JPH03502333A - 蛍光イムノアッセイ、及びそれに使用する蛍光化合物とトレーサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及■Ω各称 蛍光イムノアッセイ、及びそれに使用する蛍光化合物とトレーサー Ｒ盟凹背且 本発明の一部は、米国政府との契約第ＮＯＯＯ１４−８１−Ｃ−０６１９号に基 づいてなされたものであり、米国政府は、全世界にわたり米国のために又は米国 に代わり本発明を実施でき、実施できた、非譲渡性で変更不能な支払い済の通常 実施権を有する。

本発明は、混合物中の分析対象物、極めて低濃度でのみ存在する分析対象物の存 在を検出し、及び／又は定量する蛍光イムノアッセイにおける試薬として使用で きる蛍光化合物及びその蛍光化合物から得られるトレーサーに関する。特に本発 明は、生物学的な液体、例えば、血清、血漿、を髄液、尿及び羊水等や他の液体 、例えば、ミルク及び水、またさらに、可溶化し得る廃棄物のような固形物に存 在する成分の測定に関する。このような測定は、公衆衛生並びに人及び家畜の医 療を実施するうえで重要である。さらに、体液中の治療医薬濃度及び濫用された 薬剤の存在の測定をする上で極めて価値がある。

極めて低濃度でのみ存在する分析対象物の測定は、分析における一般的な問題で ある。１９５６年のラジオイムノアッセイの導入により、医療ラボラトリ−の能 力が著しく大きくなった。というのは、このようなラジオイムノアッセイの優れ た感度と選択性が、他の方法では容易に測定できなかった多（の分析対象物の定 量を可能にしたからである。このラジオイムノアッセイは、診断の目的と医学的 処置の有効性の評価及び追跡の目的双方のために、代謝産物、ホルモン、薬剤、 及び他の生物学的に重要な物質を同定し、かつ定量することに使用されてきた。

ある種のイムノアッセイは、ラベルされ及びラベルされていない分析対象物と結 合する特異的抗体の限られた数のレセプター結合部位について、反応混合物に加 えられたトレーサーによって、ラベルされた既知量の分析対象物と、分析される 試料中の未知量の分析対象物との拮抗的な結合を含む。

イムノアッセイにおいて放射性トレーサーを使用するためには、特別の認可及び 取扱上、健康に対する危険と汚染を最小限にするため、特別の予防措置を必要と する。放射性物質を取り扱う上で従わなければならない連邦と州の法規によって 、試験を行いかつ使用された放射性物質を処理することに要求される時間と努力 について、しばしば過重な義務が負わされる。標準曲線は、放射性物質の崩壊及 び成分である試薬の放射性分解のために常に変化する。また、生産過程における バッチ間の相違も考慮しなければならない。さらに、放射能の測定用カウンター は、大型、高価かつ取扱が厄介であり、自動化に向いていない。これら及び他の 問題のために、蛍光トｌノーサーを使用するイムノアッセイが、放射性トレーサ ーを使用した従来のアッセイと徐々に置き換えられている。

しかしながら、ある種の分子のみが有意な程度の蛍光性を示す。

蛍光分子は、光子を吸収し、そのエネルギーを使用して、電子を基底状態からよ り高いエネルギーレベルの軌道に移動させる。このプロセスは、“励起”として 知られており、特定波長の光で生じる。ナノ秒単位の短い時間の後、励起した電 子は基底状態に戻り、光子を放射する。このプロセス１こおいて、若干のエネル ギーが失われ、放射された光子は励起光の波長に対してスペクトラムの赤色部・ ＼向かいシフトする。励起光の波長と放射光の波長の差は、“ストークスシフト （Ｓｔｏｋｅｓ　５ｈｉｆｔ）″として知られている。

イムノアッセイにおいて最も普通に使用される蛍光トレーサーは、フルオレセイ ンである。フルオレセインでは、最大励起は、４９６ｎｍの波長の光で照射され た場合に起こる。最大放射光は、５１６ｎｍの波長で起こる。したがって、スト ークスシフトは２０ｎｍである。多くの他の蛍光トレーサーが、当該技術分野で 知られており、かつイムノアッセイで使用されているが、しかし、これらの蛍光 トレーサーは、ストークスシフトが３５ｎｍ未満である。

ストークスシフトが３５ｎｍに足りない蛍光トレーサーを使用すると、蛍光の測 定を制限する多くの問題がでてくる。

まず最初に、蛍光の測定は、放射チャンネルにおいて励起光の一部を検出せしめ る光の散乱によって制限される。実際には、励起と放射チャンネル双方に帯域光 学的干渉フィルターを設置することにより、光散乱による干渉を減少させている 。最大励起の波長と最大放射の波長の差が大きくなるほど、したがって、帯域フ ィルターの波長の差が大きくなるほど、このような干渉フィルターはより有効に なり、光散乱バックグラウンドの最小化はより有効となるが、その利点は、３５ ｎｍ以下のストークスシフトを有するトレーサーを使用しては得ることが出来な い。

また、血清及び他の生物学的な液体は、固有の蛍光がある。生物学的な液体の固 有の蛍光のほとんどすべては、３５ｎｍ未満のストークスシフトを示す。したが って、３５ｎｍ以下のストークスシフトを有する蛍光トレーサーの使用は、血清 及び他の生物学的な液体並びに試験される他の液体の固有の蛍光による、さらな る干渉を許すことになる。

溶液の蛍光測定における他の制限ファクターは、弾性ラマン（Ｒａｍａｎ）光散 乱である。水溶液の場合、ラマン散乱は、励起光の周波数の両側の波数約３００ の位置で起こる。ラマン散乱は、ストークスシフトの小さい蛍光トレーサーが有 する問題である。

ある多環式化合物、特にピレン及びクリセン化合物は、純粋に生物化学及び細胞 生物学研究実験において、比較的大きなストークスシフトを有することが見出さ れた。例えば１、■−ピレンイソチオシアネートは相対的に非蛍光性であるが、 抗体のアミノ基と反応して、励起最大がほぼ３８６ｎｍで放射最大が４７０ｎｍ を育し、８４ｎｍのストークスシフトを与える複合体を形成する。同様に、６− クリセンマレイミドは相対的に非蛍光性の化合物であるが、各種の化合物のスル フヒドリル基と付加化合物を形成し、それが励起最大３６０ｎｍと放射最大４０ ０ｎｍを有する蛍光生成物を形成する。ｐＨ指示薬として使用される８−ヒドロ キシピレン−１゜３．６−）リスルホン酸は、４５０ｎｍの励起最大と５１５ｎ ｍの放射最大を有し、６５ｎｍのストークスレフトを与える。このような反応性 ピレン又はクリセン化合物の使用を記述した各種の報告は、イムノアッセイ試験 におけるこれらの使用；すなわち、蛍光の強度又は蛍光の偏光が測定されるか否 かということを教示も示唆もしていない。

及肌旦！約 本発明は、イムノアッセイにおいて先の蛍光化合物及びそれから調製したトレー サーの、これまでに指摘した問題点を解決し、大きなストークスシフトを有する トレーサーを提供し、それにより、光散乱バックグラウンド、被験液体の固有の 蛍光による干渉及びラマン光散乱を最小限にしたより優れた感度の蛍光アッセイ を可能にする。

要約すると、本発明は次の多環式炭化水素を含む：（式中、ＡはＯ，Ｎ、又はＳ ＩＲはＨ１置換又は非置換Ｃ，−ＣＩアルキル基、置換又は非置換Ｃ２Ｃ−エス テル基、又は置換アリール基：Ｙは、Ｈ又はＳＯ，Ｚ　（Ｚは、Ｈ又はハロゲン ）（少なくとも１個のＹはＳＯ，Ｚ、かっＺはハロゲン）；Ｒ’はＨ，Ｙ　　又 はＡ−Ｒ、及びｎは０又はｌ　（少なくとも１個のｎは１）である。） また、本発明はトレーサー及び後述するイムノアッセイも含む。

詳細な説明 用語“リガンド”及び“分析対象物”は、文中で互換的に使用され、かつ存在及 び／又は濃度が測定される液体の成分すなわち溶解されている物質、特に生物的 な液体の成分を示すものである。

リガンドに特異的に結合する抗体は動物中で増加させることができ、かつこのよ うな抗血清は当業者に周知の標準的技術により分離し、精製することができ、又 はこのような標準的技術により、高度に特異的なモノクローナル抗体を選び出し 、かつ製造することができる。本発明のアッセイにより定性及び／又は定量する ことができるリガンドは、広範囲の分子量のものにわたっており、とりわけ典型 的な化合物として次のような化合物を含んでいる：テオフィリン、シランチン、 フエノバルビタール、カルバマゼピン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、 アミカシン、トブラマイシン、チロキシン、ジゴキシン、ジギトキシン、プロカ インアミド、リドカイン、キニジン、プリミドン、プロプラノール、モルフイン 、コディン、ヘロイン、ホルモン類等である。

溶液又は混合物中のリガンドの定量では、特異的な抗体による結合のために、非 ラベルリガンドと競合するのに使用することができる蛍光ラベルリガンド（トレ ーサー）を製造することが要求される。本発明の蛍光化合物は、リガンドに存在 する反応性アミノ、反応性カルボキシル又は他の反応性の置換基、又は反応性ア ミノ、反応性カルボキシル、反応性スルフヒドリル又は他の反応基を有するリガ ンド類似化合物に結合することができ、これにより適当なトレーサーを形成する 。リガンドに蛍光トレーサーを結合するのに使用できる若干の可能な反応を、以 下の本発明の実施態様の実施例に述べる。またこの目的のために、他の公知の技 術を使用することができる。これらのトレーサーは、次の式で表される本発明の ピレン化合物又はクリセン化合物の反応により形成される。

（式中、ＡはＯ，Ｎ、又はＳＩＲはＨ１置換又は非置換Ｃｌ−０８アルキル基、 置換又は非置換Ｃ２−Ｃ，エステル基、又は置換アリール基；Ｙは、Ｈ又はＳｏ 、Ｚ　（Ｚは、Ｈ又はハロゲン）（少なくとも１個のＹはＳＯ，Ｚ、かつＺはハ ロゲン）；Ｒ１はＨ，Ｙ　　又はＡ　−Ｒ’　、及びｎは０又は１（少なくとも １個のｎは１）である）。

ピレンスルホン酸又はピレンスルホニルクロライド化合物が好ましいが、特に好 ましいのは、８−アセトキシ−１，３，６−ピレントリスルホニルクロライド、 ６，８−ジアセトキシ−１，３−ピレンジスルホニルクロライド、８−エトキシ −１，３，６−ピレントリスルホニルクロライド、６，８−ジェトキシ−１，３ −ピレンジスルホニルクロライド、及び８−サクシニルアミノ−１、３，６−ピ レントリスルホン酸である。クリセンについては、９−アセトキシ−１，３，７ −クリセントリスルホニルクロライドが好ましく、この化合物は、リガンド又は リガンド類似化合物の反応性アミノ基とスルホンアミドを形成する。

一般に、このような化合物は、無本硫酸ナトリウム及び濃硫酸を使用し、テトラ スルホン酸誘導体を形成する通常の方法により、ピレン及びクリセンから合成す ることができる。続いて、ヒドロキシ又はアミノ化合物が、高温加圧下で、水酸 化ナトリウム又はアンモニア水溶液との反応により形成される。反応性蛍光誘導 体は、２種の方法のうちの１種で形成される。スルホン酸基は、例えば、チオニ ルクロライドの使用によりスルホニルクロライドに転換される。スルホニルクロ ライド誘導体は、例えば、リガンド又はリガンド類似化合物の反応性アミノ基と 付加化合物を形成する。択一的にリガンド又はリガンド類似化合物を、−〇−Ｒ １−Ｎ−Ｒ又は−Ｓ−Ｒ基と連結できる。

一般に、蛍光性の基を有するリガンド又はリガンド類似物のトレーサー付加化合 物は、例えば、米国特許第３．９９６．３４５号又は同第４．４２０．５６８号 に記載されている慣用の方法により形成される。

本発明のピレン及びクリセントレーサーは、次の式により表される： 又は、 （式中、Ａは０．Ｎ、又はＳＩＲはＨ１置換又は非置換Ｃ，−ＣＩアルキル基、 置換又は非置換Ｃ２−Ｃ，エステル基、又は置換アリール基；Ｙは、Ｈ又は５ｏ ３Ｚ　（Ｚは、Ｈ又はハロゲン）（少なくとも１個のＹはＳＯ，Ｚ、かっＺはハ ロゲン）；Ｒ１はＨ，Ｙ　　又はＡ−Ｒ、及びｎはＯ又は１（少なくとも１個の ｎはｌ）であり、Ｌは、リガンド又はリガンド類似化合物；ｍは０又は１　（た だ１個のｍが１である））。

好ましい蛍光トレーサー化合物の一群は、ピレンスルホン酸及びピレンスルホニ ルクロライドをベースとする。一般に、ピレン及びクリセン化合物は、３５ｎｍ よりも大きく、しばしば５０〜７０ｎｍになる大きなストークスシフトを有する 。ヒドロキシ、エトキシ、アセトキシ又は類似のもので置換されたピレンスルホ ン酸の特別の利点は、その励起が、他のピレン又はクリセン化合物ではスペクト ラム特性の近紫外部にあるのに対し、むしろスペクトラムの青縁部に有ることで ある。これらの化合物の他の利点は、他のピレン及びクリセン化合物が疎水性で あるのに対し、むしろ容易に水に溶けることである。

蛍光イムノアッセイは、幾つかの異なる方法で行うことができる。リガンド及び トレーサーと結合した抗体を、蛍光を測定する前に遊離のリガンド及びトレーサ ーから分離する必要がない均質アッセイ法を使用することが好ましい。というの は、このようなアッセイではインキュベーションが１回だけで済みかつ洗浄が不 要であり、簡単かつ速やかに行うことができるからである。蛍光偏光イムノアッ セイが特に有用であることは、ダンドリンカー、Ｗ、Ｂ、　　ら、によってイム ノケミストリ一旦、２１９頁（１９７３）（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ、Ｂ、Ｗ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒ　　１０．２１９（１９７３））及 びスペンサーら（Ｓｐｅｎｃｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　）、によってＣｌ１ｎ、ｃ ｈｅｍ、　１９．８３８−８４４頁（１９７３）に最初に記載された。このよう なアッセイにおいては、反応混合物は偏光した光によって励起され、蛍光放射の 偏光が測定される。蛍光放射の偏光の程度は、遊離トレーサ一対抗体に結合した トレーサーの割合に依存し、したがって、未知の試料における割合は、標準曲線 と比較することにより測定することができる。リガンドが高分子量又はリガンド が低濃度であるために、蛍光偏光イムノアッセイが十分な感度でない場合、ヘミ ラ（Ｈｅｍｍｉ　Ｉａ）が、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、３１．３５９頁（１９８５） 中で検討したように、他の種類の蛍光イムノアッセイを使用することができる。

詳細に説明することのみを目的に記載した次の実施例との関連で、本発明をさら に記述する。

実施例１ 非常に有用で新規な反応性蛍光化合物である８−アセトキシ−１、３，６−ピレ ントリスルホニルクロライドを、次のように合成した。

１　８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸（イーストマンコダッ ク（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏａｄｋ社））５ｇを無水酢酸５０ｍＪ中で１．５時間 還流した。沈澱した淡黄色の固形物を濾過により集め、塩化エチレンで洗浄し、 デシケータ−中で乾燥した。ジメチルホルムアミドｌ−に溶かしたこの物質１． ５ｇを塩化チオニル１０７ｎｌに加え、ヒユームフード中で２０時間一定の速度 で攪拌した。次に、この混合物を約２０ｇの砕いた氷の上に注いだ。活発な反応 が収まった後、この水溶液を分液ロートに移し、クロロホルム２０１ｎｌを使用 して３回抽出した。有機層を一緒にし、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。透 明なオレンジ色の溶液を濾過し、蒸発により容量を１５−まで減らした。ヘキサ ンを溶液が曇るまで加えた。２°で貯蔵した後、形成されたゴールダンブラウン の結晶を回収した。収率は３１％であった。１分子のりガントだけが各蛍光プロ ーブ分子に結合するという、分子の立体的配置に関する理由により、残る２個の スルホニルクロライド基が加水分解される。

フェノバルビタールについでアッセイを検討するため、この蛍光化合物を２−ア ミノフェノバルビクールと反応させトレーサーを形成した。このトレーサーの励 起最大は４５５ｎｍであり、かつ放射最大は５２０ｎｍ（ストークスシフト６５ ｎｍ）である。このアッセイは、先にダントリカーらによミて述べられたように 行なった。

試験に使用される標準溶液血清又は他の未知の試料を、アジ化ナトリウム０．０ １％及び牛γ−グロブリン０．０１％を含むｐＨ７，５の０．１５Ｍリン酸緩衝 液で１：４００に希釈した。０．５−の希釈試料に、前記緩衝液中に２−アミノ フェノバルビクール５ｇ／！ｎｌを含むフェノバルビタールトレーサーストック 溶液２０１を加えた。一定量のトレーサーに抗体の量を増加させながら加えて、 蛍光偏光計を用いて偏光度を測定して、抗体滴定曲線を作ることにより、最も良 い抗体及び最適な抗体希釈度を決定した。２０１緩衝液の適当な量の抗体を該反 応中に加え、この混合物を室温で３分間インキュベートした。次いで、偏光度を 測定した。第１図は、一般的な標準曲線を表している。

未知の血清試料の偏光度はこの方法で評価され、かつフェノバルビクールの濃度 は、標準曲線と比松することにより計算された。

実施例２ １−二トロピレン２．５ｇを、濃硫酸１３ｇと無水硫酸ナトリウム３ｇの混合物 に、６０℃で、攪拌しながら５分間かけて加え、形成されたダークパープルの固 まりを粉砕するため、さらに１５分間攪拌した。次に、発煙硫酸８ｇを、６０° で、一定速度で攪拌しながら３０分間かけて加えた。全混合物を氷８０ｇに加え 、さらに水６０Ｊを加えた。１８時間経過後、ｐＨを５に調整し、溶液を濾過し た。８−ニトロ−１，３，６−ピレントリスルホン酸を含む水相を鉄のやすり屑 及び酢酸で還元した。溶液を濾過し、希ＨＣＡを加えて８−アミノ−１，３，６ −ピレントリスルホン酸を沈澱させた。

乾燥ジメチルホルムアミド１０１ｎｌに溶解したこの生成物２．５ｇに、無水コ ハク酸０．７５　ｇ加え、この混合物を５０’の暗所で４時間攪拌した。水２０ −を加え、わずかに酸性とし、氷上で冷却した。沈澱物を集め、この生成物を薄 層シリカゲル上で精製した。

この蛍光マーカーは、ジシクロへキシルカルボジイミドを使用して、３，５−ジ クロロ−３’、５’−シイオドチロキシンと付加化合物を形成させることにより 、チロキシンをアッセイするのに使用した。この付加化合物トレーサーの励起は ４６１ｎｍ、かつ放射最大は５２４ｎｍ（ストークスシフト６３ｎｍ）であった 。この蛍光チロキシントレーサーは、前記と同様の蛍光偏光アッセイにおいて使 用した。

実施例３ 濃硫酸６．５ｇと無水硫酸ナトリウム１．５ｇの混合物に、ピレン１０ｇを、６ ０℃で、攪拌しながら１５分間かけて加えた。５０℃まで冷却した後、発煙硫酸 ４ｇを、２０分間以上かけて少量ずつ加えた。暗黒赤色の固まりを氷上で冷却し た。２時間放置した後、その固まりを粉砕し、水７０ｍ１に溶解した。濾過後、 濾液をＮａＣ１で飽和させることにより、生成物を沈澱させた。

前記生成物１．５ｇ、水酸化ナトリウム１．５　ｇ及び、水１．０−の混合物を ガラス圧力管中に封入し、１５５℃で３０分間加熱し、次に１６５℃で２０分間 、さらに１７０℃で５分間加熱した。この工程の間に、薄いスラリーは濃くなっ た。得られた固まりを水に溶解し、過剰のアルカリを中和した。濾過後、上清に 酢酸を加え゛Ｃ酸性化し、６，８−ジヒドロキシ−１，３−ピレンジスルホン酸 生成物を沈澱させた。無水酢酸による処理によって最初にジアセトキシ誘導体を 形成させ、次いで、実施例１と同様にジスルホニルクロライドを形成させた。第 ２図は、一般的な標準曲線を示している。

トレーサー付加化合物は、６，８−ジアセトキシ−１，３−ピレンジスルホニル クロライドを８−アミノエチルテオフィリンと反応させて形成させた。このトレ ーサー付加化合物は、励起最大が４６４ｎｍであり、かつ放射最大が５２７ｎｍ である。このテオフィリントレーサーは、実施例１と同様に蛍光偏光アッセイに おいて使用した。一般的な標準曲線を第２図に示した。

実施例４ 濃硫酸６，５ｇと無水硫酸ナトリウム１．５　ｇの混合物に、クリセン１０ｇを 、６０℃で、攪拌しながら１５分間かけて加えた。

５０℃まで冷却した後、発煙硫酸４ｇを、少量ずつ２０分間かけて加えた。暗色 の固まりを氷上で冷却した。２時間放置した後、その固まりを粉砕し、水７０− に溶解した。濾過後、濾液をＮａＣ１で飽和させることにより、生成物を沈澱さ せた。

前記生成物を水酸化ナトリウム１．５ｇ及び水ｌ−と混合し、ガラス圧ツノ管中 に封入し、１５５℃で３０分間加熱し、次に１６５℃で２０分間、さらに１７０ ℃で５分間加熱した。

圧力管を冷却し、得られた固まりを水に溶解し、次いで、ｐＨ９，０に調整した 。濾過後、上清にギ酸を加えて酸性化し、７，９−ジヒドロキシ−１，３−クリ センジスルホン酸を沈澱させた。

無水酢酸による処理で、最初にジアセトキシ誘導体を製造し、次いで、実施例１ に記載したようにチオニルクロライドによる処理で、ジスルホニルクロライドを 形成した。

トレーサー付加化合物は、７，９−ジアセトキシ−］、］３−クリセンジスルホ ニルクロライをジフェニルグリジンと反応させて形成させた。このトレーサー付 加化合物は、吸収最大が４３８ｎｍであり、かつ放射最大が４８２ｎｍである。

このフェニトイントレーサーは、実施例１と同様に蛍光偏光アッセイに使用した 。

実施例５ ８−アセトキシ−１，３，６−ピレントリスルホニルクロライドをゲンタマイシ ンと反応させ、トレーサー付加物を形成した。

このトレーサー付加物は、４５５ｎｍの励起光を使用しかっ５２０ｎｍの蛍光を 測定することにより、実施例１と同様に蛍光偏光アッセイに使用した。２６個の 試料を６回測定した平均試料内相関係数は、０．９８７であった。フルオレセイ ンをベースとするトレーサーを使用する市販のゲンタマイシンアッセイと比較し た平均試料量相関係数（ｎ＝２６）は、０．９６６であった。

本発明は好ましい実施態様との関連で記載されているが、記載された特定の形態 に本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、逆に、添付した請求の 範囲により明確にされた本発明の企図及び範囲に含まれる変形例、改良及び均等 物を網羅することを意図している。

μｇ１ｍｌ　　フエハイルビタール 第１図 μ９１ｍ１　　テオフィリン ｊ＠２図 国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の式で表される多環式炭化水素。 式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 又は、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＡはＯ、Ｎ、又はＳ；ＲはＨ、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ８アルキル基、 置換又は非置換Ｃ２−Ｃ８エステル基、又は置換アリール基；Ｙは、Ｈ又はＳＯ ３Ｚ（Ｚは、Ｈ又はハロゲン）（少なくとも１個のＹはＳＯ３Ｚ、かつそのＺは ハロゲン）；Ｒ１はＨ、Ｙ又はＡ−Ｒ；及びｎは０又は１（少なくとも１個のｎ は１）である）。
2. ２．炭化水素がピレンスルホン酸又はピレンスルホニルクロライドである、請求 の範囲第１項記載の炭化水素。
3. ３．ピレンスルホン酸が、８−サクシニルアミノ−１，３，６−ピレントリスル ホン酸であり、ピレンスルホニルクロライドが８−アセトキシ−１，３，６−ピ レントリスルホニルクロライド、６，８−ジアセトキシ−１，３−ピレンジスル ホニルクロライド、８−エトキシ−１，３，６−ピレントリスルホニルクロライ ド、又は６，８−ジエトキシ−１，３−ピレンジスルホニルクロライドである、 請求の範囲第２項記載の炭化水素。
4. ４．８−アセトキシ−１，３，６−ピレントリスルホニルクロライド。
5. ５．下記の式で表される多環式炭化水素トレーサー。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 又は、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＡはＯ、Ｎ、又はＳ；ＲはＨ、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ８アルキル基、 置換又は非置換Ｃ２−Ｃ８エステル基、又は置換アリール基；Ｙは、Ｈ又はＳＯ ３Ｚ（Ｚは、Ｈ又はハロゲン）（少なくとも１個のＹはＳＯ３Ｚ）；Ｒ１はＨ、 Ｙ又はＡ−Ｒ；及びｎは０又は１（少なくとも１個のｎは１）であり、Ｌは、リ ガンド又はリガンド類似化合物；ｍは０又は１（ただ１個のｍが１である））。
6. ６．炭化水素部位が、ピレンスルホン酸又はピレンスルホンアミドである、請求 の範囲第５項記載の炭化水素トレーサー。
7. ７．炭化水素部位が、８−アミドサクシニルアミノ−１，３，６−トリスルホン 酸、８−アセトキシ−１−ピレンスルホンアミド−３，６−ジスルホン酸、６， ８−ジアセトキシ−１−ピレンスルホンアミド−３−スルホン酸、８−エトキシ −１−ピレンスルホンアミド−３，６−ジスルホン酸、又は６，８−ジエトキシ −１−ピレンスルホンアミド−３−スルホン酸である、請求の範囲第６項記載の 炭化水素トレーサー。
8. ８．炭化水素部位が、８−アセトキシ−１，３，６−ピレンスルホンアミド−３ ，６−ジスルホン酸である、請求の範囲第７項記載の炭化水素トレーサー。
9. ９．Ｌがリガンド類似化合物である、請求の範囲第５〜８項のいずれか１項記載 の炭化水素トレーサー。
10. １０．Ｌがリガンドである、請求の範囲第５〜８項のいずれか１項記載の炭化水 素トレーサー。
11. １１．リガンドの定性及び／又は定量を行う試料のアッセイ方法において、 前記試料、有効量の請求の範囲第５、６、７又は８項のいずれか１項に記載の炭 化水素トレーサー、及び測定すべき前記リガンド及び前記トレーサーのリガンド 類似化合物に特異的な抗体を混合し；この混合物を均質又は不均質の蛍光アッセ イにかけて、前記試料中の前記リガンドの定性及び／又は定量を行うことを特徴 とする方法。
12. １２．前記トレーサーの炭化水素部位が、ピレンスルホン酸又はピレンスルホン アミドである請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．炭化水素部位が、８−アミドサクシニルアミノ−１，３，６−トリスルホ ン酸、８−アセトキシ−１−ピレネスルホアミド−３，６−ジスルホン酸、６， ８−ジアセトキシ−１−ピレンスルホンアミド−３−スルホン酸、８−エトキシ −１−ピレンスルホンアミド−３，６−ジスルホン酸、又は６，８−ジエトキシ −１−ピレンスルホンアミド−３−スルホン酸である、請求の範囲第１０項記載 の方法。
14. １４．炭化水素部位が、８−アセトキシ−１−ピレンスルホンアミド−３，６− ジスルホン酸である、請求の範囲第１１項記載の方法。