Testobjekte mit unterschiedlichen Molekulargewichten
verwendet werden, solange das Fluorochrom eine Lebensdauer der Fluoreszenz
entsprechend der Änderung
in dem Molekulargewicht vor und nach der Bindung hat.
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Die
vorliegende Erfindung wird unten detaillierter beschrieben werden.
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Mit
dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren der vorliegenden Erfindung
ist es möglich,
ein Testobjekt in einer Probe zu analysieren (d. h. Quantifizieren,
Detektieren oder Identifizieren), basierend auf dem oben beschriebenen
Prinzip des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens.
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Durch
kovalentes Binden des Proteins, welches entweder als ein Antikörper, ein
Rezeptor oder ein Inhibitor klassifiziert ist, und welches in der
Lage ist, spezifisch an das Testobjekt zu binden (auf das hiernach
Bezug genommen wird als das „spezifisch bindende
Protein"), mit einem
Fluorochrom, wird ein fluoreszenzmarkiertes Protein, das bei dem
Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, bereitgestellt.
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Das
spezifisch bindende Protein hat eine gewünschte Bindungsfähigkeit
im Hinblick auf das Testobjekt. Das spezifisch bindende Protein
ist ein Protein, welches als irgendeines von Antikörpern, Rezeptoren
oder Inhibitoren klassifiziert ist, solange es eine funktionelle
Gruppe hat, welche für
die Bindung an das Fluorochrom sorgt. Ein Antikörper wird besonders bevorzugt
aufgrund seines breiten Anwendungsspektrums. Der Antikörpertyp
schließt
einen polyklonalen Antikörper,
einen monoklonalen Antikörper,
einen chimären
Antikörper,
einen Fab-Antikörper
und einen (Fab)2-Antikörper
ein. Jeder Antikörpertyp
kann auf das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Ein Rezeptor kann in dem Falle verwendet werden, wo das Testobjekt
als ein Ligand für
den Rezeptor wirkt. Zum Beispiel kann ein Inhibitor verwendet werden
in dem Fall, wo das Testobjekt ein Enzym ist.
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Als
das Fluorochrom werden jene mit einer funktionellen Gruppe genutzt,
welche kovalent an eine funktionelle Gruppe des spezifisch bindenden Proteins
gebunden werden können
(typischerweise eine primäre,
sekundäre
oder tertiäre
Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Phenylgruppe,
eine Phenolgruppe oder eine Hydroxylgruppe). Besonders in dem Fall,
bei welchem ein Protein, wie zum Beispiel ein Antikörper, als
das spezifisch bindende Protein verwendet wird, wird von der Bindungseffizienz
her ein Fluorochrom mit einer aktivierten funktionellen Gruppe (z.
B. einer halogenierten Sulfonylgruppe, einer mit Succinimid substituierten Carboxylgruppe
oder einer mit Isothiocyanat substituierten primären Aminogruppe) gewünscht werden.
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Die
Anzahl der an ein Molekül
des markierten Objektes (d. h. das spezifisch bindende Protein) gebundenen
Fluorochrommoleküle
kann zufällig
variiert werden. Es wird bevorzugt, um die Detektionsempfindlichkeit
zu steigern, zwei oder mehr Fluorochrome zu binden. Wenn jedoch
mehr Fluorochrome als notwendig gebunden sind, kann dies nachteilig eine
Eigenschaft des spezifisch bindenden Proteins beeinflussen. Zum
Beispiel kann es die Affinität,
Löslichkeit
oder Ähnliches
des Antikörpers
reduzieren. Deshalb beträgt
die oben beschriebene Bindungszahl bevorzugt 10 oder weniger und
bevorzugter 1.
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Wenn
die Skelettstruktur des zu verwendenden Fluorochroms ausgewählt wird,
sind die Exzitationswellenlänge,
die Fluoreszenzwellenlänge,
die Stokes'sche
Verschiebung und die Lebensdauer der Fluoreszenz wichtig. Vorzugsweise
liegen entweder die Exzitationswellenlänge und/oder die Fluoreszenzwellenlänge oder
beide in dem Wellenlängenbereich
des sichtbaren Lichts (d. h. 300 nm bis 700 nm). Vorzugsweise beträgt der Unterschied
in der Wellenlänge
zwischen der Exzitationswellenlänge
und der Fluoreszenzwellenlänge
(d. h. die Stokes'sche
Verschiebung) wenigstens 20 nm oder mehr). Die Lebensdauer der Fluoreszenz
(die Fluoreszenzrelaxationszeit) des Fluorochroms ist typischerweise
ausgewählt
aus dem Bereich von ungefähr
10 Nanosekunden bis ungefähr
1.000 Nanosekunden und vorzugsweise ausgewählt aus dem Bereich von ungefähr 10 Nanosekunden
bis ungefähr
200 Nanosekunden. Ein Fluorochrom mit einer äußerst langen Fluoreszenzlebensdauer,
die ungefähr
1.000 Nanosekunden überschreitet,
wird nicht bevorzugt, da der Polarisationsgrad wegen der langen
Lebensdauer kaum aufrechterhalten werden kann, unabhängig davon,
wie groß das
Testobjekt ist. Beim Auswählen
der Lebensdauer der Fluoreszenz wird die Änderung im Molekulargewicht
des fluoreszenzmarkierten Proteins durch die Bindung an das Testobjekt
berücksichtigt.
Dies liegt daran, dass sich der Polarisationsgrad der Fluoreszenz,
die von dem an das Testobjekt gebundenen, fluoreszenzmarkierten
Protein emittiert wird, in einer verhältnismäßigen Beziehung mit der Größe des Moleküls befindet.
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Besonders
wird, wenn die Änderung
in dem Molekulargewicht ungefähr
5.000 bis ungefähr 50.000
beträgt
(d. h. wenn das Molekulargewicht des Testobjektes etliche Tausend
bis etliche Zehntausend ist), ein Fluorochrom mit einer Lebensdauer
der Fluoreszenz von ungefähr
1 bis ungefähr
15 Nanosekunden bevorzugt. Beispiele solch eines Fluorochroms schließen Cyanin
und Rhodamin ein. Wenn die Änderung
in dem Molekulargewicht ungefähr 50.000
bis ungefähr
500.000 beträgt
(d. h. wenn das Molekulargewicht des Testobjektes ungefähr etliche Zehntausend
bis etliche Hunderttausend beträgt), wird
ein Fluorochrom mit einer Lebensdauer der Fluoreszenz von ungefähr 10 Nanosekunden
bis ungefähr
150 Nanosekunden bevorzugt. Beispiele solch eines Fluorochroms schließen Dialkylaminonaphthalene
und Pyrenderivate ein. Wenn die Änderung
in dem Molekulargewicht ungefähr
500.000 bis ungefähr
5.000.000 beträgt
(d. h. wenn das Molekulargewicht des Testobjektes ungefähr etliche
Hunderttausend bis etliche Millionen ist), wird ein Fluorochrom mit
einer Lebensdauer der Fluoreszenz von ungefähr 100 Nanosekunden bis ungefähr 1.000
Nanosekunden bevorzugt. Beispiele solch eines Fluorochroms schließen Pyrenderivate
und Metallkomplexe ein.
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Aus
den oben beschriebenen Gesichtspunkten schließen bevorzugte Beispiele von
Fluorochromen Fluorochrome mit einer Skelettstruktur von Rhodamin,
Pyren, einem Dialkylaminonaphthalen, Cyanin oder Ähnlichem
ein. Ein besonders bevorzugtes Fluorochrom mag einen Fluorochrom
mit einer Skelettstruktur eines Dialkylaminonaphthalens oder Pyrens
sein.
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Die
Reaktion der Bildung der kovalenten Bindung zwischen dem spezifisch
bindenden Protein und dem Fluorochrom kann nach Fachleuten wohl bekannten
Bedingungen durchgeführt
werden. Wenn das spezifisch bindende Protein eine primäre, sekundäre oder
tertiäre
Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Phenylgruppe,
eine Phenolgruppe oder eine Hydroxylgruppe hat, kann die kovalente
Bindung durch Reagieren lassen des spezifisch bindenden Proteins
und des Fluorochroms mit einer aktivierten funktionellen Gruppe,
normalerweise bei Raumtemperatur für etliche Stunden, gebildet werden.
Nach dem Abschluss der Reaktion kann das nicht umgesetzte Fluorochrom
durch ein gewöhnliches
Verfahren (z. B. Gelfiltration oder Dialyse) leicht entfernt werden.
Das spezifisch bindende Protein und das Fluorochrom können direkt
gebunden sein oder können
indirekt gebunden sein über
ein bifunktionales Linkermolekül
oder Ähnliches.
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Unter
Verwendung des oben beschriebenen fluoreszenzmarkierten Proteins
ist es möglich,
das Testobjekt in einer Probe wie folgt zu analysieren.
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Die
das Testobjekt enthaltende Probe und das fluoreszenzmarkierte Protein
werden miteinander in einer Lösung
so vermischt, um den Grad der Fluoreszenzpolarisation des fluoreszenzmarkierten Proteins
in der vermischten Lösung
zu messen. Falls notwendig wird der Grad der Fluoreszenzpolarisation des
fluoreszenzmarkierten Proteins in der Abwesenheit des Testobjektes
ebenfalls gemessen werden. Jeder Polarisationsmessapparat kann für das Messen
des Grades der Fluoreszenzpolarisation verwendet werden. Die Messung
wird bei einer milden Temperatur durchgeführt (ungefähr 10 Grad Celsius (°C) bis ungefähr 40 °C) und bevorzugt
bei einer konstanten Temperatur.
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Die
Messung des Grades der Fluoreszenzpolarisation kann durchgeführt werden
durch Messen des Grades nach einer vorbestimmten Zeit ab dem Vermischen
des Testobjektes mit dem fluoreszenzmarkierten Protein oder durch
Messen einer Änderung
in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation für eine Zeiteinheit. Indem eine
Messung zu dem Zeitpunkt gemacht wird, in welchem die Bindung zwischen
dem Testobjekt und dem fluoreszenzmarkierten Protein vollständig abgeschlossen
ist, werden reproduzierbarere Messwerte erhalten. Durch Messen der Änderung
in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation für eine Zeiteinheit während der
die Bindungsreaktion zwischen dem Testobjekt und dem fluoreszenzmarkierten
Protein fortschreitet, ist auf der anderen Seite eine schnellere
Messung möglich.
Für den Zweck
der Identifikation des Testobjektes wird ein Messwert eines Fluoreszenzpolarisationsgrades
für eine
bekannte Standardprobe mit dem Messwert für das unbekannte Testobjekt
in der Probe verglichen. Für
den Zweck der Quantifizierung des Testobjektes, das in der Probe
enthalten ist, wird eine Standardkurve durch eine Messung des Fluoreszenzpolarisationsgrades
unter Verwendung einer Lösung
bereitgestellt, die eine bekannte Konzentration des Testobjektes
enthält,
um sie mit dem Messwert für
die Probe zu vergleichen.
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Mit
dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren der vorliegenden Erfindung
ist es möglich,
eine schnelle Messung für
ein Protein mit einem hohen Molekulargewicht, besonders ungefähr 1.000.000 oder
mehr, und für
Bakterien oder ein Virus durchzuführen, was in der Vergangenheit
schwierig war. Deshalb wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung beim
Testen eines Objektes bevorzugt, besonders von jenen mit einem hohen
Molekulargewicht. Das Fluoreszenzpolarisationsverfahren der vorliegenden Erfindung
ist besonders nützlich;
da es möglich
ist, den Bakterien- oder Virustyp zu identifizieren.
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Die
Probe, von der beabsichtigt wird, dass sie mit dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Material, das ein
Testobjekt einschließt,
von dem gewünscht
wird, dass es analysiert wird, in allen Gebieten der Technik, einschließlich medizinischer
Diagnose, Umwelttest und Lebensmittelkontrolle. Beispielhafte Proben
für medizinische
Diagnose schließen
Körperflüssigkeiten,
einschließlich
einer Blut-, einer Lymph- und einer Gewebeflüssigkeit, ein. Beispielhafte
Proben für
Umwelttest schließen
aus Boden, einem Fluss, der Luft oder Ähnlichem gesammelte Materialien
ein. Beispielhafte Proben für
die Lebensmittelkontrolle schließen einen Extrakt aus gemahlenem
Fleisch und einen Extrakt von einem Schneidbrett ein. Die Probe
kann in jeder Form vorliegen, solange sie mit dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann.
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Die
Testobjekte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung schließen ein,
obwohl sie nicht darauf beschränkt
sind, eine biologische Substanz, einen Mikroorganismus, ein Virus,
ein Pharmazeutikum, einen Umweltschadstoff und ein missbrauchtes Arzneimittel.
Bevorzugt ist das Testobjekt eine Substanz mit hohem Molekulargewicht,
mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20.000 bis 30.000 oder mehr,
bevorzugter ungefähr
100.000 bis 200.000 oder mehr, sogar noch bevorzugter ungefähr 500.000
oder mehr und am bevorzugtesten ungefähr 1.000.000 oder mehr. Alternativ
ist das Testobjekt vorzugsweise eine Substanz mit einer Größe von ungefähr 2 nm
oder mehr, bevorzugter ungefähr
10 nm oder mehr und am bevorzugtesten 20 nm oder mehr.
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Die
biologische Substanz bezieht sich auf jede organische oder anorganische
Substanz, die in dem Körper
eines Menschen oder anderen Säugers vorkommt.
Typische Beispiele der biologischen Substanz schließen ein
Peptid, ein Protein, ein Lipid, ein Saccharid und eine Nukleinsäure ein.
Hierin bezieht sich das Peptid als eine biologische Substanz auf jene
mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 1.000. Das Protein als eine
biologische Substanz bezieht sich auf jene mit einem Molekulargewicht
von ungefähr
1.000 oder mehr. Beispiele des Proteins schließen einen Antikörper, ein
Hormon, einen Entzündungsmarker,
einen Gerinnungsfaktor, ein Apolipoprotein, ein High-Density-Lipoprotein (HDL),
ein Low-Density-Lipoprotein
(LDL), ein glycosyliertes Albumin, ein glycosyliertes Hämoglobin,
ein Hämoglobin,
einen Krebsmarker und ein Enzym ein. Beispiele des Krebsmarkers
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf α-Fetoprotein
(AFP), CEA, CA19-9, Ferritin, ein immunsuppressives saures Protein
(IAP), β2-Mikroglobulin
(BMG), TPA, Polyamin, eine Polyaminfraktion, basisches Fetoprotein
(BFP), SCC-Antigen, neuralspezifische Enolase (NSE), Sialyl-Le-i-Antigen
(SLX), CYFRA21-1, CA15-3, BGA225, Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor
(PgR), 5'-Nukleotidphosphodiesteraseisozym-V (5'-NPD-V), Vitamin-K-Mangelprotein II
(PIVKA-II), CA19-9, Elastase I, CA50, SPan-1, DUPAN-2, KMO I, NCC-ST-439,
CA125, CA130, CA72-4, Sialyl-Tn-Antigen (STN), SP4,
fee-HOG-β,
PAP, PA, γ-Seminoprotein
(γ-Sm) und Ähnliche.
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Der
Mikroorganismus schließt
Bakterien, einen Pilz und ein Protozoon ein. Als das Testobjekt können Bakterien
wichtig sein, Enterobacteriaceae und Vibrionaceae können wichtiger
sein und Salmonella und enterohämorrhagisches
Escherichia coli, das zu den Enterobacteriaceae gehört, und
Vibrio parahaemolyticus, das zu den Vibrionaceae gehört, können besonders
wichtig sein. Das Virus schließt ein
bakterielles Virus, ein Pflanzenvirus und ein Tiervirus ein. Als
das Testobjekt mögen
menschliches Immunschwächevirus
(AIDS-Virus), Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus
und Hepatitis-C-Virus besonders wichtig sein. Das Pharmazeutikum
schließt
jedes Mittel ein, das für
die Behandlung oder die Diagnose eines Menschen oder anderen Säugers verwendet wird.
Der Umweltschadstoff schließt
jede Substanz ein, die Umweltverschmutzung verursacht, welche aus
Boden, einem Fluss, der Luft oder Ähnlichem nachgewiesen werden
kann. Das missbrauchte Arzneimittel bezieht sich auf ein Arzneimittel,
deren Einnahme durch einen Menschen durch Gesetz oder Verordnung
beschränkt
ist, und welches unter Verletzung der Beschränkung verwendet worden ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Reagenz bereit, einschließend ein
fluoreszenzmarkiertes Protein, welches für die Verwendung in dem oben beschriebenen
Verfahren geeignet ist. Das fluoreszenzmarkierte Protein kann in
verschiedenen Formen wie trockener Form, einer Lösungsform, worin das Protein
in einer Pufferlösung
gelöst
ist, oder Ähnlichem
bereitgestellt werden.
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Von
den folgenden Beispielen der Erfindung ist beabsichtigt, dass sie
die vorliegende Erfindung erläutern,
jedoch nicht beschränken.
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Beispiele
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Hierin
unten werden die Ergebnisse von Messungen gemäß der vorliegenden Erfindung
beschrieben werden für
Testobjekte mit hohem Molekulargewicht: C-reaktives Protein (CRP;
Molekulargewicht: 120.000); ein High-Density-Lipoprotein (HDL; Molekulargewicht:
ungefähr
400.000), ein Low-Density-Lipoprotein (LDL; Molekulargewicht: 3.000.000), und
enterohämorrhagisches
E. coli 0157 (E. coli 0157; Größe: 2 μm). Es wurden
bei den Messungen ein polyklonaler Anti-CRP-Antikörper, ein
polyklonaler Anti-HDL-Antikörper, ein
polyklonaler Anti-LDL-Antikörper
und ein polyklonaler Anti-E.coli-0157-Antikörper verwendet, jeweils mit
einem Pyrenderivat markiert. Das Pyrenderivat ist ein Fluorochrom
mit einer Fluoreszenzlebensdauer von ungefähr 50 Nanosekunden bis ungefähr 500 Nanosekunden,
was einer Änderung
im Molekulargewicht von ungefähr
100.000 bis ungefähr
5.000.000 entspricht. F-4000, hergestellt von Hitachi Ltd., wurde
als ein Gerät
zum Messen des Fluoreszenzpolarisationsgrades verwendet.
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Beispiel 1
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Synthese von Succinimidyl-1-pyrenbutansäure (SPB)
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SPB
wurde nach dem in 2 gezeigten Syntheseschema zubereitet.
In 20 ml Dimethylsulfoxid (DMF), wurden 2,25 g 1-Pyrenbutansäure (7,8 mmol:
erhalten von Molecular Probes Inc.) und 1,2 g N-Hydroxysuccinimid
(10,4 mmol: erhalten von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gelöst. Nachdem
die vermischte Lösung
auf 0 °C
abgekühlt
worden ist, wurden 2,69 g 1,3-Dichlorhexylcarbodiimid (13,1 mmol:
DCC) hinzugefügt.
Dann wurde die Mischung bei 0 °C
für 24
Stunden unter Rühren
zur Reaktion gebracht. Nachdem die reagierte Lösung mit einem 0,45 μm-Filter
filtriert worden ist, wurde das Filtrat gesammelt und unter Verwendung
eines Verdampfers getrocknet. Dann wurde das Filtrat rekristallisiert
aus 95 % Ethanol, wodurch 1,88 g Succinimidyl-1-pyrenbutansäure gewonnen
wurden (Ausbeute: 70 %).
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Die
gewonnene SPB wurde durch ein IR-Spektrometer und NMR analysiert.
Die Infrarotabsorption der Carboxylgruppe (1692 cm–1)
verschwand und die Infrarotabsorption der Imidgruppe (1783 cm–1,
1785 cm–1 und
1817 cm–1)
tauchte auf. Auch aus den Ergebnissen von NMR für 1H
und 13C wurde das Produkt als SPB identifiziert.
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Beispiel 2
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Zubereitung eines pyrenmarkierten
polyklonalen Antikörpers
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Ein
pyrenmarkierter polyklonaler Antikörper wurde wie unten beschrieben
zubereitet unter Verwendung eines polyklonalen Anti-CRP-Antikörpers (erhalten
von Bio Reactive), eines polyklonalen Anti-HDL-Antikörpers (erhalten
von Cosmo Bio Co., Ltd.), eines polyklonalen Anti-LDL-Antikörpers (erhalten
von Cosmo Bio Co., Ltd.) und eines polyklonalen Anti-E.coli-0157-Antikörpers (erhalten
von Funakoshi), zusammen mit dem in Beispiel 1 oben synthetisierten
SPB.
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Es
wurde jeweils eine Lösung
(1.000 μl),
enthaltend 2,0 mg/ml jedes der polyklonalen Antikörper, in
einer phosphatgepufferten Salzlösung
(PBS), pH 7,4, mit einer Lösung
(20 μl),
enthaltend 1,29 mg/ml SPB (5-fache Menge des Antikörpers),
gelöst
in Dimethylsulfoxid (DMSO), vermischt. Diese vermischten Lösungen wurden
bei Raumtemperatur für
vier Stunden zur Reaktion gebracht. Die zur Reaktion gebrachten
Lösungen
wurden jeweils Sephadex-G-25-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) (Größe: 10×60 mm,
Durchflussrate: ungefähr
2 ml/min) ausgesetzt. Nicht umgesetztes SPB wurde entfernt und die
den pyrenmarkierten polyklonalen Antikörper enthaltenden Fraktionen
wurden gesammelt.
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Die
gesammelten Fraktionen wurden verwendet, um die Markierungsmenge
und die Fluoreszenzeigenschaft des zubereiteten pyrenmarkierten polyklonalen
Antikörpers
zu beurteilen.
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Die
Markierungsmenge wurde gemessen unter Verwendung eines Ultraviolett/sichtbar-Spektrometers (hergestellt
von Shimadzu Corp., UV-1600PC), wobei die Markierung bestätigt wurde von:
1,1 Pyrene pro ein Molekül
des polyklonalen Anti-CRP-Antikörpers,
0,9 Pyrene pro ein Molekül
des polyklonalen HDL-Antikörpers,
0,5 Pyrene pro ein Molekül
des polyklonalen Anti-LDL-Antikörpers,
und 1,2 Pyrene pro ein Molekül
des polyklonalen Anti-E.coli-0157-Antikörpers. 3 zeigt
eine Abbildung der Pyrenbindung an einen Antikörper.
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Die
Fluoreszenzeigenschaft wurde gemessen unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers
(hergestellt von Shimadzu Corp., RF-5300PC), wobei gefunden wurde,
dass die Fluoreszenzeigenschaft von Pyren, das an jeden der markierten
Antikörper
gebunden worden ist, so war, dass die Exzitationswellenlänge 330
nm und die resultierenden Fluoreszenzwellenlängen 373 nm und 397 nm waren. Da
die Fluoreszenzintensität
bei 397 nm größer war, wurden
als die mit dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren zu verwendenden
Messbedingungen festgelegt, die Exzitationswellenlänge von
330 nm und die Fluoreszenzwellenlänge von 397 nm zu nutzen.
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Beispiel 3
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Messung von
CRP mit pyrenmarkiertem polyklonalen Anti-CRP-Antikörper
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Eine
Lösung
(700 μl),
enthaltend den pyrenmarkierten polyklonalen Anti-CRP-Antikörper mit
400 μg/ml,
wurde in eine Küvette
(5×5 mm)
gegeben, um den Grad an Fluoreszenzpolarisation zu messen. Die Messbedingungen
für den
pyrenmarkierten polyklonalen CRP-Antikörper waren wie folgt: eine
Messtemperatur von 35 °C,
eine Exzitationswellenlänge von
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von 397 nm und ein G-Faktor
von 0,942.
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Eine
CRP-Lösung
mit einer CRP-Konzentration von 0 bis 50 mg/dl (erhalten von O.E.M.
Concepts, Inc.) wurde zubereitet. Die oben beschriebene Antikörperlösung (700 μl) und die
CRP-Lösung
(30 μl)
wurden miteinander vermischt und bei 35 °C für 0,5 Minuten gerührt, wonach
der Grad der Fluoreszenzpolarisation unter den oben beschriebenen
Bedingungen für
0,5 Minuten gemessen worden ist, wodurch die Änderung in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation
gemessen wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass für CRP bis
zu einer Konzentration von 30 mg/dl gemessen werden kann. Die Ergebnisse
sind in 4 gezeigt.
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Beispiel 4
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Messung von
HDL mit pyrenmarkiertem polyklonalen Anti-HDL-Antikörper
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Eine
Lösung
(700 μl),
enthaltend den pyrenmarkierten polyklonalen HDL-Antikörper mit
400 μg/ml
wurde in eine Küvette
(5×5 mm)
gegeben, um den Grad an Fluoreszenzpolarisation zu messen. Die Messbedingungen
für den
pyrenmarkierten polyklonalen Anti-HDL-Antikörper waren wie folgt: eine
Messtemperatur von 35 °C,
eine Exzitationswellenlänge von
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von 397 nm und ein G-Faktor von 0,943.
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Eine
HDL-Lösung
mit einer HDL-Konzentration von 0 bis 500 mg/dl (erhalten von Cosmo
Bio Co., Ltd.) wurde zubereitet. Die oben beschriebene Antikörperlösung (700 μl) und die
HDL-Lösung
(5 μl) wurden
miteinander vermischt und bei 35 °C
für 0,5 Minuten
gerührt,
wonach der Grad an Fluoreszenzpolarisation unter den oben beschriebenen
Bedingungen für 0,5
Minuten gemessen worden ist, wodurch die Änderung in dem Grad an Fluoreszenzpolarisation
gemessen wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass HDL bis zu
einer Konzentration von 500 mg/dl gemessen werden konnte. Die Ergebnisse sind
in 5 gezeigt.
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Beispiel 5
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Messung von
LDL mit pyrenmarkiertem polyklonalen Anti-LDL-Antikörper
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Eine
Lösung
(700 μl),
enthaltend den pyrenmarkierten polyklonalen Anti-LDL-Antikörper mit
400 μg/ml,
wurde in eine Küvette
(5×5 mm)
gegeben, um den Grad der Fluoreszenzpolarisation zu messen. Die
Messbedingungen für
den pyrenmarkierten polyklonalen Anti-LDL-Antikörper waren wie folgt: eine Messtemperatur
von 35 °C,
eine Exzitationswellenlänge
von 330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge von 397 nm und ein G-Faktor von 0,943.
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Eine
LDL-Lösung
mit einer LDL-Konzentration von 0 bis 1650 mg/dl (erhalten von Cosmo
Bio Co., Ltd.) wurde zubereitet. Die oben beschriebene Antikörperlösung (700 μl) und die
LDL-Lösung
(5 μl) wurden
miteinander vermischt und bei 35 °C
für 0,5 Minuten
gerührt,
wonach der Grad an Fluoreszenzpolarisation unter den oben beschriebenen
Bedingungen für
0,5 Minuten gemessen wurde, wodurch die Änderung in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation
gemessen wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass LDL bis zu
einer Konzentration von 1000 mg/dl gemessen werden konnte. Die Ergebnisse
sind in 6 gezeigt.
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Beispiel 6
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Messung von LDL mit pyrenmarkiertem
polyklonalen Anti-E.coli-0157-Antikörper
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Eine
Lösung
(700 μl),
enthaltend den pyrenmarkierten polyklonalen Anti-E.coli-0157-Antikörper mit
400 μg/ml,
wurde in eine Küvette
(5×5 ml)
gegeben, um den Grad an Fluoreszenzpolarisation zu messen. Die Messbedingungen
für den
pyrenmarkierten polyklonalen Anti-E.coli-0157-Antikörper waren
wie folgt: eine Messtemperatur von 35 °C, eine Exzitationswellenlänge von
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von 397 nm und ein G-Faktor von 0,942.
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Eine
Lösung
mit E. coli 0157 (erhalten von Funakoshi) wurde zu der oben beschriebenen
Antikörperlösung (700 μl) hinzugefügt, so dass
die Endkonzentration von 0 bis 1,2 × 109 Zellen/ml
ist. Die vermischte Lösung
wurde bei 35 °C
für 0,5
Minuten gerührt,
wonach der Grad an Fluoreszenzpolarisation unter den oben beschriebenen
Bedingungen für 0,5
Minuten gemessen wurde, wodurch die Änderung in den Grad der Fluoreszenzpolarisation
gemessen wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass E. coli 0157
bis zu einer Konzentration von 1,0 × 108 Zellen/ml
gemessen werden konnte. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren
mit einem einfachen Testreaktionssystem und einer einfachen Testoperation
bereit, und besonders ein Verfahren, das geeignet ist für einen
Test einer Substanz mit hohem Molekulargewicht.