JPH04502208A - 高められた電気化学発光 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高められた電気化学発光 この出願は、１９８６年４月３０日提出の米国出願シリアルＮｏ、８５８，３５ ４．１９８７年４月３０日提出のＰＣＴ出願シリアルＮｏ、ＵＳ　８７１００９ ８７、国内段階ＰＣＴ出願シリアルＮｏ、３６９．５６０．名称“電気化学発光 分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ａｓ５ａｙｓ）　” 、１９８７年１２月１８日提出（Ｃｕｒｔｉｓ、　Ｍｏｒｒｉｓ　＆５ａｆｆｏ ｒｄ、　Ｐ、Ｃ，Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、　３７００６８−２０８８　）、および １９８７年１２月４日提出の米国出願シリアルＮｏ、Ｉ　Ｉ　７．０１７の一部 継続出願で、そのすべての出願はここに参考としてとり入れられる。加えて、１ ９８８年４月２９日提出の米国出願シリアルＮｏ、　１８８．２５８．１９８５ 年ｌθ月２４日出願の米国出願シリアルＮｏ、２８９．１１３、および米国出願 シリアルＮｏ、２６６．８８２、名称″電気化学発光分析（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃ ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ａｓ５ａｙｓ　）　−，５ｈａｈ、　Ｈａｌ ｌ、　ＰｏｗｅｌｌおよびＭａｓｓｅｙ名、これと同日付提出（Ｃｕｒｔｉｓ、 　Ｍｏｒｒｉｓ。

＆　５ａｆｆｏｒｄ、　Ｐ、Ｃ，Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、　３７００６８−２３９ ０　）かすべてここに参考としてとり入れられる。

発明の分野 この出願は一般的には電気化学発光（“ＥＣＬ”）反応、より詳細には調査され る系から発する！磁放射を測定することによる対象の分析物の検出、そして所望 の場合存在する量の定量に関する。

発明の背景 反対に荷電されたラジカルイオンの消滅放射を含む初期のＥＣＬ反応は、ダブル ポテンシャルステップを用いる電極における逐次酸化還元により生成した。以下 を参照。

Ｆａｕｌｋｕｒ、Ｌ、Ｒ，ら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、　Ａ、ｊ。

Ｂａｒｄ　（Ｅｄ、）、　Ｖｏｌ、　１０．　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　 Ｎ、Ｙ、　１９７７、　Ｏｈ。

１：　Ｔｏｋｅｌ−Ｔａｋｖｏｒｙａｎ、Ｎ、ε、ら、ＣｈｅＩＩｌ、Ｐｈｙｓ 、Ｌｅｔｔ、。

Ａｂｒｕｎａ、Ｈ，Ｄ、、Ｊ、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、１９８４． 　１７５．　３２１゜十分にエネルギをもつラジカルと反対荷電のラジカルとの 間の均質な電子の移動により、ブレカーサのひとつの励起状態を形成することが でき、つづく放射か励起状態の種により生じる。更に、三重−三重（ｔｒｉｐｌ ｅｔ−ｔｒｉｐｌ−ｅｔ）消滅放射を含む、いわゆるエネルギ不足機構（ｅｎｅ ｒｇｙ　ｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）が報告された。

Ｆｒｅｅｄ、　Ｄ、ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、＋９７１．　９３．　２ ０９７；Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｗ、Ｌ、ら、Ｊ、εＩｅｃｔｒｏｃｈｅｍ、　Ｓａ ｃ、＋９７８．　１２５゜１４３０参照。

ある他のＥＣＬ反応において発光団がシュウ酸塩またはピルビン酸塩のようなカ ルボン酸とともに使われ、電気化学発光を得た。このような酸化−還元機構はＲ ｕ（ｂｐｙ）ｓ　２°　（ここにｂｐｙは“ビピリジル（ｂｉｐｙｒｉｄｙＩ） ”を指す）およびカルボン酸の酸化を含む。

ａｇｅ、　Ｄ、ら、Ｊ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、１９８４．　５６．２４１３ 　；Ｒｕｂｔｎｓｔｅｉｎ、Ｅ、ら、Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅａ＋、　Ｓｏｃ、１９ ８１，１０３．５１２　；Ｃｈａｎ、　Ｍ、Ｍ、ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、 　Ｓｏｃ、１９７９．９９．５３９９参照。

しかしこれらの系に対し必要な、報告された発光団の量されるより小量の発光団 を用いて作動となるような進歩が期待される。更に又これらの系が高い検出能力 を持ち、与えられた発光団の量に対し通常の場合より小量の分析物に感度をもつ ことが期待される。

従って、好ましい検出限界を示すＥＣＬ反応を行うための材料および方法の提供 が顕著な技術進歩である。

この発明の目的 電気化学発光を生起する好適な材料および方法を提供することかこの発明のひと つの目的である。

この発明の池の目的のひとつはＥＣＬ分析を行うのに好適な材料と方法を提供す ることである。

更にこの発明の目的は電気化学発光を検出し、それにより広い範囲の濃度で存在 する多様な分析対象の検出に好適な材料および方法を提供することである。

更にこの発明の目的は、極めて低濃度の分析対象物の検出および定量に対し高感 度ＥＣＬ分析を行うのに好適な材料および方法を提供することである。

更にこの発明の目的は、水性環境においても又有機の環境においても広範囲の濃 度で存在する分析物の検出および／又は定量に対する精密な、再現性の、高感度 のＥＣＬ分析を行うのに好適な材料および方法を提供することである。

この発明の面別の目的は、金属含有ＥＣＬモイエティーを検出および／又は定量 するためのＥＣＬ分析に好適な材料および方法を提供することである。

この発明のこれらのそして他の目的は以下のこの発明の記述を考察することによ りより容易に明らかになるで以下の考察から明らかになるように、この発明は前 のセクションで述べた目的を果すことが可能な強力な道具である。

このように、ひとつの態様においてこの発明はＥＣＬ分析に用いて好適な組成物 であって、その組成物により出される電磁放射が検出され、その組成物が以下を 含むことを特徴とする。

（ａ）　励起状態に転換することが可能な金属含有ＥＣＬモイエティーであって 、その励起されたＥＣＬモイエティーが前述の放射を誘導するのに十分な条件に 曝されたときそれから電磁放射が出されるＥＣＬモイエティー−（ｂ）　酸化さ れたとき強い還元剤を形成する種：（Ｃ）　その中で前述のＥＣＬモイエティー と前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質：および（ｄ）　それが 存在することにより組成物によ出される電磁放射の量が増加する物質。

別の態様において、この発明はＥＣＬ分析をおこなう組成物を提供するのに使っ て好適な試薬に関し、ここで電磁放射が（ｉ）励起状態に転換することが可能な 金属含有ＥＣＬモイエティーであって、その励起されたＥＣＬモイエティーが前 述の放射を誘導するのに十分な条件に曝されたときそれから電磁放射が出される ＥＣＬモイエティー、（ｉｉ）酸化されたき強い還元剤を形成する種、（ＮＯそ の中で前述のＥＣＬモイエティーと前述の種とが酸化され得る媒体として機能し 得る電解質、および（ｆｖ）それが存在することにより組成物により出される電 磁放射の量が増加する物質、を含む組成物から出され、前述の試剤が前述の物質 （ｉｖ）と、前述のＥＣＬモイエティー（１）、種（ｉｉ）、および電解質（ｉ ｉｉ）の少くともひとつを含む。

更に別の態様において、組成物により出される電磁放射が検出されるＥＣＬ分析 を行うためのキットを目的とし、そのキットは （ｉ）　励起状態に転換することが可能な金属含有ＥＣＬモイエティーであって 、その励起されたＥＣＬモイエティーが前述の放射を誘導するのに十分な条件に 曝されたときそれから電磁放射が出され、 （ｉｉ）　酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（Ｈｉ）その中で前述のＥ ＣＬモイエティーと前述の種とが酸化され得る媒体として機能し得る電解質、お よび（ｆｖ）　それが存在することにより組成物により出される電磁放射の量が 増加する物質、 を含み、前述のキットはＥＣＬモイエティー（ｉ）、種（ｉｉ）、電解質（ｉｉ ｉ）　、物質（ｉｖ）からなるグループの１またはそれより多いメンバーが含ま れる少くともひとつの分離された組成物を含む。

面別の態様において、この発明は以下のステップを含む電磁放射の放出を生起す る方法に関する。

（ａ）　以下を含む組成物を形成する。

（ｉ）　励起状態に転換することが可能な金属合作ＥＣＬモイエティーであって 、その励起されたＥＣＬモイエティーが前述の放射を誘導するのに十分な条件に 曝されたときそれから電磁放射が出されるＥＣＬモイエティー、（ｉｉ）　酸化 されたとき強い還元剤を形成する種、（ｉｉｉ）その中で前述のＥＣＬモイエテ ィーと前述の種とが酸化され得る媒体として機能し得る電解質、および（ｉｖ） 　それが存在することにより組成物により出される電磁放射の量が増加する物質 。

（ｂ）　その組成物をその組成物か電磁投射を出すように誘導するにの有効な量 の電気化学的エネルギに、好適な条件下で曝す。

（Ｃ）　出された電磁放射を検出する。

追加の態様において、この発明は更に以下を含むＥＣＬ分析による分析対象物を 検出し定量する方法を目的とする。

（１）　以下を含む組成物を形成する。

（ａ）　分析対象物に関しテストされるサンプル、（ｔｌ）　以下からなるグル ープから選ばれる少くともひとつの物質。

（ｉ）　付加的分析対象物またはその分析対象物の類似体、 （ｉｉ）　分析対象物またはその類似体の結合パートナ、（ｉｉｉ）　（ｉ）ま たは（ｉｉ）と結合し得る反応性成分、（Ｃ）　金属含有ＥＣＬモイエティーで あって、有効量の電気化学的エネルギへの曝露により酸化されたとき励起状態に 転換され、投射を誘導するのに十分な条件に、励起されたモイエティーが曝され たとき電磁放射を投射することかでき、そして分析対象物または（ｂ）（ｉ）、 　（ｂ）（ｉｉ）、または（ｂ）（ｉｉｉ）で示される物質と結合相互反応に入 ることができるＥＣＬモイエティー、 （ｄ）　酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（ｅ）　前述のＥＣＬモイエ ティーおよび前述の種がその中で酸化され得る媒体として機能し得る電解質、お よび（ｆ）　その存在において前述の組成物により出される電磁放射の量が増加 する物質。

（２）前述の組成物をその組成物が電磁放射を出すように誘導されるのに有効な 量の電気化学的エネルギに曝す。

そして、 （３）出された電磁放射を検出する。

更に他の態様において、この発明は以下を含む電気化学発光現象をベースとする 、サンプル中の分析対象物を検出または定量するためのシステムに関する。

（ａ）　ひとつのサンプル、 （ｂ）　以下で構成されるグループから選ばれる少くともひとつの物質、 （ｉ）　加えられた分析対象物または分析対象物の類似体、 （ｊｉ）　分析対象物またはその類似体の結合パートナ、および （ｉｉｉ）　（ｉ）または（ｉｉ）と結合し得る反応性組成物であって、その物 質のひとつが直接あるいは１またはそれより多い他の分子により金属含有ＥＣＬ モイエティーに結合し、そのＥＣＬモイエティーを、投射を誘導するのに十分な 条件に曝すことにより電磁放射が出される励起状態に転換することができる組成 物、 （Ｃ）　強い還元剤に転換し得る種、その存在によりその系により出される電磁 放射の量が増加する物質、および電解質、 （ｄ）　ＥＣＬモイエティーに電磁放射の放出を誘導する手段、そして （ｅ）　サンプル中の分析対象物の存在または量を測定するために系により出さ れる放射を計測する手段。

“ＥＣＬモイエティー”または“金属合作ＥＣＬモイエティー”は時により　“ ラベル”、　“ラベル化合物”、０ラベル物質”等と呼ばれる。“ＥＣＬモイエ ティー”、“金属含有ＥＣＬモイエティー”、　“有機金属”、　“金属キレー ト”、遷移金属牛レート、および“希土類金属キレート”が、−二の発明による 組成物、試薬、キット、方法またはシステム態様の形で利用されるとき一分析物 またはその類似体、そのような分析物の結合パートナまたはその類似体、前述の 結合パートナの更なる結合パートナ、分析物、その類似体または前述の結合パー トナと結合することができる反応性成分のようなその他の分子と結合することは この発明の範囲である。上記の種はまた、ｌまたはそれより多い結合パートナお よび／または１またはそれより多い反応性成分の組み合わせと結合することもで きる。更に前述の種は、結合パートナに結合された分析物またはその類似体、反 応性成分、または！またはそれより多い結合パートナおよび／または１またはそ れより多い反応成分の組み合わせと結合することもできる。複数の前述の種が、 分析物またはその類似体と直接または前に検討されたように他の分子を介して結 合されることもこの発明の範囲である。

前記の“組成物”　（以後時として”ＥＣＬ組成物”）または“系”が、ＥＣＬ 反応のコースにおいて形成される前述の励起状態のＥＣＬモイエティーおよび前 記の強い還元剤のような安定な、準安定なその他の中間体積を含むことも同様に この発明の範囲である。

更に、可視光線の放出がこの発明のある態様の有利な特徴であるが、組成物（又 はＥＣＬ組成物）が赤外または紫外線、Ｘ線、マイクロ波等のようなその他の型 の電磁放射を出すこともこの発明の範囲である。この発明に関する用語“電気化 学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）″、′電気化学 発光の（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）″、“電気化学発 光する（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）”、“発光（ｌｕｍｉ ｎｅｓｃｅｎｃｅ）　”、　“発光の（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）”　、および 、　“発光する（　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）”使用するとき、放射が光であること は必ずしも要さず、放射が他の形態の電磁放射であることを許容する。

この発明の実施者には本質的な利益が与えられる。この発明による材料および方 法は分析対象物のＥＣＬ検出および定量の実行に対し、微量の分析物濃度に亘る 広範囲の濃度、水性のみならず有機性環境において簡潔な技術を提供する。検出 および定量測定に秀れた精度と再現性が得られる。他の方法では検出できない微 量濃度の検体を検出することができる。逆に、この発明により特殊な（特に微量 の）１１度の分析物を検出するためには従来の技術で要求されるより少量の金属 含有ＥＣＬモイエティーが必要であるという別のことを意味する。このように進 歩した検出限界がこの発明により実現する。

更に、この発明はこれにつづくこの発明の記載において検討されるように極めて 多様な分析対象物の検出および定量に有用である。

更に、この発明が不均一系の分析のみならず均−系の分析においても有用である という事実はその多能性を更に証明する。これに関し、不均一系の分析は、直接 または１またはそれより多い他の分子を介して分析対象物と結合したＥＣＬモイ エティーが、そのようなモイエティーが電気化学的エネルギに曝される前に分析 物またはその類似物に結合しないＥＣＬモイエティーから分離されるそれである 。それに対し均一系分析は、材料が電気化学的エネルギに曝される前にそのよう な分離がなされないそれである。この発明の均一系分析においては、ＥＣＬモイ エティーが分析物またはその類似体と結合するときに出される電磁放射はＥＣＬ モイエティーが分析物またはその類似体と結合しないときに出される電磁放射と 異る。これはたとえば、分析物またはその類似体と結合するＥＣＬモイエティー の存在に対応する増加または減少した放射を検出することにより達成することが できる。

図面の簡単な説明 図１はこの発明により電気化学発光の放射を誘導するのに好適なセルの模式図で ある。

図２は図１に示されたセルと共に用いられる電圧制御装置の簡略化したダイアグ ラムである。

図３はＥＣＬ強度（カウント）対ＴＡＧ（トリス（２、２′−ピペリジル）ルテ ニウムクロリドへキサヒトラード）の濃度（ｎＭ）のプロットである。

図４は均−系テオフィリン分析の結果をグラフで示す。

図５は各種血清における均−系テオフィリン分析の結果をグラフで示す。

・＝正常血清 ■＝溶血を起こした血清 ◆＝脂血症の血清 ＝黄痘の血清 図６はＥＣＬテオフィリン分析の結果を蛍光偏向テオフィリン分析の結果と比較 してグラフで示す。

Ａ、正常血清　ｎ＝４．勾配＝　、９８６．、　ｒ＝１．００Ｂ、　溶血血清　 ｎ＝３．勾配＝　、８７８．、ｒ＝１．００Ｃ９脂血住血＊ｎ＝５．勾配＝　、 ８７２．、　ｒ＝ｏ、９９Ｄ、黄療血清　ｎ＝４．勾配＝２．１４．、　ｒ＝１ ．００図７はＥＣＬジゴキシン免疫分析の結果をグラフで示す。

■＝ニブラン ク＝ジゴキシン 好ましい実施態様の説明 この発明は、付加的な目的、特徴およびそれらの利点と共に以下詳細に記載され た好ましい実施態様により、より完全に理解されるであろう。

この発明は、結合反応に入ることが可能な金属キレートのような金属含有化合物 、およびその他の分析対象物の検出および定量ができる点で有用である。これら の反応は、例えば、抗原抗体反応、リガンドレセプタ反応、ＤＮＡおよびＲＮＡ 相互作用、およびその他の既知の反応を含む。ある実施態様においてこの発明は 、多成分サンプル中の分析対象物の存在を定性的に又定量的に検出するための種 々の材料および方法に関する。

金属含有ＥＣＬモイエティーに加え、典型的な分析対象物はサンプル中の全細胞 または表面抗原、細胞上粒子、ウィルス、ブリオン、ウィロイド、抗体、抗原、 ハブテン、核酸、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、リボ多糖類、糖タンパ ク質、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬剤、非生物学的ポ リマー（好ましくは可溶性）、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザ、 催眠剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、再結 合または誘導タンパク質、ビオチン、アビディン、ストレプトアビディン、また は無機分子である。ひとつの実施態様において、ＥＣＬモイエティーは抗体、抗 原、核酸、ハブテン、小ヌクレオチット連続、オリゴマ、リガンド、酵素、また はビオチン、アビディン、ストレプトアビディン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ 、またはそれらの錯体、またはタンパク質相互作用を通して一次結合バートナに 結合し得るその他の二次結合パートナである。

全細胞は動物、植物、または細菌で生きていても死んでいてもよい。例として真 菌類および線虫のような植物病原体を含む。用語“準細胞粒子“は、例えば、準 細胞小器官、破壊細胞からのような膜粒子、細胞壁の断片、リポソーム、複酵素 錯体、および生活器官から誘導し得るその他の粒子を包含することを意味する。

核酸は、例えば染色体のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルス性ＤＮＡ、および 複数の起原から誘導される再結合ＤＮＡを含む。核酸はＲＮＡ’　Ｓ、例えばＲ ＮＡのメツセンジャ、リポソームＲＮＡ’　Ｓ、およびトランスファＲＮＡ’　 Ｓをも含む。ポリペプチドは、例えば酵素、輸送タンパク質、レセプタタンパク 質、およびウィルス被覆タンパク質のような構造タンパク質を含む。好ましいポ リペプチドは酵素および抗体である。とりわけ好ましいポリペプチドはモノクロ ーナル抗体である。ホルモンは、例えばインスリンおよびＴ４チロイドホルモン を含む。薬剤は、例えば心臓のグリコシドを含む。合成ポリペプチド、合成核酸 、および合成膜、小胞およびリポソームのような化学的に生物学的材料に相似の 合成物質は勿論この発明の範囲に含まれる。上記はこの発明に好適な生物学的物 質の広範囲のリストを意図したのでなく、この発明の広い範囲を説明することだ けを意味する。

更に通常は、分析対象物は１Ｏ−３モルまたはそれ未満、たとえば少くとも１ｏ −１１モルのように低い濃度で与えられる。

分析対象物を含むサンプルは、固体、エマルション、分散体、液体、またはガス の形体であり、そしてたとえば細胞および細胞由来生成物、水、食品、血液、血 清、毛髪、汗、尿、排泄物、組織、唾液、油、有機溶媒又は空気から誘導され得 る。サンプルは更に、例えば水、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメ チルホルムアミド、ｎ−メチルピロリドンまたはアルコールを含み得る。

この発明の重要な特徴は金属含有ＥＣＬモイエティーの利用である。好ましくは ＥＣＬモイエティーは再生できるので、繰返し電磁投射を誘発することができ、 即ち分子当り多数回の投射がなされる。これは、分子当り１回より多い投射を“ ラベル”なしてつくり、通常の態様を上まわる顕著な利点である。（放射性アイ ソトープ、ルミノールのような化学発光分子等のような付加的ラベルを使うこと がこの発明の範囲であることに注目すべきである。

この発明により使われるＥＣＬモイエティーは、この発明による電気化学的刺激 の結果として、可視光線のような電磁放射を発する有機金属化合物を包含する。

例は４．４’、５’、５テトラメチルビピリジンＲｅ（［）　（４−エチル−ピ リジン）　（Ｃｏ、）”　ＣＦ、　ＳＯ，：およびｐｔ（２−（２−チェニル） ピリジン）ｔである。

存利なことに、金属含有ＥＣＬモイエティーは金属キレートである。そのキレー トの金属はこの発明による電気化学的刺激の結果として、可視光線のような電磁 放射を発するキレートである。このような金属キレートの金属は、例えば遷移金 属（周期率表のｄ−ブロックからの遷移金属のような）または希土類金属である 。その金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジ ウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム またはタングステン、またはランタン、ネオジム、プラセオジムまたはサマリウ ムである。とりわけ好ましい金属はルテニウムおよびオスミウムである。

金属とそのキレートで結合されるリガンドは通常天然の複素環式または有機化合 物で、そして金属キレートの放射波長の測定に、その金属キレートが水性環境に おいてもあるいは存機またはその他の非水性環境において可溶であっても、ひと つの役割を示す。リガンドは多座であってもよく置換体であってもよい。好適な 多座リガンドは芳香族および脂肪族リガンドを含む。このような芳香族多座リガ ンドは複素環式芳香族リガンドを含む。好ましい複素環式芳香族リガンドは、例 えば、ビピリジル、ビビラジル、ターピリジル、およびフエナントロリルのよう ゛な窒素含存物である。好適な置換基は、たとえばアルキル、置換アルキル、ア リール、置換アリール、アラリキル、置換アラリキル、カルボキシレート、カル ボキシアルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、 ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジン、ウレイド、 硫黄含有基、リン含有基、およびＮ−ヒドロキシサクシンイミドのカルボン酸エ ステルを含む。キレートは１またはそれより多い多座リガンドをもっことができ 、その多様性は当業者既知である。好適な単座リガンドは、例えば−酸化炭素、 シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化物、および脂肪族、芳香族および複素 環式ホスフィン、アミン、スチルベン、およびアルシンを含む。

好適なキレートの例はビス（（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリ ジン）２−　（３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）プロピル 〕−１，３〜ジオキソランルテニウム（■）；ビス（２，２’−ビピリジン）（ ４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム （■）：ビス（２，２’−ビピリジン）（４−（４’−メチル−２゜２′−ビピ リジン−４′−イル）−ブチル酸〕ルテニウム（ＩＩ）；　（２，２’−ビピリ ジン）〔ビス−ビス（１゜２−ジフェニルホスフィノ）エチレン）２−　（３− （４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル）−１，３−ジオ キソランオスミウム（ＩＩ）　：ビス（２，２’−ビピリジン）（４−（４’− メチル−２゜２′−ビピリジン）−ブチルアミン〕ルテニウム（■）；ビス（２ ，２’−ビピリジン）〔ｌ−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン −４−イル）ブタン〕ルテニウム（■）；およびビス（２，２’　−ヒビリジン ）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２゜２′−ビピリジン−４′〜ブチルア ミドルテニウムｉ）である。

この発明における金属含有ＥＣＬモイエティーの機能は、反応系中に電気化学的 エネルギを導入する結果としてｔｔｎ放射を出すことである。これを行うために 金属台１！ｒＥＣＬモイエティーは励起エネルギ状態に刺激されることができ、 更にまたその励起状態から下るときプロトン光のような電磁放射を出すことが可 能でなければならない。金属含有ＥＣＬモイエティーの役割の機構の理論的解析 に結ばれることは望まないが、ＥＣＬモイエティーが反応系への電気化学的エネ ルギの導入によって酸化され、その結果、強い還元剤を形成することができる種 から誘導される還元体との交互作用を通して励起状態に転換されると、我々は考 える。この状態は比較的不安定で、そして金属合作ＥｃＬモイエティーキレート はより安定な状態に急速に下る。そのような作用の中で、ＥＣＬモイエティーは プロトン光のような電磁放射を出す。

典型的には、分析操作において、金属合作ＥＣＬモイエティーは分析対象物また はその類似体に直接または、１またはそれより多い他の分子を介して結合する。

分析対象物の類似体、それは天然物であっても合成物であってもよいが、通常は 分析物に似た結合性をもつ化合物であり、しかしまたより高いかまたはより低い 結合能力の化合物でもあり得る。金属含有ＥＣＬモイエティーが分析物または前 述の類似体と】またはそれより多い他の分りより多い結合パートナ−および／ま たはｌあるいはそれより多い反応性成分である。この発明に用いて好適な結合パ ートナ−はよく知られている。その数例は抗体、酵素、核酸、コツアクタおよび レセプタである。分析物またはその類似体、および／または結合パートナ−と結 合できる反応性成分は、好適には第二抗体あるいは、タンパク質Ａまたはタンパ ク質Ｇのようなタンパク質、あるいはアビディンまたはビオチンまたは当業者既 知の結合反応に入るその他の成分である。

この発明に従ってとり入れられる金属キレートまたはその他の金属含有モイエテ ィーの量は系によって変る。

一般的に、使われるそのようなＥＣＬモイエティーの量は、その量が放射の検出 に有効な、そしてもし望むならば前述の組成物からの電磁放射の量の定量ができ る量でである。分析対象物の検出および／または定量は通常、（ｉ）ＥＣＬ組成 物により出される電磁放射の量または波長と（ｉｉ）分析対象物の濃度が既知の 時に出される電磁放射の量を示す、補正曲線の形式のようなデータとを比較する ことによりおこなわれる。これは勿論均質成分系を予定している。不均質成分系 においてはＥＣＬ分析に先立って前に検討したように分離がおこなわれる。

通常の習熟度の当業者により評価し得るように、金属含有ＥＣＬモイエティーの 本質と量は、支配的な条件により系ごとに異るであろう。望ましい結果を得るた めの適当な金属合作ＥＣＬモイエティー、およびその十分な量は、一旦ここに示 される教示を習得すれば過度の実験なしで通常の技術の当業者により実験的に決 定することができる。

より具体的な態様において、この発明による組成物は２またはそれより多い異っ たＥＣＬモイエティーを含む。

それぞれのＥＣＬモイエティーは他のひとつのまたは複数のモイエティーと異っ た波長の電磁照射を出すように誘導できる。この発明の別の実施態様においては 、ＥＣＬモイエティーは、他の単数または複数のモイエティーが放射を出すため に曝されるエネルギ値とは異った値のエネルギに曝すことにより電磁照射を出す ように誘導されるそれぞれの種であり得る。この方法により供試サンプル中に存 在し得る２またはそれよりも多い異った分析対象物を測定することができる。

この発明のもうひとつの重要な特徴は、高度の還元種に転換するため酸化するこ とができる種の利用である。

再度、反応機構の理論的説明に束縛されることは好まないが、カルボン酸のよう なこの種は反応系に存在する酸化された金属含有モイエティー（または他の酸化 された物質）により、あるいは電気化学的エネルギにより酸化すると考えられる 。−例として、種がシュウ酸塩の場合、それはＩｔ子を失い、ついでＣｏｔへ運 びラジカルイオンＣ０１−となり、後者は強い還元剤となる。この還元剤が酸化 された金属含有ＥＣＬモイエティーと相互作用をしてそれが上述の励起状態にな るようにさせる。この種から誘導された還元物が、酸化された金属合作ＥＣＬモ イエティーをその励起状態に転換するために必要な刺激をこのようにして提供し 、それから電磁放射が出される。

この発明の実施に使うことができる典型的な種のサンプルはカルボン酸である。

一般的に、種は分析中それが働かなければならない環境、即ち水性のまたは場合 によっては非水性の環境と調和すべきである。もうひとつの考慮は、選ばれた種 が支配的な条件において系内の酸化された金属含有ＥＣＬモイエティーを還元す るのに十分強力で、励起状態の形成に導くことができる還元物を形成しなければ ならないことである。

この発明において育利に使われるカルボン酸は次式をもつものである。

式中ＲはＣ，Ｈ□＋ｌ　ｌｃ＋＋　８１ｍ。１−アＸ、　、　Ｒ’Ｃ０ＯＨ。

Ｒ”ＣＯまたは Ｘは塩素、臭素、フッ素またはヨウ素、Ｒ１はＣ３Ｈ□またはＣＨＯ）ｌ　、　 Ｒ”はＣ＠　Ｈｔ＊＋＋；　Ｒ”　、Ｒ’およびＲｈは水素、Ｃ，Ｈ□、３、フ ェニル、または置換されたフェニル、Ｒ１，Ｒ４およびＲ′のそれぞれは同一か またはそのすべてが同一ではなく：ｎは０から２０；そしてｙは０から２ｎであ る。特に、ｎは２から１０であり得、更に特別にｎは４から６であり得る。

好適なカルボン酸の具体例はシュウ酸、マロン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸 、乳酸ピルビン酸および下式の酸である。（フェニルは任意に置換される）式中 Ｒ＠はＨ，ＣＨ＠　、またはフェニルである。シュウ酸（“シュウ酸塩”）は特 に好ましい。

前記カルボン酸のエステルもまたこの発明のある態様の実施に好適である。

この発明により強い還元剤を形成することができる種は１から７の範囲のｐＨに おいて好適に、若干の態様では２−６の範囲のｐＨで、そしである態様において は３−６の範囲のｐＨで好適に働く。シュウ酸はｐＨ３−５で最良の結果を与え る。

通常、この発明で使われる金属含有ＥＣＬモイエティーは反応制限成分である。

従って、強い還元剤を形成する種は通常ＥＣＬモイエティーに対し化学量論的に 過剰に与えられる。たとえば、そのような種は５−２００ｍＭの濃度で、より特 定の場合は５−５０ｍＭで更に特定の場合は２５−４０ｍＭの濃度で与えられる 。一般的に、強い還元剤を形成するのに使われる種の量は、酸化された金属含有 ＥＣＬモイエティーを励起状態に転換するのに十分な量で、そのようにして電磁 放射が生じる。

ここに記載の教示を習得した通常の習熟度の当業者は、分析される特定の系に使 われる前述の種の本質および／または量を、過剰な実験なしで実験的に決定する ことができる。

その物質が存在するときに出された電磁放射が増加する物質は通常下式の化合物 である。

式中Ｒは水素またはＣ，Ｈｏ、ｌ、Ｒ’はＣ，Ｈ，、、Ｘは０から７０でｎは１ から２０である。好ましくはｎは１から４である。具体例はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ− １００の名で市販されている下式の物質、 およびＴｒｉｏｎ　Ｎ−４０１（ＮＰＥ−４０）で市販されている下式の物質で ある。

式中Ｘは４０ この物質は一般的にその存在が所望の放射の増加をひき起すのに十分な量で使わ れる。通常その量は０．０１％から５．０％、より具体的には０．１％から１． ０％Ｖ／Ｖである。

既に述べたように、この発明に従ってとり入れられたＥＣＬモイエティーはそれ を励起状態に刺激することにより電磁放射を出すように導かれる。これはＥＣＬ モイエティーがとり入れられた組成物を電気化学的エネルギに曝すことにより達 成される。ＥＣＬモイエティーの酸化がおこるポテンシャルはその化学的構造に よるとともに、系のｐＨおよび電気化学的エネルギの導入に使われる電極の性質 のようなファクタによる。ＥＣＬ系に対する最適ポテンシャルと溶液条件の決定 方法は通常の習熟度の当業者周知である。

勿論、その中に電極が電気化学的エネルギを導入するシステムを操作するために は、電極が浸漬される電解質を用意し、ＥＣＬモイエティー、還元剤が誘導され る種、およびその存在により放射が増加する物質を加えることが必要である。電 解質はそれを通して電荷がイオンにより運ばれる泪である。

一般的に、電解質は液体で、そして１またはそれより多い塩または他の種の水の 、有機物の液の、または水と有機液の混合物の溶液である。しかし、他の形態の 電解質もまた、この発明のある態様においては有用である。

たとえば、電解質は１またはそれより多い物質の流体−たとえば、液、蒸気、ま たは超臨界流体−中の分散物であってもよく、または１またはそれより多い物質 の蒸気、固体または超臨界流体中の溶液であってもよい。

上記の超臨界流体はその臨界温度、即ちそれより高い温度ではいかなる圧力でも 液化することができない温度以上に保たれるデンスガスである。超臨界流体は低 い粘度で、液体より容易に拡散する。この発明の実施に有用な超臨界流体の例は 二酸化炭素、およびメタン、エタンおよびプロパンのようなアルカンである。超 臨界挙動を示す条件は当業者既知である。たとえばＳｍ１ｔｈ、米国特許４．５ ８２，７３１．１９８６年４月１５日許可を参照。

超臨界流体の利用は利益があり得る。たとえばこの発明のある態様においては各 種分析対象物の溶解度が超臨界溶液中において増加することが可能である。更に 、強い還元剤か誘導されるＥＣＬモイエティーおよび種の溶解度を、若干の態様 において超臨界流体中でより容易にコントロールすることができる。更に、いく つかのケースに、これらの流体中ではさまざまな種の拡散係数がより高いので感 度を改善することができる。

水溶液であるこの発明による組成物においては、電解質は水溶液、たとえば水の 中の塩の溶液である。塩は好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩であり得る が、カチオンがＥＣＬの相互作用シーケンスを妨げない限りある態様においては 他のカチオンをとり入れることもまた好適である。塩のアニオンはたとえばリン 酸であり得るが他のアニオンの使用もまたこの発明のある態様においては、−や はり選ばれたアニオンがＥＣＬ相互作用シーケンスを妨げない限り、許容される 。

組成物はまた非水性のこともあり得る。超臨界流体、蒸気および固体がある場合 に有利に使うことができるので、非水性組成物中に有機液体を含む電解質を使う ことがより一層通常である。水性電解質のように、非水性電解質もまた電荷がそ れを通してイオンにより運ばれる相である。普通は、これは塩が有機液媒体に溶 解することを意味する。好適な有機液体の例はアセトニトリル、トルエン、ジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、ジメチルホルムアミドＣＤＭＰ）　、メタノ ール、エタノール、および上述の２またはより多くの混合物である。たとえば、 テトラブチルアンモニウムテトラフルオロボラートのようなテトラアルキルアン モニウム塩は有機液体に可溶で、それと共に非水性電解質をつくるのに使うこと ができる。

この発明のある態様においては電解質はバッファ系である。リン酸塩バッファは しばしば有利である。例はすン酸ナトリウム／塩化ナトリウムの水溶液、および リン酸ナトリウム／フッ化ナトリウムの水溶液である。

バッファ系を含む電解質の処方、およびこの発明の実施に使われる電解質の好適 な量の決定は、一旦実施者がここに与えられる教示を習得すれば当業者の技術の 範囲である。

この発明における前述の材料を使えば、実施者はこの発明の態様の方法によるＥ ＣＬ組成物から電磁放射を出させるようにすることができるようになる。

広い観点においては、ごの発明の方法は既に述べたようにＥＣＬ組成物からの電 磁放射の生起である。

これは、ｌまたはそれより多い金属含有ＥＣＬモイエティー、強い還元剤が誘導 される１またはそれより多い種、その存在によりそれが出す電磁投射が増加する ｌまたはそれより多い物質、および適合性の電解質の組み合わせにより達成され 、その中に電気化学的エネルギが導入されてその結果電磁投射が出される組成物 が形成される。その組成物はその組成物が電磁投射を出すように誘導するのに作 動な量の電気化学的エネルギをうける。

組成物中のＥＣＬモイエティーの励起状態と我々が言うような、組成物が電磁投 射を出すように誘導することにより、励起したＥＣＬモイエティーか電磁投射− たとえば室温において約２００ｎｍから約９００ｎｍの波長の発光−を放出する 。この励起状態はＥＣＬモイエティーをモイエティーの酸化が起るポテンシャル はその化学的構造と共に組成物のｐＨや使われる電極め性質のような諸ファクタ による。〜旦ＥＣＬモイエティーが励起されると、それは前述の強い還元物との 相互作用により電磁投射を出す。ＥＣＬ組成物に対する最適のポテンシャルおよ び放射波長は、ここに示される教示を一旦習得するれば当業者の通常の技術の範 囲である。励起状態から下るとき１：　Ｅ　ＣＬモイエティーにより出される電 磁投射の量は存在する分析物の量の指標として直接測定することができる。

あるいは、ＥＣＬモイエティーそれ自体による電磁放射より、むしろ、ＥＣＬモ イエティーがその励起状態から下るときに出される電磁放射が、測定される検出 し得る事象（または結局は検出し得る事象になる連続のステップ中のひとつのス テップ）を誘発するために利用することか可能である。

ＥＣＬ組成物により出される放射は、分析対象物の定性的または定量的測定を可 能にするために好適な手段を用いて検出される。

この測定は連続速度ベース測定としても、または長時間に亘るＥＣＬシグナルの 蓄積としてもおこなうことができる。たとえば、速度ベース測定は光電子増幅管 、光ダイオード、または光トランジスタを用い入射光線に比例する大きさの電流 を生成することにより、または電荷転送素子を使うことによりおこなわれるのに 対し、蓄積法の例は速度ベースデータの積分、および蓄積データを直接提供する 写真フィルムの使用である。

組成物は所望のｐＨ，ＥＣＬモイエティーの濃度、強い還元物が誘導される種の 濃度、その存在により出る放射が増加する物質の濃度、および電解質を得るため に処方される。これに関し、前述の金属含有ＥＣＬモイエティー、強い還元剤が 誘導される種、物質および電解質、その組成物におけるそれらの好適なそして好 ましい量および濃度は、ここの別のところに記載される。

その組成物は個々の成分の組み合わせによりつくられる。しかし、組成物がつく られるさまざまな物質の組み合わせを含むｌまたはそれより多い試薬を使うこと がしばしばより宥和である。この方法はこの発明により処方された組成物の均一 性を維持するのに役立ち、この発明の実施により達成される信頼性と再現性に寄 与する。

従って、組成物の処方に好適な試薬は、その存在により出される放射が増加する 物質、金属含有ＥＣＬモイエティー、還元剤形成種、および電解質のいずれかｌ またはそれより多い組み合わせを含むことができる。選ばれる試薬はいずれも組 成物を処方するために必要な成分のバランスと組み合わすことができる。ｌまた はそれより多いそれらの成分は別の試薬の中に含むこともできる。

たとえば、前述の物質、金属含有ＥＣＬモイエティーおよび電解質を組み合わせ で含む試薬は、前述の物質、還元物形成種および電解質を含む別の試薬と組み合 わせて混合し所望の組成物をつくることができる。

組成物の形成は、処方ステップに必要なｌまたはそれすることができる。このよ うに総合キットは（ｉ）金属合作ＥＣＬモイエティー、（ｉｉ）還元物形成種、 （ｉｉｉ）　’ＩＩＬ解質および（ｉｖ）その存在により出される放射が増加す る物質を含み、そのすべては前記の通りである。組成物の処方にキットの形で使 われるパッケージ成分の魅力的な特る標準化成分が、この発明の実施の信頼性と 再現性を改善するために採用できることである。試剤および他の材料をキットの 形で使うことは、使われるキットフォーマットは起るかもしれないどのような劣 化も防止し得るように組み合わせを構成することができるので、使用前の成分の 劣化の可能性が最小限になる点において更に宥和である。

従って、組成物は、金属合作ＥＣＬモイエティー、還元物形成種、電解質および 前述の物質からなるグループの２または３のメンバーのいずれかを第一の分離成 分中に含むことができ、そしてそのグループ中の残りの単数または複数のメンバ ーが第二の分離成分に、または複数の異った成分に含まれるひとつのキットから 処方することができる。（キットの成分は通常組み合わせる前の相互汚染を除く ようにそれぞれそれ自体のバイアル中に分ループの２または３のメンバーのいず れかを含む第一の分離成分、およびグループの残りのメンバーと第一グループに 含まれるｌまたはそれより多いメンバーを含む第二の分離成分で構成される。更 に別の案は、ひとつのキットが４の分離成分で構成され、それぞれは前記４つの グループメンバーの異ったｌを含む。面別のフォーマットにおいては、第一の分 離成分はグループの４メンバーのすべてを含み、そしてそのグループのメンバー の１゜２または３のいずれかを含む第二の分離成分でキットを構成することがで きる。そのキットは任意に４グループメンバーのひとつを含む第二の成分を含み 、更に１．　２または３（好ましくは２）のグループメンバーを含む第三の分離 成分およびｌまたは２のグループメンバーを含む第四の分離成分を含む。

有利な態様において、より具体的には、キットの第一分離成分は金属含有ＥＣＬ モイエティーを含み、第二分離成分は還元物形成種、電解質、およびその存在に より出される放射が増加する物質を含む。

上述のようにこの発明による電磁放射エネルギの放出は、組成物を前述のように そのような放出を誘導するために有効な量の電気化学的エネルギに曝すことによ りもたらされる。有利なことに、その放出は組成物、即ちここでは金属含有ＥＣ Ｌモイエティーを、ポルタンメトリックに働く電極に曝すことにより誘導される 。従って、ＥｄＬ反応性混合物は、所望の光または他の電磁放射の生成をもたら すのに有効な特定の時間特定の方法により、作動する電極に加えられた電圧によ り、光または電磁放射を放出するように誘発が制御される。必要な電圧は通常の 習熟度の当業者がここにおける教示を習得することにより、過度の実験なしで実 験的に導きだすことができる。

この発明の方法は図１および２に示されるこの発明を実施するのに好適な装置を 検討することにより更に詳しく説明される。

図１は電気化学発光を生成する有利な装置を開示する。

しかし、この発明の方法は装置ｌＯの適用に制限されず、むしろ電気化学発光を 誘発する電気化学的エネルギを与える作動電極またはその他のトリガー表面を含 む他のタイプの装置を使うことができる。この発明の方法は静的または流通モー ドでおこなうことができるが、装ｆｌｉ。

は流通セルであり、それは多（の型のＥＣＬ操作、たとえば結合（ｂｉｎｄｉｎ ｇ）分析サンプルを含む多くのサンプルのとり扱いに明らかな利益を与える。

装置１０は電気化学セル１２、光検出／測定装ｆｉ１４、それは好ましくは光増 幅管（ＰＭＴ）　、光ダイオード、電荷転送素子、写真フィルムまたはエマルシ ョンまたはその他であることができ、そして流体をセル１２へ、または１２を通 しおよび１２から移送する、好ましくはぜん動ボンであるポンプ１６を含む。そ れにかえて、陽圧ディスプレースメントボンブを使うことができる。シャッタ機 構１８はセルＩ２とＰＭＴｌ　４との間に設けられ、電気化学発光の測定時間中 ＰＭＴ１４をセル１２に曝している限り開くように制御される。シャッタ機構は たとえば保全中は閉じることができる。図１に示されないが（簡略化と明瞭化の 目的で）装置ｌＯに含まれるものは、好ましくは光遮蔽ハウジングで、その中に おける装置の諸要素は電気化学発光の測定中外部光のいずれからもＰＭＴ　１４ をシールドすることができる。

セル１２はそれ自体第一マウンティングブロック２０を含み入口管２２および出 口管２４がそれを通り、有利にステンレス鋼でつくられている。マウンティング ブロック２０は第一外側面２６とサンプル保持容積３０の一側を区画する第二の 内側面２８をもち、その中でセル１２は清浄および／または調整および／または 測定溶液を装置１０の操作に対応してその時間保持する。入口および出口管２２ ．２４はマウンティングブロック２０を外面２６から内面２８に通りサンプル保 持容積３０に通じる。第二マウンティングブロック３２は、有利にステンレス鋼 でつくられやはり第一外面３４および第二内面３６をもつ。第二マウンティング ブロック３２は第一マウンティングブロック２０から、有利にテフロンまたはそ の他の非汚染性材料でつくられた環状スペーサ３８で隔てられている。このよう にしてマウンティングブロック２０の外面３４はサンプル保持容積３０の第二サ イドの部分を区画している。スペーサ３８はサンプル保持容積３０の側壁を区画 する外側部分４０および中央開口部４２、内部エツジ４４をもつ。外側部分４０ は第一マウンティングブロック２０の内面２８を第二マウンティングブロック３ ２の外面３４に対し、サンプル保持容積３０から２面２８．３４を通して如何な る溶液も通さないようにシールする。マウンティングブロック３２は更に中央開 口部４６をもち、その中に窓４８がシールフィツトされ、サンプル保持容積３０ の第二サイドの残りを外面３４と連続して区画している。窓４８はサンプル保持 容積３０中の系により発生されるＥＣＬ光の波長を実質的に透過する材料で形成 される。従って官４８は好ましくはガラス、プラスチック、石英またはその類似 物で形成される。

入口管２２はサンプル保持容積３０とスペーサ３８に隣接するその第一端部５０ で交差し、出口管２４はサンプル保持容積３０とスペーサ３８に隣接するその第 二端部　５２で交差する。入口管２２、サンプル保持容積３０および出口管２４ はそれにより溶液の細い、実質的に層流かセル１２へ、セル１２を通しそしてセ ル】２から流れる連続流径路を提供する。

第一マウンティングブロック２０の内面２８に装着されているのは実施態様に示 されるような第一および第二作動電極５６および５８を含む作動電極システム５ ４である。他の実質態様においては単一作動電極が有利に与えられることもあり 、または電極５６だけか作動電極であることもある。作動電極５６．５８は対象 物の電気化学的およびＥＣＬ反応がおこるところにある。作動電極５６．５８は 固体ボルタ電極でありそのため白金、金、炭素またはこの目的に対し有効な他の 材料で有利につくることができる。作動電極５６．５８にそれぞれ接続された接 続線６０．６２は第一マウンティングブロック２０を通って外へ出る。

接続線６０．６２は共に図２に示される電圧制御器６６の第一の“作動電極”端 子６４に接続される。電圧制御器６６はポテンショスタットの方法で作動電極５ ６゜５８に電圧信号を供給するために、および任意に電気化学発光を測定する間 それから流れる電流を測定するために有利に操作される。あるいは、接続子６０ ．６２は電圧制御器６６の個別操作のための別の端子に接続されてもよい。

電圧制御器６６のポテンショスタット操作は反対電極６８および、任意にかつ有 利に、参照電極７０を通して更に作用する。示された実施態様においては塔載ブ ロック３２はステンレス鋼でつくられ、反対電極６８は塔載ブロック３２の露出 面７２．７４を構成する。反対電極７２．７４および作動電極５６．５８は対象 反応物にエネルギを与えそしてサンプル中の電気化学発光を誘発するボテンシア ルをサンプル保持容積３０内の溶液に与える境界面を提供し、および／またはセ ル１２の面を清浄にし調整するエネルギを与える。反対電極７２．７４は接続線 ７６により電圧制御器６６の第二“反対電極”端子７８に接続される。

参照電極７０は、それに対し作動電極５６．５８により加えられた電圧が、たと えば参照に対し＋１．２ボルトと参照される参照電圧を与える。参照電極７０は 出口管２４中のセル１２から離れた位置８０におかれ、接続線８２により電圧制 御器６６の第三“参照電極”端子８４に接続される。３つの電極モードにおいて 、電流は参照電極７０を通して流れない。参照電極７０は釣合い（ｐｏｉｓｅｄ ）　、既知および安定電圧を与える３つの電極操作モードで使うことができ、そ のため銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣ１）でつくられまたは飽和甘木電極（ＳＣＥ） である。

電圧制御器６６もまた単一の作動電極５６と反対／参照電極として電極５８とを 用いる２つの電極モードで操作することができる。この２電極モードの操作にお いては、反対／参照電極５８は電圧制御器６６の電圧制御端子７８および８４に 電気的に接続される。この場合、電圧制御器６６は実質的に電池として働く。電 圧制御器６６は電圧信号を作動および反対電極５６および５８に与え、任意にそ れぞれの電極を通して流れる電流を測定する。

参照電極７０は代りに白金、金、ステンレス鋼また他の材料でつくられるいわゆ る“準参照”電極でもよく、それは安定度の小さい電圧を提供するが、接触する 溶液の測定を可能にする。２および３電極モードの両者において１．参照電極７ ０または５８は参照を提供する目的に役立ち、それに対し作動電極に加えられた 電圧が測定される。釣合い電圧参照は一般により有利と考えられている。

そのポテンショスタット操作における電圧制御器６６は参照電極７０に対する作 動電極５６．５８において既知の電圧を加えることにより各種電極を制御し、そ の間作動電極５６．５８と反対電極７２．７４との間の電流を測定する。この目 的のためのポテンショスタットは周知で、従って電圧制御器６６の内部構造は上 記機能を生成する通常の市販ポテンショスタットのいずれにも好適に対応し、そ のためそれ自体ではこの発明の一部を形成しない。実際に、装置ｌＯは上と異り 内部電圧制御器６６なしで構成されることもでき、電極５６．　５８．　７２゜ ７４および７０に対し所望の電圧信号を与えるために別々に制御される外部ポテ ンショスタットに接続するのに適合することができる。下記のように特定の問題 に適用されるこれらの電圧信号は、作動電極５６．５８の表面に反復性の初期条 件を与えそしてセル１２の表面に全体として有利に、電気化学発光を測定するプ ロセスを改善するために有意に寄与する特徴を与える。

ポンプ１６は出口２４においてサンプル容積から入口管２２へ矢印Ａの方向に溶 液を”引（”ように位置する。

溶液は入口管２２、サンプル保持容積３０および出口管２４に向って流れ、参照 電極７０を径て矢印Ｂの方向に出る。あるいは、ポンプ１６は入口２２に位置し 溶液を装置ｌＯを通して“押し”でもよい。好都合に、入口管２２、サンプル保 持容積３０および出口管２４を通るこの同一の流れ径路はセルを通るすべての溶 液と流体に使われるので、各流体は前の流体をセル１２の外に強制流出させる流 体力学的清浄化作用を演じる。ポンプ１６は特定の溶液をどのような時間でもセ ル１２内に保持するようにその操作を一時停止するよう制御し得る。

装置ｌＯの流通構造は、変動電圧が加えられる作動電極を操作前のポテンシャル に連続して保ち、その間作動電極５６．５８（または反対電極および参考電極７ ２゜７４．７０）を空気に曝すことなしに連続して！またはそれより多い溶液に 曝すことを可能にする。空気への曝露は、その間参照電極７０への回路を開き、 未知の不規則な電圧変動を許し作動電極５６．５８上の表面条件の再現性を破壊 する。流通構造は電極システム５４が清浄であり調整されている出発ステップと 、１またはそれより多い測定波形または掃引（ｓｗｅｅｐ）が電気化学発光を誘 発する測定ステップとの速い変換を許容する。

前に記したことから、この発明による金属含有ＥＣＬモイエティー、還元物形成 種、電解質およびその存在により出される放射が増加する物質が、セル１２内に 導入され、前述のシステム（または当業界の通常の習熟度をもつものがこの教示 を習得したとき容易に誘導できる他の好適なシステム）の１またはそれより多い 電極に好適な電圧を有利に加えることにより電気化学的エネルギに曝すことによ り所望の電気化学発光が誘導されることば明らかである。

問題の反応系により出される光または他の電磁放射の量は分析物の有無を示し、 もしそれがあるときはその量を示す。このように分析対象物に関するサンプルの 定性および定量分析が可能である。これと関連して出された電磁放射が光である ときはその放出はコンピュータ、たとえばパーソナルコンピュータに接続される フォトメータにより検出することができる。そのコンピュータにおいて、フォト メータから受けとった信号は加工されそして、たとえばスクリーンに表示される かアナログ変換を径で適当な記録紙に出力される。

この発明の主要な応用は与えられたサンプル中の分析対象物をＥＣＬ分析により 検出または定量することである。既にここに言及したように、この発明のＥＣＬ 反応を含む結合分析は異ったフォーマットで行うことができる。

第一の実施態様において、実施者が分析対象物の有無を調査することを要求する サンプルは、存在するＥＣＬモイエティーが直接または！またはそれより多い他 の分子を介して分析対象物またはその類似体に結合しない比較サンプルから得ら れる放射と比較して電磁放射の放出が変化（減少または増加）するかどうかを測 定することにより直接評価される。第二の実施態様においては、検出および、も し分析対象物か存在する場合はその定量は、この発明によりサンプルからＥＣＬ 組成物を調合するために必要なすべてのステップをとり、その組成物をこの発明 による電気化学的エネルギに曝し、ついで出された電磁放射の量を分析対象物の さまざまな既知の量を含む系から出される電磁放射と比較することにより達成さ れる。調整されるサンプルからの放射の適当な変化が分析物の存在および量を知 らせる。

この発明の方法は各種分析フォーマットに取り入れることができる。このように この発明は均一系または不均一系分析フォーマットに使うことができ、そして、 正および逆分析（ｆｏｒｗａｒｄ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ ）　、競合分析、免疫分析、サンドイッチ分析、および雑種選別分析（ｈｙｂｒ ｉｄｏｍａ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む当業界既知のすべ ての分析法に使うことができる。

通常に諌渡された米国出願シリアルＮｏ、２６６．８８２、表題“電気化学発光 分析”、発明者５ｈａｈ　、　Ｈａｌｌ　。

Ｐｏｗｅ　Ｉ　ＩおよびＭａｓｓｅｙ　（ＣＭＳ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、３７０ ０８８−２３９０）、これと同日提出、に記載のように、ここに開示の分析の実 施においては分析組成物または系に粒子をとり入れることが望ましい。粒子との そのような組成物の結合、それは順次ＥＣＬモイエティーに結合されるが、はＥ ＣＬモイエティーにより生成されるＥＣＬ信号の強さを大巾に和らげ、それによ り分析組成物または系の特定の結合反応をモニターする方法を提供する。更にこ の論題に関する情報は上記出願に発表され、その主題はそこに参考としてとり入 れられている。

例えば、この発明により提供される均一系結合分析の有用なりラスは分析対象物 を含むＥＣＬモイエティーの溶液を電極に曝すことを含む。電極の表面への近接 を得ることができないＥＣＬモイエティーは検出されないであろう。これはたと えばもしＥＣＬモイエティーが電極がおかれる反応容器の表面に直接または間接 に結合される場合、もしくはＥＣＬモイエティーが抗体−抗原錯体の内部のよう な特定の錯体の内部に深く埋められる場合、または電極それ自体が、εＣＬモイ エティーがそれを通って通過することができるが分析対象物またはその類似体に 結合（直接または間接に）したＥＣＬモイエティーは通過し得ない層で被覆され る場合は、起る可能性がある。更に、電極の表面を抗体で被覆することにより、 直接または１またはそれより多い分子を介してεＣＬモイエティーに結合しそし て不動の抗体に結合した抗原のみが電極に近接することができそれにより測定が 可能となるであろう。

競合結合法はこの発明により分析対象物の存在を測定するのに使うことができる 。通常分析物とＥＣＬモイエティーとは競合的に化学材料および生物学材料に結 合する。

材料は好適な組成物を形成するために好適な条件下でＥＣＬモイエティーおよび 分析物と接触する。ＥＣＬモイエティーは組成物を電気化学的エネルギに曝すこ とにより電磁投射を出すように誘導される。分析対象物の存在は組成物により出 される電磁投射の量を検出することにより測定される。

競合結合分析において、直接または１またはそれより多い他の分子を介してεＣ Ｌモイエティーに結合される分析対象物およびその類似体は、たとえば全細胞、 準細胞粒子、核酸、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リボ 多糖類、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬剤、トランキライ ザ、精神安定剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖および非 生物学的ポリマーのような補足的材料と特定の錯体を形成するのに寄与すること ができるいずれの物質でもあり得る。特に抗体−抗原ベース法が興味がある。

これらの方法は周知の放射免疫分析に類似し、そこでは分析対象物は抗体から分 析物の放射性類似体に置き換るときに検出される。当業者既知の放射免疫分析に 関する多くの変形が、この発明によるＥＣＬモイエティーを放射性のラベルをし た化合物の位置に有利に使うことが原理的に可能である。

この発明はまた競合フォーマットに用いられる結合分析に使うこともでき、ここ ではＥＣＬモイエティーは直接あるいは１またはそれより多い他の分子を介して 加えられた分析対象物に結合する。結合パートナはＥＣＬモイエティーに結合す る分析対象物あるいは加えられた分析対象物と特に結合か可能である。分析対象 物および加えられた分析対象物は抗原が好適である。

あるいは、結合パートナは分析対象物の第一の結合パートナである。分析サンプ ルは直接あるいは１またはそれより多い他の分子を介して加えられた分析対象物 と結合したεＣＬモイエティーを含む。結合パートナはサンプル中の好適な粒子 と結合され、その粒子は従って特にＥＣＬモイエティーと結合した分析対象物ま たは加えられた分析対象物と結合可能である。ここでもまた、分析対象物および 加えられた分析対象物は通常抗原である。

この発明は免疫フォーマットにおいても使うことができる。ＥＣＬモイエティー は分析対象物の結合パートナと結合する。分析物またはその類似体は表面で結合 するので表面は特に結合パートナとの結合が可能である。その表面は粒子、膜、 ストリップ、管等の表面でよい。分析対象物は抗原であってよい。

あるいは、結合パートナは分析対象物の第一結合パートナである。第一結合パー トナの結合パートナはＥＣＬモイエティーに結合する物質である。分析物または その類似体は表面に結合し、従ってその表面は特に第一結合パートナと結合可能 である。ＥＣＬモイエティーに結合する第二結合パートナは特に第一結合パート ナを結合する。

分析対象物は通常抗原である。

この発明はたとえばサンドイッチ分析においても使うことかできる。分析対象物 は抗原であってよい。ＥＣＬモイエティーに結合する物質は分析対象物の結合パ ートナである。ＥＣＬモイエティーに結合しない結合パートナは表面に結合する ので表面は分析対象物と結合可能である。

あるいは、結合パートナは分析対象物の第一結合パートナ（ＢＰ−１）であり得 る。第一結合パートナの第二結合パートナはＥＣＬモイエティーに結合した物質 である。

分析対象物は抗原であってよい。第二結合パートナにより認められない他の第一 結合パートナ（ＢＰ−２）は表面に結合されるので、その表面は分析対象物と結 合可能である。表面と第一結合パートナ（ＢＰ−１）とは特に抗原と結合可能で あり、ＥＣＬモイエティーと結合した第二結合パートナは特に第一結合パートナ （ＢＰ−１）と結合可能である。また、結合パートナは分析対象物の第一結合パ ートナ（ＢＰ−１）であることも可能である。

ＢＰ−１はＥＣＬモイエティーに結合される。ＢＰ−１と異りそして分析対象物 を結合する他の第一結合パートナ（ＢＰ−１’）が用いられる。第一結合パート ナＢＰ−１′の第二結合パートナは表面に結合するので、その表面は分析物ＢＰ −１とＢＰ−１’との錯体を結合することができる。

この発明の方法は雑種選別分析に用いる非分離結合分析に有利に使われる。分析 対象物は特定の抗原に対し作用したモノクローナル抗体である。分析対象物の結 合パートナはＥＣＬモイエティーに結合される。抗原は表面に結合されるので、 その表面は特に分析物と結合可能である。モノクローナル抗体は特に表面と結合 し、そしてＥＣＬモイエティーの部分である結合パートナはモノクローナル抗体 を結合する。

都合のよいことに、モノクローナル抗体を特に結合することができるＥＣＬＣイ モイエティー中合パートナはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、タンパ ク質Ａ、またはタンパク質Ｇである。更に、その結合パートナはビオチン変性分 析物または結合パートナに結合可能なアビディンであり得る。

あるいは、結合パートナは分析対象物の第一結合パートナである。第−結合パー トナの結合パートナはＥＣＬモイエティーに結合される。分析対象物は抗原に作 用したモノクローナル抗体である。抗原は表面に結合されるので、その表面は特 にモノクローナル抗体と結合可能である。モノクローナル抗体は特にその表面と 結合し、第一結合パートナは特にそのモノクローナル抗体と結合し、ＥＣＬＣイ モイエティー中二結合パートナは特にその第−結合パートナと結合する。

この発明は更に以下の実施例において記載され説明さ電気化学発光測定か以下の 装置を用いておこなわれたセルが小さいサンプル試験管とサンプルに漬けること ができる電極とでつくられた。低い位置で、サンプルを入れた小試験管の上に光 の遮断シールを形成する化学発光試薬添加アームを持つＢｅｒｔｈｏｌｄルミノ メータ（モデルＬＢ９５００Ｔ、１３７５ポルトにおけるＨａｍａｍａｔｓｕ　 Ｒ３７４光増幅管（ＰＭＴ）を装備）が集光のために光増幅管（ＰＵＴ）の前に おかれた。試薬添加アームは電極およびポテンショスタット（Ｐｒｉｎｃｅｔｏ ｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ−モデルＰＡＲｌ　７３ポテンシヨスタ ツトおよびＰＡＲ１７５万能プログラマ−）への電極接続線を保持するように改 造された。そのポテンショスタットはこのアームが下げられたときサンプル溶液 に浸漬される。電極は約２ｍｍの間隔をもつ２つの平行白金網電極（幾何学的面 積ＩＣ１）で構成された。おかれたとき両電極はＰＭＴに平行に面し、ＰＭＴに 最も近いひとつは“作動電極”で他は　“反対電極”を形成した。“参照電極” として役立つ銀の線が２つの白金網の間におかれた。

材料 一トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムクロリドへキサヒドラ−）　（Ａ ｌｄｒｉｃｈ　、Ｃａｔ、　Ｎｏ、２２４７５−８）が水に溶解され１ｍＭ溶液 を得た。（“ＴＡＧ溶液”）。

−結晶シュウ酸（Ｓｊｇｍａ　Ｏ−０５０５）が水に溶かされ１Ｍ溶液を得た。

−リン酸塩緩衝液（０，１０Ｍ、　ｐＨ６，０）。

−Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　−１００（Ｓｉｇｍａ　Ｔ　−６８７８）。

手順 約１ｍｌのサンプルを含む管が改造Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメータにおかれた。

電極を保持したアームが完全に下げられ、電極はサンプル溶液に浸された。電気 化学発光が＋０．７Ｖから＋１．３　Ｖのスィーブ電圧がＩＯｍＶ／秒で加えら れたポテンショスタットにより誘発された。すべての電圧は銀参照電極に対し参 照された。発生した光子はＢｅｒｔｈｏｌｄ装置に３０秒間集積された。それぞ れ測定後、電極は除かれ、水でゆすがれ、Ｋｉｍｗｉｐｅで拭い乾燥され、次の サンプル測定のために改造アームにおかれた。

０．９＋ｓｌのリン酸塩緩衝液が（１２ｘ７５ｍｍ）プラスチック管（Ｂｅｒｔ ｈｏｌｄ管）にピペットで入れられた。ついでひとつのケースにおいて２０μｌ の１Ｍシュウ酸が更に加えられた。別のケースでは２０μｍの１Ｍシュウ酸と１ ０＋ａｌの１ｍＭ　ＴＡＧ溶液が加えられた。更に別のケースでは２０μｍの１ Ｍシュウ酸、ｌＯμｌの１ｍＭＴＡＧ溶液およびｌ０ＺＺＩのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ 　−１００が加えられた。

電気化学発光が各組み合わせについて上記のように測定結果は下表に示される。

緩衝液、シュウ酸　１６．０００：１６．５００カウントＴＡＧ溶液 緩衝液、シュウ酸　６６１．０００：５７９．　ｏｏｏカウンＴＡＧ溶液、　ト Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００ 実施例２ 追加の電気化学発光の測定が図１に示す装置により実施された。

材料 強い還元剤の前駆物質およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含む緩衝液が１５． ５９９ｇのＮａＨ，ＰＯ，と３．１２　ｇのシュウ酸を約９００ａ＋１の脱イオ ン水に溶解することにより調製された。ｐＨは５０％ＮａＯＨを滴下することに より４．０に調整された。ついで１０ｍ１のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００と蒸留 水とが加えられ、０．１Ｍリン酸塩、４０ｍＭのシュウ酸塩および１．０％（ｖ ／ｖ　）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００の、１００ｍ１の溶液（ｐＨ４，０）が 得られた。

下記の標準溶液が１１００ｎのトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムクロ リドへキサヒトラード（“ＴＡＧ”）のストック溶液から蒸留により調製された 。

ａ、ＩｏＯｐＭ ｂ、１．ＯｎＭ　 ｃ、１０．　ＯｎＭ 手順（ポルタモグラムおよび放射プロフィル）図１に関し記載された流通システ ムを用いて、電気化学発光の測定が下記手順でおこなわれた。

ａ、　緩衝液を導入しポテンシャルを１．　Ｉ　Ｖとした。

ｂ、０．５　ｍｌのサンプを導入した。

ｃ、１．ＩＶから２．５ｖに電圧をスィーブした。

（この間ポルタモグラムおよび電気化学発光は記録され）、そしてライで−１， ＯＶ　１．：、そしｒｌ、ＩＶ（１００ｍＶ／秒）にした。

結果 電気化学発光が読まれ結果は表Ｕに示される。

１１００ｐ　ｌｎＭ　１０ｎＭ 背景　ＴＡＧ　ＴＡＧ　ＴＡＧ （スィーブ間のカウント数−繰り返し）１００ｐＭ　１ｎＭ　ＩＯｎＭ 背景　ＴＡＧ　ＴＡＧ　ＴＡＧ 平均　＋６．０　３３．３　１８６．０　＋７０６．０標準偏差　０．７　＋、 ＋　１．４　８．９変動係数　４．４　３．２　０．８０．５％　（ＣＶ） 表Ｕの下半分に示される繰り返しの読みからの５点の平均を用い補正曲線が図３ に示されるようにつくられた。

得られた直線は式ｙ＝１７±１６８．９ｘにより書かれ、勾配は横座標の係数、 即ち１６８．９である。検出限界（ＤＬ）は下式により計算された。

ＤＬ＝Ｃｍｉｎ　ＴＡＧ＝２．５％ＣＶ　Ｉ　ＩＬ／　１００Ｒ式中Ｃｍ１ｎ　 ＴＡＧはＴＡＧ　（ここでは、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムクロ リドへキサヒトラード）の最低濃度、％Ｃ■はパーセント変動係数、ＦＩＬはブ ランク（背景）の強さ、モしてＲは補正曲線の勾配である。上式の各係数に数値 を代入して検出限界が約１０．４　ｐＭと計算された。この検出限界が文献（１ ０，０００ｐＭ；Ｅｇｅ。

Ｄｏ、ら、Ｊ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、１９８４．　５６．　２４１３）に報 告された検出限界より１０００倍低いことは注目すＰＣＴ特許出願シリアルＮｏ 、ＵＳ８７１００９８７．１９８７年４月３０日提出、およびその引用文献に記 載のＲｕ（ＩＩ）−化合物Ｉ１１の共役体が０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、　ｐＨ ６，０，０，３５Ｍフッ化ナトリウム含有（ＰＢＦ緩衝液）を用いて最終濃度１ ５０ｎＭに希釈された。テオフィリンに特異なモノクローナル抗体（クローン番 号９−４９、アスサイトロットＮｏ、　ＷＯ３９９、Ｃａｔ、Ｎｏ、　０４６） がＫａｌｌｅｓｔａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、（Ｃｈａｓｋａ、 　ＭＮ）から得られた。そのモノクローナル抗体がＰＢＦ緩衝液を用いて異った 濃度に希釈された（　２１．９から７００Ｍｇタンパク質／ｍｌまでの）。

テオフィリンと反応しない別のモノクローナル抗体（対照ＭＡＲ）がＳｉｇｍａ 　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ　Ｏ）から得られ、２１．９から７００Ｍｇタン パク質／ｌｌ１ｌまでの異った濃度にＰＢＦ緩衝液を用いて希釈された。テオフ ィリンの標準溶液はＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、（Ｍｉｌｗａ ｕｋｅｅ、　Ｗｌ、　ＣａｔＮｏ、２６−１４０−８．Ｍ、Ｗ、１８０．１７） から得られたテオフィリンを用いて調製された。テオフィリンはＰＢＦ緩衛液中 に溶かされ７５μＭの濃度にされ、そして分析に使うためにＰＢＦ緩衝液で６μ Ｍに希釈された。電気化学発光を測定する前に２５０＋ｎｌＪのシュウ酸と５％ （Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００とを含む溶液（εＣＬ溶液）が反応液に 加えられた。測定は、２つの白金網電極を反応液を含む試験管に入れることがで きるように改造されたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメータを用いておこなわれた。電 極はポテンショスタットに接続され、そして電気化学発光の測定は加えられたポ テンシャルを電極を介してスキャン速度５０ｍＶ／秒で１．５から２．５ボルト にスイープすることにより行われた。測定に使われたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメ ータは高ゲイン、感赤色光増幅器を持った。記録器へのルミノメータの出力は１ ０’カウント／ボルトに調整された。

測定はＸ−Ｙ−Ｙ’記録器上に記録され、ピークの高さは電気化学発光の測定と して用いられた。電極は測定の合間に（ａ）　０．１　Ｍのリン酸塩、０．１Ｍ のクエン酸塩、０．０２５Ｍのシュウ酸、および１％のＴｒｉｔＯｎ　Ｘ−１０ ０を含むＩ）８４．２の緩衝液でゆすぎ、（ｂ）この液の中の電極に＋２．２か ら−２，５ボルトのパルスを６０秒間加え、そして（Ｃ）そして１０秒間２．２ ボルトを加えることにより清浄化された。ついでこの電極はこの溶液から除かれ 、蒸留水ですすがれ拭い乾燥された。実験は表ＩＩＩに概括されるように行われ た。

表　Ｉｌｌ 抗体−Ｒｕ（ＩＩ）−化合物［１１共役体の電気化学発光に関する相互作用の影 響を調査するための実験計画 ステップｌ　ステップ２　ステップ３ １００μＪの　２００μｍの　１００μｍのＡ、　対照モノク　緩衝液　Ｒｕ（ ＩＩ）化合物ＩＩＩローナル抗　共役鉢 体 （２，１９μｇか Ｂ、　抗テオフィ　緩衝液　Ｒｕ（ＩＩ）化合物ＩＩＩリン抗体　または　共役 体 （２，１９μｇか　テオフィリン Ｃ，ＰＢＦ緩衝液　緩衝液　Ｒｕ（Ｉｆ）化合物ＩＩＩ共役体又は 緩衝液 対照モノクローナル抗体の溶液、テオフィリンに対する抗体またはＰＢＦ緩衝液 が試験管のセットに加えられた（ステップｌ）。その試験管にテオフィリンの溶 液または緩衝剤が加えられた（ステップ２）。溶液は試験管を大まかに振ること により混合され２５分間室温で反応させられた。ついでＲｕ（ＩＩ）−化合物日 ｆの共役体の溶液が管に加えられた（ステップ３）。試験管は振られ室温に１５ 分間保持された。最後に、１００μｍのＥＣＬ溶液が各管に加えられ電気化学発 光が前述のように測定された。

結果は表ＩＶに示される。

表　ＩＶ Ｒｕ（１１）−化合物ＩＩＩの電気化学発光に関する抗体およびテオフィリンの 影響 抗テオフィリ 抗テオフィ　ンＭＡＢ＋チオ 抗体タンパ　対照ＭＡＢ　リンＭＡＢ＋　フィリンク質濃度　十Ｒｕ（ＩＩ）　 Ｒｕ（ＩＩ）　−Ｒｕ（ＩＩ）　−（μｇ／管）　化合物ｒｌｌ　化合物１１ｆ 　化合物１目２．１９　５５．０００　４０．０００　４３．０００５５．００ ０　４１，０００　５７，０００４．３８　５７．０００　２２，５００　３７ ．０００５７．０００　２５．０００　３６．０００８．７５　５３．０００　 ２０，０００　３３．５００５０．０００　２２．０００　３０．５００３５． ０　４３，０００　１３，５００　１７．５００４１．０００　１４，０００　 １６．０００７０．０　４２．０００　１１．０００　１１．０００３７．５０ ０　１２．０００　１２．５００２つのサンプルの電気化学発光が上記のように 測定された。上記調査に用いられたＲｕ（ＩＩ）−化合物ｍ共役体の電気化学発 光は抗体が加えられない緩衝液中で測定されたとき５７，２００であった。緩衝 液に対する背景は５７５０であった。

データは、特異的にテオフィリンを識別するモノクローナル抗体が、ルテニウム 化合物が結合したテオフィリンの類似体、たとえばＲｕ（ＩＩ）−化合物０１　 と接触したとき、電気化学発光を減じるであろうことを示す。電気化学発光の減 少はＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役共合体度が一定に保たれるとき抗体濃度に 比例する。テオフィリンと反応しない抗体か使われるときは、極めて僅かな電気 化学発光の低下が最高の抗体の濃度において見られる。

データはまた、テオフィリンが抗テオフィリン抗体と接触し、ついでＲｕ（ＩＩ ）−化合物ＩＩＩ共役共合体合物に加えられるとき、電気化学的発光の量がより 大きいことを示す。これはテオフィリンは抗体がＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共 役共合体合することに対し競合し、電気化学発光を生成する時より多量のＲｕ（ 目）−化合物ＩＩＩ共役共合体たら実施例３に記載の結果をベースにして、テオ フィリンに対する均一系免疫分析が競合結合フォーマットにおいてテオフィリン に対する抗体と実施例３に記載のＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役共合体いて開 発された。使用された材料は、ＰＢＦ緩衝液が０．１Ｍのフッ化ナトリウムを含 む０．１Ｍリン酸塩緩衝液、１１Ｈ６，０，であったこと以外は実施例３に記載 の通りであった。この分析に対し、テオフィリンに対する特定の濃度のモノクロ ーナル抗体が選ばれた。抗体の濃度は５５μｇ／ｍｌであった。Ｒｕ（Ｉｆ）− 化合物ＩＩＩ共役共合体度は１７５ｎＭに調整された。テオフィリンがヒトの血 清に加えられ、２．５．５．１０．２０および４０μｇテオフィリン／ａ＋１血 清の最終濃度を得た。

分析は１０８ｍの血清を２９０μｍの抗テオフィリンモノクローナル抗体に加え その溶液を２５分間室温で保持することによりおこなわれた。ついで１００μｍ のＲｕ（ＩＩ）−化合物Ｈ１共役体が容管に加えられ３５μＭの最終濃度を得そ してこの溶液は室温で１５分間保持された。

実施例３に記載の１００μ】のεＣＬ溶液がついで容管に加えられそしてその溶 液の電気化学発光特性が、５０ｍＶ／秒における１、５ボルト対２．５ボルトの スィーブモードを用いて前述のように測定された。データは図４に示され、血清 サンプル中のテオフィリンの濃度と反応混合物により出される電気化学発光の量 との間に相関があることを示す。この観察はテオフィリンに対する分析を展開す ることが可能であることを示す。

これらの結果をベースに、当業者が生物学的マトリックス中の分析対象物の検出 および定量に対する均一系電気化学発光免疫分析を展開することは可能である。

異ったタイプの血清サンプル中のテオフィリンの濃度が均−系ＥＣＬ免疫分析を 用いて測定された。分析に対するフォーマットはテオフィリンおよび実施例３に 記載のＲｕ（ＩＩ）−化合物ｍ共役体に対し特異のモノクローナル抗体を用いる 競合結合分析であった。電気化学発光に対する試剤および方法は実施例３に記載 される。

比較のために、蛍光偏光分析もおこなわれた。異った血清サンプル中のテオフィ リンの濃度の測定に使われた蛍光偏光分析はＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ　（Ｎｏｒｔｈ、　Ｃｈｉｃａｇｏ。

ＩＬ）からの自動ＴＤＫ装置を用いておこなわれた。溶血を起した、脂血症の、 そして黄痘のそして正常な血清が分析に使われ、非正常血清に対するデータは下 記表Ｖに均−系テオフィリン分析 潜在的な問題をもつ血清の特性 血　清　濃度ファクタ　正常範囲 溶血性　１２．４ｍｇ／ｄｌヘモグロビン　Ｏ−３，２ｍｇ／ｄｉ脂血症　４０ ５　ｍｇ／ｄｌ　ｌ−リグリセリ　１０−１９０ｍｇ／旧ド １９６　ｍｇ／旧コレステロ−１２０−２００ｍｇ／ｄｉ異った量のテオフィリ ンが血清サンプルに加えられ２．５μｇテオフィリン／ｍｌから４０μｇテオフ ィリン／ｍｌの最終濃度を得た。均−系ＥＣＬ免疫分析に対する結果は図５に示 される。

各血清サンプルはまたテオフィリン濃度について蛍光偏光分析により分析された 。均一系電気化学発光免疫分析および蛍光偏光分析によるテオフィリン濃度が比 較された。そのデータは分散点としてプロットされ図６Ａ−Ｄに示される。デー タの点は直線回帰により解析されその相関係数が計算された。解析は両分桁間の 高い相関を示す。相関係数（ｒ）は０．９８から１，００であった。正常、溶血 性および脂血性血清サンプルに対する線の勾配は０．８から１．２で血清サンプ ルからのテオフィリンの高い回収を示した。

テオフィリンを含む黄療血清サンプルより出された電気化学発光は他の血清サン プルのより高かったが、各テオフィリン濃度において比例的に高かった。これは 図６Ｄで見ることかできる。電気化学発光と蛍光偏光とを比較するデータ点に対 し相関係数はｌ、００であるが、勾配は２．１４で、黄度血清サンプル中のテオ フィリンに対する高い回収を示す。

これらの結果に基き、黄療サンプル中のテオフィリンの濃度は、黄療血清のアリ コートに既知量のＲｕ（［１）−化合物＋１１共役体を加えることによりサンプ ルに対する標準曲線を確立することによって測定することができる。

これらのデータは均−系ＥＣＬ免疫分析が非正常レベルのヘモグロビン、詣質お よびビリルビンを含む血清サンプル中に存在するテオフィリンの濃度を測定する のに使うことができることを示す。

均−系ＥＣＬ免疫分析は、ＥＣＬ検出の多能性、たとえば生物学的分子の高い濃 度における敏感な検出、の故に蛍光偏光法に利益を与える。

均−系ＥＣＬ免疫分析は、入射光源が不必要で有効な光の生成に対し電気的励起 のみが必要であるという理由で、蛍光偏光法に更に利益を与える。結論的に、複 雑な光学系は不要である。測定原理が電気化学的刺戟により誘導される純粋に特 定の光子の放出であるので、システムの感度は潜在的に蛍光偏光より大幅に高く 、広いダイナミックレンジの達成が可能であろう。更にまた、生物学的認識事象 、たとえば抗体−抗原相互作用による電気化学発光の選択的変調のために、均− 系εＣＬ免疫分析により蛍光偏光技術によるより大幅に多様な分析物の測定か可 能である。

これらの結果に基き、当業者は、非正常な血清サンプル中の池の分析対象物を検 出する均−系εＣＬ免疫分析法を展開することができるであろう。

実施例６ １０ｍｇの固体ジゴキシンかｌ０ｍ１のＤＭＳＯ：）１．０　（８：２）に溶解 され、１ｍｇ／ｍｌの濃度のジゴキシン（以後”ストック標準”）を得た。

作業標準液はストック標準から、０．１％ＢＳＡおよび０．１５ＭＮａＦを含む ０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０（以後’　ＥＣＬ　１衝液”）中に、８ ０　ｎｇ／ｍ１．　４０　ｎｇ／ｍｌ。

２０　ｎｇ／ｍ１．　１０　ｎｇ／ｍ１．　５　ｎｇｌｏｗｌおよびＯｎｇ／ａ ＋１の濃度に調製された。

ＰＣＴ特許出願シリアルＮｏ、　ＵＳ　８７１００９８７゜１９８７年４月３０ 日提出、およびそこに引用の文献に記載の抗−ジゴキシン化合物Ｉ共役体の７５ μｌ　（希釈１：９０）および７５μ】の各標準液がガラス管にピペットで入れ られ、ポルテックスで混合し室温で２０分間培養された。

予備洗浄されたオバイン−ＢＳＡ　−Ｂｉｏｍａｇ粒子が容管に加えられ、ポル テックスで混合され室温で５分間培養された。Ｂｉｏｍａｇ粒子は分離され浮遊 物質は別の管に移された。

１００μｌの浮遊物質は４００μｍの０．１２５Ｍリン酸カリウム、０．１２５ Ｍのクエン酸、３２ｍＭのシュウ酸、１．２５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００ と共に管の中で混合された。

そのサンプルはＢｅｒｔｈｏｌｄ装置におかれ、電気化学発光が前述のように測 定された。但し手順はオーブン回路から加えられたポテンシャルを２．２ｖまで 上げそして光子カウントを１０秒間集積することにより修正した。

電極は測定の合間にリン酸塩−クエン酸塩緩衝液を用い下記のように清浄化した 。

（ａ）３秒間隔で−２，２ｖから＋２．２ｖの変動電圧を１分間加えて電極をパ ルス。

（ｂ）　＋２．２Ｖで１０秒間電極を平衡にした。

（Ｃ）　電極を脱イオン水で洗浄し、拭いて乾かした。

結果は図７に示される。

ＦＩＧ、２ Ｆｌｇ、　３ Ｆｌｇ、５ Ｆｉｌ；１．６Ａ Ｆｉｇ、　６Ｂ Ｆｉｇ、　６　Ｃ Ｆｌｇ、６Ｄ Ｆｌｇ、　７ 手続補正書（自発） 平成３　年　６　月　７日 ◇

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＥＣＬ分析に用いて好適な組成物であって、その組成物により出される電磁 放射が検出され、その組成物が以下を含むことを特徴とする組成物。 （ａ）金属含有ＥＣＬモイエティーであって、有効な量の電気化学的エネルギに 曝すことにより酸化された時、励起状態に転換することが可能で、前述の放射を 誘導するのに十分な条件に、励起されたＥＣＬモイエティーを曝すことによりそ れから電磁放射が放出されるＥＣＬモイエティー、 （ｂ）酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（ｃ）その中で前述のＥＣＬモ イエティーと前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質、および（ｄ ）それが存在することにより前述の組成物により出される電磁放射の量が増加す る物質。 ２．請求項１に記載の組成物であって、前述のＥＣＬモイエティーが金属キレー トであることを特徴とする組成物。 ３．請求項２に記載の組成物であって、前述の金属キレートの金属がルテニウム 、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウ ム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、またはタングステンであることを 特徴とする組成物。 ４．請求項１に記載の組成物であって、前述の電解質が水溶液であることを特徴 とする組成物。 ５．請求項１に記載の組成物であって、前述の電解質が非水溶液であることを特 徴とする組成物。 ６．ＥＣＬ分析に用いて好適な組成物であって、その組成物により出される電磁 放射が検出され、その組成物が以下を含むことを特徴とする組成物。 （ａ）有効量の電気化学的エネルギに曝すことにより酸化された時励起状態に転 換することが可能で、前述の放射を誘導するのに十分な条件に、励起された金属 キレートを曝すことによりそれから電磁放射が放出される金属キレート。 （ｂ）酸化されたとき強い還元剤を形成するカルボン酸、（ｃ）その中で前述の キレートおよびカルボン酸が酸化し得る媒体として機能し得る電解質、および（ ｄ）その存在により前述の組成物により出される電磁放射の量が増加する物質。 ７．請求項６に記載の組成物であって、前述の金属キレートの金属が遷移金属ま たは希土類金属であることを特徴とする組成物。 ８．請求項６に記載の組成物であって、前述の金属キレートの金属がルテニウム 、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウ ム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、またはタングステンであることを 特徴とする組成物。 ９．請求項６に記載の組成物であって、カルボン酸がシュウ酸塩、酒石酸塩、ク エン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、グルコン酸塩、またはピルビン酸塩であること を特徴とする組成物。 １０．請求項６に記載の組成物であって、カルボン酸がシュウ酸であることを特 徴とする組成物。 １１．請求項６に記載の組成物であって、その組成物が水溶液であることを特徴 とする組成物。 １２．請求項６に記載の組成物であって、その組成物が非水溶液であることを特 徴とする組成物。 １３．請求項６に記載の組成物であって、水に溶けた塩を含む電解質を含むこと を特徴とする組成物。 １４．請求項６に記載の組成物であって、リン酸塩緩衝液を含む電解質を含むこ とを特徴とする組成物。 １５．請求項６に記載の組成物であって、有機液体を含む電解質を含むことを特 徴とする組成物。 １６．請求項６に記載の組成物であって、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、 メタノール、エタノール、またはそれらの２またはそれより多い混合物を含む電 解液を含むことを特徴とする組成物。 １７．請求項６に記載の組成物であって、金属キレートがルテニウム含有キレー トまたはオスミウム含有キレートであることを特徴とする組成物。 １８．請求項６に記載の組成物であって、金属キレートがルテニウム含有キレー トで、強い還元剤を形成する種がシュウ酸塩で、電解質がリン酸塩緩衝液を含み 、そして前述の物質がＴｒｉｔｏｎＸ−１００であることを特徴とする組成物。 １９．請求項６に記載の組成物であって、水およびそれと混和し得る有機液体を 含む電解質を含むことを特徴とする組成物。 ２０．請求項６に記載の組成物であって、それがｐＨが１−７の水溶液であるこ とを特徴とする組成物。 ２１．請求項６に記載の組成物であって、それがｐＨが２−６の水溶液であるこ とを特徴とする組成物。 ２２．請求項６に記載の組成物であって、前述のカルボン酸が金属キレートに対 し化学量論的に過剰にあることを特徴とする組成物。 ２３．請求項６に記載の組成物であって、カルボン酸が５−５０ｍＭの濃度で存 在することを特徴とする組成物。 ２４．請求項６に記載の組成物であって、前述の物質が０．１から１．０％ｗ／ ｖの量で配合されていることを特徴とする組成物。 ２５．請求項６に記載の組成物であって、前述の物質が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物であることを特徴とする組成物。 式中ＲはＨまたはＣｍＨ２ｍ＋１、Ｒ１はＣｍＨ２ｍ、ｘは０から７０でｎは１ から２０である。 ２６．ＥＣＬ分析を行うための組成物の提供に用いて好適な試薬であって、 （ｉ）金属含有ＥＣＬモイエティーであって、有効な量の電気化学的エネルギに 曝すことにより酸化された時、励起状態に転換することが可能で、前述の放射を 誘導するのに十分な条件に、励起されたＥＣＬモイエティーを曝すことによりそ れから電磁放射が放出されるＥＣＬモイエティー、 （ｉｉ）酸化されたとき強い酸化剤を形成する種、（ｉｉｉ）その中で前述のＥ ＣＬモイエティーと前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質、およ び（ｉｖ）それが存在することにより前述の組成物により出される電磁放射の量 が増加する物質、を含む前述の組成物により電磁放射が出され、前述の試薬が前 述の物質（ｉｖ）を、出された電磁放射が増加するのに十分な量で含み、そして 前述のＥＣＬモイエティー（ｉ）、種（ｉｉ）、および電解質（ｉｉｉ）の少く ともひとつを含むことを特徴とする試薬。 ２７．請求項２６に記載の試薬であって、前述の物質（ｉｖ）および前述の金属 含有ＥＣＬモイエティー（ｉ）を含むことを特徴とする試薬。 ２８．請求項２６に記載の試薬であって、前述の物質（ｉｖ）、前述の金属含有 ＥＣＬモイエティー（ｉ）、および前述の電解質（ｉｉｉ）を含むことを特徴と する試薬。 ２９．請求項２６に記載の試薬であって、前述の物質（ｉｖ）、前述の種（ｉｉ ）および前述の電解質（ｉｉｉ）を含むことを特徴とする試薬。 ３０．請求項２６に記載の試薬であって、前述の物質（ｉｖ）、前述のＥＣＬモ イエティー（ｉ）、および前述の電解質（ｉｉｉ）を含むことを特徴とする試薬 。 ３１．ＥＣＬ分析を行うための組成物の提供に用いて好適な試薬であって、 （ｉ）金属キレートであって、有効な量の電気化学的エネルギに曝すことにより 酸化された時、励起状態に転換することが可能で、前述の放射を誘導するのに十 分な条件に、励起された金属キレートを曝すことによりそれから電磁放射が放出 される金属キレート、 （ｉｉ）酸化されたとき強い還元剤を形成するカルボン酸、 （ｉｉｉ）その中で前述のキレートと前述のカルボン酸とが醇化し得る媒体とし て機能し得る電解質、および（ｉｖ）それが存在することにより前述の組成物に より出される電磁放射の量が増加する物質、を含む前述の組成物により電磁放射 が出され、前述の試薬が前述の物質（ｉｖ）を、出された電磁放射が増加するの に十分な量で含み、そして前述の金属キレート（ｉ）、カルボン酸（ｉｉ）、お よび電解質（ｉｉｉ）の少くともひとつを含むことを特徴とする試薬。 ３２．請求項３１に記載の試薬であって、前述のカルボン酸（ｉｉ）、電解質（ ｉｉｉ）、および物質（ｉｖ）を含むことを特徴とする試薬。 ３３．請求項３１に記載の試薬であって、前述のカルボン酸がシュウ酸塩、クエ ン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、グルコン酸塩、またはピルビン酸塩で あることを特徴とする試薬。 ３４．請求項３１に記載の試薬であって、シュウ酸塩を含むことを特徴とする試 薬。 ３５．請求項３１に記載の試薬であって、水に溶解する塩を含む電解質を含むこ とを特徴とする試薬。 ３６．請求項３１に記載の試薬であって、水溶液電解質を含むことを特徴とする 試薬。 ３７．請求項３１に記載の試薬であって、水に溶解する塩を含む水溶液電解質を 含むことを特徴とする試薬。 ３８．請求項３１に記載の試薬であって、リン酸塩緩衝液を含む水溶液電解質を 含むことを特徴とする試薬。 ３９．請求項３１に記載の試薬であって、有機液体を含む電解質を含むことを特 徴とする試薬。 ４０．請求項３１に記載の試薬であって、前述の有機液体がアセトニトリル、Ｄ ＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、またはそれらの２またはそれより多 い混合物であることを特徴とする試薬。 ４１．請求項３１に記載の試薬であって、水およびそれと混和し得る有機液体を 含む電解質を含むことを特徴とする試薬。 ４２．請求項３１に記載の試薬であって、ｐＨが２−６の水溶液であることを特 徴とする試薬。 ４３．請求項３１に記載の試薬であって、前述のカルボン酸が金属キレートに対 し化学量論的に過剰に存在することを特徴とする試薬。 ４４．請求項３１に記載の試薬であって、カルボン酸が５−５０ｍＭの濃度で存 在することを特徴とする試薬。 ４５．請求項３１に記載の試薬であって、前述の物質が０．１から１％Ｗ／Ｖの 量で配合されることを特徴とする試薬。 ４６．請求項３１に記載の試薬であって、前述の物質が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物であることを特徴とする試薬。 式中ＲはＨまたはＣｍＨ２ｍ＋１、Ｒ１はＣｍＨ２ｍ、ｘは０から７０、そして ｎは１から２０である。 ４７．組成物により出される電磁放射が検出されるＥＣＬ分析をおこなうための キットであって、そのキットが（ｉ）金属含有ＥＣＬモイエティーであって、有 効な量の電気化学的エネルギに曝すことにより酸化された時、励起状態に転換す ることが可能で、前述の放射を誘導するのに十分な条件に、励起されたＥＣＬモ イエティーを曝すことによりそれから電磁放射が放出されるＥＣＬモイエティー 、 （ｉｉ）酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（ｉｉｉ）その中で前述のＥ ＣＬモイエティーと前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質、およ び（ｉｖ）それが存在することにより前述の組成物により出される電磁放射の量 が増加する物質を含み、そのキットが前述のＥＣＬモイエティー（ｉ）、種（ｉ ｉ）、電解質（ｉｉｉ）、および物資（ｉｖ）からなるグループの１コまたはそ れより多いメンバーを含む少くともひとつの分離成分を含むことを特徴とするキ ット。 ４８．請求項４７に記載のキットであって、前述のグループのいずれか２コのメ ンバーを含む第一の分離成分と、前述のグループの残りのメンバーを含む第二の 分離成分とを含むことを特徴とするキット。 ４９．請求項４７に記載のキットであって、前述のグループのいずれか２コのメ ンバーを含む第一分離成分と、前述のグループの残りのメンバーおよびその第一 成分中の前述のグループの他のメンバーの１コを含む第二成分とを含むことを特 徴とするキット。 ５０．請求項４７に記載のキットであって、４コの分離成分を含み、そのそれぞ れが前述のグループの４コのメンバーの異ったひとつを含むことを特徴とするキ ット。 ５１．請求項４７に記載のキットであって、前述のグループのすべての４コのメ ンバーを含む第一分離成分と、前述のグループのいずれかの１コ，２コ，または ３コのメンバーを含む第二分離成分とを含むことを特徴とするキット。 ５２．請求項５１に記載のキットであって、その第二分離成分が前述のグループ の４コのメンバーの１コを含み、前述のキットが更に前述のグループの１コ，２ コ，または３コのメンバーを含む第三分離成分と、前述のグループの１コまたは ２コのメンバーを含む第四分離成分とを含むことを特徴とするキット。 ５３．請求項５１に記載のキットであって、その第一分離成分が前述のＥＣＬモ イエティー（ｉ）、および前述の種（ｉｉ）を含み、その第二分離成分が前述の 電解質（ｉｉｉ）および前述の物質（ｉｖ）を含むことを特徴とするキット。 ５４．請求項４８に記載のキットであって、その第一分離成分が前述のＥＣＬモ イエティー（ｉ）および前述の電解質（ｉｉｉ）を含み、その第二分離成分が前 述の種（ｉｉ）および前述の物質（ｉｖ）を含むことを特徴とするキット。 ５５．請求項４８に記載のキットであって、その第一分離成分が前述の種（ｉｉ ）および前述の電解質（ｉｉｉ）を含み、その第二分離成分が前述のＥＣＬモイ エティー（ｉ）および前述の物質（ｉｖ）を含むことを特徴とするキット。 ５６．請求項４７に記載のキットであって、各第二分離成分が水溶液であること を特徴とするキット。 ５７．請求項５１に記載のキットであって、その第一分離成分が前述のＥＣＬモ イエティー（ｉ）を含み、そしてその第二分離成分が前述の種（ｉｉ）、前述の 電解質（ｉｉｉ）、および前述の物質（ｉｖ）を含むことを特徴とするキット。 ５８．組成物により出される電磁放射が検出されるＥＣＬ分析をおこなうための キットであって、そのキットが、（ｉ）金属キレートであって、有効な量の電気 化学的エネルギに曝すことにより酸化された時、励起状態に転換することが可能 で、前述の放射を誘導するのに十分な条件に、励起された金属キレートを曝すこ とによりそれから電磁放射が放出される金属キレート、 （ｉｉ）酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（ｉｉｉ）その中で前述の金 属キレートと前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質、および（ｉ ｖ）それが存在することにより前述の組成物により出される電磁放射の量が増加 する物質を含み、そのキットが（ａ）前述の金属キレート（ｉ）、前述の有機酸 （ｉｉ）、前述の電解質（ｉｉｉ）、および前述の物質（ｉｖ）からなるグルー プの少くとも２コのメンバーを含む第一分離成分と、（ｂ）前述のグループの残 りのメンバー（複数）を含む第二分離成分とを含むことを特徴とするキット。 ５９．請求項５８に記載のキットであって、その金属キレートの金属が遷移金属 または希土類金属であることを特徴とするキット。 ６０．請求項５８に記載のキットであって、その金属キレートの金属がルテニウ ム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジ ウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、またはタングステンであること を特徴とするキット。 ６１．請求項６０に記載のキットであって、その金属キレートの金属がルテニウ ムまたはオスミウムであることを特徴とするキット。 ６２．請求項５８に記載のキットであって、前述のカルボン酸がシュウ酸塩、ク エン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、グルコン酸塩、またはピルビン酸塩 であることを特徴とするキット。 ６３．請求項６２に記載のキットであって、カルボン酸がシュウ酸塩であること を特徴とするキット。 ６４．請求項５８に記載のキットであって、電解質が水溶液であることを特徴と するキット。 ６５．請求項５８に記載のキットであって、電解質が非水溶液であることを特徴 とするキット。 ６６．請求項５８に記載のキットであって、電解質が水に溶けた塩を含むことを 特徴とするキット。 ６７．請求項５８に記載のキットであって、物質が式▲数式、化学式、表等があ ります▼ の化合物であることを特徴とするキット。 式中ＲはＨまたはＣｍＨ２ｍ＋１、ｘは０から７０、そしてｎは１から２０であ る。 ６８．請求項５８に記載のキットであって、電解質が有機液体を含むことを特徴 とするキット。 ６９．請求項５８に記載のキットであって、物質が式▲数式、化学式、表等があ ります▼ の化合であることを特徴とするキット。 式中ＲはＨまたはＣｍＨ２ｍ＋１、ｘは０から７０、そしてｎは１から２０であ る。 ７０．請求項５８に記載のキットであって、金属キレートがルテニウム含有キレ ート、強い還元剤を形成する種がシュウ酸塩、電解質がリン酸塩緩衝液を含み、 そして物質がＴｒｉｔｏｎ−１００であることを特徴とするキット。 ７１．請求項５８に記載のキットであって、全細胞または表面抗原、細胞下粒子 、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、タ ンパク質、リボタンパク質、多糖類、リポ多糖類、糖タンパク質、ペプチド、ポ リペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬剤、非生物学的ポリマー（好ましくは可 溶性）、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザ、精神安定剤、アルカロ イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、再結合または誘導タン パク質、ビオチン、アビディン、ストレプトアビディン、またはサンプル中に存 在する無機分子からなるグループからなるグループから選ばれた分析物の検出に 適合することを特徴とするキット。 ７２．請求項５８に記載のキットであって、１０−３から１０−１８モルの濃度 の検体の検出に適合することを特徴とするキット。 ７３．組成物により放出される電磁放射が検出されるＥＣＬ分析による分析対象 物の検出または定量のためのキットであって、そのキットが （ｉ）金属キレートであって、有効な量の電気化学的エネルギに曝すことにより 酸化された時、励起状態に転換することが可能で、前述の放射を誘導するのに十 分な条件に、励起された金属キレートを曝すことによりそれから電磁放射が放出 される金属キレート、（ｉｉ）酸化されたとき強い還元剤を形成するカルボン酸 、 （ｉｉｉ）その中で前述のキレートと前述のカルボン酸が酸化され得る媒体とし て機能し得る電解質、および（ｉｖ）それが存在することにより前述の組成物に より出される電磁放射の量が増加する物質を含み、そのキットが前述の金属キレ ート（ｉ）、前述のカルボン酸（ｉｉ）、前述の電解質（ｉｉｉ）、および前述 の物質（ｉｖ）からなるグループの１コまたはそれより多いメンバーを含む少く ともひとつの分離成分を含み、 前述のキットが更に（ａ）追加の分析対象物または分析対象物の類似体、（ｂ） 分析対象物または前述のその類似体の結合パートナ、および（ｃ）物質（ａ）ま たは（ｂ）と結合可能な反応成分からなるグループから選ばれる少くともひとつ の追加物質を含み、その追加物質がキットの中に含まれる追加の分離成分の中、 または前述のグループの１コまたはそれより多いメンバーを含む前述のキットの ひとつの成分中に含まれることを特徴とするキット。 ７４．請求項７３に記載のキットであって、全細胞または表面抗原、細胞下粒子 、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、タ ンパク質、リボタンパク質、多糖類、リポ多糖類、糖タンパク質、ペプチド、ポ リペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬剤、非生物学的ポリマー（好ましくは可 溶性）、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザ、精神安定剤、アルカロ イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、再結合または誘導タン パク質、ビオチン、アビディン、ストレプトアビディン、またはサンプル中に存 在する無機分子からなるグループから選ばれる分析物の検出に適合することを特 徴とするキット。 ７５．請求項７３に記載のキットであって、その金属キレート中の金属がルテニ ウムまたはオスミウムであることを特徴とするキット。 ７６．請求項７３に記載のキットであって、カルボン酸がシュウ酸塩であること を特徴とするキット。 ７７．請求項７３に記載のキットであって、電解質が水溶液であることを特徴と するキット。 ７８．電磁放射の放出を発生する方法であって以下のステップを含むことを特徴 とする方法。 （ａ）以下を含む組成物を形成する。 （ｉ）金属含有ＥＣＬモイエティーであって、有効な量の電気化学的エネルギに 曝すことにより酸化された時、励起状態に軽換することが可能で、前述の放射を 誘導するのに十分な条件に、励起されたＥＣＬモイエティーを曝すことによりそ れから電磁放射が放出されるＥＣＬモイエティー、 （ｉｉ）酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（ｉｉｉ）その中で前述のＥ ＣＬモイエティーと前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質、およ び（ｉｖ）それが存在することにより前述の組成物により出される電磁放射の量 が増加する物質。 （ｂ）その組成物を、その組成物が電磁放射を出すように誘導するために有効な 量の電気化学的エネルギに好適な条件下で曝す。 （ｃ）放出された電磁放射を検出する。 ７９．請求項７８に記載の方法であって、前述の組成物を、前述のＥＣＬモイエ ティー（ｉ）、前述の種（ｉｉ）、前述の電解質（ｉｉｉ）、および前述の物質 （ｉｖ）からなるグループのひとつのメンバーを含む第一キット成分と、そのグ ループの残りのメンバー（複数）を含む第二キット成分とを組み合わせることに よりＥＣし分析をおこなうためのキットから形成することを特徴とする方法。 ８０．請求項７８に記載の方法であって、前述の組成物が前述の電気化学的エネ ルギに曝されている間ｐＨが１−７であることを特徴とする方法。 ８１．請求項８０に記載の方法であって、そのｐＨか２−６であることを特徴と する方法。 ８２．請求項７８に記載の方法であって、還元剤を形成する種がＥＣＬモイエテ ィーに対し化学量論的に過剰に存在することを特徴とする方法。 ８３．請求項７８に記載の方法であって、ＥＣＬモイエティーが遷移金属キレー トまたは希土類金属キレートであることを特徴とする方法。 ８４．請求項７８に記載の方法であって、ＥＣＬモイエティーが金属キレートで 、その金属がルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金 、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、またはタ ングステンであることを特徴とする方法。 ８５．請求項７８に記載の方法であって、還元剤を形成する前述の種としての前 述の組成物中に、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、グ ルコン酸塩、またはビルビン酸塩からなるグループから選ばれるカルボン酸が配 合されることを含むことを特徴とする方法。 ８６．請求項８５に記載の方法であって、前述の物質が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物であることを特徴とする方法。 ここにＲはＣｍＨ２ｍ＋１、Ｒ′はＣｍＨ２ｍ、ｘは０から７０、そしてｎは１ から２０である。 ８７．請求項７８に記載の方法であって、ＥＣＬモイエティーがルテニウム含有 キレート、強い酸を形成する種がシュウ酸塩、電解質がリン酸塩緩衝液を含み、 前述の物質がＴｒｉｔｏｎＸ−１００であることを特徴とする方法。 ８８．請求項７８に記載の方法であって、組成物が水溶液であることを特徴とす る方法。 ８９．請求項７８に記載の方法であって、組成物が非水溶液であることを特徴と する方法。 ９０．請求項７８に記載の方法であって、電解質が塩の水溶液を含むことを特徴 とする方法。 ９１．請求項７８に記載の方法であって、電解質がリン酸塩緩衝液を含むことを 特徴とする方法。 ９２．請求項７８に記載の方法であって、電解質が有機液体を含むことを特徴と する方法。 ９３．請求項７８に記載の方法であって、電解質がアセトニトリル、ＤＭＳＯ、 ＤＭＦ、メタノール、エタノール、またはそれらの２またはそれより多い混合物 であることを特徴とする方法。 ９４．組成物を放射を誘導するのに十分な条件に曝すことにより電磁放射を出す 組成物中の物質を検出しまたは定量する方法であって、 （ａ）前述の組成物が （ｉ）金属含有ＥＣＬモイエティーであって、有効な量の電気化学的エネルギに 曝すことにより酸化された時、励起状態に転換することが可能で、前述の放射を 誘導するのに十分な条件に、励起されたＥＣＬモイエティーを曝すことによりそ れから電磁放射が放射されるＥＣＬモイエティー、 （ｉｉ）酸化されたとき強い還元剤を形成する種、（ｉｉｉ）その中で前述のＥ ＣＬモイエティーと前述の種とが酸化し得る媒体として機能し得る電解質、で形 成され、 （ｂ）その組成物を、前述の放射を誘導するのに十分な量の電気化学的エネルギ に好適な条件下で曝し、そして（ｃ）放出された電磁投射が検出され、組成物中 に、その存在により組成物により出される電磁放射の量が増加する物質を配合す ることを含む改善がおこなわれることを特徴とする方法。 ９５．請求項９４に記載の方法であって、物質が式▲数式、化学式、表等があり ます▼ の化合物であることを特徴とする方法。 式中、Ｒは水素またはＣｍＨ２ｍ＋１、Ｒ１はＣｍＨ２ｍ、ｘは０から７０、ｎ は１から２０である。 ９６．請求項９５に記載の方法であって、物質が、ｘが９から１０であることを 特徴とする方法。 ９７．請求項９４に記載の方法であって、改善が、更に組成物中に、金属がルテ ニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パ ラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、またはタングステンからな るグループから選ばれる金属キレートの配合を含むことを特徴とする方法。 ９８．請求項９７に記載の方法であって、金属がルテニウムまたはオスミウムで あることを特徴とする方法。 ９９．請求項９４に記載の方法であって、組成物が水溶液であることを特徴とす る方法。 １００．ＥＣＬ分析により分析対象物を検出または定量する方法であって、以下 を含むことを特徴とする方法。 （１）以下を含む組成物を形成する。 （ａ）分析対象物に関し試験されるサンプル、（ｂ）（ｉ）追加の分析対象物ま たは分析対象物の類似体、 （ｉｉ）分析対象物または前述のその類似体の結合パートナ、および （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と結合し得る反応成分、からなるグループから 選ばれる少くともひとつの物質、 （ｃ）有効量の電気化学的エネルギに曝されたとき励起状態に転換可能な金属キ レートであって、励起されたキレートを、前述の放射を誘導するのに十分な条件 に曝すことによりそれから電磁放射が放出され、前述の金属キレートが分析対象 物または（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、または（ｂ）（ｉｉｉ）に規定の物質 と結合相互作用に入り得るキレート、（ｄ）酸化されたとき強い還元剤を形成す るカルボン酸、 （ｅ）その中で前述の発光団と前述のカルボン酸とが酸化され得る媒体として機 能し得る電解質、および （ｆ）その存在により放出される電磁放射の量が増加する物質。 （２）前述の組み合わせを、その組成物が電磁放射を出すように誘導するために 有効な量の電気化学的エネルギに曝す。そして （３）放出されを電磁投射を検出する。 １０１．請求項１００に記載の方法であって、全細胞または表面抗原、細胞下粒 子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、 タンパク質、リボタンパク質、多糖類、リポ多糖類、糖タンパク質、ペプチド、 ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬剤、非生物学的ポリマー（好ましくは 可溶性）、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザ、精神安定剤、アルカ ロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、再結合または誘導タ ンパク質、ビオチン、アビディン、ストレプトアビディン、またはサンプルに存 在する無機分子からなるグループから選ばれる分析物の検出に適合する方法。 １０２．請求項１００に記載の方法であって、前述の金属キレート中の金属がル テニウムまたはオスミウムであることを特徴とする方法。 １０３．請求項１００に記載の方法であって、カルボン酸がシュウ酸塩であるこ とを特徴とする方法。 １０４．請求項１０２に記載の方法であって、電解液が水溶液であることを特徴 とする方法。 １０５．サンプル中の分析対象物を下記を含む電気化学発光現象をベースとして 検出または定量するシステム。 （ａ）サンプル、 （ｂ）以下で構成されるグループから選ばれる少くともひとつの物質、 （ｉ）加えられた分析対象物または分析対象物の類似体、 （ｉｉ）分析対象物またはその類似体の結合パートナ、 （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と結合し得る反応成分、ここに前述の物質は直 接または１またはそれより多い他の分子を介して、放射を誘導するために十分な 条件にＥＣＬモイエティーを曝すことによりそれから電磁放射が放出される励起 状態に転換することが可能なＥＣＬモイエティーの分子と結合する。 （ｃ）強い還元剤に転換され得る種、その存在により前述のシステムにより出さ れる電磁放射が増加する物質、および電解質、 （ｄ）ＥＣＬモイエティーを電磁放射を放出するように誘導する手段、および （ｅ）サンプル中の分析対象物の存在または量を測定するために前述の組成物に より出される放射を計測する手段。