JP2706650B2 - 発光性金属キレート標識及び検出手段 - Google Patents
発光性金属キレート標識及び検出手段Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本出願は1984年10月3
1日出願の米国シリアルNo.666,987の部分的
継続出願であり、前記No.666,987は本出願に
参考として包含される。化学的、生化学的及び生物学的
物質を短時間で極めて特異的に検出し且つ計量せしめる
方法の必要性は益々高くなってきている。特に重要なの
は少量の薬物、代謝物質、微生物及び他の診断上重要な
物質を測定する方法である。この種の物質としては、例
えば麻酔薬及び毒薬、治療用として投与された薬剤、ホ
ルモン、病原となる微生物及びウイルス、抗体、代謝物
質、酵素並びに核酸が挙げられる。 【0002】 【従来の技術】これらの物質の存在はしばしば、多くの
生化学的系及び生物学的系の特徴をなす高度の特異性を
利用する結合法によって測定できる。頻繁に使用される
方法は例えば抗原−抗体システム、核酸ハイブリダイゼ
ーション技術、及びタンパク質−リガンドシステムに基
づくものである。これらの方法では診断上重要な複合体
の存在が通常、複合体構成物質の1つ又は複数に結合さ
れた観察可能ラベル(標識)の存在又は不在によって示
される。選択された特定ラベリング(標識)法はしばし
ば問題の物質の特定検出システムの有効性及び多目的性
を支配する。好ましい標識は安価、安全であり、且つ広
範囲にわたる化学的、生化学的及び生物学的物質にこれ
ら物質の重要な結合特性を変化させることなく効果的に
結合され得るという条件を満たさなければならない。こ
の好ましいラベルは極めて特徴的なシグナルを与えるも
のでなければならず、且つ自然界に余り見られない、又
は好ましくは全く存在しないものであることが望まれ
る。このラベルはまた、安定性を有し且つ数箇月にわた
って水性システム内で検出できるようなものでなければ
ならない。ラベルの検出は高価な専用設備又は人員を必
要とせず短時間で、高感度及び再現性をもって実施され
ることが望まれる。ラベルの計量は温度及びアッセイさ
れる混合物の組成のごとき変数に余り左右されないこと
が重要である。最も有利なものは、均質系即ち複合体状
のラベルされた物質及び非複合体状のラベルされた物質
を分離する必要のない系で使用できるラベルである。こ
れはラベルされた物質が特定複合体内に合体された時に
ラベルの検出性が変化しても可能である。 【0003】これまでにも様々なラベルが開発されてき
たが、これらのラベルはいずれも特定の利点及び欠点を
有する。例えば、放射性ラベルは使用範囲がかなり広
く、且つ極めて低い濃度で検出できる。しかしながらこ
の種のラベルは高価で危険性もあり、その使用には精巧
な設備と熟練した人員とが必要とされる。更に放射性ラ
ベルの感度は、検出し得る事象がその本質的性質上ラベ
ルされた物質の放射性原子1つ当たり1度の割合でしか
生起し得ないため限定される。加えて、放射性ラベルは
均質法では使用し得ない。 【0004】そこで非放射性ラベルが注目される。この
種のラベルは分光測光法、スピン共鳴法及びルミネセン
ス法により観察し得る分子、並びにこれらの分子を産生
する酵素を含む。有用な非放射性ラベリング物質の1つ
に有機金属化合物がある。生物系ではある種の金属は希
であるため、有機金属化合物の金属成分を特異的にアッ
セイする方法が有効に使用される。例えば、Caisの
米国特許第4,205,952号には、特定抗原の定量
に使用するための特定有機金属化合物でラベルされた免
疫化学的活性物質の使用が開示されている。これらのラ
ベルには、発光スペクトル、吸光スペクトル及び蛍光ス
ペクトルの測定、原子吸光並びに中性子活性化を含め
て、通常の選択金属検出法のいずれも使用できる。これ
ら通常の方法はしばしば感度に欠け、均質系にはほとん
ど使用し得ず、且つ原子吸光の場合のごとく、時として
試料の破壊を生起する。 【0005】特に有利なラベルは、光化学的手段、化学
的手段及び電気化学的手段によって発光させ得るラベル
である。“ホトルミネセンス”は物質が電磁放射線(電
磁波)を吸収した時に発光するように誘導されるプロセ
スである。蛍光及びリン光はホトルミネセンスの一種で
ある。化学ルミネセンスはエネルギーの化学的移行によ
って発光種を発生させるプロセスである。電気化学ルミ
ネセンスは電気化学的に発光種を発生させる。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】これら発光システムの
重要性は益々高まってきている。例えばMandleの
米国特許第4,372,745号には免疫化学的用途に
おける化学発光性ラベルの使用が開示されている。この
システムではラベルが化学的手段、例えばラベルとH2
O2 及びシュウ酸(オキサレート)との反応によって発
光状態に励起される。これらのシステムではH2 O2 が
シュウ酸を高エネルギー誘導体に酸化的に変換し、この
誘導体がラベルを励起する。このシステムは原則とし
て、このアッセイの酸化性条件下で安定性を示し且つ高
エネルギーシュウ酸誘導体により励起され得る発光物質
のいずれに対しても有効である。ところが残念なこと
に、この広範囲な利用性自体がこの方法を大きく限定す
る。即ち、問題のアナライト(対象分析物、analy
te)を含む通常の生物学的流体は潜在的発光物質も多
く含み、これらの物質が大きなバックグラウンドレベル
のルミネセンス(発光)を誘起し得るのである。 【0007】同様の欠点を有する化学ルミネセンスの免
疫化学的使用の別の例がOberhardt他の米国特
許第4,280,815号に開示されている。この場合
は化学発光種でラベルされた免疫反応物の極めて近くに
その場で酸化体(例えばH2O2 )を電気化学的に形成
せしめる。電気的に発生した酸化体は化学発光種内に向
かって拡散してこれを化学的に酸化し、その結果1つ以
上の電子がこの電気的発生酸化体に移行する。前記化学
発光種は酸化されると光子を放出する。これに対しこの
発明では、電子を電気化学的エネルギー源から光子を繰
り返し放出し得る化学発光種に直接移行しなければなら
ない。 【0008】本発明は電気化学ルミネセンスラベルに係
わる。適切なラベルは有機化合物及び有機金属化合物を
含む電気化学発光性化合物からなる。ラベルされた物質
の存在を決定する電気化学ルミネセンス法は多くの理由
から他の方法より好ましい。即ちこの種の方法は特定ラ
ベルの存在を極めて良く診断し得、感度が高く安全、安
価であると共に使用範囲が広い。電気化学的ラベルに適
した有機化合物としては例えばルブレン及び9,10−
ジフェニルアントラセンが挙げられる。多くの有機金属
化合物が適切な電気化学的ラベルを構成するが、特に有
用なものはRu−含有化合物及びOs−含有化合物であ
る。本発明は種々の方法によって検出し得るRu−含有
及びOs−含有ラベルの使用に係わる。これらのラベル
は後述の種々の理由から有利である。 【0009】Ru−含有有機金属化合物及びOs−含有
有機金属化合物についてはこれまでにも文献で議論され
てきた。Caisの開示によれば、第VIII属の貴金属、
例えばRuを含む任意の金属元素又は複数の金属元素の
組み合わせは原子吸光法によって検出し得る有機金属ラ
ベルの適切な成分となる(Cais、11欄、20行
目)。しかしながらルテニウムはCaisにおいては好
ましい金属ではなく、オスミウムについては特に記述が
なく、開示されているいずれの方法でもRu及びOsの
使用の効果についてのデータが全く示されていない。ま
た、好ましいとされている検出法、即ち原子吸光法は試
料を破壊する。 【0010】Weberの米国特許第4,293,31
0号はイムノアッセイにおけるアナライト用の電気化学
的ラベルとしてのRu−含有複合体及びOs−含有複合
体の使用を開示している。開示されている複合体はチオ
尿素結合を介してアナライトのアミノ基に結合される。
Weberはまた、ラベルと別のアナライトのヒドロキ
シ基との間でのカルボン酸エステル形成の可能性につい
て示唆している。Weberによれば、ラベルされた物
質の存在は消光剤と光手段付き電気化学的フローセル
(電池)とからなる装置及び方法によって決定し得る。
光電気化学的活性ラベルは光励起すると電子を消光剤分
子に移行させる。酸化された分子は次いで、適切な電位
(ポテンシャル)に保持されたフローセルの電極からの
電子によって還元される。この電子は光電流として決定
される。このシステムのラベルされた遊離アナライトの
量は光電流信号によって測定される。この方法は発光物
質の電気化学発光検出法の逆の方法であることに留意さ
れたい。 【0011】Weber他によるその後の報告(198
3年)Clinical Chemistry 29,
pp.1665−1672、Photoelectro
analytical Chemistry:Poss
ible Interferences in Ser
um and Selective Detectio
n of Tris(2,2’−bipyridin
e)ruthenium(II)in the Pres
ence of Interferentsでは、Ru
−含有ラベルの検出にこの方法を使用することに伴う問
題が議論された。Weber等の表2によれば、トリス
(ビピリジル)ルテニウム(II)の補外検出限度は最適
条件下で1.1×10-10 モル/Lである。これらのラ
ベルの実際的使用により複合体混合物の存在が測定され
ることを期待して、Neber等は彼等のシステムにお
ける潜在的干渉物質(interferent)をテス
トした。Weber等の表3には、ジメチルアルキルア
ミン、EDTA、N−メチルモルホリン、N,N’−ジ
メチルピペラジン、水酸化物、シュウ酸(塩)、アスコ
ルビン酸(塩)、尿酸、及び血清が、実際の検出限度を
1.1×10-10 モル/Lよりかなり上昇させ得る干渉
物質として列挙されている。 【0012】これらの研究は簡単なRu−含有化合物を
用いて行なわれた。Ru−含有ラベルでラベルした複雑
な物質の検出限度について、又はラベルされた物質とラ
ベルとの間のチオ尿素結合がこのアッセイの条件下で安
定しているか否かについては、Weber又はWebe
r等による研究では全く報告されていない。 【0013】本発明が係わる特定のラベルは電気化学発
光ラベルである。これらのラベルはしばしば、化合物を
電磁放射線又は化学的エネルギー源、例えば典型的シュ
ウ酸−H2 O2 システムによって形成されるものに曝す
ことによって、酸化又は還元されることなく、発光状態
に励起され得る。加えて、これら化合物のルミネセンス
はこれら化合物の酸化又は還元を伴う電気化学的方法に
よって誘起され得る。 【0014】光ルミネセンス、化学ルミネセンス及び電
気化学ルミネセンス手段を用いるRu(2,2’−ビピ
リジン)3 2+検出法に関する研究も報告されている:R
ubinstein及びBardの“Electrog
enerated Chemiluminescenc
e.37.Aqueous Ecl Systemsb
ased on Ru(2,2’−bipyridin
e)3 2+ and Oxalate or Organ
ic Acids”、J.Am.Chem.Soc.、
103、pp.512−516(1981年)、並びに
White及びBardの“Electrogener
ated Chemiluminescence.4
1.Electrogenerated Chemil
uminescence and Chemilumi
nescence of theRu(2,2’−bp
y)3 2+−S2 O8 2 - System in Acet
onitrile−Water Solution
s”、J.Am.Chem.Soc.、104、p.6
891(1982年)。この研究は明るいオレンジ色の
化学ルミネセンスが化学的又は電気的に発生したRu
(bpy)3 3+(式中、“bpy”はビピリジルリガン
ドを表す)と、シュウ酸イオン又は他の有機酸の酸化の
中間生成物として形成される強い還元剤との水性反応に
基づき得ることを示している。ルミネセンスは電気的又
は化学的に発生したRu(bpy)3 1+とペルオキシジ
スルフェートの還元の間に発生する強い酸化剤との反応
によって有機溶媒−H2 O溶液中でも得られる。Ru
(bpy)3 2+からの電気化学ルミネセンス発生の第3
のメカニズムはRu(bpy)3 1+を発生させるに十分
な負の電位とRu(bpy)3 3+を発生させるに十分な
正の電位との間の電極電位振動を利用する。これら3つ
の方法は夫々“酸化的還元”、“還元的酸化”、及び
“Ru(bpy)3 3+/+再生システム”と称する。 【0015】酸化的還元法は水中で実施し得、酸素又は
不純物の存在に比較的感応し難い強くて効果的で安定し
たルミネセンスを生起する。Ru(bpy)3 2+からの
このルミネセンスはシュウ酸又は他の有機酸、例えばピ
ルビン酸(ピルベート)、乳酸(ラクテート)、マロン
酸(マロネート)、酒石酸(タートレート)、クエン酸
(シトレート)の存在とRu(bpy)3 3+種を酸化的
に産生する手段とに依存する。この酸化はPbO2 又は
Ce(IV)塩のような強い酸化剤によって化学的に実施
し得、また連続的又は断続的に加えられる十分に正の電
位により電気化学的に実施し得る。Ru(bpy)3 2+
の電気化学的酸化に適した電極は例えばPt、熱分解グ
ラファイト、及びガラス質炭素である。シュウ酸又は他
の有機酸は化学ルミネセンスの間に消耗されるが、消耗
物質の過剰の存在又は反応室内への消耗物質の連続的供
給により、何時間にもわたる強くて一定した化学ルミネ
センスが生起し得る。 【0016】還元的酸化法は例えばアセトニトリルのご
とき有機共存溶媒を含む部分的水性溶液中で実施し得
る。このルミネセンスはペルオキシジスルフェートの存
在とRu(bpy)3 1+種を還元的に産生する手段とに
依存する。この還元は例えばマグネシウム又は他の金属
のごとき強い還元剤によって化学的に実施し得、また連
続的又は断続的に加えられる十分な負の電位により電気
化学的に実施し得る。Ru(bpy)3 2+の電気化学的
還元に適した電極としては例えば磨いたガラス質炭素電
極が挙げられる。酸化的還元法の場合と同様に、過剰試
薬の存在又は反応混合物への消耗試薬の連続的添加によ
り強い連続的発光が何時間にもわたって得られる。 【0017】Ru(bpy)3 3+/+再生システムはアセ
トニトリルのごとき有機溶媒又は部分的水性システム中
で、Ru(bpy)3 2+を還元するに十分な負の電位と
Ru(bpy)3 2+を酸化するに十分な正の電位との間
で電極電位をパルスにすることで実施し得る。このよう
な再生システムに適した電極としては例えばPt電極が
ある。このシステムは化学的試薬を消耗せず、原則とし
て永久に作動し得る。 【0018】これら3種のRu−含有発光化合物産生法
はいずれもRu−含有化合物の酸化−還元又は還元−酸
化を繰り返し行なう。従ってこれらの化合物を含む溶液
のルミネセンスは、加えられるエネルギー源の電位に大
きく依存し、そのためRu−含有化合物の存在を極めて
良く検出(診断)する。 【0019】MandleはCurtis他の“Che
miluminescence;ANew Metho
d for Detecting Fluoresce
ntCompounds Separated By
Thin Layer Chromatograph
y”,J.Chromatography 134,p
p.343−350(1977年)をRu−トリス(ビ
ピリジル)(II)を化学ルミネセンス用途において使用
し得るラベルとして確認するものとして引用している。
Curtis他はRu複合体がシュウ酸/H2 O2 シス
テムにより化学的に励起されると光を発するようになり
得るという非公開意見を報告しているに過ぎない(Cu
rtis他p.350)。MandleもCurtis
も化学ルミネセンス用途におけるルテニウム及びオスミ
ウム複合体の例外的有用性、又は電気化学ルミネセンス
システムの有用性は認めなかった。Sprintsch
nik,G.他の“Preparation and
PhotochemicalReactivity o
f Surfactant Ruthenium(II)
Complexes in Monolayer As
sembliesand at Water−Spli
d Interfaces”,J.Am.Chem.S
oc.99,pp,4947−4954(1977年)
にはオクタデカノール又はデヒドロコレステロールでエ
ステル化したトリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウ
ム(II)が記載されており、これら界面活性複合体の単
層フィルムの形成法が開示されている。これら複合体は
ホトルミネセンス性であった。しかしながら、このフィ
ルムを水に曝し次いで光に曝すとRu−複合体はホトル
ミネセンスを発生しなかった。その原因は光の存在下に
おけるエステル基の光加水分解にあった。 【0020】本出願人は広範囲のアナライトと当該アナ
ライトに結合する化学種(moieties)とがRu
−含有又はOs−含有ラベルにアミド結合又はアミン結
合を介して適切に結合されることを発見した。本明細書
はこれを開示する。これらのラベルされた物質は広範囲
にわたる任意の手段によって検出(決定)し得るが、現
在のところ最も有効で信頼できる高感度手段はホトルミ
ネセンス、化学ルミネセンス及び電気化学ルミネセンス
手段である。本明細書では、Ru−含有及びOs−含有
ラベルとルブレン及び9,10−ジフェニルアントラセ
ンのごとき有機分子とを含む電気化学ルミネセンスラベ
ルが特に多目的に使用し得、有利であることも開示す
る。以下にこれら新規のラベルされた物質の使用と、こ
れら物質の検出法との大きな利点を説明する。 【0021】 【課題を解決するための手段】本発明によれば、式 【化2】〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p
(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Mはルテニウム又はオスミウム;PはMの多座
配位(polydentate)リガンド;L1、L
2、L3、L4、L5及びL6はMのリガンドであり、
各々が別のリガンドと互いに同じでもよく異なるもので
もよい;Bは1つ以上のアミド又はアミン結合によって
P、L1、L2、L3、L4、L5、又はL6の1つ以
上に共有結合した物質;mは1以上の整数;n、o、
p、q、r及びsの各々は0又は整数;tは1以上の整
数;uは1以上の整数;P、L1、L2、L3、L4、
L5、L6及びBは化学種(chemical moi
ety)が電磁放射線(電磁波)を放出すべく誘導され
るような組成と数とを有しており、Mのリガンドによっ
てMに与えられる結合の総数がMの配位数に等しい〕で
示される化学種が提供される。本発明は特に、発光ルテ
ニウム−又はオスミウム−含有ラベルを化学物質、生化
学物質及び生物物質のアミノ基に結合するための中間体
(介在物)として適当な化合物を提供する。従ってこれ
ら中間体は本発明の化学種の生成に特に適している。中
間体は、ルテニウム−又はオスミウム−ビス(2,2’
−ビピリジン)(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジ
カルボン酸)のモノ−及びジ−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル及びその塩、並びにルテニウム−又はオ
スミウム−ビス(2,2’−ビピリジン)(4,4’−
ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン)である。
これら化合物は当業者に公知の手段で合成され得る。 【0022】本発明は、新規な化学種の存在の判定方法
を提供する。本発明はまた、式 【化3】〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p
(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Mはルテニウム又はオスミウム;PはMの多座
配位リガンド;L1、L2、L3、L4、L5及びL6
はMのリガンドであり、各々が別のリガンドと互いに同
じでもよく異なるものでもよい;BはMのリンガド物質
であるか又はP、L1、L2、L3、L4、L5、又は
L6の1つ以上に結合した物質;mは1以上の整数;
n、o、p、q、r及びsの各々は0又は整数;tは1
以上の整数;uは1以上の整数;P、L1、L2、L
3、L4、L5、L6及びBは化学種が電磁放射線を放
出すべく誘導されるような組成と数とを有しており、M
のリガンドによってMに与えられる結合の総数がMの配
位数に等しい〕で示される化学種の存在の判定方法を提
供する。 【0023】本発明方法は、 a)適当な条件下で化学種を含有する反応混合物(re
agent mixture)を形成させ、 b)反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種からの電磁放射線の放出を誘導し、 c)放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定するステップを含む。 【0024】本発明は更に、対象物質の存在を判定する
結合方法においてルテニウム含有又はオスミウム含有ラ
ベルの使用を提案する。これらの方法は、ラベルされた
対象化学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用
して対象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析
物の類似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を
判定するため、等に使用され得る。これら結合方法は均
一又は不均一結合方法のいずれでもよい。 【0025】更に本発明は、本発明のルテニウム含有又
はオスミウム含有化学種の存在を判定するためのシステ
ムを提供する。本発明のシステムは化学種からの電磁放
射線の放出を誘導する手段と放出された電磁放射線を検
出する手段とを含む。本発明は更に、対象分析物判定用
の結合方法にルテニウム含有又はオスミウム含有化学種
を使用するためのシステムを提供する。本発明によれ
ば、式 【化4】(A)k(B)u 〔式中、Aは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電磁
放射線を反復的に放出すべく誘導され得る化合物;Bは
Aに結合した物質;kは1以上の整数;uは1以上の整
数〕で示される化学種の存在を判定するために、 a)適当な条件下で化学種を含有する反応混合物を形成
し、 b)化学種を電気化学エネルギに直接曝露して化学種か
らの電磁放射線の反復的放出を誘導し、 c)放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定するステップを含む方法を提供する。 【0026】本発明は更に、対象物質の存在を判定する
ための結合方法における電気化学ルミネセンス性ラベル
の使用を提案する。これらの方法はラベルされた対象化
学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用して対
象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析物の類
似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を判定す
るため、等に使用され得る。これら結合方法は均一又は
不均一結合方法のいずれでもよい。 【0027】 【発明の実施の形態】本発明の特定具体例では、異なる
2種以上の化学種を含有する組成物が提供される。化学
種の各々は異なる波長の電磁放射線を放出すべく誘導さ
れ得る化学物質種(chemical specie
s)でもよい。本発明の別の具体例では、化学種は、各
々が異なる値のエネルギ又は異なるエネルギ源からのエ
ネルギに曝露されて電磁放射線を放出すべく誘導される
ような複数の化学物質種から成ってもよい。この場合、
別の対象物質又は分析物が異なる化学種の各々に特異的
に結合し得る。これらの組成物及び方法の使用によっ
て、被験サンプル中に存在する異なる2種以上の対象物
質又は分析物を判定することが可能である。 【0028】本発明によれば、式、 【化5】〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p
(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Mはルテニウム又はオスミウム;PはMの多座
配位リガンド;L1、L2、L3、L4、L5及びL6
はMのリガンドであり各々が別のリガンドと互いに同じ
でもよく異なるものでもよい;Bは1つ以上のアミド又
はアミン結合によってP、L1、L2、L3、L4、L
5、又はL6の1つ以上に共有結合した物質;mは1以
上の整数;n、o、p、q、r及びsの各々は0又は整
数;tは1以上の整数;uは1以上の整数;P、L1、
L2、L3、L4、L5、L6及びBは化学種が電磁放
射線を放出すべく誘導され得るような組成と数とを有し
ており、MのリガンドによってMに与えられる結合の総
数がMの配位数に等しい〕で示される化学種が提供され
る。 【0029】この化学種は、1種類以上のMの多座配位
リガンドを有していなければならない。この化学種が2
つ以上の多座配位リガンドを有するとき複数の多座配位
リガンドは互いに同じでもよく異なっていてもよい。多
座配位リガンドは芳香族及び脂肪族リガンドを含む。適
当な芳香族多座配位リガンドは芳香族複素環リガンドを
含む。好ましい芳香族複素環リガンドは窒素含有リガン
ド例えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル及び
フェナントロリルである。 【0030】適当な多座配位リガンドは未置換でもよ
く、又は当業者に公知の多数の置換基のいずれかによっ
て置換されていてもよい。適当な置換基の例は、アルキ
ル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキ
ル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシア
ルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロ
キシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ
ル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有
基、燐含有基及びN−ヒドロキシスクシンイミドのカル
ボン酸エステルである。 【0031】この化学種は1種類以上の単座配位(mo
nodentate)リガンドを有していてもよい。多
数の単座配位リガンドが当業者に公知である。適当な単
座配位リガンドは例えば、一酸化炭素、シアニド(シア
ン化物)、イソシアニド、ハロゲン化物、並びに、脂肪
族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチビン、
アルシンである。 【0032】本発明の化学種のとくに好ましい具体例
は、ビス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム(II)及
びトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム(II)で
ある。 【0033】付加的化学ラベル例えば放射性同位体、蛍
光成分又は付加的発光ルテニウム−もしくはオスミウム
−含有中心に結合されるべき1種類以上のMのリガンド
は本発明の範囲内に包含される。更に、2つ以上又は多
数の電気化学ルミネセンス性中心によってラベルされる
べきラベル物質(B)も本発明の範囲内に包含される。 【0034】適当な物質(B)としては多くの生物物
質、例えば全細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク
質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、核
酸、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝物、ホルモン、薬理
物質、トランキライザー、バルビツール酸エステル、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び糖類
がある。全細胞は動物又は植物又は細菌のいずれでもよ
く、生細胞でも死細胞でもよい。例えば植物病原体例え
ば菌類又は線虫類がある。「細胞下粒子」なる用語は、
例えば、細胞下小器官、破壊細胞の膜粒子、細胞壁の断
片、リボソーム、多酵素複合体及びその他の生体由来の
粒子を包含する。核酸は例えば、様々な由来の染色体D
NA、プラスミドDNA、ウイルスDNA、及び組換体
DNAを含む。核酸はまた、RNA例えば、メッセンジ
ャーRNA、リボソームRNA、転移RNAを含む。ポ
リペプチドは例えば、酵素、輸送タンパク質、受容体タ
ンパク質、及び構造タンパク質例えばウイルスコートタ
ンパク質を含む。好ましいポリペプチドは酵素及び抗体
である。特に好ましいポリペプチドはモノクローナル抗
体である。ホルモンは例えばインシュリン及びT4甲状
腺ホルモンを含む。薬理物質(薬理剤)は例えば、強心
配糖体を含む。生物物質に化学的に類似した合成物質例
えば合成ポリペプチド、合成核酸、合成膜、小胞及びリ
ポソームも勿論本発明の範囲内に包含される。これらは
全て本発明での使用に適した生物物質の判り易い例とし
て示しただけであり、本発明の範囲はこれらの物質に限
定はされない。 【0035】ラベルされた重合物質の如き非生物物質も
本発明の範囲内に含まれる。これらの物質は可溶重合分
子の形態でもよく、又は、公知の種々の巨視形態のいず
れか例えばビーズ等でもよく、又は、試験管、壜もしく
はアッセイウェル等の如き容器でもよい。生物物質及び
非生物物質(B)はアミド又はアミン結合を介してMの
リガンドに共有結合する。アミド結合の場合、結合は、
物質(B)がアミド結合のカルボニル又は窒素に直接結
合するように配向される。これらの化学種はイオン化さ
れていてもよい。その場合、異なる多くの対イオンが化
学種調整物の電荷を中和し得ることは当業者に明らかで
あろう。適当なカチオンは例えば、H+ 、NH4 +、グ
アニジニウム、Ag+ 、Li+ 、Na+ 、K+ 、M
g2+、Mn2+、Cd2+である。適当なアニオンは例え
ば、ハロゲン化物、OH- 、炭酸塩、SO4 2-、ヘキサ
フルオロホスフェート及びテトラフルオロボレートであ
る。 【0036】本発明は更に、ルテニウム含有又はオスミ
ウム含有の発光ラベルを化学物質、生化学物質及び生物
物質のアミノ基に結合させる中間体(介在物)として特
に適した化合物を提供する。従ってこれら中間体は本発
明の化学種の合成に特に適している。本発明の中間体は
ルテニウム又はオスミウムのビス(2,2’−ビピリジ
ン)(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン
酸)のモノ−及びジ−N−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル及びその塩並びにルテニウム又はオスミウムビス
(2,2’−ビピリジン)(4,4’−ジ(クロロメチ
ル)−2,2’−ビピリジン)である。 【0037】これら中間体は以下の化学構造を有する。
ルテニウム又はオスミウムのビス(2,2’−ビピリジ
ン)(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン
酸)のモノ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
は、 【化6】 〔式中、MはRu又はOs、nは整数1、2又は3〕又
はその塩及びその立体異性体を含む。 【0038】ルテニウム又はオスミウム−ビス(2,
2’−ビピリジン)(2,2’−ビピリジン−4,4’
−ジカルボン酸)のジ−N−ヒドロキシスクシンイミド
エステルは、 【化7】 〔式中、MはRu又はOs、nは整数1、2又は3〕又
はその塩及びその立体異性体を含む。 【0039】ルテニウム又はオスミウム−ビス(2,
2’−ビピリジン)4,4’−ジ(クロロメチル)−
2,2’−ビピリジン)は、 【化8】 〔式中、MはRu又はOs、nは整数1、2又は3〕及
びその塩及びその立体異性体を含む。これら化合物は当
業者に公知の手段で合成され得る。 【0040】ルテニウム含有N−ヒドロキシスクシンミ
ンドエステルの好ましい合成方法によれば、先ず炭酸水
素ナトリウムの高温メタノール水溶液中でルテニウムジ
クロロビス2,2’−ビピリジンを2,2’−ビピリジ
ン−4,4’−ジカルボン酸と反応させる。酸性化した
後にカルボキシル化したルテニウム化合物の溶液にNa
PF6 の水溶液を添加する。単離したルテニウム錯体の
ヘキサフルオロホスフェート塩を次に、ジメチルホルム
アミド中のジシクロヘキシルカルボジイミドの存在中で
N−ヒドロキシスクシンイミドと反応させてエステル化
する。本発明の中間体の効果を実質的に悪化させずにN
−ヒドロキシスクシンイミド成分の構造について多くの
変形が可能である。これら中間体はイオン化されてもよ
い。その場合、異なる多くの対イオンが中間体調整物の
電荷を中和し得ることは当業者に明らかであろう。適当
なカチオンは例えば、H+ 、NH4 + 、グアニジニウ
ム、Ag+ 、Li+ 、Na+ 、K+ 、Mg2+、Mn2+、
Cd2+である。適当なアニオンは例えばハロゲン化物、
炭酸塩、SO4 2-、ヘキサフルオロホスフェート及びテ
トラフルオロボレートである。 【0041】これら中間体は、カルボン酸エステルを攻
撃してN−ヒドロキシスクシンイミドを置換し得るか又
はクロロメチル基を攻撃して塩化物を置換し得る遊離ア
ミノ基を含有する物質をラベルするために有効である。
対象分析物をラベルするためには従来技術のイソチオシ
アネート(例えばWeber、米国特許第4,293,
310号)よりも本発明の中間体のほうが好ましい。イ
ソチオシアネートは一般に、二硫化炭素又はチオホスゲ
ンと第一級アミンとの反応によって調製されるが、二硫
化炭素及びチオホスゲンはいずれも揮発性であり極めて
有毒である。二硫化炭素はまた、引火爆発の危険があ
る。また必要な前駆物質たる芳香族第一級アミンは本発
明で使用される前駆物質たる芳香族カルボン酸よりも入
手が難しい。また、本発明の中間体はイソチオシアネー
ト誘導体よりも反応しにくく従って保存及び取り扱いが
容易である。 【0042】本発明は更に、本発明の化学種の存在を判
定する方法を提供する。金属含有組成物は、当業者に公
知の種々の手段例えば放出(エミッション)、吸収、蛍
光スペクトル測定、原子吸収、陽極ストリッピング電圧
測定、中性子活性化及び電気化学的方法の如き手段によ
って検出され得る。ホトルミネセンス、ケミルミネセン
ス及び電気化学ルミネセンスの方法が特に重要である。
ルミネセンスの技術を使用するとRu(bpy)3 2+が
極めて低濃度でも測定できる。酸化的還元法を用いると
(Ege等(1984)、Analytical Ch
emistry、印刷中)、5×10-8Mの濃度のRu
(bpy)3 2+の検出が可能であった。これらの実験で
は、燐酸バッファpH5.0中に1mMのシュウ酸ナト
リウムを用い、飽和塩化ナトリウム参照電極に対して電
位を+1.0V〜+1.4Vで5〜10秒間隔のパルス
にした。還元的酸化法ではより高い感度が得られること
も知見された。CH3 CN:H2 O(1:1容量/容
量)中の18mMのNa2 S2 O8 と0.1Mのテトラ
−n−ブチルアンモニウムテトラフルオロボレートとを
使用すると10-13 Mという低い濃度のRu(bpy)
3 2+が検出できた。方法を更に精密にすれば更に高い感
度が期待できる。これらの方法はまた、ラベルされた物
質の敏感で正確な測定値を与える。これに関しては後出
の実施例で十分に説明する。 【0043】Ru(bpy)3 2+でラベルした物質に関
する本出願人等の実験によって、ルテニウム含有及びオ
スミウム含有化合物の化学ラベルとしての利点が証明さ
れた。これらの化合物は長期安定性であり、種々の化学
物質、生化学物質及び生物物質に有効に結合し得る。ラ
ベルは安全で比較的安価である。 【0044】それらは極めて特徴的なシグナルを与え、
自然には生起しないものである。標識の発光に基づく測
定は高感度、迅速且つ再現性があり、簡単な装置を利用
するものである。これらの標識の発光に基づく検出はリ
ン酸緩衝溶液、トウィーンTM(界面活性剤)、肝臓組織
抽出物又は血清のような成分のよっては殆んど干渉され
ることはない。これら標識の発光に基づく測定は試料又
は標識物質を破壊することなく繰返し行うことができ
る。各標識分子によりシグナルが繰返し発せられ、それ
によって、これら標識を検出し得るだけに感度が増強さ
れる。特定用途の必要に応じて、標識物質の存在は定量
的又は定性的に測定することができる。注意事項:「測
定」という用語は本明細書に於いて標識物質の定量的又
は定性的測定の意味に用いる。 【0045】従って、本発明は次式を有する化学種: 【化9】〔M(P)m (L1 )n (L2 )o (L3 )p
(L4 )q (L5 )r (L6 ) s 〕t (B)u 〔式中、Mはルテニウムまたはオスミウムであり、Pは
Mの多座配位リガンドであり、L1 、L2 、L3 、
L4 、L5 およびL6 はMのリガンドであって各々同一
でもまたは互いに他のリガンドと異なっていてもよく、
BはMのリガンドである物質であるかまたはP、L1 、
L2 、L3 、L4 、L5 もしくはL6 の1個以上に結合
している物質であり、mは1以上の整数であり、n、
o、p、q、rおよびsの各々はゼロまたは整数であ
り、tは1以上の整数であり、uは1以上の整数であ
り、P、L1 、L2 、L3 、L4 、L5 、L6 およびB
は電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導できる
ような組成と数になっており、MのリガンドとMとの結
合の総数はMの配置数に等しい〕の存在を測定するため
の方法であって、 【0046】a)適切な条件下で前記化学種を含有する
試薬混合物を形成し、 b)この試薬混合物を化学エネルギーまたは電気化学エ
ネルギーに曝露することによって化学種を誘導して電磁
放射線を放出させ、 c)放出された電磁放射線を検出することにより対象分
析物の存在を測定することからなる方法を提供するもの
である。 【0047】本発明方法で使用し得る化学種中に、生物
由来の又はそうでない物質(B)はMへの直接の配位に
よって、又はMのリガンドに結合することで該種に取り
込まれ得るものである。結合は共有結合、静電気結合又
は水素結合によってなされ得るものである。物質(B)
をMのリガンドに共有結合させ得る手段は多様である。
例えば、上記結合はアミドあるいはアミン結合、エステ
ルあるいはチオエステル結合、エーテルあるいはチオエ
ーテル結合又は当業者に公知の多数の他の手段のうちの
いかなるものでも良い。結合の型はリガンドの置換基及
び標識されることになっている物質上にあるリガンドと
の結合に用い得る適当な化学基によって決定されること
になる。適当な物質(B)には、例えば、細胞全体、細
胞レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパ
ク、リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝
物質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤(トランキライザ
ー)、精神安定剤(バルビツエート)、アルカロイド、
ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由来でな
いポリマーがある。本発明の好適具体例では、結合はア
ミド又はアミン結合である。アミド又はアミン結合はリ
ガンド上の置換基及び標識されることになっている物質
上のアミノ基との間で形成される。 【0048】本発明方法は相補的物質と特異的複合体
(コンプレックス)を形成することによって化学種を測
定する方法を含むものである。特に興味があるのは、抗
原−抗体の一対の物質についてである。この結合方法
は、例えば、血液、尿又は合成反応混合物のような複合
体混合物中のジゴキシン又はジギトキシンのような標識
抗原の存在を、まず初めに対象抗原に特異的な固定化抗
体に該混合物を接触させ、その後該固定化抗体に結合し
た標識物質の量を測ることによって測定する為に使用す
ることができる。 【0049】「誘導して電磁放射線を放出させる」とい
う語句は該化学種の励起状態を作り出すことを意味し、
これは室温にて200nm〜900nmの波長の発光を
行なうものである。本発明はオスミウム含有種及びルテ
ニウム含有種に関するものであり、リガンドの化学構造
を変化させることによって得られる広範囲に恒る様々な
発光種を含有するものである。これらの金属及びリガン
ドが変化することにより、それら発光種が励起状態にな
る為に必要とされるエネルギー入力の正確な値が変り得
る。これと同様に、電磁放射線の放出波長はルテニウム
又はオスミウム含有物質の性質及び環境によって変化し
得るものである。一般に、ホトルミネセンスに於ける励
起及び発光は約200nm〜約900nmの波長の電磁
放射線を伴って生起するものである。化学発光及び電気
化学発光に於ける放出は一般に約200nm〜約900
nmの波長の電磁放射線の放出を伴って生起するもので
ある。化学種の酸化・還元が起るポテンシャルは使用す
る電極の性質及び溶液のpHのような因子と同様にまさ
にその化学構造に左右されるものである。一般に、ホト
ルミネセンスシステムに於ける励起及び放出の最適波長
及び化学発光又は電気化学発光システムの最適ポテンシ
ャル及び最適放出波長の測定方法は当業者には周知のこ
とである。 【0050】存在する発光種を定量する方法は多数ある
ということは明らかである。システムへのエネルギー入
力の速度によって発光種を測定することができる。適当
な測定としては、例えば、発光種が電気化学的に生成さ
れる際の電流測定、化学的に発光種を生成する際の還元
剤あるいは酸化剤の使用速度又はホトルミネセンス法に
於ける電磁エネルギーの吸収速度の測定が挙げられる。
更に当然のことながら、放出される電磁放射線を測定す
ることによっても、発光種を検出することができる。こ
れら測定は全て、速度に基づく連続的な測定、又は長時
間に恒りシグナルを累積する累積法のいずれかの方法と
して実施し得る。速度に基づく測定の例としては、入射
光強度に比例した量の電流を生じる、光電子増倍管チュ
ーブ、光ダイオード又は光トランジスターを用いるもの
がある。累積法の例としては、速度に基づいて得られた
データの積分、及び直接に累積データを与える写真フィ
ルムを用いるものがある。 【0051】これら全ての発光に基づく方法には、ルテ
ニウム含有化合物による発光の繰返しが必然的に伴って
いる。検出し得る事象が繰返し起るというこれらの標識
の持つ性質は、放射性同位体又はルミノールのような結
合化学発光分子とは明確に異なるものである。後者の標
識はその分子(又は原子)1個につきただの1回しか検
出し得る事象を生起せず、その為にこれら標識の検出可
能性は制限される。 【0052】本発明は更に、ルテニウム及びオスミウム
含有標識を対象分析物の存在を測定する為の結合方法に
使用することを提供するものである。このような結合方
法は当業者には数多く知られている。これらの方法はし
ばしば、生化学的及び生物的成分が互いに結合する際の
高度な特異性を利用するものである。その例としては、
核酸ハイブリダイゼーション法に基づく方法、抗原−抗
体に基づく方法及び酵素−リガンドに基づく方法があ
る。これらの方法では、対象分析物を測定する為に標識
種を用いるか又は競合結合アッセイに於いては対象分析
物を測定する為に対象分析物の標識類似体を使用する為
に標識種を用いることができる。対象分析物及び化学種
は特異的な様式でお互いに結合し得る物質の対であれば
どのようなものでもかまわない。このような物質として
は、例えば、細胞全体、細胞レベル下の粒子、核酸、多
糖、タンパク、糖タンパク、リポタンパク、リポ多糖、
ポリペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理剤、鎮静
剤、精神安定剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸、糖及び生物由来でないポリマーがある。 【0053】特に興味があるのは、抗原−抗体対であ
る。例えばこの方法には細胞表面抗原の存在を測定する
為に標識抗体を使用すること、又は細胞選別法による検
出の為に或る特定の細胞を標識することが含まれる。例
えば固定化された非標識抗体に結合することによって固
定化された抗原は一般に「サンドイッチ法」として公知
の方法に於いて標識抗体によって検出することができ
る。 【0054】競合結合アッセイに於いては、対象分析物
及び該分析物の標識類似体は、例えば、細胞全体、細胞
レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパク、
リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝物
質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤、精神安定剤、アルカロ
イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由
来でないポリマーのような相補的物質との特異的複合体
の形成に関与することのできる物質であればどのような
物質でもかまわない。特に興味があるのは抗原−抗体に
基づく方法である。この方法は、対象分析物がその分析
物の標識類似体を抗体から追い出したときにその分析物
を検出する、ラジオイムノアッセイと呼ばれる周知のも
のに類似している。当業者に公知のラジオイムノアッセ
イの様々な変法は、放射活性標識された化合物の代りに
本発明の標識化学種を用いることによって原理的には有
利に使用することができる。 【0055】本発明は更にホモジーナス又はヘテロジー
ナスな結合方法に於いて標識化学種を使用することを提
供するものである。ヘテロジーナス結合方法に於いて
は、標識の存在を測定する前に未結合標識物質から結合
標識物質を物理的に分離しなければならない。これは抗
原−抗体システムに於いてしばしば、例えば抗体という
一成分を、フィルターのような不溶マトリックスか又は
テストチューブのような反応容器或いはビーズの表面に
結合させて固定化することにより達成される。抗原含有
溶液をフィルターを通すか又は反応容器に注ぎ、その後
それをフィルター又は反応容器側部から洗滌除去する。
抗体に特異的に結合した抗原のみが残留し測定されるこ
とになる。 【0056】これと対照的にホモジーナス方法に於いて
は、標識の存在を測定するときに結合及び未結合の標識
物質が同一反応混合物中に存在する。これは標識からの
検知可能なシグナルの特性が結合によって修飾されると
きに可能となる。発光標識をホモジーナスシステムで使
用することのできるような多数の方法がある。例えば、
もし発光消光剤が抗体上に適切に配置されているなら
ば、標識抗原が結合することによって該抗体上の発光消
光剤が標識の発光を抑制する。発光標識を用いる多数の
ホモジーナス方法が当業者に公知であり、そのうちの幾
つかはBoguslaski及びLi(1982)著の
「ホモジーナスイムノアッセイ」、Applied B
iochemistry and Biotechno
logy7,401−414頁中で検討されている。 【0057】本発明によって独特で有効なタイプの均質
結合アッセイが提供される。本文中の記載によれば、こ
れらのラベルは、ラベルされた対象物質の溶液を電極に
接触させることによって電気化学的に測定され得る。溶
液中に存在するが電極の表面に接近できないラベル物質
は検出されないであろう。検出されない場合として例え
ば、ラベル物質が電極を収容した反応容器の表面に直接
又は間接に結合しているとき、又は、ラベルが特異的複
合体例えば抗原抗体複合体の内部深くに包埋されている
とき、又は、電極自体がラベル物質を通過させるが錯体
を形成したラベル物質を通過させない層で被覆されてい
るときがある。更に、電極の表面が抗体で被覆されるこ
ともあり、この場合、固定化抗体に結合したラベル抗原
だけが電極に接近でき従って測定され得る。所望の電極
電位が短いパルスで与えられるときはこの特別な均質法
が最も有効であろう。 【0058】ラべル化合物の存在を測定する手段の組み
合わせ使用も本発明の範囲内に包含される。例えば、ホ
トルミネセンス又はケミルミネセンスの如き結合ラベル
物質と未結合ラベル物質とを識別しない手段によってラ
ベル物質の総量を測定し、例えば電気化学ルミネセンス
の如き結合ラベル物質と未結合ラベル物質とを識別する
手段によって結合ラベル物質の量を測定するのが好まし
い。かかる組み合わせ方法は同じサンプルに実施するこ
とができ、従って方法が個々に使用される場合よりもサ
ンプルに関して多くの情報が得られる。更に、本発明の
範囲内で同じ反応混合物中の異なる2種以上のラベル化
合物の存在を測定することも可能である。このような方
法は、異なるラベルが異なる波長の電磁放射線を放出す
るとき、又は、ラベルが異なる値又は異なるエネルギ源
のエネルギに曝露されることによって電磁放射線を放出
すべく誘導され得るときに可能である。本発明は更に、
ルテニウム含有又はオスミウム含有化学種の存在を測定
(判定、決定)するシステムを提供する。該システム
は、化学種を含有する反応混合物(試薬混合物)と電磁
放射線を放出せしむべく化学種を誘導する手段と、放出
された電磁放射線を検出する手段とを含む。 【0059】本発明は更に、対象分析物を測定するため
にルテニウム含有又はオスミウム含有のラベル化学種を
使用するシステムを提供する。本発明のシステムは、本
明細書に開示され且つ教示された種々の方法の迅速、有
効且つ柔軟な実行に有用である。本発明は更に、式
(A)k(B)uで示される化学種の存在の測定方法を
提供する。Aは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電
磁放射線を反復的に放出するように誘導され得る化合物
である。これら化合物は、無機、有機金属又は有機化合
物のいずれでもよく、例えばルブレン、9,10−ジフ
ェニルアントラセン、又はルテニウム含有もしくはオス
ミウム含有ラベルである。BはAに結合した物質であ
り、kは1以上の整数であり、nは1以上の整数であ
る。 【0060】該方法によれば、適当な条件下で化学種を
含有する反応(試薬)混合物を形成し、化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線を反
復的に放出せしむべく誘導する。放出された電磁放射線
は適当な方法によって検出されこれによって化学種の存
在を測定し得る。生物又は非生物物質(B)はAに対す
る任意の結合形態によって化学種に組み込まれることが
可能である。結合は、A中に存在する金属原子又はAの
リガンドに対する配位によって行なわれる。結合は、共
有結合、静電結合又は水素結合でもよい。結合のタイプ
は、AとBとの双方の結合に使用し得る適当な化学基に
よって決定されるであろう。 【0061】適当な物質(B)は例えば、全細胞、細胞
下粒子、核酸、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、リ
ポタンパク質、リポ多糖類、ポリペプチド、細胞代謝
物、ホルモン、薬理物質、トランキライザー、バルビツ
ール酸エステル、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸及び糖である。物質は生物物質に限定され
ない。ポリマー、有機又は無機の化合物の如き任意の適
当な非生物物質でもよい。 【0062】化学種は、室温で約200ナノメータ〜約
900ナノメータの波長で発光する化学種の励起状態を
生起することによって電磁放射線を放出すべく誘導され
る。本発明のこの具体例において、化学種は反応(試
薬)混合物を電気化学エネルギに曝露することによって
励起される。本発明の化学種の還元又は酸化が生じる電
位は、該化学種の正確な化学構造と溶液のpH及び使用
電極の種類の如き要因とに依存する。電気化学ルミネセ
ンスシステムの最適な電位と放出波長との決定方法は当
業者に公知である。電気化学発光性の化学種を測定する
には、電流又は放出電磁放射線の測定の如き任意の適当
な方法を用いる。また、本発明の化学種の存在の測定方
法を化学種が別の化学物質と結合できる場合に利用する
ことも可能である。化学物質は化学種に特異的に結合し
得る任意の物質でよい。かかる方法の例として核酸ハイ
ブリダイゼーション方法、抗体−抗原に基づく方法及び
酵素−リガンド方法がある。 【0063】本発明の別の具体例によれば、電気化学発
光性の化学種(A)k(B)uが、該化学種に結合する
対象分析物の存在を測定するために使用され得る。対象
分析物は、電気化学発光性の化学種に結合し得るいかな
る物質でもよい。例えば電気化学発光性の化学種でラベ
ルされた抗体に結合し得る抗原でもよい。方法は、反応
(試薬)混合物を形成させるに適した条件下で分析物を
化学種と接触させるステップを含む。次に化学種を電気
化学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の
反復的放出を誘導する。分析物に結合した化学種によっ
て放出された電磁放射線を検出することによって分析物
の存在を測定(判定)する。 【0064】また、対象分析物の存在を測定するために
競合結合方法を使用することも可能である。分析物と化
学種(A)k(B)uとは化学物質に競合的に結合す
る。反応混合物を形成させるに適した条件下で化学物質
を化学種と分析物とに接触させる。次に化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の反
復的放出を誘導する。電磁放射線の放出量を検出するこ
とによって対象分析物の存在を測定(判定)する。 【0065】本発明は更に、本発明のルテニウム含有又
はオスミウム含有化学種と異なる波長の電磁放射線を放
出すべく誘導され得る1種類以上の別の化学種とを含む
組成物に係る。これら組成物は同じ物質と別の物質との
混合物に含有される異なる2種以上の対象物質又は分析
物を検出する方法及びシステムにおいて有効である。別
の1種以上の化学種は、電磁放射線を放出すべく誘導さ
れ得る無機、有機及び有機金属化合物の如き任意の適当
な化学種、例えばルブレン又は9,10−ジフェニルア
ントラセンである。これらの化学種は、ルテニウム含有
又はオスミウム含有化学種から電磁放射線を誘導するた
めに使用されるエネルギとは異なる値を持つか又は異な
るエネルギ源からでるエネルギに曝露されるときに電磁
放射線を放出すべく誘導されるような化学種である。本
発明の特定具体例において、別の化学種の各々は、ルテ
ニウム含有又はオスミウム含有化学種の電磁放射線の放
出を誘導するエネルギと同じ値及び同じエネルギ源のエ
ネルギによって電磁放射線の放出を誘導されると別の異
なる波長の電磁放射線を放出する。 【0066】これら化学種の測定方法では、適当な条件
下で化学種を含有する反応(試薬)混合物を形成させ、
次に反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種の電磁放射線放出を誘導する。化学種の
各々によって放出される別々の波長の電磁放射線を検出
することによって各化学種の存在が決定される。本発明
は更に、同一混合物中に存在する異なる化学種に選択的
に結合する1種類以上の対象分析物の存在を測定する方
法に係る。方法は、反応(試薬)混合物を形成させる適
当な条件下で分析物と化学種とを接触させる。反応混合
物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに曝露すること
によって化学種を電磁放射線を放出すべく誘導し、放出
された異なる波長の電磁放射線を検出して対象分析物の
各々の存在を決定する。 【0067】混合物中の2種以上の化学種の存在を測定
するこれらの方法は、ルテニウム含有及びオスミウム含
有の発光ラベルを測定するための前記の全てのケースに
適用できる。しかし乍ら、かかる具体例では同一サンプ
ル中に同時に存在する2種以上の異なる物質を測定し得
る。本発明の別の具体例によれば、別々の化学種は、別
々の値又は別々のエネルギ源のエネルギに曝露されて電
磁放射線を放出すべく誘導される。これらの別々の化学
種の測定方法は誘導ステップ以外は、異なる波長の電磁
放射線を放出する化学種の測定方法と本質的に同じであ
る。これら化学種は、異なる値又はエネルギ源のエネル
ギによって電磁放射線を放出すべく誘導される。化学種
含有サンプルが異なる時間に別々の値又はエネルギ源の
エネルギの各々に曝露され、特定の化学種によって放出
された電磁放射線が検出され、これにより化学種の存在
が決定される。方法はまた、サンプル中に存在する別々
の化学種に選択的に結合する対象分析物の存在を決定す
るためにも有効である。 【0068】本発明の別の具体例では、同一サンプル中
に存在する1種類以上の式(A)k(B)uをもつ電気
化学発光性の化学種を測定する方法及びシステムを含
む。これら化学種は、電気化学エネルギ源に曝露される
と異なる波長の電磁放射線を放出する化合物又は各々が
別々の電気化学エネルギ源に曝露されて電磁放射線を放
出すべく誘導され得る複数の異なる化合物を含有する。
これら複数の異なる電気化学発光性の化学種は別々の対
象物質又は分析物に特異的に結合し得る。異なる化学種
の測定は前記と同じ手順で行なわれる。本発明を実施例
に基づいて以下に説明する。これらの実施例は本発明を
理解し易くするための非限定例であり、本発明の範囲は
請求の範囲のみによって限定される。 【0069】 【実施例】実施例I ルテニウムビス(2,2’−ビピリジン)(2,2’−
ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸)ビス(ヘキサフ
ルオロホスフェート)の調製 重炭酸ナトリウム(0.40g)、ルテニウムジクロロ
ビス(2,2’−ビピリジン)(0.40g)及び2,
2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸(0.30
g)を、環流メタノール(20ml)−水(5ml)中
で9時間撹拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、5
滴の濃H2 SO4 で処理し、1.5時間氷温に維持し
た。形成した沈殿を濾別しMeOH(8ml)で洗浄し
た。炉液と洗浄液を合わせたものを水(25ml)中の
ナトリウムヘキサフルオロホスフェート(5.0g)の
溶液で処理した。得られた溶液を氷浴で3時間冷却し、
赤紫色結晶の得られた沈殿を濾過により回収した(0.
40g)。 【0070】実施例II ルテニウムビス(2,2’−ビピリジン)(2,2’−
ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸)の活性エステル
の調製 ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、0.046
g)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.034
g)をDMF(2ml)中に撹拌して溶解し、氷溶中で
冷却した。ルテニウムビス(2,2’−ビピリジン)
(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸)
(0.101g、実施例Iのように調製した)をDMF
(1ml)中に溶解した溶液を加え、混合物を氷浴温度
で5時間撹拌した。形成した沈殿を遠心分離した。活性
化ルテニウム複合体を含む上清を、基質を標識するため
に保存した。 【0071】実施例III 子牛血清アルブミン(BSA)の活性化ルテニウム複合
体による標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液(1ml)を、撹拌下の水性生理緩衝塩溶液(PB
S、5ml)中のBSA溶液(25mg/mlBSA)
に加えた。混合物を1夜撹拌し、沈殿を遠心分離で除去
した。ルテニウム標識BSAを含む上清を2つの方法で
分析した。 【0072】方法1:透析 ルテニウム標識BSA溶液をPBS溶液で透析した。コ
ントロールとして実施例IIで調製した非結合の活性化ル
テニウム複合体もPBS溶液で透析した。8時間後、コ
ントロールでは透析チューブ中には蛍光を有するものは
見られなかった。それに対し、ルテニウム標識BSA溶
液は強い蛍光を示し、ルテニウム複合体が高分子量BS
Aに結合したことを示した。 【0073】方法2:マイクロフィルトレーション ルテニウム標識BSA溶液をアミコンマイクロコンセン
トレーター中に入れ、8000rpmで遠心した。赤橙
色溶液の小画分がフィルター上に残り、この着色画分を
洗浄PBS溶液で希釈し遠心した。この手順は数回繰り
返した。4回の洗浄後、フィルターを通しては無色の溶
液が得られ、フィルター上には強く赤橙色に着色した物
質が残った。この結果は、ルテニウム複合体が高分子量
BSAに結合したことを示している。 【0074】実施例IV ヒトイムノグロブリンG(IgG)の活性化ルテニウム
複合体による標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液を撹拌下に水性バッファー中のアフィニティー精製ヒ
トIgG溶液に加えた。ルテニウム標識化IgG溶液
は、充分に透析した後に強い蛍光を示し、ルテニウム複
合体が高分子量のアフィニティー精製ヒトIgGに結合
したことが示された。 【0075】実施例V ウサギ抗サルモネラ抗体の標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液(0.1ml)を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清
(1ml)と共に室温で1時間撹拌し、その後ジエタノ
ールアミン(0.1ml)を加えて停止した。ルテニウ
ム標識抗サルモネラ抗体を含む得られた溶液でサルモネ
ラ細胞を処理した。細胞の遠心分離及び新鮮バッファー
への再懸濁を5回繰り返し、全ての非結合抗体(ルテニ
ウム標識非結合抗体を含む)及び全ての遊離ルテニウム
複合体から細胞を分離した。ルテニウム標識抗サルモネ
ラ抗体で処理したサルモネラ細胞は、蛍光光学顕微鏡で
観察すると明るい赤橙色光を発しており、抗サルモネラ
抗体がルテニウム複合体で標識され、ルテニウム標識抗
体はルテニウム複合体が蛍光を発する条件下でサルモネ
ラ細胞に結合する能力を保有することが示された。 【0076】実施例VI 正常マウス血清(即ち、抗サルモネラ抗体を持たない)
を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清の代りに使用して
実施例Vの手順を繰り返した。処理後、サルモネラ細胞
は蛍光光学顕微鏡で観察しても赤橙色を発しておらず、
ルテニウム標識正常マウス血清成分のサルモネラ細胞に
対する非特異的結合は起こらないことが示された。 【0077】実施例VII ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(IgG)の標識化及び
ローダミンとの比較 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液を撹拌下にアフィニティー精製ヤギ抗ウサギIgG溶
液に加えた。反応後、混合物をバッファーに対して透析
した。透析チューブ内に残った物質はUVライト下で蛍
光を発した。ルテニウム標識IgGのウサギ抗サルモネ
ラ抗体被覆サルモネラに対する反応性をテストした。ガ
ラス顕微鏡スライドに固定したサルモネラ・ワーシント
ン(Salmonella worthington)
とウサギ抗サルモネラ抗体を反応させ、非反応抗体をバ
ッファーで洗い流した。次にルテニウム標識ヤギ抗ウサ
ギIgGを抗体処理サルモネラ・ワーシントンと反応さ
せ、非反応物質をバッファーで洗い流した。このスライ
ドを50W水銀ランプを備えた光学顕微鏡で観察する
と、非常に明るい橙赤色螢光がバクテリア上及び周囲に
見られた。ルテニウム標識抗体の非特異的結合について
コントロールの実験を行なった。ガラス顕微鏡スライド
に固定したサルモネラ・ワーシントンを正常マウス血清
と反応させ、その後ルテニウム標識ヤギ抗ウサギIgG
抗血清と反応させた。その後同じ洗浄工程を行なった。
橙赤色蛍光は観察されなかった。比較の目的で、ローダ
ミンイソチオシアナート結合ヤギ抗ウサギIgG抗血清
を(ルテニウム結合抗体と等価のタンパク質濃度で)、
ウサギ抗サルモネラ抗体で被膜したサルモネラ・ワーシ
ントンと反応させた。赤色の蛍光がわずかに検出された
が、蛍光の強度はルテニウム結合体に比較して有意に小
さいものであった。 【0078】実施例VIII ルテニウム標識・子ウシ血清アルブミン(BSA)の電
気化学発光(ECL)検知 光学的に平坦な底部を有する1区角タイプのセル(30
ml)中でECL測定を行なった。測定電極はガラス状
炭素で、対する電極はプラチナネットとし、疑似対照電
極は銀ワイヤで行なった。光強度の測定は、−2.0V
(Agワイヤに対して)の電位をかけ、光増強管(Ha
mamatsu 928)で発光を検知し、2つに対し
て得られる信号をBascom−Turner Rec
orderで統合した。アセトニトリル−水(9ml、
50:50v/v)、テトラブチルアンモニウムテトラ
フルオロボレート(329mg)及びジアンモニウムパ
ーオキシジスルフェート(42mg)をECLセル中で
混合し、バックグラウンド光強度を記録した。ルテニウ
ム標BSA溶液(実施例 IIIで調製したもの)を、アセ
トニトリル−水(50:50v/v)中に希釈し、該希
釈BSA溶液(1ml)をECLセル中に加えた。得ら
れた溶液は溶媒飽和窒素気泡で脱気した。表Iはルテニ
ウム標識BSAの異なる濃度に対して得られた結果を示
している。 【表1】表 I 光強度 (ルテニウム) (任意単位) M 5.2 ブランク 20.63 1×10-11 33.25 1×10-10 54.42 9×10-10 150.2 8×10- 9 【0079】実施例IX 4,4’−ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン
−ビス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)2+の
調製 Sprintschink等(J.Amer.Che
m.Soc.99,4947(1977))の方法によ
り、2,2−ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸から
4,4’−ジエトキシカルボニル−2,2’−ビピリジ
ンを調製した。該ジエチルエステル(100mg)を無
水ジエチルエーテル(35ml)中に溶解した。リチウ
ムアルミニウムヒドリド(100mg)を加え、30分
インキュベートした後ジエチルエーテル(35ml)及
び氷冷脱イオン水(100ml)を加えた。溶液をよく
混合し、エーテル層を回収した。水成層はエーテル(7
0ml)で2回以上抽出した。エーテル抽出物を合わ
せ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し濾過した。ロータリー
エバポレーターで溶媒を除去し、所望生成物(43m
g)を得た。この43mgの4,4−ジ(ヒドロキシメ
チル)−2,2’−ビピリジン及び120mgのcis
−ジクロロビス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム
(II)ジヒドレートをエタノール(25ml)に加え、
溶液を14時間環流させた。溶液を冷却した後、アンモ
ニウムヘキサフルオロホスフェートの溶液(水1ml中
1mg)の50μlを加え、得られた結晶状固体を回収
し、少量のエタノールで洗浄して乾燥し、138mgの
4,4−ジヒドロキシメチル複合体のヘキサフルオロホ
スフェート塩を得た。この複合体(6mg)を塩化チオ
ニル(5ml)に加え、溶液を6時間環流させた。蒸留
により塩化チオニルを除去し、固体残渣をジオキサン−
水(1:1)混合物(500μl)に溶解した。4,
4’−ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン−ビ
ス−(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)2+を含
むこの溶液を抗体の標識に使用した。 【0080】実施例X 4,4’−ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン
−ビス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)2+に
よるウサギ及びヒツジ抗マウスIgGの標識化 ウサギ及びヒツジ抗体をPBS中の2mg/mlの溶液
とした。これ等の溶液を重炭酸ナトリウム(500m
l、50mM、pH9)に対して一晩透析した。その後
抗体(2mg)を重炭酸ナトリウム溶液で希釈し2ml
の最終容量とした。この溶液(1ml)を炭酸ナトリウ
ム溶液(1ml、50mM)に加えpHを10に調整し
た。ジオキサン−水中の活性化複合体溶液(100μ
l)を抗体溶液に加え4℃で16時間反応させた。この
後、反応物にBSA(5mg)を加え、溶液を直ちに炭
酸バッファー(500ml、25mM、pH9)に対し
て透析した。透析バッファーは24時間間隔で3回交換
した。 【0081】実施例XI 蛍光光度測定分析による標識ウサギ及びヒツジ抗マウス
イムノグロブリンの免疫学的反応性のデモンストレーシ
ョン レジオネラ・ニューモフィラ1(Legionella
pneumophila 1,Philadelph
ia 1単離体)のホルマリン化懸濁液をPBSバッフ
ァーで希釈して光学密度1.00(425nm)に調整
した。この懸濁液の1.3希釈物(1ml)を一連の円
垂形マイクロ遠心分離管に入れた。細胞を遠心分離(1
0分、10000RPM)、上清を傾瀉して細胞をマウ
スモノクローナルIgG抗体を含むPBS(“10C
8”0.85mg/ml)(1ml)あるいは陰性対照
としてのPBS中に1:100希釈物として再懸濁し
た。室温で1時間インキュベートした後、細胞を先と同
じように遠心分離し、上清を傾瀉して細胞をPBSバッ
ファー中に再懸濁し、再度遠心分離した。上清を傾瀉し
た後、細胞を貯蔵ルテニウム標識ウサギ及びヒツジ抗マ
ウスIgG抗体の1:5希釈物(PBS中)(1ml、
10mgルテニウム複合体/ml)、あるいは陽性対照
としてフルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgG抗体の
1:50希釈物(PBS中)(1ml、0.5mgIg
G/ml)、あるいは陰性対照としてPBS中に再懸濁
した。室温で1時間インキュベートした後、前と同じよ
うに細胞を遠心分離して上清を傾瀉し、細胞をPBS中
に再懸濁して前のように遠心分離で2回洗浄した。最後
の洗浄の後細胞をPBS(1ml)中に再懸濁し、ポリ
スチレンキュベット中に移して蛍光光度測定分析に供し
た。 【0082】フルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgG抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、491nmに
励起ピーク、519nmに放射ピークが観察された。こ
れ等の波長をフルオレセイン標識細胞の蛍光測定に使用
した。ルテニウム標識ウサギ/ヒツジ抗マウスIgG抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、455nmに
励起ピーク、623nmに放射ピークが認められた。こ
れ等の波長をルテニウム標識細胞の蛍光測定に使用し
た。“10C8”第1抗体及び蛍光性結合体の代りにP
BSとインキュベートした細胞懸濁液を陰性コントロー
ルとし、蛍光光度計のブランクに使用した。“10C
8”第1抗体と蛍光性結合体の両方と共にインキュベー
トした細胞懸濁液の蛍光を100とし、その他の全ての
蛍光測定はこれ等の内部標準に対する相対的な蛍光単位
で行なった。表IIに示した結果は、ルテニウム標識抗マ
ウスIgG結合体は蛍光を発し、“10C8”第1抗体
の存在下で特異的な免疫学的反応性を示すことを表わし
ている。 【表2】表 II 相対蛍光単位 フルオレセイン ルテニウム (519nm) (623nm) 1:3細胞希釈 1:3細胞希釈 第1抗体を有する ≡ 100 ≡ 100 結合体の蛍光 第1抗体を有しない 37 64 結合体の蛍光 バックグラウンドの蛍光 (第1抗体を有するが 6 48 結合体は有さない)
1日出願の米国シリアルNo.666,987の部分的
継続出願であり、前記No.666,987は本出願に
参考として包含される。化学的、生化学的及び生物学的
物質を短時間で極めて特異的に検出し且つ計量せしめる
方法の必要性は益々高くなってきている。特に重要なの
は少量の薬物、代謝物質、微生物及び他の診断上重要な
物質を測定する方法である。この種の物質としては、例
えば麻酔薬及び毒薬、治療用として投与された薬剤、ホ
ルモン、病原となる微生物及びウイルス、抗体、代謝物
質、酵素並びに核酸が挙げられる。 【0002】 【従来の技術】これらの物質の存在はしばしば、多くの
生化学的系及び生物学的系の特徴をなす高度の特異性を
利用する結合法によって測定できる。頻繁に使用される
方法は例えば抗原−抗体システム、核酸ハイブリダイゼ
ーション技術、及びタンパク質−リガンドシステムに基
づくものである。これらの方法では診断上重要な複合体
の存在が通常、複合体構成物質の1つ又は複数に結合さ
れた観察可能ラベル(標識)の存在又は不在によって示
される。選択された特定ラベリング(標識)法はしばし
ば問題の物質の特定検出システムの有効性及び多目的性
を支配する。好ましい標識は安価、安全であり、且つ広
範囲にわたる化学的、生化学的及び生物学的物質にこれ
ら物質の重要な結合特性を変化させることなく効果的に
結合され得るという条件を満たさなければならない。こ
の好ましいラベルは極めて特徴的なシグナルを与えるも
のでなければならず、且つ自然界に余り見られない、又
は好ましくは全く存在しないものであることが望まれ
る。このラベルはまた、安定性を有し且つ数箇月にわた
って水性システム内で検出できるようなものでなければ
ならない。ラベルの検出は高価な専用設備又は人員を必
要とせず短時間で、高感度及び再現性をもって実施され
ることが望まれる。ラベルの計量は温度及びアッセイさ
れる混合物の組成のごとき変数に余り左右されないこと
が重要である。最も有利なものは、均質系即ち複合体状
のラベルされた物質及び非複合体状のラベルされた物質
を分離する必要のない系で使用できるラベルである。こ
れはラベルされた物質が特定複合体内に合体された時に
ラベルの検出性が変化しても可能である。 【0003】これまでにも様々なラベルが開発されてき
たが、これらのラベルはいずれも特定の利点及び欠点を
有する。例えば、放射性ラベルは使用範囲がかなり広
く、且つ極めて低い濃度で検出できる。しかしながらこ
の種のラベルは高価で危険性もあり、その使用には精巧
な設備と熟練した人員とが必要とされる。更に放射性ラ
ベルの感度は、検出し得る事象がその本質的性質上ラベ
ルされた物質の放射性原子1つ当たり1度の割合でしか
生起し得ないため限定される。加えて、放射性ラベルは
均質法では使用し得ない。 【0004】そこで非放射性ラベルが注目される。この
種のラベルは分光測光法、スピン共鳴法及びルミネセン
ス法により観察し得る分子、並びにこれらの分子を産生
する酵素を含む。有用な非放射性ラベリング物質の1つ
に有機金属化合物がある。生物系ではある種の金属は希
であるため、有機金属化合物の金属成分を特異的にアッ
セイする方法が有効に使用される。例えば、Caisの
米国特許第4,205,952号には、特定抗原の定量
に使用するための特定有機金属化合物でラベルされた免
疫化学的活性物質の使用が開示されている。これらのラ
ベルには、発光スペクトル、吸光スペクトル及び蛍光ス
ペクトルの測定、原子吸光並びに中性子活性化を含め
て、通常の選択金属検出法のいずれも使用できる。これ
ら通常の方法はしばしば感度に欠け、均質系にはほとん
ど使用し得ず、且つ原子吸光の場合のごとく、時として
試料の破壊を生起する。 【0005】特に有利なラベルは、光化学的手段、化学
的手段及び電気化学的手段によって発光させ得るラベル
である。“ホトルミネセンス”は物質が電磁放射線(電
磁波)を吸収した時に発光するように誘導されるプロセ
スである。蛍光及びリン光はホトルミネセンスの一種で
ある。化学ルミネセンスはエネルギーの化学的移行によ
って発光種を発生させるプロセスである。電気化学ルミ
ネセンスは電気化学的に発光種を発生させる。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】これら発光システムの
重要性は益々高まってきている。例えばMandleの
米国特許第4,372,745号には免疫化学的用途に
おける化学発光性ラベルの使用が開示されている。この
システムではラベルが化学的手段、例えばラベルとH2
O2 及びシュウ酸(オキサレート)との反応によって発
光状態に励起される。これらのシステムではH2 O2 が
シュウ酸を高エネルギー誘導体に酸化的に変換し、この
誘導体がラベルを励起する。このシステムは原則とし
て、このアッセイの酸化性条件下で安定性を示し且つ高
エネルギーシュウ酸誘導体により励起され得る発光物質
のいずれに対しても有効である。ところが残念なこと
に、この広範囲な利用性自体がこの方法を大きく限定す
る。即ち、問題のアナライト(対象分析物、analy
te)を含む通常の生物学的流体は潜在的発光物質も多
く含み、これらの物質が大きなバックグラウンドレベル
のルミネセンス(発光)を誘起し得るのである。 【0007】同様の欠点を有する化学ルミネセンスの免
疫化学的使用の別の例がOberhardt他の米国特
許第4,280,815号に開示されている。この場合
は化学発光種でラベルされた免疫反応物の極めて近くに
その場で酸化体(例えばH2O2 )を電気化学的に形成
せしめる。電気的に発生した酸化体は化学発光種内に向
かって拡散してこれを化学的に酸化し、その結果1つ以
上の電子がこの電気的発生酸化体に移行する。前記化学
発光種は酸化されると光子を放出する。これに対しこの
発明では、電子を電気化学的エネルギー源から光子を繰
り返し放出し得る化学発光種に直接移行しなければなら
ない。 【0008】本発明は電気化学ルミネセンスラベルに係
わる。適切なラベルは有機化合物及び有機金属化合物を
含む電気化学発光性化合物からなる。ラベルされた物質
の存在を決定する電気化学ルミネセンス法は多くの理由
から他の方法より好ましい。即ちこの種の方法は特定ラ
ベルの存在を極めて良く診断し得、感度が高く安全、安
価であると共に使用範囲が広い。電気化学的ラベルに適
した有機化合物としては例えばルブレン及び9,10−
ジフェニルアントラセンが挙げられる。多くの有機金属
化合物が適切な電気化学的ラベルを構成するが、特に有
用なものはRu−含有化合物及びOs−含有化合物であ
る。本発明は種々の方法によって検出し得るRu−含有
及びOs−含有ラベルの使用に係わる。これらのラベル
は後述の種々の理由から有利である。 【0009】Ru−含有有機金属化合物及びOs−含有
有機金属化合物についてはこれまでにも文献で議論され
てきた。Caisの開示によれば、第VIII属の貴金属、
例えばRuを含む任意の金属元素又は複数の金属元素の
組み合わせは原子吸光法によって検出し得る有機金属ラ
ベルの適切な成分となる(Cais、11欄、20行
目)。しかしながらルテニウムはCaisにおいては好
ましい金属ではなく、オスミウムについては特に記述が
なく、開示されているいずれの方法でもRu及びOsの
使用の効果についてのデータが全く示されていない。ま
た、好ましいとされている検出法、即ち原子吸光法は試
料を破壊する。 【0010】Weberの米国特許第4,293,31
0号はイムノアッセイにおけるアナライト用の電気化学
的ラベルとしてのRu−含有複合体及びOs−含有複合
体の使用を開示している。開示されている複合体はチオ
尿素結合を介してアナライトのアミノ基に結合される。
Weberはまた、ラベルと別のアナライトのヒドロキ
シ基との間でのカルボン酸エステル形成の可能性につい
て示唆している。Weberによれば、ラベルされた物
質の存在は消光剤と光手段付き電気化学的フローセル
(電池)とからなる装置及び方法によって決定し得る。
光電気化学的活性ラベルは光励起すると電子を消光剤分
子に移行させる。酸化された分子は次いで、適切な電位
(ポテンシャル)に保持されたフローセルの電極からの
電子によって還元される。この電子は光電流として決定
される。このシステムのラベルされた遊離アナライトの
量は光電流信号によって測定される。この方法は発光物
質の電気化学発光検出法の逆の方法であることに留意さ
れたい。 【0011】Weber他によるその後の報告(198
3年)Clinical Chemistry 29,
pp.1665−1672、Photoelectro
analytical Chemistry:Poss
ible Interferences in Ser
um and Selective Detectio
n of Tris(2,2’−bipyridin
e)ruthenium(II)in the Pres
ence of Interferentsでは、Ru
−含有ラベルの検出にこの方法を使用することに伴う問
題が議論された。Weber等の表2によれば、トリス
(ビピリジル)ルテニウム(II)の補外検出限度は最適
条件下で1.1×10-10 モル/Lである。これらのラ
ベルの実際的使用により複合体混合物の存在が測定され
ることを期待して、Neber等は彼等のシステムにお
ける潜在的干渉物質(interferent)をテス
トした。Weber等の表3には、ジメチルアルキルア
ミン、EDTA、N−メチルモルホリン、N,N’−ジ
メチルピペラジン、水酸化物、シュウ酸(塩)、アスコ
ルビン酸(塩)、尿酸、及び血清が、実際の検出限度を
1.1×10-10 モル/Lよりかなり上昇させ得る干渉
物質として列挙されている。 【0012】これらの研究は簡単なRu−含有化合物を
用いて行なわれた。Ru−含有ラベルでラベルした複雑
な物質の検出限度について、又はラベルされた物質とラ
ベルとの間のチオ尿素結合がこのアッセイの条件下で安
定しているか否かについては、Weber又はWebe
r等による研究では全く報告されていない。 【0013】本発明が係わる特定のラベルは電気化学発
光ラベルである。これらのラベルはしばしば、化合物を
電磁放射線又は化学的エネルギー源、例えば典型的シュ
ウ酸−H2 O2 システムによって形成されるものに曝す
ことによって、酸化又は還元されることなく、発光状態
に励起され得る。加えて、これら化合物のルミネセンス
はこれら化合物の酸化又は還元を伴う電気化学的方法に
よって誘起され得る。 【0014】光ルミネセンス、化学ルミネセンス及び電
気化学ルミネセンス手段を用いるRu(2,2’−ビピ
リジン)3 2+検出法に関する研究も報告されている:R
ubinstein及びBardの“Electrog
enerated Chemiluminescenc
e.37.Aqueous Ecl Systemsb
ased on Ru(2,2’−bipyridin
e)3 2+ and Oxalate or Organ
ic Acids”、J.Am.Chem.Soc.、
103、pp.512−516(1981年)、並びに
White及びBardの“Electrogener
ated Chemiluminescence.4
1.Electrogenerated Chemil
uminescence and Chemilumi
nescence of theRu(2,2’−bp
y)3 2+−S2 O8 2 - System in Acet
onitrile−Water Solution
s”、J.Am.Chem.Soc.、104、p.6
891(1982年)。この研究は明るいオレンジ色の
化学ルミネセンスが化学的又は電気的に発生したRu
(bpy)3 3+(式中、“bpy”はビピリジルリガン
ドを表す)と、シュウ酸イオン又は他の有機酸の酸化の
中間生成物として形成される強い還元剤との水性反応に
基づき得ることを示している。ルミネセンスは電気的又
は化学的に発生したRu(bpy)3 1+とペルオキシジ
スルフェートの還元の間に発生する強い酸化剤との反応
によって有機溶媒−H2 O溶液中でも得られる。Ru
(bpy)3 2+からの電気化学ルミネセンス発生の第3
のメカニズムはRu(bpy)3 1+を発生させるに十分
な負の電位とRu(bpy)3 3+を発生させるに十分な
正の電位との間の電極電位振動を利用する。これら3つ
の方法は夫々“酸化的還元”、“還元的酸化”、及び
“Ru(bpy)3 3+/+再生システム”と称する。 【0015】酸化的還元法は水中で実施し得、酸素又は
不純物の存在に比較的感応し難い強くて効果的で安定し
たルミネセンスを生起する。Ru(bpy)3 2+からの
このルミネセンスはシュウ酸又は他の有機酸、例えばピ
ルビン酸(ピルベート)、乳酸(ラクテート)、マロン
酸(マロネート)、酒石酸(タートレート)、クエン酸
(シトレート)の存在とRu(bpy)3 3+種を酸化的
に産生する手段とに依存する。この酸化はPbO2 又は
Ce(IV)塩のような強い酸化剤によって化学的に実施
し得、また連続的又は断続的に加えられる十分に正の電
位により電気化学的に実施し得る。Ru(bpy)3 2+
の電気化学的酸化に適した電極は例えばPt、熱分解グ
ラファイト、及びガラス質炭素である。シュウ酸又は他
の有機酸は化学ルミネセンスの間に消耗されるが、消耗
物質の過剰の存在又は反応室内への消耗物質の連続的供
給により、何時間にもわたる強くて一定した化学ルミネ
センスが生起し得る。 【0016】還元的酸化法は例えばアセトニトリルのご
とき有機共存溶媒を含む部分的水性溶液中で実施し得
る。このルミネセンスはペルオキシジスルフェートの存
在とRu(bpy)3 1+種を還元的に産生する手段とに
依存する。この還元は例えばマグネシウム又は他の金属
のごとき強い還元剤によって化学的に実施し得、また連
続的又は断続的に加えられる十分な負の電位により電気
化学的に実施し得る。Ru(bpy)3 2+の電気化学的
還元に適した電極としては例えば磨いたガラス質炭素電
極が挙げられる。酸化的還元法の場合と同様に、過剰試
薬の存在又は反応混合物への消耗試薬の連続的添加によ
り強い連続的発光が何時間にもわたって得られる。 【0017】Ru(bpy)3 3+/+再生システムはアセ
トニトリルのごとき有機溶媒又は部分的水性システム中
で、Ru(bpy)3 2+を還元するに十分な負の電位と
Ru(bpy)3 2+を酸化するに十分な正の電位との間
で電極電位をパルスにすることで実施し得る。このよう
な再生システムに適した電極としては例えばPt電極が
ある。このシステムは化学的試薬を消耗せず、原則とし
て永久に作動し得る。 【0018】これら3種のRu−含有発光化合物産生法
はいずれもRu−含有化合物の酸化−還元又は還元−酸
化を繰り返し行なう。従ってこれらの化合物を含む溶液
のルミネセンスは、加えられるエネルギー源の電位に大
きく依存し、そのためRu−含有化合物の存在を極めて
良く検出(診断)する。 【0019】MandleはCurtis他の“Che
miluminescence;ANew Metho
d for Detecting Fluoresce
ntCompounds Separated By
Thin Layer Chromatograph
y”,J.Chromatography 134,p
p.343−350(1977年)をRu−トリス(ビ
ピリジル)(II)を化学ルミネセンス用途において使用
し得るラベルとして確認するものとして引用している。
Curtis他はRu複合体がシュウ酸/H2 O2 シス
テムにより化学的に励起されると光を発するようになり
得るという非公開意見を報告しているに過ぎない(Cu
rtis他p.350)。MandleもCurtis
も化学ルミネセンス用途におけるルテニウム及びオスミ
ウム複合体の例外的有用性、又は電気化学ルミネセンス
システムの有用性は認めなかった。Sprintsch
nik,G.他の“Preparation and
PhotochemicalReactivity o
f Surfactant Ruthenium(II)
Complexes in Monolayer As
sembliesand at Water−Spli
d Interfaces”,J.Am.Chem.S
oc.99,pp,4947−4954(1977年)
にはオクタデカノール又はデヒドロコレステロールでエ
ステル化したトリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウ
ム(II)が記載されており、これら界面活性複合体の単
層フィルムの形成法が開示されている。これら複合体は
ホトルミネセンス性であった。しかしながら、このフィ
ルムを水に曝し次いで光に曝すとRu−複合体はホトル
ミネセンスを発生しなかった。その原因は光の存在下に
おけるエステル基の光加水分解にあった。 【0020】本出願人は広範囲のアナライトと当該アナ
ライトに結合する化学種(moieties)とがRu
−含有又はOs−含有ラベルにアミド結合又はアミン結
合を介して適切に結合されることを発見した。本明細書
はこれを開示する。これらのラベルされた物質は広範囲
にわたる任意の手段によって検出(決定)し得るが、現
在のところ最も有効で信頼できる高感度手段はホトルミ
ネセンス、化学ルミネセンス及び電気化学ルミネセンス
手段である。本明細書では、Ru−含有及びOs−含有
ラベルとルブレン及び9,10−ジフェニルアントラセ
ンのごとき有機分子とを含む電気化学ルミネセンスラベ
ルが特に多目的に使用し得、有利であることも開示す
る。以下にこれら新規のラベルされた物質の使用と、こ
れら物質の検出法との大きな利点を説明する。 【0021】 【課題を解決するための手段】本発明によれば、式 【化2】〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p
(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Mはルテニウム又はオスミウム;PはMの多座
配位(polydentate)リガンド;L1、L
2、L3、L4、L5及びL6はMのリガンドであり、
各々が別のリガンドと互いに同じでもよく異なるもので
もよい;Bは1つ以上のアミド又はアミン結合によって
P、L1、L2、L3、L4、L5、又はL6の1つ以
上に共有結合した物質;mは1以上の整数;n、o、
p、q、r及びsの各々は0又は整数;tは1以上の整
数;uは1以上の整数;P、L1、L2、L3、L4、
L5、L6及びBは化学種(chemical moi
ety)が電磁放射線(電磁波)を放出すべく誘導され
るような組成と数とを有しており、Mのリガンドによっ
てMに与えられる結合の総数がMの配位数に等しい〕で
示される化学種が提供される。本発明は特に、発光ルテ
ニウム−又はオスミウム−含有ラベルを化学物質、生化
学物質及び生物物質のアミノ基に結合するための中間体
(介在物)として適当な化合物を提供する。従ってこれ
ら中間体は本発明の化学種の生成に特に適している。中
間体は、ルテニウム−又はオスミウム−ビス(2,2’
−ビピリジン)(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジ
カルボン酸)のモノ−及びジ−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル及びその塩、並びにルテニウム−又はオ
スミウム−ビス(2,2’−ビピリジン)(4,4’−
ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン)である。
これら化合物は当業者に公知の手段で合成され得る。 【0022】本発明は、新規な化学種の存在の判定方法
を提供する。本発明はまた、式 【化3】〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p
(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Mはルテニウム又はオスミウム;PはMの多座
配位リガンド;L1、L2、L3、L4、L5及びL6
はMのリガンドであり、各々が別のリガンドと互いに同
じでもよく異なるものでもよい;BはMのリンガド物質
であるか又はP、L1、L2、L3、L4、L5、又は
L6の1つ以上に結合した物質;mは1以上の整数;
n、o、p、q、r及びsの各々は0又は整数;tは1
以上の整数;uは1以上の整数;P、L1、L2、L
3、L4、L5、L6及びBは化学種が電磁放射線を放
出すべく誘導されるような組成と数とを有しており、M
のリガンドによってMに与えられる結合の総数がMの配
位数に等しい〕で示される化学種の存在の判定方法を提
供する。 【0023】本発明方法は、 a)適当な条件下で化学種を含有する反応混合物(re
agent mixture)を形成させ、 b)反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種からの電磁放射線の放出を誘導し、 c)放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定するステップを含む。 【0024】本発明は更に、対象物質の存在を判定する
結合方法においてルテニウム含有又はオスミウム含有ラ
ベルの使用を提案する。これらの方法は、ラベルされた
対象化学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用
して対象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析
物の類似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を
判定するため、等に使用され得る。これら結合方法は均
一又は不均一結合方法のいずれでもよい。 【0025】更に本発明は、本発明のルテニウム含有又
はオスミウム含有化学種の存在を判定するためのシステ
ムを提供する。本発明のシステムは化学種からの電磁放
射線の放出を誘導する手段と放出された電磁放射線を検
出する手段とを含む。本発明は更に、対象分析物判定用
の結合方法にルテニウム含有又はオスミウム含有化学種
を使用するためのシステムを提供する。本発明によれ
ば、式 【化4】(A)k(B)u 〔式中、Aは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電磁
放射線を反復的に放出すべく誘導され得る化合物;Bは
Aに結合した物質;kは1以上の整数;uは1以上の整
数〕で示される化学種の存在を判定するために、 a)適当な条件下で化学種を含有する反応混合物を形成
し、 b)化学種を電気化学エネルギに直接曝露して化学種か
らの電磁放射線の反復的放出を誘導し、 c)放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定するステップを含む方法を提供する。 【0026】本発明は更に、対象物質の存在を判定する
ための結合方法における電気化学ルミネセンス性ラベル
の使用を提案する。これらの方法はラベルされた対象化
学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用して対
象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析物の類
似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を判定す
るため、等に使用され得る。これら結合方法は均一又は
不均一結合方法のいずれでもよい。 【0027】 【発明の実施の形態】本発明の特定具体例では、異なる
2種以上の化学種を含有する組成物が提供される。化学
種の各々は異なる波長の電磁放射線を放出すべく誘導さ
れ得る化学物質種(chemical specie
s)でもよい。本発明の別の具体例では、化学種は、各
々が異なる値のエネルギ又は異なるエネルギ源からのエ
ネルギに曝露されて電磁放射線を放出すべく誘導される
ような複数の化学物質種から成ってもよい。この場合、
別の対象物質又は分析物が異なる化学種の各々に特異的
に結合し得る。これらの組成物及び方法の使用によっ
て、被験サンプル中に存在する異なる2種以上の対象物
質又は分析物を判定することが可能である。 【0028】本発明によれば、式、 【化5】〔M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p
(L4)q(L5)r(L6)s〕t(B)u 〔式中、Mはルテニウム又はオスミウム;PはMの多座
配位リガンド;L1、L2、L3、L4、L5及びL6
はMのリガンドであり各々が別のリガンドと互いに同じ
でもよく異なるものでもよい;Bは1つ以上のアミド又
はアミン結合によってP、L1、L2、L3、L4、L
5、又はL6の1つ以上に共有結合した物質;mは1以
上の整数;n、o、p、q、r及びsの各々は0又は整
数;tは1以上の整数;uは1以上の整数;P、L1、
L2、L3、L4、L5、L6及びBは化学種が電磁放
射線を放出すべく誘導され得るような組成と数とを有し
ており、MのリガンドによってMに与えられる結合の総
数がMの配位数に等しい〕で示される化学種が提供され
る。 【0029】この化学種は、1種類以上のMの多座配位
リガンドを有していなければならない。この化学種が2
つ以上の多座配位リガンドを有するとき複数の多座配位
リガンドは互いに同じでもよく異なっていてもよい。多
座配位リガンドは芳香族及び脂肪族リガンドを含む。適
当な芳香族多座配位リガンドは芳香族複素環リガンドを
含む。好ましい芳香族複素環リガンドは窒素含有リガン
ド例えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル及び
フェナントロリルである。 【0030】適当な多座配位リガンドは未置換でもよ
く、又は当業者に公知の多数の置換基のいずれかによっ
て置換されていてもよい。適当な置換基の例は、アルキ
ル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキ
ル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシア
ルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロ
キシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ
ル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有
基、燐含有基及びN−ヒドロキシスクシンイミドのカル
ボン酸エステルである。 【0031】この化学種は1種類以上の単座配位(mo
nodentate)リガンドを有していてもよい。多
数の単座配位リガンドが当業者に公知である。適当な単
座配位リガンドは例えば、一酸化炭素、シアニド(シア
ン化物)、イソシアニド、ハロゲン化物、並びに、脂肪
族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチビン、
アルシンである。 【0032】本発明の化学種のとくに好ましい具体例
は、ビス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム(II)及
びトリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム(II)で
ある。 【0033】付加的化学ラベル例えば放射性同位体、蛍
光成分又は付加的発光ルテニウム−もしくはオスミウム
−含有中心に結合されるべき1種類以上のMのリガンド
は本発明の範囲内に包含される。更に、2つ以上又は多
数の電気化学ルミネセンス性中心によってラベルされる
べきラベル物質(B)も本発明の範囲内に包含される。 【0034】適当な物質(B)としては多くの生物物
質、例えば全細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク
質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、核
酸、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝物、ホルモン、薬理
物質、トランキライザー、バルビツール酸エステル、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び糖類
がある。全細胞は動物又は植物又は細菌のいずれでもよ
く、生細胞でも死細胞でもよい。例えば植物病原体例え
ば菌類又は線虫類がある。「細胞下粒子」なる用語は、
例えば、細胞下小器官、破壊細胞の膜粒子、細胞壁の断
片、リボソーム、多酵素複合体及びその他の生体由来の
粒子を包含する。核酸は例えば、様々な由来の染色体D
NA、プラスミドDNA、ウイルスDNA、及び組換体
DNAを含む。核酸はまた、RNA例えば、メッセンジ
ャーRNA、リボソームRNA、転移RNAを含む。ポ
リペプチドは例えば、酵素、輸送タンパク質、受容体タ
ンパク質、及び構造タンパク質例えばウイルスコートタ
ンパク質を含む。好ましいポリペプチドは酵素及び抗体
である。特に好ましいポリペプチドはモノクローナル抗
体である。ホルモンは例えばインシュリン及びT4甲状
腺ホルモンを含む。薬理物質(薬理剤)は例えば、強心
配糖体を含む。生物物質に化学的に類似した合成物質例
えば合成ポリペプチド、合成核酸、合成膜、小胞及びリ
ポソームも勿論本発明の範囲内に包含される。これらは
全て本発明での使用に適した生物物質の判り易い例とし
て示しただけであり、本発明の範囲はこれらの物質に限
定はされない。 【0035】ラベルされた重合物質の如き非生物物質も
本発明の範囲内に含まれる。これらの物質は可溶重合分
子の形態でもよく、又は、公知の種々の巨視形態のいず
れか例えばビーズ等でもよく、又は、試験管、壜もしく
はアッセイウェル等の如き容器でもよい。生物物質及び
非生物物質(B)はアミド又はアミン結合を介してMの
リガンドに共有結合する。アミド結合の場合、結合は、
物質(B)がアミド結合のカルボニル又は窒素に直接結
合するように配向される。これらの化学種はイオン化さ
れていてもよい。その場合、異なる多くの対イオンが化
学種調整物の電荷を中和し得ることは当業者に明らかで
あろう。適当なカチオンは例えば、H+ 、NH4 +、グ
アニジニウム、Ag+ 、Li+ 、Na+ 、K+ 、M
g2+、Mn2+、Cd2+である。適当なアニオンは例え
ば、ハロゲン化物、OH- 、炭酸塩、SO4 2-、ヘキサ
フルオロホスフェート及びテトラフルオロボレートであ
る。 【0036】本発明は更に、ルテニウム含有又はオスミ
ウム含有の発光ラベルを化学物質、生化学物質及び生物
物質のアミノ基に結合させる中間体(介在物)として特
に適した化合物を提供する。従ってこれら中間体は本発
明の化学種の合成に特に適している。本発明の中間体は
ルテニウム又はオスミウムのビス(2,2’−ビピリジ
ン)(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン
酸)のモノ−及びジ−N−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル及びその塩並びにルテニウム又はオスミウムビス
(2,2’−ビピリジン)(4,4’−ジ(クロロメチ
ル)−2,2’−ビピリジン)である。 【0037】これら中間体は以下の化学構造を有する。
ルテニウム又はオスミウムのビス(2,2’−ビピリジ
ン)(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン
酸)のモノ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル
は、 【化6】 〔式中、MはRu又はOs、nは整数1、2又は3〕又
はその塩及びその立体異性体を含む。 【0038】ルテニウム又はオスミウム−ビス(2,
2’−ビピリジン)(2,2’−ビピリジン−4,4’
−ジカルボン酸)のジ−N−ヒドロキシスクシンイミド
エステルは、 【化7】 〔式中、MはRu又はOs、nは整数1、2又は3〕又
はその塩及びその立体異性体を含む。 【0039】ルテニウム又はオスミウム−ビス(2,
2’−ビピリジン)4,4’−ジ(クロロメチル)−
2,2’−ビピリジン)は、 【化8】 〔式中、MはRu又はOs、nは整数1、2又は3〕及
びその塩及びその立体異性体を含む。これら化合物は当
業者に公知の手段で合成され得る。 【0040】ルテニウム含有N−ヒドロキシスクシンミ
ンドエステルの好ましい合成方法によれば、先ず炭酸水
素ナトリウムの高温メタノール水溶液中でルテニウムジ
クロロビス2,2’−ビピリジンを2,2’−ビピリジ
ン−4,4’−ジカルボン酸と反応させる。酸性化した
後にカルボキシル化したルテニウム化合物の溶液にNa
PF6 の水溶液を添加する。単離したルテニウム錯体の
ヘキサフルオロホスフェート塩を次に、ジメチルホルム
アミド中のジシクロヘキシルカルボジイミドの存在中で
N−ヒドロキシスクシンイミドと反応させてエステル化
する。本発明の中間体の効果を実質的に悪化させずにN
−ヒドロキシスクシンイミド成分の構造について多くの
変形が可能である。これら中間体はイオン化されてもよ
い。その場合、異なる多くの対イオンが中間体調整物の
電荷を中和し得ることは当業者に明らかであろう。適当
なカチオンは例えば、H+ 、NH4 + 、グアニジニウ
ム、Ag+ 、Li+ 、Na+ 、K+ 、Mg2+、Mn2+、
Cd2+である。適当なアニオンは例えばハロゲン化物、
炭酸塩、SO4 2-、ヘキサフルオロホスフェート及びテ
トラフルオロボレートである。 【0041】これら中間体は、カルボン酸エステルを攻
撃してN−ヒドロキシスクシンイミドを置換し得るか又
はクロロメチル基を攻撃して塩化物を置換し得る遊離ア
ミノ基を含有する物質をラベルするために有効である。
対象分析物をラベルするためには従来技術のイソチオシ
アネート(例えばWeber、米国特許第4,293,
310号)よりも本発明の中間体のほうが好ましい。イ
ソチオシアネートは一般に、二硫化炭素又はチオホスゲ
ンと第一級アミンとの反応によって調製されるが、二硫
化炭素及びチオホスゲンはいずれも揮発性であり極めて
有毒である。二硫化炭素はまた、引火爆発の危険があ
る。また必要な前駆物質たる芳香族第一級アミンは本発
明で使用される前駆物質たる芳香族カルボン酸よりも入
手が難しい。また、本発明の中間体はイソチオシアネー
ト誘導体よりも反応しにくく従って保存及び取り扱いが
容易である。 【0042】本発明は更に、本発明の化学種の存在を判
定する方法を提供する。金属含有組成物は、当業者に公
知の種々の手段例えば放出(エミッション)、吸収、蛍
光スペクトル測定、原子吸収、陽極ストリッピング電圧
測定、中性子活性化及び電気化学的方法の如き手段によ
って検出され得る。ホトルミネセンス、ケミルミネセン
ス及び電気化学ルミネセンスの方法が特に重要である。
ルミネセンスの技術を使用するとRu(bpy)3 2+が
極めて低濃度でも測定できる。酸化的還元法を用いると
(Ege等(1984)、Analytical Ch
emistry、印刷中)、5×10-8Mの濃度のRu
(bpy)3 2+の検出が可能であった。これらの実験で
は、燐酸バッファpH5.0中に1mMのシュウ酸ナト
リウムを用い、飽和塩化ナトリウム参照電極に対して電
位を+1.0V〜+1.4Vで5〜10秒間隔のパルス
にした。還元的酸化法ではより高い感度が得られること
も知見された。CH3 CN:H2 O(1:1容量/容
量)中の18mMのNa2 S2 O8 と0.1Mのテトラ
−n−ブチルアンモニウムテトラフルオロボレートとを
使用すると10-13 Mという低い濃度のRu(bpy)
3 2+が検出できた。方法を更に精密にすれば更に高い感
度が期待できる。これらの方法はまた、ラベルされた物
質の敏感で正確な測定値を与える。これに関しては後出
の実施例で十分に説明する。 【0043】Ru(bpy)3 2+でラベルした物質に関
する本出願人等の実験によって、ルテニウム含有及びオ
スミウム含有化合物の化学ラベルとしての利点が証明さ
れた。これらの化合物は長期安定性であり、種々の化学
物質、生化学物質及び生物物質に有効に結合し得る。ラ
ベルは安全で比較的安価である。 【0044】それらは極めて特徴的なシグナルを与え、
自然には生起しないものである。標識の発光に基づく測
定は高感度、迅速且つ再現性があり、簡単な装置を利用
するものである。これらの標識の発光に基づく検出はリ
ン酸緩衝溶液、トウィーンTM(界面活性剤)、肝臓組織
抽出物又は血清のような成分のよっては殆んど干渉され
ることはない。これら標識の発光に基づく測定は試料又
は標識物質を破壊することなく繰返し行うことができ
る。各標識分子によりシグナルが繰返し発せられ、それ
によって、これら標識を検出し得るだけに感度が増強さ
れる。特定用途の必要に応じて、標識物質の存在は定量
的又は定性的に測定することができる。注意事項:「測
定」という用語は本明細書に於いて標識物質の定量的又
は定性的測定の意味に用いる。 【0045】従って、本発明は次式を有する化学種: 【化9】〔M(P)m (L1 )n (L2 )o (L3 )p
(L4 )q (L5 )r (L6 ) s 〕t (B)u 〔式中、Mはルテニウムまたはオスミウムであり、Pは
Mの多座配位リガンドであり、L1 、L2 、L3 、
L4 、L5 およびL6 はMのリガンドであって各々同一
でもまたは互いに他のリガンドと異なっていてもよく、
BはMのリガンドである物質であるかまたはP、L1 、
L2 、L3 、L4 、L5 もしくはL6 の1個以上に結合
している物質であり、mは1以上の整数であり、n、
o、p、q、rおよびsの各々はゼロまたは整数であ
り、tは1以上の整数であり、uは1以上の整数であ
り、P、L1 、L2 、L3 、L4 、L5 、L6 およびB
は電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導できる
ような組成と数になっており、MのリガンドとMとの結
合の総数はMの配置数に等しい〕の存在を測定するため
の方法であって、 【0046】a)適切な条件下で前記化学種を含有する
試薬混合物を形成し、 b)この試薬混合物を化学エネルギーまたは電気化学エ
ネルギーに曝露することによって化学種を誘導して電磁
放射線を放出させ、 c)放出された電磁放射線を検出することにより対象分
析物の存在を測定することからなる方法を提供するもの
である。 【0047】本発明方法で使用し得る化学種中に、生物
由来の又はそうでない物質(B)はMへの直接の配位に
よって、又はMのリガンドに結合することで該種に取り
込まれ得るものである。結合は共有結合、静電気結合又
は水素結合によってなされ得るものである。物質(B)
をMのリガンドに共有結合させ得る手段は多様である。
例えば、上記結合はアミドあるいはアミン結合、エステ
ルあるいはチオエステル結合、エーテルあるいはチオエ
ーテル結合又は当業者に公知の多数の他の手段のうちの
いかなるものでも良い。結合の型はリガンドの置換基及
び標識されることになっている物質上にあるリガンドと
の結合に用い得る適当な化学基によって決定されること
になる。適当な物質(B)には、例えば、細胞全体、細
胞レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパ
ク、リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝
物質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤(トランキライザ
ー)、精神安定剤(バルビツエート)、アルカロイド、
ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由来でな
いポリマーがある。本発明の好適具体例では、結合はア
ミド又はアミン結合である。アミド又はアミン結合はリ
ガンド上の置換基及び標識されることになっている物質
上のアミノ基との間で形成される。 【0048】本発明方法は相補的物質と特異的複合体
(コンプレックス)を形成することによって化学種を測
定する方法を含むものである。特に興味があるのは、抗
原−抗体の一対の物質についてである。この結合方法
は、例えば、血液、尿又は合成反応混合物のような複合
体混合物中のジゴキシン又はジギトキシンのような標識
抗原の存在を、まず初めに対象抗原に特異的な固定化抗
体に該混合物を接触させ、その後該固定化抗体に結合し
た標識物質の量を測ることによって測定する為に使用す
ることができる。 【0049】「誘導して電磁放射線を放出させる」とい
う語句は該化学種の励起状態を作り出すことを意味し、
これは室温にて200nm〜900nmの波長の発光を
行なうものである。本発明はオスミウム含有種及びルテ
ニウム含有種に関するものであり、リガンドの化学構造
を変化させることによって得られる広範囲に恒る様々な
発光種を含有するものである。これらの金属及びリガン
ドが変化することにより、それら発光種が励起状態にな
る為に必要とされるエネルギー入力の正確な値が変り得
る。これと同様に、電磁放射線の放出波長はルテニウム
又はオスミウム含有物質の性質及び環境によって変化し
得るものである。一般に、ホトルミネセンスに於ける励
起及び発光は約200nm〜約900nmの波長の電磁
放射線を伴って生起するものである。化学発光及び電気
化学発光に於ける放出は一般に約200nm〜約900
nmの波長の電磁放射線の放出を伴って生起するもので
ある。化学種の酸化・還元が起るポテンシャルは使用す
る電極の性質及び溶液のpHのような因子と同様にまさ
にその化学構造に左右されるものである。一般に、ホト
ルミネセンスシステムに於ける励起及び放出の最適波長
及び化学発光又は電気化学発光システムの最適ポテンシ
ャル及び最適放出波長の測定方法は当業者には周知のこ
とである。 【0050】存在する発光種を定量する方法は多数ある
ということは明らかである。システムへのエネルギー入
力の速度によって発光種を測定することができる。適当
な測定としては、例えば、発光種が電気化学的に生成さ
れる際の電流測定、化学的に発光種を生成する際の還元
剤あるいは酸化剤の使用速度又はホトルミネセンス法に
於ける電磁エネルギーの吸収速度の測定が挙げられる。
更に当然のことながら、放出される電磁放射線を測定す
ることによっても、発光種を検出することができる。こ
れら測定は全て、速度に基づく連続的な測定、又は長時
間に恒りシグナルを累積する累積法のいずれかの方法と
して実施し得る。速度に基づく測定の例としては、入射
光強度に比例した量の電流を生じる、光電子増倍管チュ
ーブ、光ダイオード又は光トランジスターを用いるもの
がある。累積法の例としては、速度に基づいて得られた
データの積分、及び直接に累積データを与える写真フィ
ルムを用いるものがある。 【0051】これら全ての発光に基づく方法には、ルテ
ニウム含有化合物による発光の繰返しが必然的に伴って
いる。検出し得る事象が繰返し起るというこれらの標識
の持つ性質は、放射性同位体又はルミノールのような結
合化学発光分子とは明確に異なるものである。後者の標
識はその分子(又は原子)1個につきただの1回しか検
出し得る事象を生起せず、その為にこれら標識の検出可
能性は制限される。 【0052】本発明は更に、ルテニウム及びオスミウム
含有標識を対象分析物の存在を測定する為の結合方法に
使用することを提供するものである。このような結合方
法は当業者には数多く知られている。これらの方法はし
ばしば、生化学的及び生物的成分が互いに結合する際の
高度な特異性を利用するものである。その例としては、
核酸ハイブリダイゼーション法に基づく方法、抗原−抗
体に基づく方法及び酵素−リガンドに基づく方法があ
る。これらの方法では、対象分析物を測定する為に標識
種を用いるか又は競合結合アッセイに於いては対象分析
物を測定する為に対象分析物の標識類似体を使用する為
に標識種を用いることができる。対象分析物及び化学種
は特異的な様式でお互いに結合し得る物質の対であれば
どのようなものでもかまわない。このような物質として
は、例えば、細胞全体、細胞レベル下の粒子、核酸、多
糖、タンパク、糖タンパク、リポタンパク、リポ多糖、
ポリペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理剤、鎮静
剤、精神安定剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸、糖及び生物由来でないポリマーがある。 【0053】特に興味があるのは、抗原−抗体対であ
る。例えばこの方法には細胞表面抗原の存在を測定する
為に標識抗体を使用すること、又は細胞選別法による検
出の為に或る特定の細胞を標識することが含まれる。例
えば固定化された非標識抗体に結合することによって固
定化された抗原は一般に「サンドイッチ法」として公知
の方法に於いて標識抗体によって検出することができ
る。 【0054】競合結合アッセイに於いては、対象分析物
及び該分析物の標識類似体は、例えば、細胞全体、細胞
レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパク、
リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝物
質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤、精神安定剤、アルカロ
イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由
来でないポリマーのような相補的物質との特異的複合体
の形成に関与することのできる物質であればどのような
物質でもかまわない。特に興味があるのは抗原−抗体に
基づく方法である。この方法は、対象分析物がその分析
物の標識類似体を抗体から追い出したときにその分析物
を検出する、ラジオイムノアッセイと呼ばれる周知のも
のに類似している。当業者に公知のラジオイムノアッセ
イの様々な変法は、放射活性標識された化合物の代りに
本発明の標識化学種を用いることによって原理的には有
利に使用することができる。 【0055】本発明は更にホモジーナス又はヘテロジー
ナスな結合方法に於いて標識化学種を使用することを提
供するものである。ヘテロジーナス結合方法に於いて
は、標識の存在を測定する前に未結合標識物質から結合
標識物質を物理的に分離しなければならない。これは抗
原−抗体システムに於いてしばしば、例えば抗体という
一成分を、フィルターのような不溶マトリックスか又は
テストチューブのような反応容器或いはビーズの表面に
結合させて固定化することにより達成される。抗原含有
溶液をフィルターを通すか又は反応容器に注ぎ、その後
それをフィルター又は反応容器側部から洗滌除去する。
抗体に特異的に結合した抗原のみが残留し測定されるこ
とになる。 【0056】これと対照的にホモジーナス方法に於いて
は、標識の存在を測定するときに結合及び未結合の標識
物質が同一反応混合物中に存在する。これは標識からの
検知可能なシグナルの特性が結合によって修飾されると
きに可能となる。発光標識をホモジーナスシステムで使
用することのできるような多数の方法がある。例えば、
もし発光消光剤が抗体上に適切に配置されているなら
ば、標識抗原が結合することによって該抗体上の発光消
光剤が標識の発光を抑制する。発光標識を用いる多数の
ホモジーナス方法が当業者に公知であり、そのうちの幾
つかはBoguslaski及びLi(1982)著の
「ホモジーナスイムノアッセイ」、Applied B
iochemistry and Biotechno
logy7,401−414頁中で検討されている。 【0057】本発明によって独特で有効なタイプの均質
結合アッセイが提供される。本文中の記載によれば、こ
れらのラベルは、ラベルされた対象物質の溶液を電極に
接触させることによって電気化学的に測定され得る。溶
液中に存在するが電極の表面に接近できないラベル物質
は検出されないであろう。検出されない場合として例え
ば、ラベル物質が電極を収容した反応容器の表面に直接
又は間接に結合しているとき、又は、ラベルが特異的複
合体例えば抗原抗体複合体の内部深くに包埋されている
とき、又は、電極自体がラベル物質を通過させるが錯体
を形成したラベル物質を通過させない層で被覆されてい
るときがある。更に、電極の表面が抗体で被覆されるこ
ともあり、この場合、固定化抗体に結合したラベル抗原
だけが電極に接近でき従って測定され得る。所望の電極
電位が短いパルスで与えられるときはこの特別な均質法
が最も有効であろう。 【0058】ラべル化合物の存在を測定する手段の組み
合わせ使用も本発明の範囲内に包含される。例えば、ホ
トルミネセンス又はケミルミネセンスの如き結合ラベル
物質と未結合ラベル物質とを識別しない手段によってラ
ベル物質の総量を測定し、例えば電気化学ルミネセンス
の如き結合ラベル物質と未結合ラベル物質とを識別する
手段によって結合ラベル物質の量を測定するのが好まし
い。かかる組み合わせ方法は同じサンプルに実施するこ
とができ、従って方法が個々に使用される場合よりもサ
ンプルに関して多くの情報が得られる。更に、本発明の
範囲内で同じ反応混合物中の異なる2種以上のラベル化
合物の存在を測定することも可能である。このような方
法は、異なるラベルが異なる波長の電磁放射線を放出す
るとき、又は、ラベルが異なる値又は異なるエネルギ源
のエネルギに曝露されることによって電磁放射線を放出
すべく誘導され得るときに可能である。本発明は更に、
ルテニウム含有又はオスミウム含有化学種の存在を測定
(判定、決定)するシステムを提供する。該システム
は、化学種を含有する反応混合物(試薬混合物)と電磁
放射線を放出せしむべく化学種を誘導する手段と、放出
された電磁放射線を検出する手段とを含む。 【0059】本発明は更に、対象分析物を測定するため
にルテニウム含有又はオスミウム含有のラベル化学種を
使用するシステムを提供する。本発明のシステムは、本
明細書に開示され且つ教示された種々の方法の迅速、有
効且つ柔軟な実行に有用である。本発明は更に、式
(A)k(B)uで示される化学種の存在の測定方法を
提供する。Aは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電
磁放射線を反復的に放出するように誘導され得る化合物
である。これら化合物は、無機、有機金属又は有機化合
物のいずれでもよく、例えばルブレン、9,10−ジフ
ェニルアントラセン、又はルテニウム含有もしくはオス
ミウム含有ラベルである。BはAに結合した物質であ
り、kは1以上の整数であり、nは1以上の整数であ
る。 【0060】該方法によれば、適当な条件下で化学種を
含有する反応(試薬)混合物を形成し、化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線を反
復的に放出せしむべく誘導する。放出された電磁放射線
は適当な方法によって検出されこれによって化学種の存
在を測定し得る。生物又は非生物物質(B)はAに対す
る任意の結合形態によって化学種に組み込まれることが
可能である。結合は、A中に存在する金属原子又はAの
リガンドに対する配位によって行なわれる。結合は、共
有結合、静電結合又は水素結合でもよい。結合のタイプ
は、AとBとの双方の結合に使用し得る適当な化学基に
よって決定されるであろう。 【0061】適当な物質(B)は例えば、全細胞、細胞
下粒子、核酸、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、リ
ポタンパク質、リポ多糖類、ポリペプチド、細胞代謝
物、ホルモン、薬理物質、トランキライザー、バルビツ
ール酸エステル、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸及び糖である。物質は生物物質に限定され
ない。ポリマー、有機又は無機の化合物の如き任意の適
当な非生物物質でもよい。 【0062】化学種は、室温で約200ナノメータ〜約
900ナノメータの波長で発光する化学種の励起状態を
生起することによって電磁放射線を放出すべく誘導され
る。本発明のこの具体例において、化学種は反応(試
薬)混合物を電気化学エネルギに曝露することによって
励起される。本発明の化学種の還元又は酸化が生じる電
位は、該化学種の正確な化学構造と溶液のpH及び使用
電極の種類の如き要因とに依存する。電気化学ルミネセ
ンスシステムの最適な電位と放出波長との決定方法は当
業者に公知である。電気化学発光性の化学種を測定する
には、電流又は放出電磁放射線の測定の如き任意の適当
な方法を用いる。また、本発明の化学種の存在の測定方
法を化学種が別の化学物質と結合できる場合に利用する
ことも可能である。化学物質は化学種に特異的に結合し
得る任意の物質でよい。かかる方法の例として核酸ハイ
ブリダイゼーション方法、抗体−抗原に基づく方法及び
酵素−リガンド方法がある。 【0063】本発明の別の具体例によれば、電気化学発
光性の化学種(A)k(B)uが、該化学種に結合する
対象分析物の存在を測定するために使用され得る。対象
分析物は、電気化学発光性の化学種に結合し得るいかな
る物質でもよい。例えば電気化学発光性の化学種でラベ
ルされた抗体に結合し得る抗原でもよい。方法は、反応
(試薬)混合物を形成させるに適した条件下で分析物を
化学種と接触させるステップを含む。次に化学種を電気
化学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の
反復的放出を誘導する。分析物に結合した化学種によっ
て放出された電磁放射線を検出することによって分析物
の存在を測定(判定)する。 【0064】また、対象分析物の存在を測定するために
競合結合方法を使用することも可能である。分析物と化
学種(A)k(B)uとは化学物質に競合的に結合す
る。反応混合物を形成させるに適した条件下で化学物質
を化学種と分析物とに接触させる。次に化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の反
復的放出を誘導する。電磁放射線の放出量を検出するこ
とによって対象分析物の存在を測定(判定)する。 【0065】本発明は更に、本発明のルテニウム含有又
はオスミウム含有化学種と異なる波長の電磁放射線を放
出すべく誘導され得る1種類以上の別の化学種とを含む
組成物に係る。これら組成物は同じ物質と別の物質との
混合物に含有される異なる2種以上の対象物質又は分析
物を検出する方法及びシステムにおいて有効である。別
の1種以上の化学種は、電磁放射線を放出すべく誘導さ
れ得る無機、有機及び有機金属化合物の如き任意の適当
な化学種、例えばルブレン又は9,10−ジフェニルア
ントラセンである。これらの化学種は、ルテニウム含有
又はオスミウム含有化学種から電磁放射線を誘導するた
めに使用されるエネルギとは異なる値を持つか又は異な
るエネルギ源からでるエネルギに曝露されるときに電磁
放射線を放出すべく誘導されるような化学種である。本
発明の特定具体例において、別の化学種の各々は、ルテ
ニウム含有又はオスミウム含有化学種の電磁放射線の放
出を誘導するエネルギと同じ値及び同じエネルギ源のエ
ネルギによって電磁放射線の放出を誘導されると別の異
なる波長の電磁放射線を放出する。 【0066】これら化学種の測定方法では、適当な条件
下で化学種を含有する反応(試薬)混合物を形成させ、
次に反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種の電磁放射線放出を誘導する。化学種の
各々によって放出される別々の波長の電磁放射線を検出
することによって各化学種の存在が決定される。本発明
は更に、同一混合物中に存在する異なる化学種に選択的
に結合する1種類以上の対象分析物の存在を測定する方
法に係る。方法は、反応(試薬)混合物を形成させる適
当な条件下で分析物と化学種とを接触させる。反応混合
物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに曝露すること
によって化学種を電磁放射線を放出すべく誘導し、放出
された異なる波長の電磁放射線を検出して対象分析物の
各々の存在を決定する。 【0067】混合物中の2種以上の化学種の存在を測定
するこれらの方法は、ルテニウム含有及びオスミウム含
有の発光ラベルを測定するための前記の全てのケースに
適用できる。しかし乍ら、かかる具体例では同一サンプ
ル中に同時に存在する2種以上の異なる物質を測定し得
る。本発明の別の具体例によれば、別々の化学種は、別
々の値又は別々のエネルギ源のエネルギに曝露されて電
磁放射線を放出すべく誘導される。これらの別々の化学
種の測定方法は誘導ステップ以外は、異なる波長の電磁
放射線を放出する化学種の測定方法と本質的に同じであ
る。これら化学種は、異なる値又はエネルギ源のエネル
ギによって電磁放射線を放出すべく誘導される。化学種
含有サンプルが異なる時間に別々の値又はエネルギ源の
エネルギの各々に曝露され、特定の化学種によって放出
された電磁放射線が検出され、これにより化学種の存在
が決定される。方法はまた、サンプル中に存在する別々
の化学種に選択的に結合する対象分析物の存在を決定す
るためにも有効である。 【0068】本発明の別の具体例では、同一サンプル中
に存在する1種類以上の式(A)k(B)uをもつ電気
化学発光性の化学種を測定する方法及びシステムを含
む。これら化学種は、電気化学エネルギ源に曝露される
と異なる波長の電磁放射線を放出する化合物又は各々が
別々の電気化学エネルギ源に曝露されて電磁放射線を放
出すべく誘導され得る複数の異なる化合物を含有する。
これら複数の異なる電気化学発光性の化学種は別々の対
象物質又は分析物に特異的に結合し得る。異なる化学種
の測定は前記と同じ手順で行なわれる。本発明を実施例
に基づいて以下に説明する。これらの実施例は本発明を
理解し易くするための非限定例であり、本発明の範囲は
請求の範囲のみによって限定される。 【0069】 【実施例】実施例I ルテニウムビス(2,2’−ビピリジン)(2,2’−
ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸)ビス(ヘキサフ
ルオロホスフェート)の調製 重炭酸ナトリウム(0.40g)、ルテニウムジクロロ
ビス(2,2’−ビピリジン)(0.40g)及び2,
2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸(0.30
g)を、環流メタノール(20ml)−水(5ml)中
で9時間撹拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、5
滴の濃H2 SO4 で処理し、1.5時間氷温に維持し
た。形成した沈殿を濾別しMeOH(8ml)で洗浄し
た。炉液と洗浄液を合わせたものを水(25ml)中の
ナトリウムヘキサフルオロホスフェート(5.0g)の
溶液で処理した。得られた溶液を氷浴で3時間冷却し、
赤紫色結晶の得られた沈殿を濾過により回収した(0.
40g)。 【0070】実施例II ルテニウムビス(2,2’−ビピリジン)(2,2’−
ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸)の活性エステル
の調製 ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、0.046
g)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.034
g)をDMF(2ml)中に撹拌して溶解し、氷溶中で
冷却した。ルテニウムビス(2,2’−ビピリジン)
(2,2’−ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸)
(0.101g、実施例Iのように調製した)をDMF
(1ml)中に溶解した溶液を加え、混合物を氷浴温度
で5時間撹拌した。形成した沈殿を遠心分離した。活性
化ルテニウム複合体を含む上清を、基質を標識するため
に保存した。 【0071】実施例III 子牛血清アルブミン(BSA)の活性化ルテニウム複合
体による標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液(1ml)を、撹拌下の水性生理緩衝塩溶液(PB
S、5ml)中のBSA溶液(25mg/mlBSA)
に加えた。混合物を1夜撹拌し、沈殿を遠心分離で除去
した。ルテニウム標識BSAを含む上清を2つの方法で
分析した。 【0072】方法1:透析 ルテニウム標識BSA溶液をPBS溶液で透析した。コ
ントロールとして実施例IIで調製した非結合の活性化ル
テニウム複合体もPBS溶液で透析した。8時間後、コ
ントロールでは透析チューブ中には蛍光を有するものは
見られなかった。それに対し、ルテニウム標識BSA溶
液は強い蛍光を示し、ルテニウム複合体が高分子量BS
Aに結合したことを示した。 【0073】方法2:マイクロフィルトレーション ルテニウム標識BSA溶液をアミコンマイクロコンセン
トレーター中に入れ、8000rpmで遠心した。赤橙
色溶液の小画分がフィルター上に残り、この着色画分を
洗浄PBS溶液で希釈し遠心した。この手順は数回繰り
返した。4回の洗浄後、フィルターを通しては無色の溶
液が得られ、フィルター上には強く赤橙色に着色した物
質が残った。この結果は、ルテニウム複合体が高分子量
BSAに結合したことを示している。 【0074】実施例IV ヒトイムノグロブリンG(IgG)の活性化ルテニウム
複合体による標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液を撹拌下に水性バッファー中のアフィニティー精製ヒ
トIgG溶液に加えた。ルテニウム標識化IgG溶液
は、充分に透析した後に強い蛍光を示し、ルテニウム複
合体が高分子量のアフィニティー精製ヒトIgGに結合
したことが示された。 【0075】実施例V ウサギ抗サルモネラ抗体の標識化 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液(0.1ml)を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清
(1ml)と共に室温で1時間撹拌し、その後ジエタノ
ールアミン(0.1ml)を加えて停止した。ルテニウ
ム標識抗サルモネラ抗体を含む得られた溶液でサルモネ
ラ細胞を処理した。細胞の遠心分離及び新鮮バッファー
への再懸濁を5回繰り返し、全ての非結合抗体(ルテニ
ウム標識非結合抗体を含む)及び全ての遊離ルテニウム
複合体から細胞を分離した。ルテニウム標識抗サルモネ
ラ抗体で処理したサルモネラ細胞は、蛍光光学顕微鏡で
観察すると明るい赤橙色光を発しており、抗サルモネラ
抗体がルテニウム複合体で標識され、ルテニウム標識抗
体はルテニウム複合体が蛍光を発する条件下でサルモネ
ラ細胞に結合する能力を保有することが示された。 【0076】実施例VI 正常マウス血清(即ち、抗サルモネラ抗体を持たない)
を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清の代りに使用して
実施例Vの手順を繰り返した。処理後、サルモネラ細胞
は蛍光光学顕微鏡で観察しても赤橙色を発しておらず、
ルテニウム標識正常マウス血清成分のサルモネラ細胞に
対する非特異的結合は起こらないことが示された。 【0077】実施例VII ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(IgG)の標識化及び
ローダミンとの比較 実施例IIで調製した活性化ルテニウム複合体のDMF溶
液を撹拌下にアフィニティー精製ヤギ抗ウサギIgG溶
液に加えた。反応後、混合物をバッファーに対して透析
した。透析チューブ内に残った物質はUVライト下で蛍
光を発した。ルテニウム標識IgGのウサギ抗サルモネ
ラ抗体被覆サルモネラに対する反応性をテストした。ガ
ラス顕微鏡スライドに固定したサルモネラ・ワーシント
ン(Salmonella worthington)
とウサギ抗サルモネラ抗体を反応させ、非反応抗体をバ
ッファーで洗い流した。次にルテニウム標識ヤギ抗ウサ
ギIgGを抗体処理サルモネラ・ワーシントンと反応さ
せ、非反応物質をバッファーで洗い流した。このスライ
ドを50W水銀ランプを備えた光学顕微鏡で観察する
と、非常に明るい橙赤色螢光がバクテリア上及び周囲に
見られた。ルテニウム標識抗体の非特異的結合について
コントロールの実験を行なった。ガラス顕微鏡スライド
に固定したサルモネラ・ワーシントンを正常マウス血清
と反応させ、その後ルテニウム標識ヤギ抗ウサギIgG
抗血清と反応させた。その後同じ洗浄工程を行なった。
橙赤色蛍光は観察されなかった。比較の目的で、ローダ
ミンイソチオシアナート結合ヤギ抗ウサギIgG抗血清
を(ルテニウム結合抗体と等価のタンパク質濃度で)、
ウサギ抗サルモネラ抗体で被膜したサルモネラ・ワーシ
ントンと反応させた。赤色の蛍光がわずかに検出された
が、蛍光の強度はルテニウム結合体に比較して有意に小
さいものであった。 【0078】実施例VIII ルテニウム標識・子ウシ血清アルブミン(BSA)の電
気化学発光(ECL)検知 光学的に平坦な底部を有する1区角タイプのセル(30
ml)中でECL測定を行なった。測定電極はガラス状
炭素で、対する電極はプラチナネットとし、疑似対照電
極は銀ワイヤで行なった。光強度の測定は、−2.0V
(Agワイヤに対して)の電位をかけ、光増強管(Ha
mamatsu 928)で発光を検知し、2つに対し
て得られる信号をBascom−Turner Rec
orderで統合した。アセトニトリル−水(9ml、
50:50v/v)、テトラブチルアンモニウムテトラ
フルオロボレート(329mg)及びジアンモニウムパ
ーオキシジスルフェート(42mg)をECLセル中で
混合し、バックグラウンド光強度を記録した。ルテニウ
ム標BSA溶液(実施例 IIIで調製したもの)を、アセ
トニトリル−水(50:50v/v)中に希釈し、該希
釈BSA溶液(1ml)をECLセル中に加えた。得ら
れた溶液は溶媒飽和窒素気泡で脱気した。表Iはルテニ
ウム標識BSAの異なる濃度に対して得られた結果を示
している。 【表1】表 I 光強度 (ルテニウム) (任意単位) M 5.2 ブランク 20.63 1×10-11 33.25 1×10-10 54.42 9×10-10 150.2 8×10- 9 【0079】実施例IX 4,4’−ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン
−ビス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)2+の
調製 Sprintschink等(J.Amer.Che
m.Soc.99,4947(1977))の方法によ
り、2,2−ビピリジン−4,4’−ジカルボン酸から
4,4’−ジエトキシカルボニル−2,2’−ビピリジ
ンを調製した。該ジエチルエステル(100mg)を無
水ジエチルエーテル(35ml)中に溶解した。リチウ
ムアルミニウムヒドリド(100mg)を加え、30分
インキュベートした後ジエチルエーテル(35ml)及
び氷冷脱イオン水(100ml)を加えた。溶液をよく
混合し、エーテル層を回収した。水成層はエーテル(7
0ml)で2回以上抽出した。エーテル抽出物を合わ
せ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し濾過した。ロータリー
エバポレーターで溶媒を除去し、所望生成物(43m
g)を得た。この43mgの4,4−ジ(ヒドロキシメ
チル)−2,2’−ビピリジン及び120mgのcis
−ジクロロビス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム
(II)ジヒドレートをエタノール(25ml)に加え、
溶液を14時間環流させた。溶液を冷却した後、アンモ
ニウムヘキサフルオロホスフェートの溶液(水1ml中
1mg)の50μlを加え、得られた結晶状固体を回収
し、少量のエタノールで洗浄して乾燥し、138mgの
4,4−ジヒドロキシメチル複合体のヘキサフルオロホ
スフェート塩を得た。この複合体(6mg)を塩化チオ
ニル(5ml)に加え、溶液を6時間環流させた。蒸留
により塩化チオニルを除去し、固体残渣をジオキサン−
水(1:1)混合物(500μl)に溶解した。4,
4’−ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン−ビ
ス−(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)2+を含
むこの溶液を抗体の標識に使用した。 【0080】実施例X 4,4’−ジ(クロロメチル)−2,2’−ビピリジン
−ビス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム(II)2+に
よるウサギ及びヒツジ抗マウスIgGの標識化 ウサギ及びヒツジ抗体をPBS中の2mg/mlの溶液
とした。これ等の溶液を重炭酸ナトリウム(500m
l、50mM、pH9)に対して一晩透析した。その後
抗体(2mg)を重炭酸ナトリウム溶液で希釈し2ml
の最終容量とした。この溶液(1ml)を炭酸ナトリウ
ム溶液(1ml、50mM)に加えpHを10に調整し
た。ジオキサン−水中の活性化複合体溶液(100μ
l)を抗体溶液に加え4℃で16時間反応させた。この
後、反応物にBSA(5mg)を加え、溶液を直ちに炭
酸バッファー(500ml、25mM、pH9)に対し
て透析した。透析バッファーは24時間間隔で3回交換
した。 【0081】実施例XI 蛍光光度測定分析による標識ウサギ及びヒツジ抗マウス
イムノグロブリンの免疫学的反応性のデモンストレーシ
ョン レジオネラ・ニューモフィラ1(Legionella
pneumophila 1,Philadelph
ia 1単離体)のホルマリン化懸濁液をPBSバッフ
ァーで希釈して光学密度1.00(425nm)に調整
した。この懸濁液の1.3希釈物(1ml)を一連の円
垂形マイクロ遠心分離管に入れた。細胞を遠心分離(1
0分、10000RPM)、上清を傾瀉して細胞をマウ
スモノクローナルIgG抗体を含むPBS(“10C
8”0.85mg/ml)(1ml)あるいは陰性対照
としてのPBS中に1:100希釈物として再懸濁し
た。室温で1時間インキュベートした後、細胞を先と同
じように遠心分離し、上清を傾瀉して細胞をPBSバッ
ファー中に再懸濁し、再度遠心分離した。上清を傾瀉し
た後、細胞を貯蔵ルテニウム標識ウサギ及びヒツジ抗マ
ウスIgG抗体の1:5希釈物(PBS中)(1ml、
10mgルテニウム複合体/ml)、あるいは陽性対照
としてフルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgG抗体の
1:50希釈物(PBS中)(1ml、0.5mgIg
G/ml)、あるいは陰性対照としてPBS中に再懸濁
した。室温で1時間インキュベートした後、前と同じよ
うに細胞を遠心分離して上清を傾瀉し、細胞をPBS中
に再懸濁して前のように遠心分離で2回洗浄した。最後
の洗浄の後細胞をPBS(1ml)中に再懸濁し、ポリ
スチレンキュベット中に移して蛍光光度測定分析に供し
た。 【0082】フルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgG抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、491nmに
励起ピーク、519nmに放射ピークが観察された。こ
れ等の波長をフルオレセイン標識細胞の蛍光測定に使用
した。ルテニウム標識ウサギ/ヒツジ抗マウスIgG抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、455nmに
励起ピーク、623nmに放射ピークが認められた。こ
れ等の波長をルテニウム標識細胞の蛍光測定に使用し
た。“10C8”第1抗体及び蛍光性結合体の代りにP
BSとインキュベートした細胞懸濁液を陰性コントロー
ルとし、蛍光光度計のブランクに使用した。“10C
8”第1抗体と蛍光性結合体の両方と共にインキュベー
トした細胞懸濁液の蛍光を100とし、その他の全ての
蛍光測定はこれ等の内部標準に対する相対的な蛍光単位
で行なった。表IIに示した結果は、ルテニウム標識抗マ
ウスIgG結合体は蛍光を発し、“10C8”第1抗体
の存在下で特異的な免疫学的反応性を示すことを表わし
ている。 【表2】表 II 相対蛍光単位 フルオレセイン ルテニウム (519nm) (623nm) 1:3細胞希釈 1:3細胞希釈 第1抗体を有する ≡ 100 ≡ 100 結合体の蛍光 第1抗体を有しない 37 64 結合体の蛍光 バックグラウンドの蛍光 (第1抗体を有するが 6 48 結合体は有さない)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.第1の化学種及び更に1もしくはそれ以上の異なる
化学種からなる組成物であって、それぞれの化学種はそ
れぞれ異なる波長の電磁放射線を放出させるべく誘導す
ることができる化学種であって、そして第1の化学種は 【化1】〔M(P)m (L1 )n (L2 )o (L3 )p
(L4 )q (L5 )r (L6 )s〕t (B)u 〔式中、Mはルテニウムまたはオスミウムであり、 PはMの多座配位であり、 L1 、L2 、L3 、L4 、L5 およびL6 はMのリガン
ドであって各々同一でもまたは互いに他のリガンドと異
なっていてもよく、 Bは1個以上のアミド結合またはアミン結合を介して
P、L1 、L2 、L3 、L4 、L5 またはL6 の1個以
上と共有結合している生物物質、合成物質または非生物
物質であり、該生物物質および合成物質は相補的物質と
の競合結合反応において生物物質と競合することがで
き、 mは1以上の整数であり、 uは1以上の整数であり、 P、L1 、L2 、L3 、L4 、L5 、L6 およびBは電
気化学ルミネセンスを放出させるべく化学種が誘導され
るように十分な量で存在、Mのリガンドによって与えら
れるMとの結合の総数はMの配位数に等しい。〕で表さ
れる、組成物。 2.各々の化学種は、各々異なる対象分析物に結合して
いる請求項1の組成物。 3.いろいろな化学種を異なる値のエネルギーまたは異
なるエネルギー源からのエネルギーに曝露することによ
って誘導して電気化学ルミネセンスを放出させる請求項
1の組成物。 4.化学種が各々異なる物質に結合している請求項3の
組成物。
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