DE69705711T2

DE69705711T2 - Bindungssysteme auf basis von wasserunvermischibaren lösungsmitteln

Info

Publication number: DE69705711T2
Application number: DE69705711T
Authority: DE
Inventors: Paul Aston; Lathan Ball; Jennifer Cryer; Ian Weeks
Original assignee: Molecular Light Technology Ltd; Molecular Light Technology Research Ltd
Current assignee: Gen Probe Cardiff Ltd
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2017-04-25
Also published as: DE69705711D1; WO1997040382A1; ES2161457T3; EP0900377A1; GB2312746B; US6344331B1; EP0900377B1; GB2312746A; GB9608611D0; AU2397697A; HK1019090A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Ausrüstungen zur Ermittlung oder Untersuchung, ob ein Analyt in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel anwesend ist.
Die Begriffe "mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel" und "wässrige Lösung" sollen weit ausgelegt werden, um Flüssigkeiten einzuschließen, die durch Rühren teilweise vermischbar sind, sich jedoch nach dem Ruhen in zwei Schichten trennen, um eine Flüssigkeits-/Flüssigkeitszwischenschicht zu bilden.

Hintergrund der Erfindung

Ligand-Bindungstests sind in großem Rahmen eingesetzt worden, um Verbindungen von biologischer Bedeutung zu erfassen und zu quantifizieren, die in Fluiden anwesend sind, wie etwa einem Serum. Derartige Tests beruhen auf der Wechselwirkung zwischen der Verbindung, die analysiert werden soll (dem Analyt) und einem speziellen Bindungspartner, wie etwa einem Antikörper. Das Ausmaß der Bindungsreaktion wird allgemein überwacht durch den Einsatz eines Markers, wie etwa eines radioaktiven Labels, welches bei sehr niedrigen Konzentrationen ermittelt werden kann. Diese Testtechniken sind in großem Rahmen zum Einsatz gekommen zur Messung von wasserlöslichen Substanzen, wie etwa Proteinen, und auch bei der Quantifizierung von Verbindungen, wie etwa Steroiden oder Thyroidhormonen, die nur sehr geringfügig in Wasser lösbar sind, jedoch normalerweise assoziiert sind mit spezifischen oder nicht spezifischen Bindungsproteinen. Untersuchungen dieser letzteren Verbindungen involvieren häufig die Extraktion der Substanz von Interesse in ein mit Wasser nicht vermischbares Lösungsmittel, die Entfernung des Lösungsmittels durch Evaporation und dann die "Solubilisierung" der Verbindung in einem wässrigen Medium, um im wesentlichen ein Einphasensystem zur Verfügung zu stellen, in welchem eine Reaktion mit einem Bindungspartner, wie etwa einem Antikörper, eintreten kann. Derartige Techniken sind arbeitsintensiv und lassen sich nur in spezialisierten Laboratorien ausführen.
Die fortschreitende Übertragung von Ligand-Bindungstests auf nicht spezialisierte Laboratorien und der ansteigende Einsatz in analytischen Anwendungen außerhalb klinischer Diagnosen erfordern eine Vereinfachung der grundlegenden analytischen Verfahren, um sie einem nicht spezialisierten Personal zugänglich zu machen, wobei dies als "Feld"-Situation angesehen werden kann.
Es wurde allgemein in Betracht gezogen, daß das Testsystem im wesentlichen eine einzige flüssige Phase umfassen sollte, und wie aus dem Stand der Technik deutlich wird, komplexe und teuere Verfahren zum Einsatz gekommen sind, um eine Probe eines Analyten in einem organischen Lösungsmittel lösbar zu machen, das für die Analyse durch Ligand-Bindungstests geeignet ist.
Es wurde jedoch überraschenderweise herausgefunden, daß ein wirkungsvoller Ligand-Bindungstest in einem Zweiphasenflüssigkeitssystem aufgebaut werden kann, bei welchem der Bindungspartner eine wässrige Phase und der Analyt eine im wesentlichen mit Wasser unvermischbare Lösungsmittelphase ist, wobei die Bindung an oder in der Nähe der Zwischenschicht zwischen den Flüssigkeiten eintritt.

Beschreibung des Stand der Technik

Das Konzept eines physiologisch abgeleiteten Moleküls, wie etwa eines Antikörpers, der seine Aktivität unter Bedingungen beibehält, in welchen er einem organischen Lösungsmittel ausgesetzt wird, ist sowohl unerwartet als auch unvorhersagbar. Russell et al (Biochem Biophys Res Comm 1989; 158: 80) haben gezeigt, daß immobilisierte Antihaptenantikörper Hapten in der Anwesenheit von mit Wasser unvermischbaren Lösungsmitteln binden, wie etwa Dioxan und Acetonitril. Jedoch deren Experimente zeigten, daß die Bindungsaffinität der Antikörper signifikant durch die Anwesenheit des Lösungsmittels reduziert war und auch daß die Bindung progressiv reduziert war, wenn die Hydrophobizität des eingesetzten Lösungsmittels gesteigert wurde.
Anschließend fand Weetall (J Immunol Meth 1991; 136: 139) daß Antikörper, die an paramagnetische Partikel angeheftet waren, in der Lage waren, die Bindeaktivität in mit Wasser unvermischbaren Lösungsmitteln, wie etwa Hexan, beizubehalten.
Francis und Graston (Analyst 1994; 119: 1801) entwickelte einen Immuntest für Parathion in Hexan, wobei der Antikörper in reversen Micellen eingekapselt war. Auf diese Weise wurde der Antikörper durch den Einschluß in der Micelle "geschützt".
Kürzlich haben Matsuura et al (J Biochem 1993; 114: 273) die Bindung eines Schellfischtoxins an Antikörpern in der Anwesenheit von Methanol beschrieben, obwohl sie kein quantitatives analytisches Verfahren entwickelt haben.
Die US-PS 4,238,472 beschreibt ein Verfahren, bei welchem Proben mit einem in Wasser nicht vermischbarem Lösungsmittel extrahiert wurden, welches anschließend durch Evaporation entfernt wurde. Die getrockneten Rückstände werden in einem Detergenz aufgenommen, welches eine Emulsion bildet mit den Testreaktionsteilnehmern, wobei im wesentlichen ein Einphasenflüssigkeitssystem erzeugt wurde.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung mit der Nummer WO 92112427 beschreibt ein Testverfahren, wobei die Probe in ein Hexan extrahiert wird, wobei nach einer weiteren Reinigung das Hexan durch Evaporation entfernt wird, während die Probe in einem wasserlöslichen Lösungsmittel (Methanol) wieder gelöst wurde. Dieses wird dann in einen wässrigen Testpuffer verdünnt und bildet wiederum eine einzige Phase.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration eines Analyten in einem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel mit den folgenden Schritten zur Verfügung gestellt:
(i) Mischen einer Probe des mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittels mit einer wässrigen Lösung, welche einen spezifischen Bindungspartner des Analyten enthält, so daß eine Bindung zwischen dem Bindungspartner und dem Analyten (sofern vorhanden) möglich ist und
(ii) direktes oder indirektes Überwachen des Ausmaßes der Assoziierung zwischen dem Analyten und dem Bindungspartner, wodurch die Anwesenheit und/oder die Konzentration des Analyten bestimmt wird.
Die Vorteile dieses Verfahrens schließen die Tatsachen ein, daß das Verfahren ein Zweiphasenflüssigkeitssystem zur Verfügung stellt, in welchem die Bindung eintreten kann und daß der Bindungsparnter in starkem Maße abgeschirmt oder geschützt werden kann durch einen Verbleib in der wässrigen Phase und daß die natürliche Trennung der wässrigen und Lösungsmittelphasen in vielen Fällen die Trennung der Fraktionen des gebundenen und ungebundenen Analyten vereinfacht.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt ist das Bindungsreaktionsmittel ein Antikörper, versehen mit einer Substanz, die es gestattet, das Ausmaß der Bindung leicht zu beurteilen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gestatten die Entwicklung von quantitativen oder qualitativen analytischen Verfahren zur Bestimmung der hydrophoben Verbindungen, die in mit Wasser unvermischbaren Lösungsmitteln anwesend sind, wie etwa Hexan, Xylol und Toluol, wobei das geeignete Bindungsreaktionsmittel in einem wässrigen Medium mit der Lösungsmittelprobe derart gerührt wird, daß die Verbindung mit dem Bindungsreaktionsmittel an oder in der Nähe der Wasser-/Lösungsmittelzwischenfläche reagiert, so daß es wirkungsvoll "eingefangen" wird durch das Reaktionsmittel in der wässrigen Schicht. Das Ausmaß, das auf diese Weise eingefangen wird, ist eine Funktion der Konzentration des Analyten in der Lösungsmittelprobe und kann leicht bestimmt werden durch Standard-Ligand-Bindungsverfahren, wofür es geeignete Beispiele gibt, die dem Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt sind.
Es leuchtet ohne weiteres ein, daß diese Näherung eine signifikante Vereinfachung repräsentiert zur Erfassung oder Beurteilung eines Analyten, der ursprünglich in einem Lösungsmittel anwesend ist, verglichen mit Verfahren, die eine vorherige Extraktion der Probe oder die Herstellung von reversen Micellen erfordern zum Einkapseln des Bindungsreaktionsmittels. Solche Betrachtungen sind besonders wichtig wenn ein Verfahren entwickelt wird für den Feldeinsatz.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt schließt die Erfindung den Einsatz von monoklonalen Antikörpern in Lösungen in einem wässrigen Puffer ein, der mit einer Probe eines hydrophobischen Haptens, welches in einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel anwesend ist, geschüttelt wird. Die Antikörper, die mit einem Marker gekennzeichnet werden können, sind spezifisch für das Hapten, welches normalerweise nicht in die wässrige Phase übergeht. Nach dem Schütteln über einen vorbestimmten Zeitabschnitt gestattet man der Mischung ein kurzes Abstehen, um es zu gestatten, daß sich die wässrigen und die mit Wasser nicht vermischbaren Lösungsmittelschichten trennen können. Die wässrige Schicht wird in ein Reaktionsrohr übertragen, welches ein immobilisiertes Derivat des Analyten enthält. In einer weiteren Reaktion wird der gekennzeichnete Antikörper, der nicht mit dem Analyten in der Probe reagiert hat, an das Derivat in dem Rohr gebunden. Das Ausmaß dieses Bindungsantikörpers, welches umgekehrt variiert mit der Konzentration des Analyten in der ursprünglichen Lösungsmittelprobe kann durch geeignete Maßnahmen quantiziert werden, nachdem jeglicher nicht reagierte Antikörper ausgewaschen ist. Das Ausmaß des Analyten, der in der ursprünglichen Probe anwesend ist, kann durch Bezug auf Reaktionen von Eichlösungen berechnet werden.
Dieses Verfahren stellt einige einmalige Vorteile zur Verfügung, insbesondere in Beziehung auf den Aufbau von Felduntersuchungen. Zunächst gestattet die Tatsache, daß das Bindungsreaktionsmittel in der Lösung frei und nicht immobilisiert ist, ein maximales Reaktionsausmaß mit dem Antigen, wenn die beiden Lösungen miteinander verrührt werden. In der Praxis kann eine Reaktionszeit von nur einer Minute ausreichend sein, um eine signifikante Bindung zu erzeugen. Des weiteren ist das Reaktionsausmaß konzentrationsabhängig, so daß die Messung eines exakten Probenvolumens nicht kritisch ist. Die Vermeidung von komplexen Pipettierungsschritten ist in hohem Maße für Felduntersuchungen erstrebenswert.
Es leuchtet auch ohne weiteres ein, daß einfache Anpassungen des Grundverfahrens eine Flexibilität bei der Wahl der Reaktionsmittel bereitstellen. Zum Beispiel ist es gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung möglich, eine wässrige Lösung, die einen nicht gekennzeichneten Antikörper enthält, mit der mit Wasser unvermischbaren Analytlösung reagieren zu lassen, und dann die wässrige Phase mit dem Analyten wie zuvor in fester Phase reagieren zu lassen. Nach einem einfachen Waschvorgang kann die Menge des Antikörpers, welcher an die feste Phase gebunden ist, mit Hilfe einer weiteren Reaktion mit einem gekennzeichneten Antiimmunoglobolin-Antikörper erfaßt werden. Diese Näherung ist besonders wertvoll wenn nur polyclonale Antikörper verfügbar sind, da diese einen komplexen Reinigungsschritt erfordern können wenn sie selbst direkt zu kennzeichnen sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine simultane Reaktion während eines vorbestimmten Zeitraumes zwischen dem gekennzeichneten Antikörper in einer wässrigen Lösung, einer mit Wasser nicht vermischbaren Analytlösung und dem immobilisierten Derivat in einem einzigen Rohr durchgeführt werden. Noch einmal, die Menge der Kennzeichnung, die mit der festen Phase assoziiert wird, variiert umgekehrt mit der Konzentration des Analyten in der Lösungsprobe. Diese Näherung trägt mit zur Vereinfachung des Testformates bei, wobei wiederum dieses Verfahren für Feld- oder Laboranwendungen angepaßt wird.
Obwohl die Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Bestimmung von mit Wasser unlöslichen Bestandteilen ausgelegt sind, leuchtet ein, daß die Erfindung ohne weiteres sogar bei Substanzen zum Einsatz kommen kann, die eine gewisse Partitionierung zeigen in wässrigen Medien auf der Basis, daß das Ausmaß der Partitionierung und ultimativ der Aufnahme des Bindungsreaktionsmittels nach wie vor proportional sind zur Konzentration der Verbindung in dem Lösungsmittel. In einer solchen Situation "fängt" das Bindungsreaktionsmittel wirkungsvoll den Analyten beim Übergang von der mit Wasser unvermischbaren Phase in die wässrige Phase an der Grenzfläche ein. Somit ist dieses Verfahren nicht auf die Molekültypen beschränkt, bei welchen es zum Einsatz kommen kann, solange die Analytsubstanz in einem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel anwesend ist oder hierein extrahiert werden kann.
Es gibt viele wichtige potentielle Anwendungen dieser Erfindung. Eine solche Anwendung ist die Identifizierung und Quantifizierung eines organischen Rückstandes, der in Materialien wie Erde und Wasser anwesend ist. Pestizide, die in der Landwirtschaft zum Einsatz kommen, können nur schwer in der Umgebung aufgespürt werden. Darüber hinaus können herkömmliche analytische Verfahren, wie etwa die Massenspektrometrie unter einem Fehlen der erforderlichen Sensitivität leiden und in jedem Fall sind sie inhärent komplex. Die Fähigkeit, derartige Materialien in mit Wasser unmischbare Lösungsmittel zu extrahieren und sie dann direkt durch Immunobewertung zu quantifizieren, führt zu einem einfachen und allgemeinen Näherungsverfahren zur Überwachung der Anwesenheit potentieller toxischer Verbindungen, die in Proben vorhanden sind, welche sich nicht ohne weiteres für eine Analyse durch herkömmliche Verfahren eignen.
Der Einsatz von Lösungsmitteln für die Extraktion von Analyten aus Proben, wie etwa beispielsweise ohne Einschränkung Erde, Saatgut, Laub und ähnliches ist den Sachverständigen auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt. Derartige Verfahren werden repräsentiert z. B., jedoch ohne Beschränkung, durch Lösungsmittelpartitionen, den Einsatz von festen Absorptionsmitteln, chromatografische Verfahren und superkritische Fluidextraktion. Die Auswahl von Materialien und Verfahren für derartige Zwecke ist hinlänglich etabliert und es liegt ohne weiteres im Rahmen der Erfahrung des Sachverständigen auf diesem Gebiet ein Verfahren auszuwählen, welches für einen speziellen Probentyp und den Analyten geeignet ist.
Es wird somit gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Konzentration in einer Probe eines Analyten zur Verfügung gestellt, welcher mindestens teilweise in einem mit Wasser nicht vermischbaren Lösungsmittel lösbar ist mit folgenden Schritten:
(i) Inkontaktbringen der Probe mit dem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel, um den Analyten aus der Probe zu extrahieren,
(ii) Sammeln des mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittels mit einer extrahierten Analytlösung und
(iii) anschließendes Bestimmen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration des Analyten in dem unmischbaren Lösungsmittel gemäß einem Verfahren, wie es zuvor beschrieben wurde.
Zum Beispiel ist es schwierig, Herbizide, wie etwa Atrazin, zu quantifizieren, wenn sie in Konzentrationen unterhalb von 100 ng/ml vorhanden sind unter Einsatz herkömmlicher chemischer Näherung. Im Gegensatz hierzu kann ein einfaches Immunteatverfahren, welches in weniger als 10 Minuten ausgeführt werden kann, zu einer Bestimmungssensitivität führen, die besser ist als 1 ng/ml.
Eine weitere wichtige Anwendung bezieht sich auf die Fähigkeit, speziell ein eigenes Produkt des Herstellers zu identifizieren, um einem Nachahmen entgegenzuwirken, wie dies beschrieben wird von Wraith and Britton in EPA 0 327 163. Diese Anwendung beschreibt den Einsatz von Verbindungen, die Brennstoffen auf Petroleumbasis vor ihrer Verteilung beigegeben werden können und anschließend aus Proben extrahiert werden können, die an unterschiedlichen Punkten in dem Verteilungsverfahren entnommen werden, in ein wässriges Medium, welches für die Bestimmung durch Immuntest geeignet ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Maßnahme für die direkte Erfassung durch Immuntest von wasserunvermischbaren Bestandteilen zur Verfügung, die dem Brennstoff als Markersubstanzen beigegeben werden. Alternativ kann die Erfindung für die Quantifizierung von bestimmten Additiven zum Einsatz kommen, die dem Brennstoff beigegeben werden, um seine Wirksamkeit zu erhöhen, vorausgesetzt, daß ein geeigneter Bindungspartner für ein derartiges Additiv identifiziert werden kann. Da bestimmte sog. Additive einzigartig für einen speziellen Hersteller sind, stellt ein quantitativer Test auf diese Weise eine Maßnahme zur Identifizierung eines speziellen Produktes zur Verfügung wie auch eine Maßnahme zur Qualitätskontrolle des Endproduktes für den Verbraucher.
Es leuchtet ohne weiteres ein, daß der einfache Einsatz, der bereitgestellt wird durch einen direkten Test, der keine komplexen Probenmanipulationen erfordert, es ermöglicht, daß ein solcher Test im wesentlichen unter Feldbedingungen ausgeführt werden kann.
Die Identifizierung des in Frage stehenden Analyten wird mit Hilfe eines speziellen Bindungspartners ausgeführt, wie etwa eines Antikörpers. Es leuchtet dem Sachverständigen auf diesem Gebiet ein, daß sowohl polyklonale und noch nützlicher, monoklonale Antikörper in einem sehr weiten Bereich organischer Verbindungen prodzuiert werden können. Antikörper können mit verschiedenen Markern markiert werden, wie etwa Radioisotopen, Enzymen oder fluoreszierenden Molekülen.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper mit chemilumineszierenden Molekülen, vorzugsweise Acridiniumderivaten, wie sie in EP 0 082 636 beschrieben sind, markiert. Derartige Verbindungen besitzen mehrere einzigartige Vorteile für diesen Typ der Anwendung. Zunächst können sie mit extrem hoher Sensitivität erfaßt werden, so daß sie zur Gesamtsensitivität des Verfahrens beitragen. Zum zweiten sind chemilumineszierende Moleküle inhärent stabil bis die chemische Reaktion, die zur Fotoemission führt, aktiviert wird. Somit können sie in einen weiten. Bereich von flüssigen Medien ohne das Risiko des Verlustes der Chemilumineszenzaktivität eingeführt werden.
Das analytische Verfahren kann in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, wie dies zuvor beschrieben wurde. In jedem Fall machen sich die Verfahren die Tatsache zunutze, daß das Ausmaß, in welchem der markierte Antikörper an die festen Phasenderivate gebunden wird, abhängig ist von der Konzentration des Analyten in der Lösungsmittelprobe. Durch Messung des Ausmaßes an Bindung, erzeugt mit bekannten Analytkonzentrationen, kann eine Eichkurve erzeugt werden, um es zu ermöglichen, daß eine Quantifizierung der unbekannten Proben des Analyten ausgeführt wird.
Die Aufmerksamkeit wurde auf einen Vorteil dieses Verfahrenstyps gelenkt dahingehend, daß das Verfahren ohne die Notwendigkeit hinsichtlich komplexer Pipettierungsschritte ausgeführt werden kann. Darüber hinaus kann die Lichtmessung mit einfachen, ohne weiteres verfügbaren Luminometern ausgeführt werden. Tragbare Instrumente sind gegenwärtig verfügbar, so daß es in Kombination mit diesen vereinfachten analytischen Verfahren möglich ist, hochsensitive Tests zu entwickeln für den Einsatz unter Feldbedingungen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Ausrüstung zur Beurteilung einer Probe hinsichtlich der Anwesenheit eines Analyten, der in einem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel löslich ist, zur Verfügung gestellt, wobei die Ausrüstung die folgenden Elemente umfaßt:
(i) eine Menge des mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittels zum Extrahieren des Analyten aus der Probe;
(ii) einen Behälter mit einer wässrigen Lösung, die einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten enthält;
(iii) einen Behälter, der einen immobilisierten Analyten oder ein Derivat desselben enthält und
(iv) Reagenzien zur Überwachung der Bindung des Bindungspartners mit dem Analyten.
Bevorzugte Merkmale der Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen angegeben.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht einer Kombination eines Testrohres sowie einer Spritze, die in Beispiel 5 zum Einsatz kommt und
Fig. 2 ist eine schematische Ansicht der Anordnung von Teströhrchen, wie sie in Beispiel 6 zum Einsatz kommen.

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele bedeuten lediglich eine Erläuterung und keinerlei Einschränkung.

Beispiel 1 - Chemilumineszente Immunountersuchung für Atrazin in Hexan- Extrakten

(a) Herstellung eines Derivats von Atrazin

Um Atrazin an ein Protein anzuheften, wurde es eingangs umgesetzt in 3-{{4- (Ethylamino)-[(1-Methylethyl)Amino]-1,3,5-Triazin-2-yl}Thio}Propanolsäure durch das Verfahren gemäß Goodrow et al (J Agric Food Chem 1990; 38: 4990). Kurz gesagt wurde eine Lösung von Atrazin in trockenem Ethanol im Rückfluß geführt unter Stickstoff mit 3-Mercaptopropionsäure 3 Stunden lang. Das lösbare Produkt dieser Reaktion wurde in einem sauberen Behälter transferiert und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum evaporiert. Der Rückstand wurde aufgenommen in 25 ml von 5% (w/v) Natriumhydrogenkarbonat und drei mal mit Chloroform ausgewaschen. Das Propanolsäurederivat wurde dann durch die Versäuerung der Lösung mit 6 N Chlorwasserstoffsäure ausgefällt und mit Wasser ausgewaschen und getrocknet. Die strukturelle Zusammensetzung des Produktes wurde durch NMR-Spektroskopie untersucht und ergab sich als konsistent mit den veröffentlichten Daten.

(b) Herstellung eines Protein-Atrazin-Konjugats

Das Atrazinderivat wurde konjugiert in Bovinserumalbumin (BSA) nach dem Verfahren von Goodrow et al. Kurz zusammengefaßt wurden equimolare Mengen des Derivats und Succinanhydrid 3 Stunden lang reagiert mit 10% molarem Überschuß von Dicyclohexylcarbodiimid in trockenem Dimethylformamid (DMF). Die Ausfällung von Dicyclohexylharnstoff wurde entfernt durch die Durchführung des Schlammes durch eine Säule mit einem Gehalt an Glaswolle und 0,25 ml des Eluats wurde gemischt mit einer 0,01%igen (w/v) Lösung von BSA in Wasser (5 ml) und DMF (1,05 ml). Die Reaktion ließ man 22 Stunden lang fortschreiten und das Produkt wurde intensiv dialysiert gegen phosphatgepuffertes Salm (PBS), pH 7,4, 0,01 M.

(c) Herstellung von überzogenen Röhrchen

Polystyrolröhrchen (Nung Maxisorb TM) wurden überzogen mit dem Atrazin-BSA- Konjugat in einem 0,1 M Bicarbonatpuffer bei pH 9,6 18 Stunden lang. Die Röhrchen wurden drei mal gewaschen mit PBS mit einem Gehalt an 0,5% (v/v) Tween 20 (PBS/Tween) und dann einer Lösung von 0,1% (w/v) BSA in PBS/Tween mit 0,05% (w/v) Natriumazid als Schutz ausgesetzt. Die blockierende Lösung wurde belüftet und die Röhrchen wurden unter Vakuum getrocknet und dann trocken gelagert bis zu ihrem Einsatz.

(d) Herstellung des markierten Antikörpers

Affinitätsgereinigte Ziegenantikörper (Antikaninchen-Immunoglobolin) wurde käuflich erworben von Sigma Chemical Co. und markiert mit einem aktiven Acridiniumester, wie er beschrieben ist in der EP 0 082 636. Markierte Antikörper wurden gereinigt durch Gelfiltration und Aliquots gelagert bei -20ºC.

(e) Atrazin-Immunountersuchung

Standardkonzentrationen von Atrazin wurden in Hexan hergestellt. Die Immunoextraktion wurde durchgeführt durch Mischen von 1 ml eines jeden Bestandteils mit einem gleichen Volumen von PBS/Tween, enthaltend Kaninchen- Antiatrazinantikörper (erhalten von Biodesign International, Maine 04043, U.S.A.) in einer Konzentration von 2,35 ug/ml 1 Minute lang durch manuelle Inversion. Die Flüssigkeitsschichten ließ man sich trennen und 0,5 ml der niedrigeren (wässrigen) Schicht wurden transferiert in konjugatüberzogene Röhrchen. Nach 5 Minuten wurde die Reaktion eingehalten durch Ausspülen der Röhrchen 3 mal mit PBS/Tween. Acridiumester markierte Ziegenantikörper (Antikaninchen-Immunoglobolin) wurde jedem Röhrchen beigegeben und nach weiteren 15 Minuten wurden die Röhrchen erneut ausgespült in PBS/Tween. Lumineszenz wurde quantifiziert in einem Luminometer während einer 2 Sekunden Reaktion, eingeleitet in den Luminometer unter Einsatz der Reagenzien 1 und 2 (Chiron Diagnostics, Halstead, Essex, P. B.) entsprechend den Maßgaben des Herstellers. Die Beziehung zwischen Lichtausgang und Konzentration von Atrazin in den Proben ist nachfolgend wiedergegeben, woraus sich ergibt, daß ein mittlerer Lichtausgang umgekehrt variiert mit der Atrazinkonzentration, und daß der Test die Erfassung von Teilen pro Billion gestattet.

Beispiel 2 - Chemilumineszente Immunotests nach Atrazin in Dodecan- Extrakten

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde angepaßt, um die Fähigkeit des Verfahrens hinsichtlich der Anwendbarkeit auf andere mit Wasser unvermischbare Lösungsmittel zu demonstrieren. Hier war das Verfahren im wesentlichen das gleiche wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß Atrazin in Dodecan gelöst wurde im Gegensatz zu Hexan. Die Beziehung zwischen der Atrazin-Konzentration und dem Lichtausgang, gemessen in dem Luminometer ist nachfolgend wiedergegeben:

Beispiel 3 - Chemilumineszenter Immunotest für Simazin in Hexan-Extrakten

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde angepaßt, um die Fähigkeit des Verfahrens hinsichtlich der Anwendbarkeit auf andere organische lösbare Substanzen zu demonstrieren. Hier waren das Verfahren und die Reagenzien im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß Simazin in Hexan gelöst wurde. Die Beziehung zwischen der Simazinkonzentration in dem Hexan und dem Lichtausgang, gemessen in dem Luminometer, wird nachfolgend dargestellt:

Beispiel 4 - Chemiluminszenter Immunotest für ein hydrophobes Molekül Rx

Ein hydrophobes Hapten Rx mit einem Molekulargewicht von etwa 350 Dalton wurde ausgewählt hinsichtlich seiner hydrophoben Natur (Octanol: Wasserverteilungskoeffizient, 10 g KOW = 6,14). Ein Karboxylsäurederivat von dem Hapten wurde konjugiert zu BSA, entsprechend dem Verfahren wie es in Beispiel 1 (b) beschrieben wurde, und das Konjugat wurde eingesetzt mit einer Konzentration von 20 ug/ml zum Überziehen der Polystyrolröhrchen, wie beschrieben in Beispiel 1 (c). Wie zuvor wurden die Röhrchen gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
Ein auf Rx gerichteter monoclonaler Mausantikörper wurde hergestellt durch Standardverfahren, wie sie hinlänglich dem Sachverständigen auf diesem Gebiet bekannt sind, und gereinigt durch Protein-G-SepharoseTM-Affinitätschromatographie. Dieser Antikörper wurde markiert mit einem Acridinumester, wie er beschrieben wird in EP 0 082 636 und gereinigt durch Gelfiltration.
Standardlösungen wurden hergestellt durch Auflösen bekannter Mengen von Rx in kommerziellem Dieselöl zur Herstellung eines Bereiches von Standardlösungen mit Konzentrationen von 0 bis 20 ppm. Der markierte monoklonale Antikörper wurde verdünnt bis zu einer Darstellung von 360 · 10&sup6; RLU/ml Lichtemission.
4 ml einer jeden Standardlösung wurden durch manuelle Inversion mit 1 ml der verdünnten markierten Antikörperlösung 1 Minute lang gemischt. Nachdem man die beiden flüssigen Phasen sich trennen ließ, wurden 0,5 ml der wässrigen Schicht transferiert in ein überzogenes Polystyrolröhrchen und nach weiteren 5 Minuten wurde die Lösung gelüftet und die Röhrchen wurden gewaschen und gesäubert zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit. Die Chemilumineszenzaktivität, die den Röhrchen zugeordnet war, wurde in einem Luminometer gemessen. Daten nach der Initiierung in dem Luminometer (unter Einsatz der Reagenzien 1 und 2 (Chiron Diagnostics, Halstead, Essex, G. B.), entsprechend den Angaben des Herstellers); basierend auf Doppelablesungen werden nachfolgend wiedergegeben, woraus ersichtlich ist, daß der mittlere Lichtausgang umgekehrt variiert mit der Konzentration von Rx und daß der Test Sensitivitäten zur Verfügung stellt, weit über Teile ppm hinaus.
In diesem Beispiel ist das Molekül Rx ein geschütztes Brennstoffadditiv, dessen exakter Aufbau in diesem Augenblick nebensächlich ist, da der Zweck des Beispieles darin liegt zu zeigen, daß es möglich ist, mit extremer Genauigkeit die Konzentration eines Analyten in einer organischen Flüssigkeit, wie etwa Dieslöl, durch das Erheben von Antikörpern zu dem Analyten und unter Einsatz der Verfahren wie sie hier beschrieben werden.

Beispiel 5 - Verfahren zur Durchführung der Immunoextraktion in dem Immunotest

Die in einem Immunotest für Atrazin in Hexan eingesetzten Reagenzien wurden in Beispiel 1 beschrieben. Unter Bezugnahme auf Fig. 1 wurde die Immunoextraktion durchgeführt durch die Eingabe von einem ml einer Hexanprobe mit einem Gehalt an Atrazin in eine 5 ml Polypropylenspritze 10, versehen mit einem Hahn 12. Der Antiatrazinantikörper in seinem Puffermedium wurde zuvor in ein Polypropylenteströhrchen 14 derart eingegeben, daß der Gehalt des Teströhrchens 14 in die Spritze 10 geschüttet werden konnte und das leere Teströhrchen 14 wurde als Abdeckung des Oberteils der Spritze 10 zur Bildung einer Anordnung benutzt, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist. Die Immunoextraktion wurde durch wiederholtes Umdrehen der Anordnung 1 Minute lang, gefolgt durch Abstehen in einer aufrechten Position durchgeführt, wobei sich die Spritze zuunterst befand, bis die beiden Schichten sich trennten. Das Teströhrchen 14 wurde dann entfernt und der Hahn geöffnet, um es somit zu ermöglichen, daß nur die Unterschicht in ein konjugatüberzogenes Röhrchen 16 überführt wurde. Der Rest des Testes wurde durchgeführt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.

Beispiel 6 - Vereinfachtes Verfahren zur Durchführung der Immunoextraktion im Immunotest

Die in einem Immunotest für Atrazin in Hexan eingesetzten Reagenzien waren wie in Beispiel 1 beschrieben. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 wurde die Immunoextraktion durch Eingabe von 1 ml der Hexanprobe mit einem Gehalt an Atrazin in ein 10 ml Polypropylenteströhrchen 18 durchgeführt, welches mit einem (nicht dargestellten) Stopfer versehen war. Der Antiatrazinantikörper in seinem Puffermedium wurde vorher in dieses Reströhrchen 18 eingegeben. Die Immunoextraktion wurde durch wiederholtes Umdrehen des mit dem Stopfen verschlossenen Teströhrchens 18 1 Minute lang durchgeführt. Der Stopfen wurde dann entfernt und die Öffnung des konjugatüberzogenen Teströhrchens 20 wurde in das Polypropylenröhrchen 18 eingesteckt, um somit die Anordnung zu bilden wie sie in Fig. 2 wiedergegeben ist. Die Anordnung wurde umgedreht derart, daß es der wässrigen Schicht möglich war, die "aktive" Oberfläche des konjugatüberzogenen Röhrchens 20 zu kontaktieren. Man ließ die Anordnung in dieser Position 5 Minuten lang stehen, worauf sie anschließend umgedreht wurde. Das konjugatüberzogene Röhrchen wurde aus der Anordnung entfernt und weiter bearbeitet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf entsprechend abgepackte Testausrüstungen, wie sie oben beschrieben wurden, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, für die beabsichtigte Verwendung im Feld für den Einsatz zur Durchführung der obigen Untersuchungsverfahren.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration einer zu analysierenden Verbindung in einer mit Wasser unvermischbaren Flüssigkeit, mit folgenden Schritten:

(i) Mischen einer Probe der mit Wasser unvermischbaren Flüssigkeit mit einer wässrigen Lösung, welche einen spezifischen Bindungspartner für die zu analysierende Verbindung erhält, so daß eine Bindung zwischen dem Bindungspartner und der zu analysierenden Verbindung (sofern vorhanden) möglich ist, und

(ii) direktes oder indirektes Überwachen des Grades der Bindung zwischen der zu analysierenden Verbindung und dem Bindungspartner, wodurch das Vorhandensein und/oder die Konzentration der zu analysierenden Verbindung bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Verbindung im wesentlichen im Wasser unlöslich ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Verbindung in Wasser schwerlöslich ist.

4. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es der mit Wasser unvermischbaren Flüssigkeit und der wässrigen Lösung nach dem Mischen ermöglicht wird, sich voneinander zu trennen, um eine Grenzschicht zwischen der wässrigen und der mit Wasser unvermischbaren Flüssigkeit herzustellen, an der sich der Bindungspartner mit der zu analysierenden Verbindung bindet.

5. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Wasser unvermischbare Flüssigkeit und die wässrige Lösung für eine vorbestimmte Zeitdauer miteinander in Kontakt gehalten werden, bevor der Grad der Bindung überwacht wird.

6. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Verbindung eine organische Verbindung ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Verbindung eine Pestizidverbindung oder ein Pestizidrest ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Wasser unvermischbare Flüssigkeit ein petrochemisches Produkt und die zu analysierende Verbindung ein Marker oder eine additive Substanz ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das petrochemische Produkt aus der Gruppe Benzin, Diesel und Schmierstoff ausgewählt ist.

10. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner ein Antikörper ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

12. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Mischen und der Bindung der zu analysierenden Verbindung (sofern vorhanden) an den spezifischen Bindungspartner die gebundenen und ungebundenen Fraktionen des Bindungspartners voneinander getrennt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Mischen die Mischung mit einer immobilisierten zu analysierenden Verbindung oder einem Derivat derselben in Kontakt gebracht wird, um die ungebundene Fraktion des Bindungspartners zu immobilisieren, die gebundene Fraktion zu entfernen und die Menge der immobilisierten ungebundenen Fraktion zu bestimmen.

14. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe der mit Wasser unvermischbaren Flüssigkeit und die wässrige Lösung bei Vorhandensein einer immobilisierten, zu analysierenden Verbindung oder eines Derivates derselben gemischt werden.

15. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner mit einer Chemolumineszenzverbindung markiert ist.

16. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner der zu analysierenden Verbindung einen Antikörper umfaßt und daß die gebundene Fraktion mittels eines markierten Anti-Immunoglobin-Antikörpers überwacht wird.

17. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration einer zu analysierenden Verbindung in einer Probe, wobei die zu analysierende Verbindung wenigstens teilweise in einem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel löslich ist, mit folgenden Schritten:

(i) in Kontakt bringen der Probe mit dem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel, um die zu analysierende Verbindung aus der Probe zu extrahieren;

(ii) Sammeln des mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittels mit der extrahierten zu analysierenden Verbindungslösung und

(iii) nachfolgend Bestimmen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration der zu analysierenden Verbindung in dem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel gemäß dem Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine verunreinigte Probe umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Saatgut umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus Pflanzenmaterial gewonnen ist.

21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus tierischem Material gewonnen ist.

22. Ausrüstung zur Analyse einer Probe auf das Vorhandensein einer zu analysierenden Verbindung, welche in einem mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel löslich ist, folgendes umfassend:

(i) eine Menge des mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittels zum Extrahieren der zu analysierenden Verbindung aus der Probe;

(ii) einen Behälter mit einer wässrigen Lösung, die einen spezifischen Bindungspartner für die zu analysierende Verbindung enthält;

(iii) einen Behälter, welcher eine immobilisierte zu analysierende Verbindung oder ein Derivat desselben enthält; und

(iv) Reagenzien zum Überwachen des Bindungspartners mit der zu analysierenden Verbindung.