JP2003536075A - Ｃ反応性タンパク質誘導性炎症のインヒビター - Google Patents

Ｃ反応性タンパク質誘導性炎症のインヒビター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、心臓血管疾患およびＣ反応性タンパク質によって増強される炎症性障害の処置における使用のための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、Ｃ反応性タンパク質を阻害するモジュレーターについてスクリーニングする方法、およびＣ反応性タンパク質誘導性血管炎症を阻害するためのこれらのモジュレーターの使用に関する。１つの局面において、本発明は、Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって、以下：Ｃ反応性タンパク質を得る工程；該Ｃ反応性タンパク質に少なくとも第１の候補物質を接触させる工程；およびアッセイを用いて該Ｃ反応性タンパク質と該第１の候補物質との間の相互作用をアッセイする工程を包含する、方法、を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本願は、２０００年６月８日に出願された、米国仮出願番号６０／２１０，４
１５の優先権を主張する。
【０００２】 （１．発明の分野） 本発明は、一般に、Ｃ反応性タンパク質を調節する方法および組成物に関する
。このようなモジュレーターは、Ｃ反応性タンパク質によって誘導される脈管炎
症および他の炎症性疾患を阻害するために、有用である。
【０００３】 （２．関連技術の説明） 炎症性応答は、アテローム性動脈硬化症の病変の発症、発達および進化におい
て、重要な役割を果たす。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の上昇した血清レベル
は、急性炎症性応答の、非特異的な感受性マーカーである。多数の疫学的研究は
、急性期反応物であるＣ反応性タンパク質が、アテローム性動脈硬化症および虚
血性心疾患に対する重要な危険因子であることを示した。より高レベルのＣ反応
性タンパク質はまた、安定なアンギナを患う患者および不安定なアンギナを患う
患者において、冠状事象（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｅｖｅｎｔ）の危険性の増加に関
連する（Ｌｉｕｚｚｏら、１９９４）。この間連の基本的な機構は明らかではな
く、そしてＣ反応性タンパク質は、単に、アテローム性動脈硬化症の病因におい
て特定の役割を有さない、炎症のマーカーであり得る。しかし、Ｃ反応性タンパ
ク質は、アテローム性動脈硬化症の病変に存在するが、以前の研究は、脈管細胞
に対するＣ反応性タンパク質の可能な影響を、特には評価しなかった。
【０００４】 高レベルのＣ反応性タンパク質は、不安定なアンギナおよび急性心筋梗塞を患
う患者において、頻繁に観察される（Ｌｉｕｚｚｏら、１９９４）。３μｇ／ｍ
Ｌより高い不安定なアンギナレベルを患う患者は、冠状事象（死、心筋梗塞およ
び緊迫性冠状血管再生）における増加した危険性と関連付けられ、そしてこの関
連は、１０μｇ／ｍＬより高い患者について、さらに強い（Ｌｉｕｚｚｏら、１
９９４）。この観察は、Ｃ反応性タンパク質が、アテローム性動脈硬化症および
虚血性心疾患に対する危険因子であることを示唆した。これらの研究は、Ｃ反応
性タンパク質のレベルの少しの上昇さえも、見た目には健常な被験体におけるア
テローム性動脈硬化症および虚血性心疾患のより高い危険性と関連があり（Ｒｉ
ｄｋｅｒら、１９９７；Ｋｏｅｉｎｇら、１９９９ｐ；Ｒｉｄｋｅｒら、２００
０）、そしてこの増加した危険性は、脂質に関連する心臓血管の危険性または脂
質に関連しない心臓血管の危険性とは無関係であることを示した。安定なアンギ
ナを患う患者においては、３．６μｇ／ｍＬより高いＣ反応性タンパク質のレベ
ルは、冠状事象の危険性の２倍の増加に関連した（Ｈａｖｅｒｋａｔｅら、１９
９７）。
【０００５】 Ｃ反応性タンパク質は、１μｇ／ｍＬ未満の濃度でヒト血清に通常存在する、
急性相反応タンパク質である。しかし、Ｃ反応性タンパク質レベルは、急性炎症
の間に、１００倍または５００倍にさえ上昇し得る。この驚くべき応答は、主と
して、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（特に、イ
ンターロイキン−６）によって調節され、そして大部分が、抗炎症性の薬物およ
びホルモンによって影響されない（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら、１９９１）。実際
に、排泄時に高いＣ反応性タンパク質レベルの不安定なアンギナを患う患者にお
いて、Ｃ反応性タンパク質は、追跡の間に上昇したままであり、そして特に、高
いタータイル（ｕｐｐｅｒ ｔｅｒｔｉｌｅ）のＣ反応性タンパク質レベル（８
．６μｇ／ｍＬより高い）にある患者において、新たな冠状事象の高い危険性に
関連する（Ｂｉａｓｕｃｃｉら、１９９９）。最近の大規模な予測的研究におい
て、不安定なアンギナおよび排泄時に１５μｇ／ｍＬより高いＣ反応性タンパク
質レベルを有する患者は、９０日間の追跡の間に、３倍高い冠状事象の危険性を
有した（Ｆｅｒｒｅｉｒｏｓら、１９９９）。これらの結果は、Ｃ反応性タンパ
ク質の炎症誘発性の影響が、この急性相反応タンパク質のより高いレベルに関連
する有害な結果に寄与し得ることを示唆する。
【０００６】 Ｃ反応性タンパク質が虚血性心疾患に対する独立した危険因子であるという強
い証拠が現在存在するが（Ｓｈａｈ ２０００；Ｒｉｄｋｅｒら、２０００）、
この関連の基礎となる機構は明らかではない。炎症性応答は、アテローム性動脈
硬化症の発達および進化において重要な役割を果たし、そしてその血栓の合併症
に寄与し得るので、Ｃ反応性タンパク質は、単に、炎症性応答のマーカーであり
得る。あるいは、Ｃ反応性タンパク質は、アテローム性動脈硬化症の病因におい
て直接的な役割を有し得る（Ｓｈａｈ ２０００；Ｌａｇｒａｎｄら、１９９９
）。そのリガンド結合特性に起因して、Ｃ反応性タンパク質は、先天免疫（オプ
ソニン作用）、ならびに壊死細胞からの膜および核物質の除去において役割を果
たす。Ｃ反応性タンパク質はまた、補体因子Ｃ１ｑおよび因子Ｈに結合し得、そ
して補体の活性化の古典的経路を活性化し得る。さらに、最近の研究は、Ｃ反応
性タンパク質が、白血球において（低い親和性で）レセプターＦＣγＲＩおよび
（高い親和性で）ＦＣγＲＩＩに結合し得ることを示した（Ｂｈａｒａｄｗａｊ
ら、１９９９）。興味深いことに、Ｃ反応性タンパク質は、アテローム性動脈硬
化症のプラークに存在するが、正常な脈管壁（ここにはしばしば、末端の補体複
合体と同時局在する（Ｔｏｒｚｅｗｓｋｉら、１９９８））には存在しない（Ｒ
ｅｙｎｏｌｄｓら、１９８７）。Ｃ反応性タンパク質はまた、ヒト単球による組
織因子発現を誘導し得る（Ｃｅｒｍａｋら、１９９３）。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、一般に、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のモジュレーターについて
スクリーニングする方法に関する。本発明の特定の実施形態において、モジュレ
ーターの組成物は、Ｃ反応性タンパク質誘導性炎症性疾患（例えば、心臓血管疾
患）の発達を阻害するために有用であり得る。本発明者らは、Ｃ反応性タンパク
質のレベルをブロックするかまたは低下させることが、アテローム性動脈硬化症
の進化に対して有利な効果を有し得、そして冠状事象の危険性を低下させ得ると
考える。
【０００８】 本発明の具体的な実施形態において、Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターに
ついてスクリーニングする方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する
：Ｃ反応性タンパク質を得る工程；このＣ反応性タンパク質を少なくとも第１の
候補物質と接触させる工程；およびアッセイを用いてこれらのＣ反応性タンパク
質と第１の候補物質との間の相互作用をアッセイする工程。このアッセイを使用
して、接着分子、レセプター、シグナル伝達分子、サイトカインまたは酵素の発
現のＣ反応性タンパク質誘導についてアッセイし得る。例示的な接着分子として
は、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、脈管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ）
またはＥ−セレクチンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において
考慮されるサイトカインの具体的な例は、ケモカイン（例えば、単球化学誘導タ
ンパク質−１（ＭＣＰ−１））である。ケモカインとは、細胞（特に、食細胞お
よびリンパ球）の移動および活性化に関与する、小さなサイトカインであること
が公知である。さらに、候補物質は、接着分子のＣ反応性タンパク質誘導性発現
を阻害または増強し得る。このモジュレーターは、Ｃ反応性タンパク質、または
Ｃ反応性タンパク質の機能に関与する補因子のいずれかを調節し得ることが理解
され得る。さらに、補因子は、血清から単離され得る。
【０００９】 なお別の実施形態において、このアッセイの終点は、誘導性一酸化窒素シンタ
ーゼ（ｉＮＯＳ）誘導、高（ａｄｖａｎｃｅｄ）グリケーション最終産物のレセ
プター、単球化学誘引タンパク質−１、Ｐ−セレクチン、エンドセリン−１、エ
ンドセリン−レセプター、インターロイキン−６またはヘムオキシゲナーゼ−１
についてアッセイすることを含む。当業者は、これらの終点をアッセイするため
に種々のアッセイ（例えば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロッティングお
よび／またはウェスタンブロッティング）を使用し得ることを認識する。
【００１０】 別の具体的な実施形態において、Ｃ反応性タンパク質は、トランスジェニック
細胞または動物においてＣ反応性タンパク質を発現させること；この発現された
Ｃ反応性タンパク質を単離すること；血清（すなわち、ヒト血清）から得ること
；および細胞から得ることによって得られ得る。さらに、（トランスジェニック
）細胞は、Ｃ反応性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含み、従って、Ｃ
反応性タンパク質は、組換え核酸配列から発現される。
【００１１】 具体的な実施形態は、Ｃ反応性タンパク質を含む組成物中で細胞をインキュベ
ートすることによって、Ｃ反応性タンパク質を、第１の候補物質と接触させる工
程を包含し得る。１つの特定の局面は、Ｃ反応性タンパク質が細胞において発現
され、その後、このＣ反応性タンパク質を第１の候補物質と接触させることを包
含する。さらに、この細胞は、Ｃ反応性タンパク質および血清とインキュベート
される。この血清は、ヒト血清であり得る。当業者は、他の種（例えば、ウシま
たはモルモット）由来の血清が本発明において利用され得ることを認識する。こ
の細胞は、ヒト細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞）であり得る。他の細胞が
使用され得ることは、本発明の範囲内である。
【００１２】 さらなる実施形態において、細胞は、動物中に含まれ得る。この動物は、ヒト
のような哺乳動物であり得る。本発明において使用され得る他の例示的な哺乳動
物としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギおよびサルが挙
げられるが、これらに限定されない。
【００１３】 別の実施形態において、Ｃ反応性タンパク質または第１の候補物質は、動物に
注射され得る。第１の候補物質は、血清（例えば、ヒト血清または天然に存在す
る血清）に含まれ得る。
【００１４】 なお別の実施形態において、第１の候補物質は、Ｃ反応性タンパク質とこの第
１の候補物質に接触させる工程の前に血清と混合され得る。
【００１５】 具体的な実施形態において、第１の候補物質の正体は、スクリーニング方法を
行う前に既知であり得る。第１の候補物質は、可能性のある候補物質の混合物中
に含まれ得る。
【００１６】 さらなる実施形態において、第１の候補物質の正体は、上記スクリーニング方
法を行う前に既知ではなくてもよい。第１の候補物質の正体および特性は、スク
リーニング方法を行った後に決定され得る。例えば、第１の候補物質は、スクリ
ーニング方法を行った後に単離され得る。例示的な単離手順としては、ゲル濾過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラ
フィー、疎水性クロマトグラフィー、または水相疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、当業者は、タンパク質の
特性を決定するために、周知の方法（すなわち、電気泳動、分光測光法分析、ま
たはアミノ酸分析）を利用し得る。さらに、当業者は、上記手順が全て包括的で
あるわけではないことを認識し、そして当業者は、上記手順を改変し得るか、ま
たは他の周知のタンパク質分析手順を利用し得る。従って、タンパク質の性質（
すなわち、可溶性タンパク質、膜結合タンパク質または不溶性タンパク質）に依
存して、手順を最適化することは、十分に当業者の知識の範囲内である。
【００１７】 本発明の別の実施形態において、Ｃ反応性タンパク質調節性炎症を阻害する方
法がまた提供され、この方法は、以下の工程を包含する：Ｃ反応性タンパク質の
モジュレーターを得る工程；薬学的に受容可能なキャリア中にＣ反応性タンパク
質のモジュレーターを組み込み、薬学的組成物を形成する工程；およびこの薬学
的組成物を被験体に投与する工程。ここで、上記モジュレーターは、以下の工程
を包含する方法によって同定される：Ｃ反応性タンパク質を得る工程；このＣ反
応性タンパク質を少なくとも第１の候補物質と接触させる工程；およびアッセイ
を用いてこれらのＣ反応性タンパク質と第１の候補物質との間の相互作用をアッ
セイする工程。このモジュレーターは、Ｃ反応性タンパク質誘導性炎症を阻害し
得る。さらに、このモジュレーターは、心臓血管合併症の発達を阻害し得る。例
えば、このモジュレーターは、アンギナまたは心筋梗塞を患う被験体に与えられ
得る。また、このモジュレーターは、アテローム性動脈硬化症または虚血性心疾
患の危険性のある被験体に与えられ得る。さらに、このモジュレーターは、発作
または他のＣ反応性タンパク質誘導性炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ、
狼瘡および炎症性腸疾患）の発達を阻害する。このモジュレーターは、予防的様
式で被験体に与えられ得る。このモジュレーターは、単回用量または連続用量で
与えられ得る。さらに、この連続用量は、毎日投与され得る。当業者は、種々の
組み合わせのいずれかを利用して、このモジュレーターが患者に投与され得るこ
とを認識する。例えば、毎日の単回用量が投与され得るか、または連続用量が１
日の間に数回投与され得る。本発明は、詳述される具体的な回数または用量に限
定されるとは解釈されない。当業者は、回数および用量が、モジュレーターおよ
びその特性、または所定のモジュレーターに対して最良に利用される薬学的キャ
リアの特性に依存して変更される必要があり得ることを認識する。
【００１８】 なお別の実施形態において、Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターがまた提供
され、このモジュレーターは、以下を包含する方法によって生成される：Ｃ反応
性タンパク質を得る工程；このＣ反応性タンパク質を候補物質と接触させる工程
；これらのＣ反応性タンパク質と候補物質との間の相互作用をアッセイする工程
；およびこの候補物質がＣ反応性タンパク質のモジュレーターであることを決定
する工程。このモジュレーターは、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれ得る
。
【００１９】 なお別の実施形態において、Ｃ反応性タンパク質は、このＣ反応性タンパク質
と第１の候補物質との接触の前に、標識され得る。この標識されたＣ反応性タン
パク質は、第１の候補物質またはモジュレーターについてスクリーニングツール
として利用され得る。
【００２０】 別の実施形態において、改変されたモジュレーターについてスクリーニングす
るための方法がまた提供され、ここで、第１の候補物質が単離され、この方法は
、以下の工程を包含する：Ｃ反応性タンパク質を得る工程；このＣ反応性タンパ
ク質を、第１の候補物質と接触させる工程；このＣ反応性タンパク質と第１の候
補物質との間の相互作用についてアッセイして、非改変モジュレーターの基準線
を確立する工程；第１の候補物質を改変する工程；Ｃ反応性タンパク質を、改変
された第１の候補物質と接触させる工程；Ｃ反応性タンパク質の存在下で、この
改変されたモジュレーターとの間の相互作用についてアッセイする工程、および
この改変されたモジュレーターの相互作用と、非改変モジュレーターの確立され
た基準線とを比較する工程。第１の候補物質の改変は、第１の候補物質（例えば
、接着分子、レセプター、シグナル伝達分子、サイトカイン、または酵素）のア
ミノ酸配列または核酸配列の改変を含む。アミノ酸配列についての例示的な改変
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：化学的変異誘発、放射線
変異誘発、アミノ酸の切断またはアミノ酸の点変異誘発。化学的改変に加えて、
当業者は、モジュレーターが温度の変動に感受性であり得、従ってモジュレータ
ーが加熱または冷却を使用して改変され得ることを認識する。第１候補物質の核
酸配列のさらなる例は、化学的変異誘発、放射線変異誘発、挿入性変異誘発、イ
ンビトロスキャニング変異誘発、または部位特異的変異誘発を含む。当業者は、
これらの標準的な周知の改変手順の変化が、本発明において利用され得ることを
認識する。さらに、改変された核酸配列は、発現ベクター内に挿入される。この
発現ベクターは、レポーター分子を含む。発現ベクターは、細胞（例えば、ヒト
臍静脈内皮細胞）にトランスフェクトされる。さらに、レポーター分子は、タン
パク質の発現、タンパク質の活性またはトランスフェクション後の結合活性につ
いて測定される。当業者は、発現ベクター中で使用されるレポーター分子が、測
定される活性の型を決定することを認識する。従って、本発明は、当該分野で公
知の利用可能なレポーター分子のいずれかを含むように改変され得る。当業者は
、一過性のトランスフェクションおよび安定なトランスフェクションが、本発明
において使用され得ることを認識する。特定の実施形態において、細胞は、胚性
幹細胞であり、これは、トランスフェクション後に胚盤胞に移植されて、トラン
スジェニックマウスを作製する。さらに、当業者は、トランスジェニックマウス
を作製する種々の方法を認識する。別の例は、改変された核酸配列が胚に注入さ
れて、トランスジェニックマウスを作製することである。従って、本発明は、当
該分野で公知の利用可能な方法のいずれかによって、トランスジェニックマウス
を生じるために改変され得る。
【００２１】 本明細書中で使用される場合、詳述「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味
し得る。特許請求の範囲において使用される場合、単語「含む」と共に使用され
るときは、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上のものを意味し得る。本明細
書中で使用される場合、「別の」とは、少なくとも第２以上のものを意味し得る
。
【００２２】 本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが
、例示の目的のみで与えらることを理解すべきである。なぜなら、本発明の精神
および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかと
なるからである。
【００２３】 （例示的実施形態の説明） （タンパク質機能のモジュレーターについてのスクリーニング） 本発明は、Ｃ反応性タンパク質の機能のモジュレーターを同定するための方法
を含む。このモジュレーターは、Ｃ反応性タンパク質、またはＣ反応性タンパク
質の機能に関与する補因子のいずれかを調節し得る。さらに、補因子は、血清か
ら単離され得る。これらのアッセイは、候補物質の大きなライブラリーのランダ
ムスクリーニングを含み得る；あるいは、このアッセイは、Ｃ反応性タンパク質
の機能をより調節しやすくすると考えられる構造的特性に関して目視で選択され
た特定のクラスの化合物に焦点をあてるために使用され得る。
【００２４】 機能とは、タンパク質の発現、タンパク質の活性または結合活性についてアッ
セイされ得るものを意味する。また、ｍＲＮＡのレベル、ｍＲＮＡの安定性また
はｍＲＮＡの分解についてアッセイし得る。
【００２５】 Ｃ反応性モジュレーターを同定するために、候補物質の存在下または非存在下
でのＣ反応性タンパク質の機能を一般に決定する。この候補物質またはモジュレ
ーターは、Ｃ反応性タンパク質の機能を変更する任意の物質として定義される。
例えば、方法は、一般に、以下： Ｃ反応性タンパク質を得る工程； このＣ反応性タンパク質を、少なくとも第１の候補物質と接触させる工程；お
よび このＣ反応性タンパク質と第１候補物質との間の相互作用を、アッセイを用い
てアッセイする工程、 を包含し、ここで、アッセイする工程は、接着分子、レセプター、シグナル伝達
分子、サイトカインまたは酵素の発現のＣ反応性タンパク質誘導についてアッセ
イすることを含む。
【００２６】 本発明において測定され得る特定のアッセイの終点または相互作用としては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯ
Ｓ）誘導、高（ａｄｖａｎｃｅｄ）グリケーション最終産物に対するレセプター
、単球化学誘引タンパク質−１、Ｐ−セレクチン、エンドセリン−１、エンドセ
リン−レセプター、インターロイキン−６またはヘムオキシゲナーゼ−１のアッ
セイ。これらアッセイの終点は標準的な方法（例えば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、
ノザンブロティングおよび／またはウエスタンブロティング）を使用してアッセ
イされ得る。なおさらに、アッセイは、無細胞系、単離された細胞またはトラン
スジェニック動物を含む生物体において実施され得ることが明白である。
【００２７】 他のスクリーニング方法は、候補物質を同定するための標識されたＣ反応性タ
ンパク質を使用することを含み得る。Ｃ反応性タンパク質は、当該分野で周知で
ありそして使用されて、標準的な標識化手順を使用して標識され得る。このよう
な標識としては、放射活性タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素学的タグが
挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】 もちろん、本発明の全てのスクリーニング方法は、効果的な候補が、見出され
ないかもしれない事実にもかかわらず、それら自身で有用であることが理解され
る。本発明は、このような候補を見出すための方法だけではなく、このような候
補をスクリーニングするための方法を提供する。
【００２９】 （１．モジュレーター） 本明細書中において使用される場合、用語「候補物質」は、Ｃ反応性タンパク
質活性を潜在的に阻害または増強し得る任意の分子をいう。候補物質は、タンパ
ク質またはそのフラグメント、低分子あるいはなお核酸分子であり得る。最も有
用な薬学的化合物は、Ｃ反応性タンパク質または他のプロ炎症性分子（すなわち
、接着分子、表面レセプター、サイトカイン、またはＣ反応性タンパク質によっ
て誘導される他の物質）に構造的に関する化合物であることが理解され得る。改
善した化合物の開発を助けるためにリード化合物を使用することは、「合理的な
薬物設計」として公知であり、そして既知のインヒビターおよびアクチベーター
との比較だけではなく、標的分子の構造に関する予想を含む。
【００３０】 一方、有用な化合物の同定を「力任せに行なう」試みにおいて、有用な薬物に
ついて基礎的な基準を満たすと考えられる低分子ライブラリーを、種々の市販の
供給源から簡単に入手し得る。このようなライブラリー（コンビナトリアル生成
されたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含む）のスクリーニン
グは、活性について多数の関連する（または関連しない）化合物のスクリーニン
グするための迅速かつ効率的な手段である。コンビナトリアルアプローチはまた
、それら自身を、さもなければ、所望でない化合物ではない活性をモデルとした
、第２世代、第３世代および第４世代の化合物の作製によって、潜在的な薬物の
迅速な進化をそれら自身が導く。
【００３１】 候補化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは部分を含み得るか
、あるいはさもなければ、不活性である、公知の化合物の活性な組み合わせとし
て見出され得る。天然の供給源（例えば、動物供給源、細菌供給源、真菌供給源
、植物供給源（葉および樹皮を含む）ならびに海洋サンプル）は、潜在的に有用
な薬学的因子の存在について候補としてアッセイされ得る。スクリーニングされ
る薬学的因子はまた、化学的組成物または人工化合物から誘導または合成され得
ることが理解される。従って、本発明によって同定される候補物質は、ペプチド
、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子インヒビター、または公知のインヒ
ビターまたは刺激因子から開始する合理的な薬物設計を介して設計され得る任意
の他の化合物であり得ることが理解される。
【００３２】 他の適切なモジュレーターとしては、アンチセンス分子、リボザイムおよび抗
体（単鎖抗体を含む）（これらのそれぞれは、標的分子に対して特異的である）
が挙げられる。例えば、翻訳開始部位または転写開始部位あるいはスプライス接
合点に結合するアンチセンス分子は、理想的な候補インヒビターである。
【００３３】 最初に同定された調節化合物に加えて、本発明者らはまた、他の立体的に類似
する化合物が、そのモジュレーターの構造の重要な部分を模倣するように処方さ
れ得ることを企図する。ペプチドモジュレーターのペプチド模倣物を含み得る、
このような化合物は、最初のモジュレーターと同じ様式において使用され得る。
【００３４】 本発明に従うインヒビターは、上流、下流またはＣ反応性タンパク質の直接的
の阻害効果または活性化効果を及ぼすインヒビターであり得る。本発明のスクリ
ーニング方法によって同定されるインヒビターまたはアクチベーターの型にかか
わらず、このような化合物による阻害または活性化の効果は、その添加された候
補物質の非存在において観察された効果と比較して、Ｃ反応性タンパク質を生じ
る。
【００３５】 （２．インビトロアッセイ） 実施するのに迅速で低費用かつ簡単なアッセイは、インビトロアッセイである
。このようなアッセイは、一般に、単離された分子を使用し、迅速かつ多数にお
いて実施され得、それによって短い期間に獲得可能な情報の量を増大する。多様
な容器（試験管、プレート、皿および他のディップスティックおよびビーズのよ
うな表面を含む）は、これらのアッセイを実施するために使用され得る。
【００３６】 無細胞系アッセイの１例は、結合アッセイである。直接的に機能を示めさない
が、特定の様式で標的分子に結合するモジュレーターの能力は、関連する生物学
的効果の強い示唆の証拠である。例えば、標的と分子との結合は、それ自体でか
つ自然に、立体的相互作用、アロステリック相互作用または電荷−電荷相互作用
に起因し得る。標的は、溶液中で遊離しているか、支持体に固定化されているか
、細胞内に発現されるか、または細胞の表面に発現されるかのいずれかであり得
る。標的かまたは化合物のいずれかは、標的化され得、それによって結合の決定
を可能にする。通常、標的が、標識種であり、これは、その標識化が、結合を干
渉するか、または増強する機会を減少する。競合結合形式が、実施される。ここ
で因子のうちの１つが、標識され、そして遊離の標識の量 対 結合した標識の
量を測定して、結合に対する効果を決定し得る。
【００３７】 化合物の高スループットスクリーニングのための技術は、ＷＯ８４／０３５６
４において記載される。多数の小ペプチド試験化合物は、固体基板（例えば、プ
ラスチックピンまたはいくつかの他の表面）において合成され得る。結合したポ
リペプチドは、種々の方法によって検出される。
【００３８】 （３．インサイト（ｉｎ ｃｙｔｏ）アッセイ） 本発明はまた、細胞におけるＣ反応性タンパク質を調製する能力についての化
合物のスクリーニングを企図する。種々の細胞株は、この目的のために特異的に
操作された細胞を含むが、このようなスクリーニングアッセイのために利用され
得る。例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＤＥＣ）が、このアッセイに使用され
得るが、本発明は、ＨＵＶＥＣに限定して作製されると解釈されなるべきでない
。さらに、本発明者らはまた、トランスジェニック細胞が、Ｃ反応性タンパク質
またはＣ反応性タンパク質のモジュレーターあるいはＣ反応性タンパク質または
Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターの両方の組み合わせを発現するように操作
され得ることを企図する。さらに、当業者は、安定または一過性のトランスフェ
クション（これは、当該分野で周知であり、そして使用されている）が、本発明
において使用され得ることを認識する。
【００３９】 発現ベクターを含むトランスジェニック細胞は、発現ベクターを細胞に導入す
るために産生される。細胞または宿主細胞へのＤＮＡの導入は、分子生物学の分
野において周知の技術であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ａｕ
ｓｕｂｅｋら（１９９４）およびＧｅｒｈａｒｄｔら（１９９４）において記載
される。細胞のトランスフェクションの方法としては、リン酸カルシウム沈殿、
リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェ
クション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。あるいは、細胞は、本明
細書中に提供される参考文献および実施例に記載される通常の技術を使用する本
発明のレトロ遺伝子発現ベクターで簡単に形質導入され得る。宿主細胞としては
、原核細胞または真核生物細胞が挙げられ、そしてこれは、ベクターを複製し得
、そして／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現し得る任意の
形質転換可能な生物体が挙げられる。宿主細胞は、ベクターのためのレシピエン
トとして使用され得、そしてベクターのためのレシピエントとして使用されてい
る。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターコード
核酸配列の部分または全ての発現であるかに依存して、原核生物または真核生物
に由来し得る。多数の細胞株および培養物が、宿主細胞として利用可能であり、
そしてこれらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を介して入手され得る。これは、生きている培養物および
遺伝的物質を保管するのに役立つ組織である（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）。適
切な宿主を決定することは、知識内でありそして当業者の範囲内である。一般に
、これは、ベクター骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたは
コスミドは、多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入され得る。
ベクター複製および／または発現のために宿主細胞として使用される細菌細胞と
しては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８ならびにＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｔ ＣｅｌｌおよびＳＯＬＯＰＡＣＫＴＭ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌ（
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のような多くの
市販の細菌宿主が挙げられる。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２のような細
菌細胞は、ファージウイルスのための宿主細胞として使用され得る。宿主細胞と
して使用される得る真核生物細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げら
れるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺
乳動物真核生物細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋｅｔ、２
９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるがこれらに限定さ
れない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１
が挙げられるがこれらに限定されない。種々の細胞型および生物体由来の多くの
宿主細胞は、入手可能であり、そして当該分野で公知である。同様に、ウイルス
ベクターは、真核生物宿主細胞か、または原核生物宿主細胞のいずれか（特にベ
クターの複製または発現に許容的である細胞）との組み合わせにおいて使用され
得る。
【００４０】 アッセイに依存して、培養物が必要とされ得る。細胞は、多数の異なる生理学
的アッセイのいずれかを使用して試験される。あるいは、分子分析が、実施され
得、例えば、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現（全細胞またはポリＡ ＲＮＡの差
次的ディスプレイを含む）などを見出す。
【００４１】 （４．インビトロアッセイ） インビトロアッセイは、種々の動物の使用に関与する。これらは、特定の欠損
を有するか、または生物体内の異なる細胞に達し、そして効果を与える候補物質
の能力を測定するために使用され得るマーカーを送達するように操作されたトラ
ンスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物のサイズ、扱いの容易さな
らびに生理学的な情報および遺伝子構成の情報に起因して、マウスは、特に、ト
ランスジェニックに好ましい実施形態である。しかし、他の動物は、同様に適切
である。これらとしては、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、スナネズ
ミ、マーモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマならびにサル（
チンパンジー、テナガザルおよびヒヒを含む）が挙げられる。モジュレーターに
ついてのアッセイは、これらの種々のいずれか由来の動物モデルを使用して実施
され得る。
【００４２】 このようなアッセイにおいて、１つ以上の候補物質は、動物に投与され、そし
て１つ以上の特徴を改変する候補物質の能力により、候補物質で処理していない
類似の動物と比較して、モジュレーターを同定する。この特徴は、特定の化合物
（例えば、酵素、レセプター、ホルモン）または細胞（例えば、増殖、腫瘍形成
能、生存）の機能あるいは代わりにより広範な兆候（例えば、激痛、心筋梗塞、
アテローム硬化症など）に関して上で考察されるものいずれかであり得る。
【００４３】 本発明は、血管炎症に誘導されるＣ反応性タンパク質誘導性血管炎症の機能を
調節する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。これらの実施形態にお
いて、Ｃ反応性タンパク質を調節する候補物質の能力を決定するための方法に関
し、この方法は、一般に、以下の工程を包含する：動物に候補物質を投与する工
程；およびＣ反応性タンパク質の１つ以上の特徴を減少する候補物質の能力を決
定する工程。
【００４４】 試験化合物でのこれらの動物の処理は、適切な形態で動物への化合物の投与を
包含する。投与は、臨床的目的または非臨床的目的のために使用され得る任意の
経路による。経路としては、経口、経鼻、口腔内または局所経路でさえ挙げられ
がこれらに限定されない。あるいは、投与は、気管内滴下、気管支滴下、皮膚内
、皮下注射、筋内注射、心膜内注射または静脈内注射によってであり得る。特定
の企図される経路は、全身性の静脈注射、血液またはリンパ供給を介する局所テ
受投与または病気に冒された部位への直接的な投与である。
【００４５】 インビボにおける化合物の有効性を決定する抗体とは、種々の異なる基準に関
与し得る。また、毒性および用量応答を測定することは、インビトロアッセイま
たはインサイトアッセイよりもより意義のある様式で動物で実施され得る。
【００４６】 （トランスジェニック動物／ノックアウト動物） 本発明の１つの実施形態において、機能的なＣ反応性タンパク質またはＣ反応
性タンパク質のモジュレーターあるいはＣ反応性タンパク質の改変されたモジュ
レーターをコードする機能的な導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が作製
される。Ｃ反応性タンパク質またはモジュレーターあるいはＣ反応性の改変され
たモジュレーターの導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物、このような
動物およびトランスジェニック胚に由来する組み合わせ細胞株は、Ｃ反応性タン
パク質の機能を誘導または抑制する薬剤をスクリーニングおよび同定するための
方法において有用であり得る。本発明のトランスジェニック動物はまた、疾患状
態を研究するためのモデルとして使用され得る。
【００４７】 本発明の１つの実施形態において、導入遺伝子を非ヒト宿主に導入し、ヒト遺
伝子またはマウス遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製する。トラン
スジェニック動物は、導入遺伝子を、この導入遺伝子の発現を可能にする様式で
、ゲノムに組み込むことによって作製される。トランスジェニック動物を作製す
るための方法は、一般的にＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７
３，１９１号；これは、本明細書中で参考として援用される）、Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒら、１９８５（これは、その全体が参考として本明細書中で援用される）そし
て「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第二版（Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ
、ＣｏｓｔａｎｔｉｍｉおよびＬｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４；これは、その全体が参考
として本明細書中で援用される）により記載されている。
【００４８】 導入遺伝子と内因性遺伝子との間の相同組換えによって内因性Ｃ反応性タンパ
ク質またはＣ反応性タンパク質のモジュレーターを置換することが望ましくあり
得るか、または内因性遺伝子が「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」動物の
作製におけるように欠失によって排除され得る。代表的には、ゲノム配列に隣接
する導入遺伝子は、マイクロインジェクションによって受精卵に移入される。マ
イクロインジェクションされた卵は、宿主雌に移植され、そしてその子孫は、こ
の導入遺伝子の発現についてスクリーニングされる。トランスジェニック動物は
、以下が挙げられるが、これらに限定されない多数の動物由来の受精卵から作製
され得る：爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物、および魚類。特に好ましい実施形
態において、Ｃ反応性タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスを作
製する。あるいは、「ノックアウト」マウスにおけるＣ反応性タンパク質の非存
在は、インビボにおけるＣ反応性タンパク質欠損の細胞への影響の研究を可能に
する。なおさらに、候補物質は、Ｃ反応性タンパク質の相互作用をさらに研究す
るために過剰発現され得るか、または「ノックアウト」され得る。
【００４９】 上記のように、トランスジェニック動物およびこのような動物由来の細胞株は
、特定の試験的実験における用途を見出され得る。この観点において、Ｃ反応性
タンパク質を過剰発現し得るトランスジェニック動物および細胞株は、試験候補
物質に曝露され得る。これらの試験物質は、Ｃ反応性タンパク質の１以上の性質
（例えば、接着分子、レセプター、サイトカイン、シグナル伝達分子または酵素
の発現）を増大または阻害する能力についてスクリーニングされ得る。
【００５０】 （Ｃ反応性タンパク質モジュレーターの予防的使用） 本発明はまた、Ｃ反応性タンパク質モジュレーターについていくつかの予防的
使用を意図する。従って、本発明のモジュレーターは、所望の結果を達成する有
効量で被験体に投与され得ることが意図される。例えば、本発明のモジュレータ
ーは、不安定アンギナおよび急性心筋梗塞に罹患する被験体に投与され得る。ま
た、これらの組成物は、代表的にＣ反応性タンパク質誘導性脈管炎症に関連する
生物学的活性を減少（例えば、減少したアテローム性動脈硬化、減少した局所性
炎症応答、および減少した心筋梗塞）させ得ることが意図される。なおさらに、
このモジュレーターは、発作または他のＣ反応性タンパク質誘導性炎症疾患（例
えば、慢性関節リュウマチ、狼瘡、および炎症性腸疾患）の発症を阻害し得る。
【００５１】 モジュレーターが、単回用量または連続用量で、被験体に投与され得ることが
意図される。連続用量は、毎日、毎週、毎月、毎年または必要と見なされる場合
に随時、投与され得る。詳細には、このモジュレーターは、疾患の予測される「
突発的発症」もしくは「急性なエピソード」もしくは「再発」の間またはその前
に投与され得る。
【００５２】 （モジュレーターの単離） 特定の実施形態において、候補物質は、当該分野で周知の標準的な手順を使用
して単離および／または精製され得る。本発明の候補物質は、タンパク質、低分
子、または核酸配列であり得る。タンパク質精製技術は、当業者に周知である。
これらの技術は、あるレベルにおいて、細胞環境のポリペプチド画分および非ポ
リペプチド画分への粗分画化を含む。このポリペプチドを他のタンパク質から分
離するために、目的のポリペプチドは、部分的な精製または完全な精製（または
均質になるまでの精製）を達成するためのクロマトグラフィー技術および電気泳
動技術を使用して、さらに精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適する分
析的方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリア
クリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチド精製の特に効率的
な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（すなわち、ＨＰＬＣ）であ
る。
【００５３】 なおさらに、広範な種々のクロマトグラフィー手順のいずれかを使用して、低
分子の候補物質もしくはモジュレーターを単離および／または精製し得る。例え
ば、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、ペーパークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ま
たは超臨界流体クロマトグラフィー（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｌｏｗ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用して、種々の化学種の分離をもたらし得
る。
【００５４】 分配クロマトグラフィーは、２つの相がお互いに接触し、そして１つまたは両
方の相が溶質を構成する場合、この溶質は、それ自身が２つの相に分配するとい
う理論に基づいている。通常、分配クロマトグラフィーは、吸着剤および溶媒を
充填されたカラムを使用する。溶質を含む溶液は、カラム上端で層状化される。
次に、この溶媒を連続的にカラムに通す（これは、カラムの材料を通る溶質の移
動を可能にする）。次いで、溶質が、その移動速度に基づいて回収され得る。分
配クロマトグラフィーの最も一般的な２つの型は、ペーパークロマトグラフおよ
び薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）であり、これらは共に吸着クロマトグラフィー
と呼ばれる。両方の場合において、マトリックスは結合液を含む。分配クロマト
グラフィーの他の例は、気−液（ｇａｓ−ｌｉｑｕｉｄ）クロマトグラフィーお
よびゲルクロマトグラフィーである。
【００５５】 ペーパークロマトグラフィーは、ペーパーシート形態のセルロースカラムで行
われる分配クロマトグラフィーの改変型である。セルロースは、非常に乾燥して
いる場合にさえ、大量の結合水を含む。分配は、結合水と展開溶媒との間で起こ
る。しばしば、使用される溶媒は水である。通常、非常に少量の分離されるべき
溶液混合物が、ペーパーの上部に置かれ、そして乾燥される。毛管現象により、
ペーパーを介して溶媒が吸い上げられ、サンプルを溶解し、そして流れの方向に
成分を移動させる。ペーパークロマトグラムは、上昇する溶媒または下降する溶
媒のいずれかの流れに対して展開され得る。１回目の実行後に移動の軸を９０°
変化させることによって、二次元分離が可能になる。
【００５６】 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、脂質を分離するために非常に一般的に
使用され、従って、本発明の好ましい実施形態であると考えられる。ＴＬＣは、
ペーパークロマトグラフィーの利点を有するが、微細に分割され、そして均一な
層を形成し得る任意の物質の使用を可能にする。ＴＬＣにおいて、固定相は、ガ
ラス板またはプラスチック板の表面に均一に塗布された吸着剤層である。この板
は、通常吸着剤のスラリーを形成し、この吸着剤スラリーを、この板の周囲にそ
って選択された高さでテープを配置することによってウェルを作製した後に、ゲ
ル表面上に注ぐことによって作製される。吸着剤が乾燥した後、このテープを剥
がし、そしてペーパークロマトグラフィーにおけるペーパーとまったく同様に処
理される。サンプルを適用し、そしてこの板を溶媒と接触させる。一旦、溶媒が
、板の端部におおよそ達したら、この板を取りだし、そして乾燥させる。次いで
、スポットは、蛍光、免疫原性同定、放射能の計測によるか、または表面に色の
変化を生じる種々の試薬をスプレーすることによって、同定され得る。
【００５７】 気−液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）において、移動相は気体であり、そして
固定相は、チューブもしくはカラムの内部表面または固体支持体に吸着させた液
体である。この液体は、通常エーテルのような揮発性溶媒に溶解した固体として
適用される。サンプルは、揮発し得る任意のサンプルであり得、不活性な気体（
例えば、ヘリウム、アルゴン、または窒素）と共に液体として導入され、次いで
加熱される。このガス状の混合物は、チューブを介して通過する。この気化され
た化合物は、これらの分配係数に従って、気体状移動相と液状固定相との間で、
連続して再分配する。
【００５８】 ＧＬＣの利点は、低分子の分離にある。感度および速度は、非常に良好であり
、速度は、標準的な液体クロマトグラフィーの速度の１０００倍に達する。非破
壊的な検出器を使用することによって、ＧＬＣを分取的に使用して、グラム量の
物質を精製し得る。ＧＬＣの主な用途は、アルコール、エステル、脂肪酸および
アミンの分離にある。
【００５９】 ゲルクロマトグラフィー、または分子ふるいクロマトグラフィーは、分子の大
きさに基づく分配クロマトグラフィーの特殊な形態である。ゲルクロマトグラフ
ィーの背景理論は、小さな孔を含む不活性な物質の小さな粒子によって調製され
たカラムが、より大きな分子とより小さな分子を分離することである（なぜなら
、これらは、大きさに依存してこの孔を通過するか、この孔の周りを通過するか
らである）。粒子を作っている物質が、分子を吸着しない限り、流速を決定する
唯一の因子は大きさである。故に、形状が比較的一定である限り、分子はカラム
から大きさが減少する順に溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、異なる大き
さの分子を分離するためには最高である。なぜなら、分離が、ｐＨ、イオン強度
、温度などのような他の全ての要因に依存しないからである。また、実質的に吸
着がなく、区域での広がりが少なく、そして溶出容量は、分子量に対する単純な
事象に関連する。
【００６０】 ゲルクロマトグラフィーのためのゲル状物質は、三次元網であり、この構造は
通常無作為である。一般的に不活性な架橋ポリマーからなるゲルは、分析されて
いる物質と結合または反応せず、そして荷電していない。ゲル内にある間隙は、
液体で満たされ、そしてこの液体は、ゲル容量のほとんどを占める。一般的なゲ
ルは、デキストラン、アガロースおよびポリアクリルアミドであり、これらは水
溶液として使用される。
【００６１】 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、非常に高いピーク分解能を有す
る非常に迅速な分離によって特徴付けられる。これは、非常に微細な粒子および
高圧の維持および十分な流速の使用によって達成される。分離は、およそ数分ま
たはほとんど１時間で達成され得る。さらに、非常に少量のサンプルのみが必要
とされる。なぜなら、粒子は非常に小さく、そして緊密に充填されているため、
空間容量は総容量のうち非常に少ない割合であるからである。また、サンプルの
濃度は、それほど高い必要はない。なぜなら、バンドは非常に狭く、サンプルの
希釈は非常に少ないからである。
【００６２】 アフィニティークロマトグラフィーは、単離されるべき物質とこの物質が特異
的に結合し得る分子との間の特定の親和性に依存するクロマトグラフ手順である
。これは、レセプター−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、結合パー
トナーの１つを不溶性のマトリックスに共有結合することによって合成される。
次いで、カラム材料は、溶液からの物質を特異的に吸着し得る。溶出は、条件を
結合が生じない条件に変える（ｐＨ、イオン強度、温度などを変える）ことによ
って生じる。
【００６３】 マトリックスは、それ自身が分子を有意ないずれの程度でも吸着せず、そして
広範な化学的安定性、物理的安定性および熱安定性を有する物質であるべきであ
る。リガンドは、その結合特性に影響しないような方法で結合されるべきである
。リガンドはまた、比較的強固な結合を提供すべきである。そして、サンプルま
たはリガンドを破壊することなく物質を溶出させ得るべきである。アフィニティ
ークロマトグラフィーの最も一般的な形態の１つは、イムノアフィニティークロ
マトグラフィーである。
【００６４】 （変異誘発） 使用される場合、変異誘発は、種々の標準的な変異誘発手順によって達成され
る。変異は、生物の量または構造に変化を生じるプロセスである。変異は、単一
の遺伝子の核酸配列の変異、遺伝子または全染色体のブロックを包含し得る。単
一の遺伝子における変化は、ＤＮＡ配列内の単一のヌクレオチド塩基の除去、付
加、または置換を含む点変異の結果であっても、多数のヌクレオチドの挿入また
は欠失を含む変化の結果であってもよい。
【００６５】 変異は、ＤＮＡ複製の忠実度におけるエラー、またはゲノム内の転位性の遺伝
的エレメント（トランスポゾン）の移動のような事象の結果として、自然に生じ
得る。これらはまた、化学的変異原または物理的変異原に対する曝露の後に誘導
される。このような変異誘導因子としては、電離放射線、紫外線光および化学物
質の多様なアレイ（たとえば、アルカリ化剤および多環式芳香族炭化水素（これ
らのうち全てが、核酸と直接的にかまたは間接的（一般に、いくつかの代謝生体
内変化の後に）にかのいずれかで相互作用し得る））が挙げられる。このような
環境的因子によって誘導されるＤＮＡ損傷は、塩基配列の改変を生じ得、影響を
受けたＤＮＡが複製または修復される場合に、変異を生じ得る。変異はまた、特
定の標的化方法の使用によって、部位特異的であり得る。
【００６６】 （１．ランダム変異誘発） （ａ）挿入変異誘発） 挿入変異誘発は、既知のＤＮＡフラグメントの挿入を介する遺伝子の不活化に
基づく。これは、いくつかの型のＤＮＡフラグメントの挿入を含むことから、生
成される変異は、一般に、機能獲得変異ではなく、機能喪失変異である。しかし
、機能獲得変異を生成する、挿入のいくつかの例が存在する（Ｏｐｐｅｎｈｅｉ
ｍｅｒら、１９９１）。挿入変異誘発は、細菌およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにお
いて、非常に成功し（Ｃｏｏｌｅｙら、１９８８）そして最近、トウモロコシ（
Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９８７）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｍａｒｋｓら、１９
９１；Ｋｏｎｃｚら、１９９０）；およびＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ（Ｓｏｍｍｅ
ｒら、１９９０）において強力な手段となった。
【００６７】 転位性の遺伝的エレメントは、細胞のゲノム中の１つの場所から別の場所へ移
動（転位）し得るＤＮＡ配列である。認識された最初の転位性のエレメントは、
Ｚｅａ ｍａｙｓの活性化因子／解離（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ／Ｄｉｓｓｏｃｉａ
ｔｉｏｎ）エレメントであった（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ、１９５７）。これ以降
、これらは、原核生物および真核生物の両方の広範な生物において、同定されて
きた。
【００６８】 ゲノム中の転位性エレメントは、転位の間に複製され、そして標的部位複製と
呼ばれる、ＤＮＡの短い配列の直列反復が隣接することによって特徴付けられる
。実質的に全ての転位性エレメントは、その型、および転位機構が何であれ、そ
の挿入部位でこのような複製を行う。いくつかの場合、複製される塩基の数は一
定であり、他の場合、各転位事象によって異なり得る。ほとんどの転位性エレメ
ントは、その末端に、逆方向反復配列を有する。これらの末端逆方向反復は、数
塩基〜数百塩基長のいずれかであり得、そして多くの場合、これらは、転位のた
めに必要であることが公知である。
【００６９】 真核生物のエレメントは、その構造および転位の機構に従って、分類され得る
。ＲＮＡ中間体を介して転位するエレメントとＤＮＡからＤＮＡへ直接転位する
エレメントとの間に主な区別がある。
【００７０】 ＲＮＡ中間体を介して転位するエレメントは、しばしば、レトロトランズポゾ
ンといわれ、その最も特徴的な性質は、これらが、逆転写酵素活性を有すると考
えられるポリペプチドをコードすることである。２つの型のトランスポゾンが存
在する。いくつかは、各末端に長直列反復配列、長末端反復（ＬＴＲ）を有する
点で、レトロウイルスの組み込まれたプロウイルスＤＮＡと類似する。これらの
レトロトランズポゾンとプロウイルスとの間の類似性は、コード能力に広がる。
これらは、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子に関連する配列を
含み、このことは、これらが、レトロウイルスの生活環に関連する機構によって
転位することを示唆する。第二の型のレトロトランスポゾンは、末端反復を有さ
ない。これらはまた、ｇａｇ様ポリペプチドおよびｐｏｌ様ポリペプチドをコー
ドし、そしてＲＮＡ中間体の逆転写によって転位するが、レトロウイルスまたは
レトロウイルス様のエレメントとは異なる機構で転位する。逆転写による転位は
、複製的なプロセスであり、そしてドナー部位からのエレメントの切除を必要と
しない。
【００７１】 転位性エレメントは、自然発生的変異の重要な供給源であり、そして遺伝子お
よびゲノムが進化してきた道程に影響してきた。これらは、遺伝子内に挿入する
ことによって遺伝子を不活化し得、そしてそのトランスポザーゼ活性を介して直
接的にか、またはゲノム中に散らばるエレメントのコピー間の組換えの結果とし
て間接的にかのいずれかで、全体の染色体再編成を生じ得る。転位性エレメント
は、しばしば、不正確に切除し、そして付加または欠失された塩基の数が３の倍
数である場合、変更された遺伝子産物をコードする対立遺伝子を生成し得る。
【００７２】 転位性エレメント自体は、異常な方法で進化し得る。これらが、他のＤＮＡ配
列のように遺伝しない場合、１つの種におけるエレメントのコピーは、より離れ
た種におけるコピーよりも密接に関連した種におけるコピーに、より類似する。
これは、常に起こるわけではないが、転位性エレメントが時々、１つの種から別
の種へ水平的に伝達されることを示唆する。
【００７３】 （ｂ）化学的変異誘発） 化学的変異誘発は、特定の利点（例えば、表現型の重症度の程度によって、全
範囲の変異対立遺伝子を見出す能力）を提供し、そして実施が容易かつ安価であ
る。化学的発癌物質の大多数は、ＤＮＡ中に変異を生成する。ベンゾ［ａ］ピレ
ン、Ｎ−アセトキシ−２−アセチルアミノフルオレンおよびアフラトキシン（ａ
ｆｌｏｔｏｘｉｎ）Ｂ１は、細菌および哺乳動物細胞においてＧＣからＴＡへの
塩基転換を生じる。ベンゾ［ａ］ピレンはまた、ＡＴからＴＡへのような塩基置
換を生成する。Ｎ−ニトロソ化合物は、ＧＣからＡＴへの塩基転換を生成する。
チミンのＯ４位のアルキル化は、ｎ−ニトロソウレアに対する曝露によって誘導
され、ＴＡからＣＧへの塩基転換を生じる。
【００７４】 変異原性と発癌性との間の高い相関は、Ａｍｅｓ試験（ＭｃＣａｎｎら、１９
７５）の背景の根底となる仮定であり、この試験は、添加されたラット肝臓ホモ
ジネート（これは、ミクロソームチトクロームｐ４５０を含み、必要とされる場
合、変異原の代謝活性を提供する）と共に、細菌系における変異についてすばや
くアッセイする。
【００７５】 脊椎動物において、いくつかの発癌物質が、ｒａｓ前癌遺伝子中に変異を生成
することが見出された。Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレアは、ラットにおいて乳
癌、前立腺癌などの癌を誘導し、そして腫瘍の大多数は、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子
のコドン１２の２番目の位置でＧからＡへの転換を示す。ベンゾ［ａ］ピレン誘
導皮膚腫瘍は、Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の２番目のコドン中にＡからＴへの塩基転換
を含む。
【００７６】 （ｃ）放射能変異誘発） 生物学的分子の統合性は、電離放射線によって分解される。入射エネルギーの
吸収は、イオンおよびフリーラジカルの形成、ならびにいくつかの共有結合の切
断を生じる。放射線損傷に対する感受性は、分子間で、そして同じ分子の異なる
結晶形成の間で非常に多様であるようである。これは、総累計線量に依存し、そ
してまた、線量率に依存する（一旦フリーラジカルが存在すると、これらが引き
起こす分子損傷は、フリーラジカルの天然の拡散速度、従って実時間に依存する
）。損傷は、可能な限りサンプルを冷却することによって、減少および制御され
る。
【００７７】 電離放射線は、一般には線量率に比例して、ＤＮＡ損傷および細胞の殺傷を生
じる。電離放射線は、ＤＮＡとの直接の相互作用によって、またはＤＮＡ損傷を
生じるフリーラジカル種の形成を介して（Ｈａｌｌ、１９８８）、複数の生物学
的効果を誘導するために、必要とされる。これらの効果としては、遺伝子変異、
悪性形質転換および細胞殺傷が挙げられる。電離放射線は、いくつかの原核生物
および下等真核生物細胞において特定のＤＮＡ修復遺伝子の発現を誘導するが、
哺乳動物遺伝子発現の調節に対する電離放射線の効果については、ほとんど知ら
れていない（Ｂｏｒｅｋ、１９８５）。いくつかの研究が、哺乳動物細胞の照射
後に観察されるタンパク質合成のパターンにおける変化を説明した。例えば、ヒ
ト悪性黒色腫細胞の電離放射線処置は、いくつかの未同定タンパク質の誘導に関
連する（Ｂｏｏｔｈｍａｎら、１９８９）。サイクリンおよび同時調節されたポ
リペプチドの合成は、ラットＲＥＦ５２細胞においては電離放射線によって抑制
されるが、癌遺伝子が形質転換されたＲＥＦ５２細胞株においては、抑制されな
い（ＬａｍｂｅｒｔおよびＢｏｒｅｋ、１９８８）。他の研究は、特定の増殖因
子またはサイトカインが、ｘ線誘導ＤＮＡ損傷に関与し得ることを実証した。こ
れに関して、血小板由来増殖因子が、照射後の内皮細胞から放出される（Ｗｉｔ
ｔｅら、１９８９）。
【００７８】 本発明において、用語「電離放射線」は、十分なエネルギーを有するか、また
はイオン化（電子の獲得または喪失）を生成するために核相互作用を介して十分
なエネルギーを生成し得る、粒子または光子含む放射能を意味する。例示的かつ
好ましい電離放射線は、ｘ線放射である。所定の細胞において必要な電離放射線
の量は、一般に、その細胞の性質に依存する。代表的には、有効な発現誘導線量
は、細胞損傷または細胞死を直接引き起こす電離放射線の線量より低い。有効量
の放射能を決定するための手段は、当該分野で周知である。
【００７９】 特定の実施形態において、有効な発現誘導量は、約０．５〜約２Ｇｙ／分の速
度で投与される約２〜約３０Ｇｒａｙ（Ｇｙ）である。さらにより好ましくは、
有効な発現誘導量の電離放射線は、約５〜約１５Ｇｙである。他の実施形態にお
いて、２〜９Ｇｙの線量が、一回の投与において使用される。有効線量の電離放
射線は、１０〜１００Ｇｙであり得、１５〜７５Ｇｙが好ましく、そして２０〜
５０Ｇｙがより好ましい。
【００８０】 組織に放射線を送達するための任意の適切な手段は、外部手段に加えて、本発
明において使用され得る。例えば、放射線は、腫瘍の抗原と免疫反応する放射能
標識抗体を最初に提供し、次に有効量の放射能標識抗体を腫瘍に送達することに
よって、送達され得る。さらに、放射性同位体を使用して、組織または細胞に電
離放射線を送達し得る。
【００８１】 （ｄ）インビトロのスキャニング変異誘発） ランダム変異誘発はまた、誤りがちなＰＣＲを使用して導入され得る（Ｃａｄ
ｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ、１９９２）。変異誘発の速度は、テンプレートを希
釈して複数のチューブでＰＣＲを実行することによって、増大され得る。
【００８２】 １つの特に有用な変異誘発技術は、アラニンスキャニング変異誘発であり、こ
こで、多くの残基が、アミノ酸アラニンによって個々に置換され、その結果、側
鎖の相互作用の喪失の効果が決定され得、一方でタンパク質コンフォメーション
における大規模な混乱の危険性を最小化する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９８
９）。
【００８３】 近年、極少量のタンパク質を使用してリガンド結合についての平衡定数を推定
するための技術が、開発された（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、１９９１；米国特許第
５，２２１，６０５号および同第５，２３８，８０８号）。少量の物質を用いて
機能的なアッセイを実施する能力は、高い効率、抗体の飽和変異誘発についての
インビトロの方法論を開発するために、開発され得る。本発明者らは、タンパク
質変異体の高スループット生成のための、インビトロの転写／翻訳と組み合わせ
たＰＣＲ変異誘発を組み合わせることによって、クローニング工程を省いた。こ
こで、このＰＣＲ産物は、変異単鎖抗体のインビトロの転写／翻訳のためのテン
プレートとして直接使用される。１９全てのアミノ酸による置換がこの方法によ
って生成および分析され得る高い効率に起因して、現在、目的の多くの残基上の
飽和変異誘発、インビボのスキャニング飽和変異誘発として記載され得るプロセ
ス（Ｂｕｒｋｓ、１９９７）を実行することが可能である。
【００８４】 インビトロのスキャニング飽和変異誘発は、以下を含む大量の機能−構造情報
を獲得するための迅速な方法を提供する：（ｉ）リガンド結合特異性を調節する
残基の同定、（ｉｉ）所定の位置で活性を保持するアミノ酸の同定および活性を
消去するアミノ酸の同定に基づいた、リガンド結合のよりよい理解、（ｉｉｉ）
活性化部位またはタンパク質サブドメインの全体的柔軟性の評価、（ｉｖ）結合
の増大を生じるアミノ酸置換の同定。
【００８５】 （ｅ）フラグメント化および再組立によるランダム変異誘発） 提示されたポリペプチドのライブラリーを生成するための方法は、米国特許第
５，３８０，７２１号に記載される。この方法は、ポリヌクレオチドライブラリ
ーメンバーを獲得する工程、ポリヌクレオチドをプールおよびフラグメント化す
る工程、ならびにこれら由来のフラグメントを再形成する工程、ＰＣＲ増幅を実
施し、それによってフラグメントを均質に組み合わせて、組み換えられたポリヌ
クレオチドのシャッフルされたプールを形成する工程を包含する。
【００８６】 （２．部位特異的変異誘発） 構造誘導性部位特異的変異誘発は、タンパク質−リガンド相互作用の分析およ
び操作のための強力な手段を代表する（Ｗｅｌｌｓ、１９９６、Ｂｒａｉｓｔｅ
ｄら、１９９６）。この技術は、選択されたＤＮＡに１以上のヌクレオチド配列
の変化を導入することによる、配列改変体の調製および試験を提供する。
【００８７】 部位特異的変異誘発は、所望の変異、ならびに十分な数の隣接した未改変のヌ
クオレチドのＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列を使用する
。この様式では、横断された欠失接合部の両側に安定した二重鎖を形成するのに
十分なサイズおよび複雑性を有するプライマー配列が提供される。変更される配
列の接合部の両側に約５〜１０残基を有する、約１７〜２５ヌクレオチド長のプ
ライマーが好ましい。
【００８８】 この技術は、代表的に、一本鎖および二本鎖形態の両方で存在するバクテリオ
ファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発において有用なベクターとし
ては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージベクタ
ーは、市販されており、そしてこれらの使用は、一般に、当業者に周知である。
二本鎖プラスミドはまた、部位特異的変異誘発において慣用的に使用され、部位
特異的変異誘発は、ファージからプラスミドへの目的の遺伝子の移入の工程を排
除する。
【００８９】 一般に、最初に一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクター（これは、所
望のタンパク質または遺伝子エレメントをコードするＤＮＡ配列をその配列中に
含む）の二本の鎖を融解する。次いで、所望の変異配列を保有するオリゴヌクレ
オチドプライマー（合成的に調製される）は、ハイブリダイゼーション条件を選
択する際にミスマッチの程度を考慮して、一本鎖ＤＮＡ調製物とアニールされる
。ハイブリダイズした産物は、変異保有鎖の合成を完成するために、Ｅ．ｃｏｌ
ｉポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）のようなＤＮＡ重合酵素に供さ
れる。従って、ヘテロ二重鎖が形成され、ここで、１つの鎖は、本来の非変異配
列をコードし、そして第２の鎖は、所望の変異を保有する。次いで、ヘテロ二重
鎖ベクターを使用して、適切な宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転
換し、そして変異された配列構成を保有する組換えベクターを含むクローンが選
択される。
【００９０】 機能的重要性に関する包括的な情報およびタンパク質の所定の残基の情報内容
は、全ての１９アミノ酸置換が調査される飽和変異誘発によって、最も良く得ら
れ得る。このアプローチの欠点は、多重残基（ｍｕｌｔｉｒｅｓｉｄｕｅ）飽和
変異誘発のロジスティックが困難であるということである（Ｗａｒｒｅｎら、１
９９６、Ｂｒｏｗｎら、１９９６；Ｚｅｎｇら、１９９６；Ｂｕｒｔｏｎおよび
Ｂａｒｂａｓ、１９９４；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９
９５；Ｓｈｏｒｔら、１９９５；Ｗｏｎｇら、１９９６；Ｈｉｌｔｏｎら、１９
９６）。数百およびおそらく実に数千の部位特異的変異が研究されなければなら
ない。しかし、改善された技術は、変異体の生成および迅速なスクリーニングを
、はるかにより簡単にする。例えば、「通り抜け（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）
」変異誘発の記載については、米国特許第５，７９８，２０８号および同第５，
８３０，６５０号もまた参照のこと。
【００９１】 部位特異的変異誘発の他の方法は、米国特許第５，２２０，００７号；同第５
，２８４，７６０号；同第５，３５４，６７０号；同第５，３６６，８７８号；
同第５，３８９，５１４号；同第５，６３５，３７７号；および同第５，７８９
，１６６号において開示されている。
【００９２】 （合理的薬物設計） 合理的薬物設計の目的は、生物学的に活性な化合物の構造的アナログを生成す
ることである。このようなアナログを作製することによって、天然分子よりもよ
り活性であるかまたは安定な薬物、変更に対して異なる感受性を有する薬物、あ
るいは種々の他の分子の機能に影響し得る薬物を作製することが可能である。１
つのアプローチにおいて、Ｃ反応性タンパク質およびＣ反応性タンパク質もしく
はそのフラグメントのモジュレーターの三次元構造を作製する。これは、Ｘ線結
晶学、コンピューターモデリング、または両方のアプローチの組み合わせによっ
て達成され得る。代替的なアプローチは、Ｃ反応性タンパク質またはＣ反応性タ
ンパク質のモジュレーター全体にわたる官能基の無作為な置換を包含し、そして
機能に対して生じる影響が決定される。
【００９３】 機能的アッセイによって選択されたＣ反応性タンパク質またはＣ反応性タンパ
ク質特異的抗体のモジュレーターを単離し、次いでその結晶構造を解析すること
もまた可能である。原則として、このアプローチは、引き続く薬物設計の基礎と
なり得る薬物コア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生じる。機能的で薬理学的に活性
な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製することによって、タンパク質結晶
学を全部回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結
合部位は、本来の抗原のアナログであると予想される。次いで、抗イディオタイ
プを使用して、化学的または生物学的に生成されたペプチドのバンクからペプチ
ドを同定および単離し得る。次いで、選択されたペプチドは、薬物コアとして機
能する。抗イディオタイプ抗体は、抗原として抗体を使用して、抗体を生成する
ために本明細書中に記載された方法を使用して作製され得る。
【００９４】 （患者への投与のための処方物および経路） 臨床適用が意図される場合、薬学的組成物（発現ベクター、ウイルスストック
、タンパク質、抗体および薬物）を、意図される適用に適切な形態で調製するこ
とが必要である。一般に、これは、発熱物質およびヒトまたは動物に有害であり
得る他の不純物を基本的に含まない組成物を調製することを必然的に伴う。
【００９５】 一般に、送達ベクターを安定にしそして標的細胞による取り込みを可能にする
ための適切な塩および緩衝液を使用することが所望される。緩衝液はまた、組換
え細胞が患者に導入される場合に使用される。本発明の水性組成物は、薬学的に
受容可能なキャリアまたは水性媒体中に溶解または分散された、細胞に対して有
効量のベクターを含む。このような組成物はまた、接種材料といわれる。成句「
薬学的または薬理学的に受容可能な」は、動物またはヒトに投与される場合に、
有害な反応、アレルギー性反応、または他の不要な反応を生じない分子実体およ
び組成物をいう。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア
」は、任意および全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌
剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質についてのこのよ
うな媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または
薬剤が、本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除いて、治療組成物
におけるその使用が意図される。補助的な活性成分がまた、組成物に組み込まれ
得る。
【００９６】 本発明の活性組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。本発明に従うこれ
らの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の
一般の経路を介する。これらとしては、経口経路、経鼻経路、頬側経路、直腸経
路、膣経路または局所経路が挙げられる。あるいは、投与は、同所性注射、皮内
注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射による投与であり得
る。このような組成物はまた、通常、前出のように薬学的に受容可能な組成物と
して投与される。
【００９７】 活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与され得る。遊離塩基または薬理学
的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキ
シプロピルセルロース）と適切に混合した水中で調製され得る。分散剤はまた、
グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならび
に油中で調製され得る。貯蔵および使用の一般的な条件下で、これらの調製物は
、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【００９８】 注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性溶液または分散
物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる
。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易なシリ
ンジ利用能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に、流動性でなけれ
ばならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして
微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならな
い。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール
、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの
適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流
動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の
場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によ
って、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例
えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン
酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤
（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、好ましい。注射可能な組
成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノ
ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【００９９】 滅菌注射溶液は、上に列挙された種々の他の成分を含む適切な溶媒中に要求さ
れた量で活性な化合物を組み込み、必要ならば、続いてろ過滅菌することによっ
て調製される。一般に、分散物は、基本分散媒体、および上に列挙されたものに
由来する要求された他の成分を含む滅菌ビヒクルに種々の滅菌活性成分を組み込
むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合にお
いて、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末、および以前に滅菌ろ過したその
溶液から任意のさらなる所望の成分を生じる減圧乾燥技術および凍結乾燥技術で
ある。
【０１００】 本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意およ
び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならび
に吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の
使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不
適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助
的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。
【０１０１】 経口投与について、本発明の組成物は、賦形剤と共に組み込まれ得、そして摂
取不可能なうがい薬および歯みがき剤の形態で使用され得る。適切な溶媒（例え
ば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液））中に必要な量で活性成分を組
み込むうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、
グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む消毒洗浄液に組み込まれ得るこの活性
成分はまた、歯みがき剤に分散され得、これらとしては、ゲル、ペースト、粉末
およびスラリーが挙げられる。これらの活性成分は、治療的有効量で、水、結合
剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得るベースト状歯みがき剤に添
加され得る。
【０１０２】 本発明の組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能
な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙
げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢
酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カル
ボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム
、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）
、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど
の有機塩基から誘導され得る。
【０１０３】 処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投
与される。これらの処方物は、注射溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の
投薬形態で容易に投与される。例えば、水溶液での非経口投与のために、必要な
らばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に
、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は
、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適切である。こ
れに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知で
ある。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして
１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され
得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および
１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置
される被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与の責任者は、任意の事象に
おいて、個々の被験体について適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与につい
て、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄ
ａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、一般的な安全性標準およ
び純度標準を満たさなければならない。
【０１０４】 （実施例） 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。続く
実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能すると発明
者らによって発見された技術を示し、従ってその実施のための好ましい様式を構
成すると考えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当
業者らは、本発明の開示を考慮して、多数の変化が開示された特定の実施形態に
おいて行なわれ得、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様ま
たは類似な結果をなお得ることができることを理解する。
【０１０５】 （実施例１：Ｃ反応性タンパク質） 全ての実験を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙより）で実施した。ＨＵＶＥＣを、内皮細胞増殖補助因子、ヘパリンおよ
び１５％ウシ胎仔血清またはヒト血清を含むＭ１９９培地中で増殖した。細胞を
、２〜４継代（ｐａｓｓｅａｇｅ）で使用した。
【０１０６】 組換え体ヒトＣ反応性タンパク質およびヒト血清由来の高度に精製したＣ反応
性タンパク質を、Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。Ｃ反応性タンパク質調製物の純
度を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した；ロードしたゲルにおいて検出
される夾雑するタンパク質はなかった。インターロイキン−１は、ＲａｎｄＤ
ｓｙｓｔｅｍｓによって提供された。ヒト血清およびウシ胎仔血清を、Ｓｉｇｍ
ａから購入した。
【０１０７】 （実施例２：スクリーニングプロトコル） Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターを、標準的手順を使用してインビボまた
はインビトロでスクリーニングする。例えば、Ｃ反応性タンパク質を、候補物質
と接触または混合し、Ｃ反応性タンパク質と候補物質との間の相互作用を、ＦＡ
ＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロッティングおよび／またはウエスタンブロッテ
ィングを使用してアッセイする。
【０１０８】 Ｃ反応性タンパク質と候補物質との間の相互作用は、接着分子、レセプター、
シグナル伝達分子、サイトカインまたは酵素の発現の誘導を生じる。測定される
特定の終点または相互作用としては、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）誘
導、高グリケーション最終産物、単球化学誘引物質タンパク質−１、Ｐ−セレク
チン、エンドセリン−１、エンドセリンレセプター、インターロイキン−６また
はヘムオキシゲナーゼ−１についてのアッセイが挙げられ得る。
【０１０９】 他のスクリーニング法としては、候補物質の同定のための標識されたＣ反応性
タンパク質の使用が挙げられる。Ｃ反応性タンパク質を、標準的標識手順を使用
して標識する。このような標識としては、放射活性タグ、蛍光タグ、生物学的タ
グおよび酵素的タグが挙げられる。
【０１１０】 （実施例３：血清の存在下での接着分子の検出） ＨＵＶＥＣを、ヒトＣ反応性タンパク質と示された濃度で２４時間インキュベ
ートした。細胞を、ＰＢＳ中（トリプシンなし）１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡと
のインキュベーションによって剥離し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、そしてＰＢＳ中
１％のＦＢＳおよび０．１％のアジ化ナトリウムで懸濁した。次いで、細胞を、
接着分子ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）もしくはＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）に対す
るＲ−フィコエリトリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識化モノクローナル
抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、またはコントロールとしてフィコエリトリン標
識化アイソタイプＩｇＧで染色した。Ｅ−セレクチンの検出のために、ＨＵＶＥ
Ｃを、Ｃ反応性タンパク質とともに６時間インキュベーションし、次いで、Ｅ−
セレクチンに対するＦＩＴＣ標識化モノクローナル抗体（ＲａｎｄＤ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）または適切なアイソタイプコントロール（Ｐａｓｃｅｒｉら、２０００
）で染色した。Ｃ反応性タンパク質レセプターＦＣγＲＩおよびＦＣγＲＩＩ（
Ｍａｒｎｅｌｌら、１９９５；Ｂｈａｒａｄｗａｊら、１９９９）に対するＲ−
フィコエリトリン標識化モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）もまた、
使用した。
【０１１１】 染色手順を、３０分間氷上で実施し、続いて、洗浄した。各サンプルについて
、９０００個の細胞の蛍光強度を、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒＴＭ ａｎａｌｙ
ｓｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって定量した。全ての実験を
、３連で実施した。
【０１１２】 未刺激のＨＵＶＥＣは、低レベルのＩＣＡＭ−１を発現するが、ＶＣＡＭ−１
およびＥ−セレクチンを発現しなかった（図１）。ヒト血清を含むこれらの細胞
の培養物は、接着分子の発現の基準線を変化しなかった。組換え体Ｃ反応性タン
パク質（１０μｇ／ｍＬで２４時間）との完全なヒト血清インキュベーションで
培養した細胞において、ＩＣＡＭ−１発現およびＶＣＡＭ−１発現において大き
な増加を生じた（図１）。ヒト血清由来の高度に精製したＣ反応性タンパク質を
使用して、同様の結果を得た。接着分子の誘導は、１０ｎｇ／ｍＬのインターロ
イキン−１（内皮細胞のアクチベーターとして周知である）との２４時間のイン
キュベーションで観察されたものと類似した（図１）。Ｃ反応性タンパク質（お
よびインターロイキン−１）との２４時間のインキュベーション後にＥ−セレク
チン発現における増加はなかったが（Ｈａｒａｌｄｓｅｎら、１９９６）、１０
μｇ／ｍＬのＣ反応性タンパク質との６時間のインキュベーションは、Ｅ−セレ
クチンの顕著な増加を誘導した（図１）。ＩＣＡＭ−１発現およびＶＣＡＭ−１
発現に対するＣ反応性タンパク質の効果についての用量応答を、図２に示す。こ
の効果はすでに、５μｇ／ｍＬの濃度で明白であり、そして１０μｇ／ｍＬでほ
ぼ最大であったが、２００μｇ／ｍＬまでのＣ反応性タンパク質の濃度増加は、
接着分子のさらなる適度な誘導のみを生じた。
【０１１３】 本発明者らは、５μｇ／ｍＬ以上の濃度でＣ反応性タンパク質が内皮細胞にお
いて顕著なプロ炎症性効果を有し、高レベルのＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およ
びＥ−セレクチンの発現を誘導することを見出した。この知見は、Ｃ反応性タン
パク質のこの上位５分の１の濃度（すなわち、＞３．６μｇ／ｍＬ）におけるア
ンギナを有する患者での心臓の事象の危険性の増加（Ｈａｖｅｒｋａｔｅら、１
９９７）を示す、これまでに見込まれた多くの研究の結果に十分匹敵する。最大
の効果は、すでにたった１０μｇ／ｍＬの濃度で見られ、これは、難治性の不安
定アンギナを有する患者における平均値に近い（Ｌｉｕｚｚｏら、１９９４）。
内皮細胞に対するＣ反応性タンパク質のプロ炎症性効果の機構は、完全には明ら
かではない。
【０１１４】 （実施例４：血清の非存在下での接着分子の検出） ＨＵＶＥＣを、血清の非存在下で行う以外は実施例２と同様にヒトＣ反応性タ
ンパク質とインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中（トリプシンなし）１０ｍｍ
ｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡとのインキュベーションによって剥離し、ＰＢＳ緩衝液で洗
浄し、ＰＢＳ中０．１％のアジ化ナトリウムで懸濁した。次いで、細胞を、接着
分子ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）もしくはＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）に対するＲ
−フィコエリトリン標識化モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、また
はコントロールとしてフィコエリトリン標識化アイソタイプＩｇＧで染色した。
Ｅ−セレクチンの検出のために、ＨＵＶＥＣを、Ｃ反応性タンパク質とともに６
時間インキュベーションし、次いで、Ｅ−セレクチンに対するＦＩＴＣ標識化モ
ノクローナル抗体（ＲａｎｄＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または適切なアイソタイプコ
ントロール（Ｐａｓｃｅｒｉら、２０００）で染色した。Ｃ反応性タンパク質レ
セプターＦＣγＲＩおよびＦＣγＲＩＩ（Ｍａｒｎｅｌｌら、１９９５；Ｂｈａ
ｒａｄｗａｊら、１９９９）に対するＲ−フィコエリトリン標識化モノクローナ
ル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）もまた、使用した。
【０１１５】 染色手順を、３０分間氷上で実施し、続いて、洗浄した。各サンプルについて
、９０００個の細胞の蛍光強度を、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒＴＭ ａｎａｌｙ
ｓｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって定量した。全ての実験を
、３連で実施した。
【０１１６】 無血清培地で培養したＨＵＶＥＣを用いて実施した実験は、１００μｇ／ｍＬ
のＣ反応性タンパク質とのインキュベーションが接着分子の発現を誘導し得なか
ったことを示した（図３）。これは、ＨＵＶＥＣが接着分子を誘導し得ないこと
に起因しなかった。なぜなら、インターロイキン−１は、同一の条件下で接着分
子を誘導し得たからである。
【０１１７】 従って、これらの結果は、Ｃ反応性タンパク質の効果が血清の存在に依存する
ことを明白に示す。これらの結果はまた、Ｃ反応性タンパク質効果が１以上の血
清補因子に依存することを示唆する。しかし、この機構は、種特異的であるよう
ではない。なぜなら、同様の結果がヒト血清でもウシ血清でも得られたからであ
る。Ｃ反応性タンパク質応答における血清の要求性はまた、ウシ血清またはモル
モット結成でも満たされ得、このことは、これらの血清因子がまた他の種にも存
在することを示唆する。
【０１１８】 （実施例５：血清存在下でのケモカインの検出） １０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を有する内皮細胞
基本培地ＣＳ−Ｃにて１２ウェルプレートで培養されたＨＵＶＥＣにおいて、実
験を実施した。培養物上清を、示された濃度のＩＬ−１βまたはＣＲＰのいずれ
かでの刺激の６〜２４時間後に回収した。ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳの分泌
を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによる、Ｃｏｌ
ｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）によって評価した。全ての決定を、
２連で実施した。データを、５〜６回の別々の実験の平均±ＳＤとして示した。
細胞生存度を、トリパンブルーでの染色によって評価した。
【０１１９】 図４Ａに示した２４時間の経時的研究において、１００μｇ／ｍＬの濃度での
ＣＲＰは、２４時間で最大効果（２４時間で７倍増加、Ｐ＝０．００１）を有す
る、ＭＣＰ−１の顕著な分泌を誘導する。２４時間インキュベーションで実施し
た用量応答実験は、すでに５μｇ／ｍＬでＭＣＰ−１の顕著な誘導を示し（基準
線で１．１±０．５ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬのＣＲＰで２．４±０．９）
、そして、１００μｇ／ｍＬでピークであった（９．７±４．８ｎｇ／ｍＬ、Ｐ
＝０．００１）（図４Ｃ）。Ｃ反応性タンパク質の最大効果は、１０ｎｇ／ｍＬ
のインターロイキン−１βとのインキュベーションの後に観察されるものと同様
であった（８．６±３．７ｎｇ／ｍＬ、図４Ｂ）。ＣＲＰ １００μｇ／ｍＬと
の２４時間のインキュベーションは、無血清培地でのＨＵＶＥＣにおいてＭＣＰ
−１濃度の顕著な増加を誘導しなかった（図４Ｃ）が、血清の非存在は、ＩＬ−
１βに対する応答を変化しなかった。
【０１２０】 ＲＡＮＴＥＳの分泌は、Ｃ反応性タンパク質 １００μｇ／ｍＬとのインキュ
ベーションによって増加しなかった（図４Ｂ）。同様に、インターロイキン−１
β １０ｎｇ／ｍＬとのインキュベーションは、ＲＡＮＴＥＳ発現を誘導しなか
った。
【０１２１】 （実施例６：ＳｔａｔｉｎアクチベーターおよびＰＰＡＲアクチベーターによ
るＣＲＰ効果の調節） 実験を、ＨＵＶＥＣにおいて実施した。細胞を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび
１５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を有する内皮細胞基本培地ＣＳ−Ｃにて１２ウェ
ルプレートで培養した。細胞をまた、ＰＰＡＲγアゴニスト（トログリタゾン（
ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、シグリタゾン（ｃｉ
ｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（Ｂｉｏｍｏｌ）、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロ
スタグランジン Ｊ２（１５ｄ−ＰＧＪ２、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより））、Ｐ
ＰＡＲαアゴニスト（フェノフィブレート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）およびＷ
ｙ１４６４９（Ｓｉｇｍａ））もしくはＨＭＧ−ＣｏＡアンタゴニスト（シンバ
スタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ））、またはビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ
またはＰＢＳ）を示した濃度で用いて前処理した。２時間後、これらの細胞を、
Ｃ反応性タンパク質またはＩＬ−１β １０ｎｇ／ｍＬとともに２４時間インキ
ュベートした。シンバスタチンプロドラッグ（Ｍｅｒｃｋ，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎ
ｔ，ＰＡ）を、記載される（Ｋｉｔａら、１９８０）ように活性化した。ＭＣＰ
−１およびＲＡＮＴＥＳの分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ ａｎｄ Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓによる、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）に
よって評価した。全ての決定を、２連で実施した。データを、５〜６回の別々の
実験の平均±ＳＤとして示した。細胞生存度を、トリパンブルーでの染色によっ
て評価した。
【０１２２】 ＭＣＰ−１の誘導に対するシンバスタチンおよびいくつかのＰＰＡＲアクチベ
ーターでの前処理の効果を、表１に示す。５μＭ シンバスタチンは、ＣＲＰに
よって誘導されるＭＣＰ−１の分泌を顕著に減少した（最大応答の約４３％）。
アスピリンは、高濃度（１ｍＭまで）でさえ、Ｃ反応性タンパク質の効果を阻害
しなかった。ＰＰＡＲγアクチベーターであるトログリタゾンおよびシグリタゾ
ンは、低濃度では顕著な効果を示さなかったが、高濃度（２００μＭ シグリタ
ゾン）でのみＭＣＰ−１分泌を顕著に阻害した。しかし、１０μＭの１５ｄ−Ｐ
ＧＪ２は、ＣＲＰによるＭＣＰ−１の誘導をほぼ完全になくした。ＰＰＡＲαア
クチベーターであるフェノフィブレート（１００μＭ）およびＷｙ１４６４９（
１００μＭ）は、ＭＣＰ−１の分泌を完全に阻害したが、低濃度（１０μＭ）で
のＷｙ１４６４９は、効果がなかった。
【０１２３】 （表１：ＣＲＰによるＭＣＰ−１誘導に対するシンバスタチン、およびＰＰＡ
Ｒアクチベーターの効果）
【０１２４】
【表１】 値は、平均±ＳＤまたはパーセントである。＊ ｐ＜０．０５対ＣＲＰ １００μｇ／ｍＬ単独。値は、平均±ＳＤまたはパー
セントである。＊ ｐ＜０．０５対ＣＲＰ １００μｇ／ｍＬ単独。
【０１２５】 （実施例７：予防的投与） モジュレーターを、炎症の危険性のあるかまたは炎症に罹患している被験体に
、所望の結果を得るために有効量で薬学的組成物中にて投与し得る。
【０１２６】 モジュレーターを、不安定アンギナまたは急性心筋梗塞を有する被験体に投与
する。所望の結果を得るための投与経路を、この疾患または状態に基づいて決定
する。当業者は、本明細書の教示を採用し得、そして適切な臨床試験および処置
プロトコル戦略を処方する。
【０１２７】 本明細書中で開示され請求される組成物および方法の全ては、本開示の観点か
ら過度の実験をすることなく作製および実施され得る。本発明の組成物および方
法が好ましい実施形態として記載されるが、本発明の概念、精神および範囲から
逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および方法ならびに方法の工
程および方法の工程の順序に対して、改変が適用され得ることは、当業者には明
白である。より特定には、化学的および物理的の両方で関連する特定の因子が本
明細書中に記載される因子に置換され得るが同一または類似の結果が達成される
ことは、明白である。当業者に明白であるこのような類似の置換および改変の全
ては、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神、範囲およ
び概念内であるとみなされる。
【０１２８】 （参考文献） 本明細書中に記載されるものの例示の手順または他の詳細な補遺を提供する点
で、以下の参考文献は、参考として本明細書中に援用される。
【０１２９】
【化１】
【０１３０】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆは、Ｃ反応性タンパク
質による接着分子発現の誘導である。ＩＣＡＭ−１発現の大幅な増大（図１Ａ）
およびＶＣＡＭ−１発現の有意な増大（図１Ｂ）は、１０μｇ／ｍＬのＣ反応性
タンパク質とのＨＵＶＥＣの２４時間のインキュベーションによって誘導された
。１０μｇ／ｍＬのＣ反応性タンパク質との６時間のインキュベーションはまた
、Ｅ−セレクチン発現における有意な増大を誘導した（図１Ｃ）。インターロイ
キン−１（同じ時間間隔で１０ｎｇ／ｍＬ）とのインキュベーションは、Ｃ反応
性タンパク質について観察された誘導と類似の、接着分子発現の誘導を生じた（
図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆ）。実験を、第２継代ＨＵＶＥＣにおいて１５％ヒ
ト血清を用いて行った。
【図２】 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ヒト血清の存在下
での、ＩＣＡＭ−１発現（図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃ）ならびにＶＣＡＭ−１
発現（図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆ）についてのＣ反応性タンパク質の用量応答
である。接着分子発現の増大は、５μｇ／ｍＬで既に明らかであり（図２Ａおよ
び図２Ｄ）、そして１０μｇ／ｍＬでほぼ最大であった（図２Ｂおよび図２Ｅ）
。１００μｇ／ｍＬまでのＣ反応性タンパク質濃度のさらなる増大（図２Ｃおよ
び図２Ｆ）は、接着分子発現におけるさらなる穏やかな増大のみを生じた。実験
は、１５％ヒト血清を用いて培養した第４継代細胞で行った。
【図３】 図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、Ｃ反応性タンパク質１００μｇ／ｍＬとのイ
ンキュベーション（ＩＣＡＭ−１（図３Ａ）およびＶＣＡＭ−１（図３Ｂ）につ
いて２４時間、ならびにＥ−セレクチン（図３Ｃ）について６時間）が、無血清
培地中で培養したＨＵＶＥＣにおける接着分子の発現を誘導しないことを示す。
【図４】 図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＭＣＰ−１
およびＲＡＮＴＥＳの産生に対するＣ反応性タンパク質の効果である。図４Ａ：
ＣＲＰ １００μｇ／ｍＬとのインキュベーションの間のＭＣＰ−１の産生の時
間経過。ＭＣＰ−１の産生を、ヒトアルブミン１００μｇ／ｍＬと共に同じ時間
にわたってインキュベートしたＨＵＶＥＣと比較した、ＭＣＰ−１濃度における
増大倍率として表した。図４Ｂ：ＣＲＰ １００μｇ／ｍＬとのインキュベーシ
ョンの間のＲＡＮＴＥＳの産生の時間経過。図４Ｃ：ＭＣＰ−１の産生に対する
、ＣＲＰとの２４時間のインキュベーションの効果の用量応答；ＣＲＰの濃度を
、μｇ／ｍＬで表した。ＮｏＳは、無血清条件でのＣＲＰ １００μｇ／ｍＬと
のインキュベーションを示す。全ての他の実験を、１５％ヒト血清の存在下で行
った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 29/00 29/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィラーソン， ジェイムズ ティー． アメリカ合衆国 テキサス 77005， ヒ ューストン， ジョージタウン 3314 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BA13 BB03 BB20 CA26 CB01 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB04 FB06 4B024 AA01 BA07 BA21 BA63 BA80 CA02 HA01 HA06 HA17 4B063 QA06 QQ08 QQ21 QQ79 QR01 QR48 QR77 QS33 QX02 4C084 AA16 MA52 MA55 MA57 MA59 MA65 MA66 NA14 ZC41

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターについてスクリーニン
    グする方法であって、以下： Ｃ反応性タンパク質を得る工程； 該Ｃ反応性タンパク質に少なくとも第１の候補物質を接触させる工程；および アッセイを用いて該Ｃ反応性タンパク質と該第１の候補物質との間の相互作用
    をアッセイする工程 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記アッセイが、接着分子の発現のＣ反応性タンパク質誘導
    についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記接着分子が、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭまたはＥ−セレク
    チンである、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第１の候補物質が、前記接着分子のＣ反応性タンパク質
    誘導性発現を阻害する、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第１の候補物質が、前記接着分子のＣ反応性タンパク質
    誘導性発現を増強する、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記アッセイが、レセプター、シグナル伝達分子、サイトカ
    イン、接着分子または酵素の発現のＣ反応性タンパク質誘導についてアッセイす
    ることを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記アッセイが、ｉＮＯＳ誘導、高グリケーション最終産物
    に対するレセプター、単球化学誘引タンパク質−１、Ｐ−セレクチン、エンドセ
    リン−１、エンドセリン−レセプター、インターロイキン−６またはヘムオキシ
    ゲナーゼ−１についてアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記Ｃ反応性タンパク質を得る工程が、トランスジェニック
    細胞または動物においてＣ反応性タンパク質を発現させることを含む、請求項１
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記Ｃ反応性タンパク質が、該Ｃ反応性タンパク質に第１の
    候補物質を接触させる前に細胞において発現される、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記Ｃ反応性タンパク質を得る工程が、発現させたＣ反応
    性タンパク質を獲得することを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記Ｃ反応性タンパク質が、細胞からの単離によって獲得
    される、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記細胞が、Ｃ反応性タンパク質をコードする組換え核酸
    配列を含み、そして該Ｃ反応性タンパク質が、該組換え核酸配列から発現される
    、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記Ｃ反応性タンパク質が、血清から単離される、請求項
    １０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記血清が、ヒト血清である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記Ｃ反応性タンパク質に第１の候補物質を接触させる前
    記工程が、Ｃ反応性タンパク質を含む組成物中で細胞をインキュベートすること
    を含む、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記細胞が、Ｃ反応性タンパク質および血清とインキュベ
    ートされる、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記血清が、ヒト血清である、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記細胞が、ヒト臍静脈内皮細胞である、請求項１８に記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記細胞が、動物中に含まれる、請求項１５に記載の方法
    。
  21. 【請求項２１】 前記動物が、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記Ｃ反応性タンパク質が、前記動物に注射される、請求
    項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記第１の候補物質が、前記動物に注射される、請求項２
    ０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記第１の候補物質が、血清中に含まれる、請求項１に記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記血清が、ヒト血清である、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記第１の候補物質が、前記Ｃ反応性タンパク質に該第１
    の候補物質を接触させる工程の前に血清と混合される、請求項２４に記載の方法
    。
  27. 【請求項２７】 前記第１の候補物質が、天然に存在する血清中に含まれる
    、請求項２４に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記第１の候補物質の正体が、前記スクリーニング方法を
    行う前に知られている、請求項１に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記第１の候補物質の正体が、前記スクリーニング方法を
    行う前に知られていない、請求項１に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記第１の候補物質が、可能性のある候補物質の混合物中
    に含まれる、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記スクリーニング方法を行った後に前記第１の候補物質
    の正体を決定する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記スクリーニング方法を行った後に前記第１の候補物質
    を単離する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記スクリーニング方法を行った後に前記第１の候補物質
    の特性を決定する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 Ｃ反応性タンパク質調節性炎症を阻害する方法であって、
    以下： Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターを得る工程であって、該モジュレーター
    は、以下： Ｃ反応性タンパク質を得る工程； 該Ｃ反応性タンパク質に少なくとも第１の候補物質を接触させる工程；およ
    び アッセイを用いて該Ｃ反応性タンパク質と該第１の候補物質との間の相互作
    用をアッセイする工程 を包含する方法、によって同定される、工程； 薬学的に受容可能なキャリア中に該Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターを組
    み込み、薬学的組成物を形成する工程；および 該薬学的組成物を被験体に投与する工程 を包含する、方法。
  35. 【請求項３５】 前記モジュレーターが、心臓血管合併症の発症を阻害する
    、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記モジュレーターが、アンギナを患う被験体に与えられ
    る、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記モジュレーターが、心筋梗塞を患う被験体に与えられ
    る、請求項３５に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記モジュレーターが、アテローム性動脈硬化症または虚
    血性心疾患の危険性がある被験体に与えられる、請求項３５に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記モジュレーターが、予防的様式で前記被験体に与えら
    れる、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記モジュレーターが、心筋梗塞を患う被験体に与えられ
    る、請求項３５に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記モジュレーターが、発作の発症を阻害する、請求項３
    ４に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記モジュレーターが、炎症疾患の発症を阻害し、該炎症
    疾患が、Ｃ反応性タンパク質によって増強される、請求項３４に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記モジュレーターが、単回用量で与えられる、請求項３
    ４に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記モジュレーターが、連続用量で与えられる、請求項３
    ４に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記モジュレーターが、日用量で与えられる、請求項４４
    に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 Ｃ反応性タンパク質のモジュレーターであって、該モジュ
    レーターは、以下： Ｃ反応性タンパク質を得る工程； 該Ｃ反応性タンパク質に少なくとも第１の候補物質を接触させる工程； 該Ｃ反応性タンパク質と該第１の候補物質との間の相互作用をアッセイする工
    程；および 該候補物質がＣ反応性タンパク質のモジュレーターであることを、決定する工
    程 を包含する方法、によって産生される、モジュレーター。
  47. 【請求項４７】 前記モジュレーターが、薬学的に受容可能なキャリア中に
    含まれる、請求項４６に記載のモジュレーター。
  48. 【請求項４８】 改変されたモジュレーターについてスクリーニングする方
    法であって、第１の候補物質が、以下： Ｃ反応性タンパク質を得る工程； 該Ｃ反応性タンパク質に少なくとも第１の候補物質を接触させる工程； 該Ｃ反応性タンパク質と該第１の候補物質との間の相互作用をアッセイし、非
    改変モジュレーターの基準線を確立する工程； 該第１の候補物質を改変する工程； Ｃ反応性タンパク質に該改変された第１の候補物質を接触させる工程；および Ｃ反応性タンパク質の存在下で該改変されたモジュレーターとの相互作用をア
    ッセイし、そして該改変されたモジュレーターの相互作用を該非改変モジュレー
    ターの確立された基準線と比較する工程 を包含する方法、によって単離される、方法。
  49. 【請求項４９】 前記第１の候補物質を改変する工程が、該第１の候補物質
    のアミノ酸配列または核酸配列の改変を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記改変された核酸配列が、発現ベクター中に挿入される
    、請求項４８に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記発現ベクターが、レポーター分子を含む、請求項５０
    に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記発現ベクターが、細胞にトランスフェクトされる、請
    求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記細胞が、胚性幹細胞である、請求項５２に記載の方法
    。
  54. 【請求項５４】 トランスフェクトされた胚性幹細胞が胚盤胞に移植され、
    トランスジェニックマウスが作製される、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記改変された核酸配列が胚に注射され、トランスジェニ
    ック動物が作製される、請求項４９に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記第１の候補物質が、レセプター、シグナル伝達分子、
    サイトカイン、接着分子または酵素である、請求項４９に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 トランスフェクション後に前記レポーター分子を測定する
    工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記レポーター分子を測定する工程が、タンパク質発現、
    タンパク質活性または結合活性の測定を含む、請求項５７に記載の方法。
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