KR101006793B1 - 라벨 없는 바인딩 검출 및 형광 증폭과 조합된 격자-기반센서 및 센서를 위한 판독 시스템 - Google Patents

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스테판 씨. 슐츠
브리안 티. 커닝엄
란스 지. 라잉
피터 와이. 리
브란트 빈더
강아드하르 조기칼마쓰
알렉스 보르소디
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에스알유 바이오시스템즈, 인코포레이티드
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Abstract

소산 공명(ER) 형광 검출 및 라벨 없는 검출 애플리케이션들을 위해 설계되고 구성되는 격자 구조물을 갖는, 격자 기반 센서가 개시된다. 샘플이 건조되는 공기 모드에서 ER 검출을 위해 최적화되는 몇몇 실시예들이 개시된다. 다른 실시예들은 샘플이 물과 같은 액체 매체에서 부유되는 액체 모드에서 ER 검출을 위해 최적화된다. 또한, 중심 포스트들, 중심 홀들, 및 2-레벨, 2차원 격자들을 갖는 단위 셀들을 특징으로 하는 격자들을 포함하는, 1차원 및 2차원 격자들이 개시된다. 그러한 센서들을 위한 판독 시스템 또한 개시된다. 하나의 실시예는 라벨 없는 검출 데이터를 수집하기 위해 최적화되는 제 1 광원, ER 형광 증폭 데이터를 수집하기 위해 최적화되는 제 2 광원, 및 적어도 하나의 검출기를 포함한다. 제 1 실시예에서, 검출기는 영상 시스템이고, ER 및 라벨 없는 데이터를 수집하기 위한 CCD 카메라를 포함한다. 다른 실시예들에서, 적어도 하나의 검출기는 라벨 없는 데이터의 수집을 위한 분광기, 및 ER 데이터의 수집을 위한 광증배기의 형태를 갖는다. 다른 실시예들에서, 파장-가변 레이저 또는 광대역 광원과 같은 단일 광원이 사용된다.

Description

라벨 없는 바인딩 검출 및 형광 증폭과 조합된 격자-기반 센서 및 센서를 위한 판독 시스템{GRATING-BASED SENSOR COMBINING LABEL-FREE BINDING DETECTION AND FLUORESCENCE AMPLIFICATION AND READOUT SYSTEM FOR SENSOR}
본 출원은 35 U.S.C. §119 (e) 하에서 이하의 미국 가특허출원들에 대한 장점들을 청구하며, 그 전체 내용들은 참조로 본 발명에 포함된다:
(1) 2005년 8월 11일자로 제출된, 일련번호 60/707,579
(2) 2005년 9월 2일자로 제출된, 일련번호 60/713,694
(3) 2006년 2월 28일자로 제출된, 일련번호 60/778,160
(4) 2006년 4월 7일자로 제출된, 일련번호 60/790,207.
본 발명은 일반적으로 격자-기반 생화학 센서 소자들 및 그러한 소자들을 위한 검출 기기들에 관한 것이다. 격자-기반 센서들은 전형적으로 소자의 표면으로 또는 소자의 부피 내로 DNA, 단백질, 바이러스 또는 세포, 저분자, 또는 화학제들과 같은 생물학적 물질의 흡수의 광학 검출을 위해 사용된다. 본 발명의 센서는 2개의 상이한 애플리케이션들에 사용하기 위한 방식으로 구성되는 격자 구조를 갖는다: (a) 라벨 없는 바인딩(label-free binding) 검출, 및 (b) 형광 검출, 예를 들어, 샘플이 형광체(fluorophore)에 한정되거나 천연 형광(native fluorescence)을 방출한다.
1. 라벨 없는(label-free: 비표지) 검출 센서들
격자-기반 센서들은 100nm 미만의 정확도로 물질들을 정확히 증착 및 식각하는 성능을 갖는 반도체 제조 툴들에서 최근에 개발되었던 광학 장치들의 새로운 클래스를 나타낸다.
광자 결정들의 몇가지 특성들로 인해 격자-타입의 광 바이오센서들로서 애플리케이션에 대한 이상적인 후보들이 된다. 첫째, 광자 결정의 반사율/투과율 특성은 결정상에서 단백질들, DNA, 세포들, 바이러스 입자들, 및 박테리아와 같은 생물학적 물질의 흡수에 의해 용이하게 조정될 수 있다. 검출될 수 있는 다른 타입의 생물학적 실재물들(entities)은 저분자 및 보다 저분자량 분자들(즉, 분자량 < 1000 Daltons(Da) 및 1000 Da 내지 10,000 Da), 아미노산, 핵산, 지방질(lipid), 탄수화물, 핵산 폴리머들, 바이러스 입자들, 바이러스 성분들, 및 이에 제한됨이 없이, 수포들(vesicles), 미토콘드리아, 막(membranes), 구조적 피쳐들, 주변세포질(periplasm), 또는 이들의 임의의 추출물들과 같은 세포 성분들을 포함한다. 이러한 타입의 물질들은 이들의 유한한 유전체 유전율에 의해 이들을 통과하는 광의 광학 경로 길이를 변경하는 능력을 입증하였다. 둘째, 광자 결정들의 반사/투과 스펙트럼은 매우 협소할 수 있고, 간단한 조명과 검출 장치를 이용하여 생화학적 바인딩으로 인한 이들의 광학 특성들의 시프트들의 고해상도 검출을 가능하게 한다. 셋째, 광자 결정 구조들은 전자기장 전파를 매우 국부화하도록 설계될 수 있어서, 단일 광자 결정 표면이 < 3-5마이크론 내에서 인접 영역들 사이의 광 간섭 없이, 대다수의 생화학적 바인딩 이벤트들의 측정을 평행하게 보조하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 광범위한 물질들과 제조 방법들은 높은 표면/부피 비율들을 갖고, 및 생화학적 테스트 샘플과 접촉되는 영역들에서 전자기장 세기를 집중시키기 위한 성능을 갖는, 실제적인 광자 결정 소자들을 형성하는데 사용될 수 있다. 물질들과 제조 방법들은 플라스틱-기질 물질들을 이용하는 고용량 제조, 또는 반도체 물질들을 이용하는 고감도 성능을 최적화하도록 선택될 수 있다.
종래기술의 격자-타입 바이오센서들의 대표적인 예들은 Cunningham, B.T., P. Li, B. Lin, 및 J. Pepper, "Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique", Sensors and Actuators B, 2002. 81: p.316-328; Cunningham, B.T., Qiu, P. Li, J. Pepper, 및 B. Hugh, "A plastic colorimetric resonant optical biosensor for multiparallel detection of label-free biochemical interactions", Sensors and Actuators B, 2002. 85: p. 219-226; Haes, A.J. 및 R.P.V. Duyne, "A Nanoscale Optical Biosensor: Sensitivity and Selectivity of an Approach Based on the Localized Surface Plasmon Resonance Spectroscopy of Triangular Silver Nanoparticles", Journal of the American Chemical Society, 2002. 124: p. 10596-10604.
광자 결정 바이오센서들의 조합된 장점들은 임의의 다른 라벨 없는 바이오센서 기술에 의해 초과되지 않을 수 있다. 고감도의 소형, 저비용, 고 평행 바이오센서들, 및 간단한 소형의 울퉁불퉁한(rugged) 판독 기기는 의약품 개발, 진단 테스트, 환경 테스트, 및 과거에 경제적으로 실현가능하지 않았던 애플리케이션들의 식품 안전성 분야들에 바이오센서들이 적용될 수 있도록 할 것이다.
바이오센서로 수행되는 광자 밴드갭 장치를 적용하기 위해, 구조의 일부분은 테스트 샘플과 접촉되어야 한다. 바이오분자들, 세포들, 단백질들, 또는 다른 물질들은 광자 결정의 부분에 유입되고 흡수되며, 국부적으로 한정된 전자기장 세기는 가장 크다. 결과적으로, 결정으로 광의 공명 결합(resonant coupling)은 변형되고, 반사된/투과된 출력(즉, 피크 파장)은 조정되며, 즉 시프트된다. 반사된 출력에서 시프트의 양은 센서상에 나타나는 물질의 양에 관련된다. 센서들은 광이 센서로 지향되고 반사되거나 투과된 광을 캡쳐하는 조명 및 검출 기기와 연계하여 사용된다. 반사되거나 투과된 광은 피크 파장에서 시프트를 측정하는 분광기로 공급된다.
또한, 고품질 팩터(Q) 공명 광 결합, 높은 전자기 에너지 밀도, 및 긴밀한 광집중(tight optical confinement)을 제공하는 광자 결정들의 성능은 고감도 생화학 센서들을 제조하기 위해 개발될 수 있다. 여기서, Q는 공명 주파수에서 피크 파장의 선명도의 측정값이다. 광자 결정 바이오센서들은 테스트 샘플이 주기적인 격자를 관통할 수 있고, 바이오분자들 또는 세포들의 부착을 통한 결정의 표면 유전상수의 변경을 통해 공명 광 결합 조건을 조정할 수 있도록 설계된다. 표면-경계(surface-bound) 물질들과 결합된 전자기장들의 강한 상호작용, 및 공명의 높은 Q로 인해, 보고된 몇가지 고감도 바이오센서 소자들은 광자 결정들로부터 유도된다. 이전에 인용된 Cunningham 외를 참조한다. 그러한 소자들은 높은 신호-대-잡음 마진들을 가진 200 Daltons (Da) 미만의 분자량들을 갖는 분자들을 검출하고 개별적인 세포들을 검출하는 능력을 입증하였다. 광자 결정내에서 공명-결합된 광이 공간적으로 효과적으로 한정될 수 있기 때문에, 광자 결정 표면은 어레이 포맷에서 다수의 동시적인 생화학적 분석법들을 지원할 수 있고, 여기서 서로의 ~ 10㎛ 내에의 인접 영역들이 독립적으로 측정될 수 있다. Li, P. B. Lin, J. Gerstenmaier 및 B.T. Cunningham, "A new method for label-free imaging of biomolecular interactions", Sensors and Actuators B, 2003 참조.
광자 결정 구조들을 기반으로 하는 라벨 없는 바이오센서들에 대한 많은 실제적인 장점들이 있다. 형광체의 방사능 표지물질 또는 2차 리포터의 사용 없는 생화학 및 세포 바인딩의 직접 검출은 분자 정합(conformation)에 대한 라벨의 영향에 의해 유도되는 실험적 불확정성, 활성 바인딩 에피토프(epitope)의 차단, 입체적 방해(steric hindrance), 라벨링 지점의 비접근성(inaccessibility), 또는 실험에서 모든 분자들에 대해 등가적으로 기능하는 적절한 라벨을 구하는 불가능(inability)을 제거한다. 라벨 없는 검출 방법들은 소광(quenching), 쉘프 라이프, 및 백그라운드 형광으로부터 실험적 인공물들을 제거하면서, 분석법 개발을 위해 요구되는 시간과 노력을 크게 간소화한다. 다른 라벨 없는 광 바이오센서들과 비교하여, 광자 결정들은 광대역 광원(광 벌브 또는 LED와 같은)을 통해 수직 입사각으로 간단히 조명함으로써 및 반사된 컬러에서 시프트들을 측정함으로써, 용이하게 질의(query)된다. 간단한 여기(excitation)/판독 수단은 현장(point-of-care) 의학 진단 및 환경 모니터링을 위한 휴대형 시스템들 뿐만 아니라, 실험 기기들에 사용하기에 적합한 저비용의 소형, 강건 시스템들을 가능하게 한다. 광자 결정 자체는 전력을 소모하지 않기 때문에, 소자들은 다양한 액체 또는 기체 샘플링 시스템들내에 용이하게 내장되거나, 광 네트워크의 상황에서 용이하게 배치되며, 단일 조명/검출 베이스 스테이션은 빌딩내에서 수천개의 센서들의 상태를 추적할 수 있다. 광자 결정 바이오센서들은 광범위한 물질들과 방법들을 이용하여 제조될 수 있지만, 고감도 구조들은 막의 연속적인 시트들상에서 수행될 수 있는 플라스틱-기질 프로세스들을 이용하여 입증되었다. 플라스틱-기질 설계들과 제조 방법들은 다른 광 바이오센서들에 대해 경제적으로 이전에 실현되지 않았던 저비용/분석이 요구되는 애플리케이션들에 광자 결정 바이오센서들이 사용될 수 있도록 한다.
본 발명의 출원인은 라벨 없는 바인딩 검출을 위한 광자 결정 바이오센서 및 이와 연동되는 검출 기기를 개발하였다. 상기 센서와 검출 기기는 특허 문헌에 기술되고; 미국 특허출원 공개들 U.S. 2003/0027327; 2002/0127565, 2003/0059855 및 2003/0032039를 참조한다. 공명 피크 파장에서 시프트의 검출을 위한 방법들은 U.S. 특허출원 공개 2003/0077660에 개시된다. 이러한 참조문헌들에 기술된 바이오센서들은 플라스틱 막 또는 기판의 연속 시트에 도포되는 1차원 및 2차원 주기적인 구조 표면들을 포함한다. 결정 공명 파장은 0.5 피코미터의 파장 해상도를 달성하기 위해 분광기를 통해 수직인 입사각에서 피크 반사율을 측정함으로써 결정된다. < 1 pg/mm2(3차원 히드로겔 표면 화학제 없이 달성됨)의 결과적인 질량 검출 감도는 임의의 다른 상업적으로 이용가능한 바이오센서에 의해 입증되지 않았다.
상기 인용된 특허출원들에 기술된 바이오센서 소자들의 기본적인 장점은 1-2 피트/분 속도로 연속적인 프로세스들에서 플라스틱 물질들의 대량 제조가 가능하다는 점이다. 센서들의 대량 제조의 방법들은 U.S. 특허출원 공개 2003/0017581호에 기술된다. 도 1에 도시된 것처럼, 바이오센서(10)의 주기적인 표면 구조는 보다 높은 굴절률 물질(14)의 박막으로 오버코팅되는 낮은 굴절률 물질(12)로부터 제조된다. 낮은 굴절률 물질(12)은 명확한 플라스틱 물질(16)의 베이스 시트에 결합된다. 표면 구조는 폴리에스테르 기판(16)상의 연속적인-막 프로세스를 이용하여 실리콘-웨이퍼 "마스터" 성형물(mold)(즉, 목표된 복제 구조의 원판)로부터 경화 에폭시(12)의 층내에 복제된다. 액체 에폭시(12)는 마스터 격자의 형상과 일치하고, 자외선 광에 노출에 의해 순차적으로 경화된다. 경화 에폭시(12)는 우선적으로 시트(16)에 부착되고, 실리콘 웨이퍼로부터 벗겨진다. 센서 제조는 경화 에폭시(12) 격자 표면상의 120nm 티타늄 산화물(TiO2) 고 굴절률 물질(14)에 의해 완료되었다. 티타늄 산화물 증착 이후, 3×5인치 마이크로판 섹션들은 센서 시트로부터 절단되고, 바닥(bottomless) 96-웰 및 384-웰 미세역가판(microtiter plate)들의 저면들에 에폭시로 부착된다.
도 2에 도시된 것처럼, 미세역가판의 웰들을 규정하는 웰들(20)은 액체 샘플(22)을 포함한다. 바닥 마이크로판 및 바이오센서 구조물(10)의 조합은 바이오센서 장치(26)로서 집합적으로 도시된다. 이러한 방법을 이용하여, 광자 결정 센서들은 매우 낮은 비용에서 사각-야드 기반에서 대량 제조된다.
광자 결정 바이오센서를 위한 검출 기기는 간단하고, 저비용이며, 저 전력이고, 강건하다. 시스템의 개념도는 도 2에 도시된다. 반사되는 공명을 검출하기 위해, 백색 광원은 100마이크로미터 직경 광섬유(32)를 통한 센서 표면의 ~1mm 직경 영역, 및 마이크로판의 저면을 통해 공칭적으로 수직 입사각에서 조준 렌즈(34)를 조명한다. 검출 섬유(36)는 분광기(38)를 통한 분석을 위해 반사광을 수집하기 위해 광섬유(32)로 다발(bundled)된다. 일련의 8 조명/검출 헤드들(40)은 선형 방식으로 배치되고, 반사 스펙트럼은 한번에 마이크로판 칼럼에서 모두 8개 웰들로부터 수집된다. 도 3을 참조한다. 마이크로판 + 바이오센서(10)는 X-Y 어드레스가능한 운동 스테이지(도 2에 도시되지 않음)에 배치되어, 마이크로판에서 웰들의 각 칼럼이 연속적으로 어드레스될 수 있다. 기기는 운동 스테이지의 속도에 의해 제한되는, ~ 15초내에서 모두 96 웰들을 측정한다. 도 2 및 도 3의 시스템의 구조에서 추가적인 세부사항들은 공개된 U.S. 특허출원 2003/0059855에 기술된다.
이하에서 설명들과 논의들은 BIND 기술로서 상술된 라벨 없는 기술을 참조한다. BIND는 출원인 SRU Biosystems, Inc.의 상표명이다.
2. 형광 증폭 센서들
미국특허 제6,707,561호는 소산 공명(Evanescent Resonance)(ER) 기술로서 종래에 종종 지칭되는 격자-기반 바이오센싱 기술을 기술한다. 이러한 기술은 조명 신호(예, 형광, 화학-발광, 전기발광, 인광 신호)를 증폭하기 위해 서브-마이크론 크기 격자 구조를 사용하고, 격자 표면상에 바인딩 이벤트가 후속되며, 여기서 경계 분자들(bound molecules) 중 하나는 형광 라벨을 동반한다. ER 기술은 비증폭 분석법들보다 훨씬 더 낮은 분석물(analyte) 농도들에서 바인딩 검출을 가능하게 하는 형광체 기반 분석들의 감도를 향상시킨다.
ER 기술은 바인딩이 발생한 격자 표면상에 레이저 광을 집중시키기 위해 격자 생성된 광 공명을 이용한다. 실제로, 레이저 스캐너는 전형적으로 상기 격자로부터, 일부 입사각(세타)에서 센서를 스위핑(sweep)하고, 검출기는 센서 표면으로부터 형광을 발하는 광(보다 긴 광 파장의)을 검출한다. 설계에 의해, ER 격자 광학 특성들은 특정 입사각 및 레이저 파장(λ)에서, 공명으로서도 공지된, 거의 100% 반사를 초래한다. 격자 구조에 의해 및 격자 구조내에서 레이저 광의 한정은 소산장(evanescent field)(전형적으로 1-2㎛)의 범위내에서 형광체 경계로부터 방출을 증폭시킨다. 따라서, 공명에서, 투과된 광 세기는 거의 제로로 떨어진다.
상기에서 주지된 것처럼, 상기 인용된 특허출원들에 기술된 라벨 없는 바이오센서들은 서브-마이크론 크기의 격자 구조를 사용하지만, ER 사용을 위해 의도된 격자들과 비교하여 매우 상이한 격자 기하학적 구조 및 실재물(objective)을 갖는다. 실제적인 사용에서, 라벨 없는 기술 및 ER 기술들은 공명 근처에서 광학 특성들에 대한 상이한 요구조건들을 갖는다. 공명 현상의 스펙트럼 폭 및 위치는 주요한 차이점을 기술한다. 공명 폭은 파장에 대한 반사율(또는 투과율)로서 도시된 공명 피쳐의 파장 측정에서 중간 최대의 전체 폭을 지칭한다(상기 Q 인자로도 지칭됨). 또한, 공명 폭은 세타의 함수로서 반사율 또는 투과율을 나타내는 곡선상에 도시된 공명 피쳐의 각도의 폭을 지칭할 수 있고, 여기서 세타는 입사광의 각도이다.
최적으로, 라벨 없는 격자-기반 센서는 낮은 바인딩 이벤트들을 나타내는 피크 위치에서 작은 변화들의 검출을 용이하게 하기 위해, 가능한 좁은 공명 피크를 생성한다. 또한, 라벨 없는 센서는 보다 많은 물질을 결합(bind)시키기 위해, 높은 격자 표면적의 장점을 갖는다. 현재 실제적으로, 격자를 더 깊게 제조함으로써(존재하는 다른 방법들을 통해) 더 높은 표면적을 달성한다. 라벨 없는 센서들의 현재 상업적인 실시예들은 850nm 근처에서 공명을 생성하므로, BIND 라벨 없는 검출 기기는 이러한 파장을 판독하도록 최적화되었다.
반대로, 실제적인 ER 격자 센서 설계들은 격자상의 물질 축적 또는 센서 제조의 변화와 같은 물리적 변수들의 존재하에서, 고정된 입사각 및 고정된 파장 레이저 광에서 발생한다. 필드 세기가 일반적으로 공명 폭에 의해 감소되기 때문에, 실제적인 ER 센서 설계는 공명 폭의 균형을 요구한다. 적절한 ER 공명 폭을 선택함으로써, ER 신호 이득을 유지하면서 분석 범위, 기기 및 센서 변수들에 대한 일정한 증폭을 보장한다. 전형적인 애플리케이션은 Cy5로서 종래기술에 공지된, 일반적인 형광 염료(dye)를 여기시키기 위해 633nm 파장을 사용한다. 일부 ER 스캐닝 기기는 최대 레이저 형광체 결합을 향한 공명을 "조정"하기 위해 입사각에 대한 조절들을 허용한다. 그러나, 실제로 이는 적절한 제어 없는 가변의 허용불가능한 소스를 유도할 수 있다.
또한, 공지된 ER 설계들은 최적의 라벨 없는 설계들 보다 더 앝은 격자 깊이들을 사용한다. 예를 들어, 상기 인용된 '561 특허는 1 미만 및 보다 바람직하게는 0.3 내지 0.7의 격자 깊이 대 "투명 층"(즉, 높은 지수 코팅 층) 두께의 비율을 구체화한다. 최적의 라벨 없는 설계들은 1보다 더 크고 바람직하게는 1.5보다 더 큰 유사하게 제한된 비율을 가진 격자들을 사용한다. 라벨 없는 설계들은 통상적으로 격자 라인 폭 또는 중간 주기에 의해 격자 깊이를 규정한다. 예를 들어, 현재 실시되는 상업적 라벨 없는 센서들은 275nm의 중간 주기 및 약 275nm의 격자 깊이를 가지므로, 1:1 기하 비율(geometric ratio)을 기술한다. 이러한 동일한 센서 설계는 약 90nm의 두께를 갖는 격자의 상부상에 높은 굴절률 산화물 코팅을 사용한다. 따라서, '561 특허에서의 정의에 따라, 이러한 센서는 약 3:1의 격자 깊이:산화물 두께 비율을 갖는다.
본 명세서는 단일 소자에서, 두개의 검출 모드들(라벨 없는 증폭 및 형광 증폭)에 대해 최적화되는 방식으로 구성되는 격자-기반 센서 설계들을 보고한다. 그러한 격자는 단일 제품으로 가능하게 제조되는 애플리케이션들의 다양성을 현저하게 증가시킨다.
이전에 인용된 모든 종래기술은 참조로 본 발명에 포함된다.
이하의 실시예들 및 그 특징들은 범주의 제한 없이, 예시적으로 도시되는 것으로 의도된 시스템들, 툴들 및 방법들과 연계하여 기재되고 도시된다. 다양한 실시예들에서, 하나 이상의 상술된 문제들은 감소 또는 제거되었고, 다른 실시예들은 다른 개선점들에 관한 것이다.
일 실시예에서, ER 모드 및 라벨 없는 검출 모드에서 성능을 최적화하는 격자-기반 센서가 개시된다. 그러한 센서들은 라벨 없는 검출 모드에서 뾰족한 공명 피크를 유지하면서도, 종래의 ER 격자 바이오센서의 성능 곡선들을 모방하는, 작은 입사각들(세타)에서 광역(broad) 공명을 나타낸다. 몇가지 대표적인 실시예들이 개시된다. 제 1 실시예는 광의 TM 편광(격자에 수직)을 갖고, 공기 샘플 매체의 ER 모드에 대해 최적화된다. TE 편광을 갖고, 수직 입사각 근처에서, 633nm 여기를 통한 액체 샘플 매체의 ER 모드에 대해 최적화된 제 2 실시예가 개시된다. 두 실시예들의 컴퓨터 모델링은 각각이 라벨 없는 검출 모드에서 뾰족한 피크 파장 공명(높은 Q 인자)을 유지하는 것을 나타낸다.
하나의 구성에서, 바이오센서는 주기적인 표면 격자 구조(하나 또는 둘의 영역들)를 갖고, 주기적인 격자 구조는 소산 공명(ER) 검출 모드에서 제 1 광원으로부터 바이오센서의 광 조사(optical interrogation)를 최적화하도록 구성되며, 주기적인 격자 구조는 라벨 없는 검출 모드에서 제 2 광원으로부터의 광을 통해 바이오센서의 광 조사를 최적화하도록 구성된다. 하나의 가능한 실시예에서, 격자는 2차원 격자의 형태를 갖고, 격자는 상호 직교하는 제 1 및 제 2 방향에서 주기적인이다. 다른 실시예들에서, 격자는 하나의 방향(예, X 방향)에서 주기적인을 갖지만 제 2 방향에서 주기적인을 갖지 않는, 1차원 격자이다.
바이오센서의 라벨 없는 검출 사용은 더 넓은 표면적을 제공하도록 더 깊은 격자들의 장점을 가지며, 보다 많은 물질 부착을 가능하게 한다. 보다 많이 부착되는 물질은 피크 파장 값의 더 넓은 시프트의 형태로 더 많은 신호를 생성한다. 이전의 ER 격자들은 현재의 라벨 없는 격자 센서들과 동일한 라벨 없는 감도를 제공하기 위해, 충분한 표면적(깊이)을 갖지 않는다. 따라서, 바이오센서들의 하나의 설계들은 의도된 레이저 여기 파장 및 낮은 입사각들에서, 바람직하게는 10도 미만 및 보다 바람직하게는 5도 미만에서, 광역 공명 곡선을 유지하면서, 표면적을 극대화한다(이 경우 더 큰 격자 깊이를 변환). 대표적인 1차원 실시예들에서 ER 및 라벨 없는 성능 요구조건들을 충족시키는 바이오센서들은 약 0.6 내지 약 1.2의 격자 깊이 대 반주기 비율을 갖는다. 약 160nm 내지 약 210nm의 격자 깊이들이 구체적으로 예시된다. 이러한 파라미터들은 물론 강한 ER 또는 라벨 없는 성능으로 특정 센서 성능 목적들을 해결하도록 가변되거나, 예를 들어 본 발명에서 개시된 바와 같은 2차원 격자들에서 가변될 수 있다.
본 발명의 기술들에 따른 격자 설계의 컴퓨터 시뮬레이션은 제 1 및 제 2 실시예의 구체적 사항들로부터 가변될 수 있는 본 발명에 따른 다른 격자 설계들을 통상의 당업자들이 개발할 수 있도록 할 것이며, 그러한 실시예들은 제한되지 않고 예시에 의해 제공된다. 추가적인 특징에서, 이중 사용 ER 및 라벨 없는 검출 바이오센서들을 설계하는 방법들은 컴퓨터 모델링 기술들을 이용하여 개시된다.
또한, ER 및 라벨 없는 검출을 위해 적합한 2차원 직교 격자 구조를 갖는 격자-기반 센서가 개시되고, 몇몇 구현예들에서 바람직할 수 있다. 2차원 격자는 와플(홀들), 와플 철(포스트들), 또는 2차원의 교대하는 높고 낮은 영역들을 갖는 체스보드 구성처럼 보일 수 있다. 2차원 격자들은 X 및 Y 방향들에서 상이한 주기들을 가질 수 있다. 이러한 특징들은 각진 또는 곡선형 측벽들과 같이 Z 방향에서 다양한 프로파일들을 가질 수 있다. 따라서, 와플 패턴의 경우에, 돌출부(impressions) 또는 웰들은 사각형 형상 이외에 직사각형을 가질 수 있다. 실제로, 이러한 특징들은 X 및 Y 영역들에서 라운드형으로 보일 것이며, 즉 뾰족한 코너들을 갖지 않을 것이다. 따라서, "직사각형(rectangular)" 및 "사각형(square)"이란 용어들의 사용은 전체적인 구성을 지칭하는 것으로 의도되고, 라운드형 코너들을 허용하는 것으로 의도된다. 2차원 격자들에 의해 제공되는 이러한 부가되는 융통성은 상이한 파장들에서 발생하도록 라벨 없는 검출 및 ER 검출을 위한 공명 위치들을 조정할 수 있도록 한다. 이러한 성능은 현존하는 라벨 없는 검출 기기와 호환성을 유지하면서, 상이한 여기 파장들로 ER 공명의 조정에 의해 큰 장점을 제공한다. 일 예로서, X 주기는 Cy3 형광체(녹색 광) 또는 Cy5 형광체(적색 광)을 여기시키도록 조정되는 파장을 갖는 수직 입사각 근처 또는 수직 입사각에서, 광역 공명을 제공할 수 있고, Y 주기는 현재 상업화된 라벨 없는 센서들과 유사하게 820nm 내지 850nm(적외선 근처)의 뾰족한 라벨 없는 공명을 산출할 수 있다.
또한, 2차원의 2-레벨 격자 구조들은 ER 및 라벨 없는 검출을 위한 양호한 성능을 갖도록 구조화되고 배치된 격자-기반 바이오센서의 추가적인 실시예로서 개시된다.
다른 특징에서, 개시되는 적어도 하나의 샘플을 분석하는 방법은 주기적인 표면 격자 구조를 갖는 기판을 포함하는 바이오센서 상에 적어도 하나의 샘플을 배치하는 단계를 포함하고, 주기적인 격자 구조는 라벨 없는 검출 모드에서 바이오센서의 광 조사를 최적화할 뿐만 아니라, 소산 반사(ER) 검출 모드에서 바이오센서의 광 조사를 위해 구성 및 설계된다. 상기 방법은 ER 검출 모드를 위해 설계된 광원으로부터의 광을 통해 판독 검출 기기의 바이오센서를 조명하고, 및 라벨 없는 검출 모드를 위해 설계된 광원으로부터(또는 가능한 제 2 광원으로부터)의 광으로 바이오센서를 조명하는 단계; 및 상기 바이오센서로부터 광 반사를 분석하는 단계를 추가적으로 포함한다. 샘플의 분석은 샘플의 성분의 바인딩, 예를 들어, 바이오센서의 표면에 샘플의 성분의 바인딩 또는 제 1 샘플 성분(예, 단백질)에 대한 제 2 샘플 성분의 바인딩(예, 형광체, 억제제 또는 라벨)을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 판독 시스템은 2개의 광원들을 포함하고, 하나는 BIND(예, 백색 광원 또는 발광 다이오드)용이고, ER 측정들을 위한 레이저와 같은 제 2 광원을 포함한다. 그러나, 다른 실시예들에서, 제논 방전 램프 또는 파장-가변(tunable) 레이저와 같은 단일 광원이 제공되며, 2개(또는 그 이상)의 대역통과 필터들은 2개의 감지 모드들을 위해 적절한 조명 파장들을 제공하도록 광원을 샘플링한다.
하나의 가능한 실시예에서, 샘플은 공기 매체이고, 제 1 광원으로부터의 광은 격자 구조에 수직인 편광을 갖는다. 다른 가능한 실시예에서, 샘플은 액체 매체이고, 제 1 광원으로부터의 광은 격자 구조에 평행한 편광을 갖는다. 하나의 가능한 실시예에서, 제 1 광원으로부터의 광은 샘플에 결합된 형광체를 활성화시키도록 선택된 파장을 갖는다. 다른 가능한 실시예에서, 제 1 광원으로부터의 광은 샘플의 천연 형광을 활성화시키도록 선택된 파장을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 샘플의 조각은 경계 형광체를 포함할 수 있는 억제제로 한정된다. 샘플은 예를 들어, 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오센서를 위한 판독 및 검출 기기의 몇가지 대표적인 구성들이 개시된다. 일 실시예에서, 판독 및 검출 기기는 바이오센서로부터 ER 데이터를 획득하기 위해 적용되는 제 1 광원; 라벨 없는 검출 데이터를 획득하기 위해 적용되는 제 2 광원; 바이오센서를 조명하기 위해 상기 제 1 및 제 2 광원으로부터의 광을 조명 빔(illuminating beam)에 결합시키는 광학 시스템; 바이오센서로부터 반사 광을 검출하기 위한 적어도 하나의 검출기; 및 적어도 하나의 검출기로부터의 데이터를 이용하고 샘플로부터 ER 및 라벨 없는 데이터를 획득하는 분석 모듈을 포함한다. 검출기는 전하-결합 소자와 같은 영상 검출기(CCD 영상기)일 수 있다. 광검출기, 현미경, 또는 이들의 조합물과 같은 다른 타입의 검출기들이 계획되고, 하나는 ER 데이터를 획득하기 위한 것이며 다른 하나는 BIND 데이터를 획득하기 위한 것이다. 다른 대표적인 구성에서, 광학 시스템은 단일 광원으로부터의 광으로 바이오센서를 선택적으로 조명한다. 바이오센서는 다중 검출 지점들 또는 웰들을 가질 수 있고, 기기는 모든 검출 지점들로부터 ER 및 라벨 없는 데이터를 순차적으로 획득하기 위해, 광원들에 대해 검출 지점들을 연속적으로 이동시키기 위한 이동 스테이지를 포함할 수 있다.
요약하면, 본 발명은 단일 장치에서, 광자 결정 기반의 라벨 없는 바이오센서를 향상된 형광 용량들과 결합시키는 신규한 검출 및 양자화 플랫폼을 기술한다. 자체적으로, 라벨 없는 기술 및 ER 기술들은 큰 실용성을 갖는다. 단일 바이오센서에서 이러한 2개의 검출 기술들을 결합시키는 능력은 세포들, 단백질들, 및 저분자들과 같은, 생물학적 물질들간에 및 생물학적 물질들내에서, 상호작용의 범용 검출 및 선택적 측정을 위한 강력한 방법을 생성한다. 본 발명의 결합된 바이오센서는 광범위한 생물학적 또는 화학적 샘플 실재물들의 검출을 위해 유용하다. 검출될 수 있는 샘플들의 타입들의 예들은 저분자 및 저분자량 분자들(즉, 분자량 < 1000 Da 및 1000 Da 내지 10,000 Da의 물질들), 아미노산들, 핵산들, 지방질, 탄수화물, 핵산 폴리머들, 바이러스 입자들, 바이러스 성분들, 및 이에 제한됨이 없이, 수포들(vesicles), 미토콘드리아, 막(membranes), 구조적 피쳐들, 주변세포질(periplasm), 또는 이들의 임의의 추출물들과 같은 세포 성분들을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 바이오센서로 검출될 수 있는 특정 바인딩 물질들(샘플들)의 추가적인 예들은 폴리펩티드(polypeptide), 항원(antigen), 다중 클론 항체(polyclonal antibodies), 단일 클론 항체, 단일 체인 항체(scFv), F(ab) 조각들(fragments), F(ab')2 조각들, Fv 조각들, 유기 저분자들, 세포들, 바이러스들, 박테리아, 폴리머들, 펩티드 용액, 이중 나선 DNA 용액, 단일 및 이중 나선 DNA 용액들의 조합물들, RNA 용액들 및 생물학적 샘플들을 포함한다. 그러한 생물학적 샘플들은 예를 들어, 혈액, 혈장(plasma), 혈청(serum), 위장관 분비물(gastrointestinal secretions), 조직들 또는 종양들의 균질화액(homogenates), 활액(synovial fluid), 배설물(feces), 타액(saliva), 객담(sputum), 낭종수(cyst fluid), 양수(amniotic fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복막투석액(peritoneal fluid), 폐 세척액(lung lavage fluid), 정액(semen), 림프액(lymphatic fluid), 눈물 및 전립선 액(prostatic fluid)으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 기술된 바이오센서는 (a) 바이오센서 표면으로 임의의 이러한 타입의 샘플들을 바인딩, (b) 샘플의 다른 성분으로, 예를 들어 샘플의 형광체로 샘플의 바인딩, 및 (c) 샘플에 부가되는 제 2 샘플으로 샘플 또는 샘플 성분의 바인딩을 검출하는데 사용될 수 있다. 바인딩 (b)의 일 예로서, 센서 표면은 예를 들어 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 또는 6His와 같이, 샘플의 일정 성분에 바인딩될 수 있고, 바이오 센서는 폴리머라제 복합물(polymeraze complex)과 같은, 샘플의 성분들의 부가적인 그룹핑을 통해 샘플의 결합 성분의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 바인딩 (c)의 후자 예에서, 샘플은 바이오센서의 표면에 부착되는 성분, 및 바이오센서 상에 배치된 제 2 샘플로부터 다른 성분(들)을 특정하게 결합/끌어당기는 다른 성분을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 센서는 물질 바인딩 또는 상호작용의 양의 수량화하기 위해 사용될 수도 있다.
이하의 일반적인 예들은 본 발명에서 개시되는 바와 같은 그러한 이중 사용 격자-기반 센서에 의해 가능한 신규한 유틸리티들의 완전한 또는 독점적인 리스팅을 나타낸다:
1. 조합된 2개의 기술들은 혼합된 샘플 모집단에 나타나는 형광체 라벨링된 물질의 퍼센티지에서 구별된다. ER 신호가 라벨의 존재를 정량화(quantify)하면서, 라벨 없는 신호는 센서에 결합된 총 질량의 수량 측정치를 제공한다.
2. 그 조합물은 상이한 소스들로부터 중복 바인딩 신호들을 제공함으로써, 세포들, 단백질들, 및 저분자들 내에서 및 이들간의 상호작용들의 측정에서 통계적 경직(stastical rigor)을 증가시킬 수도 있다.
3. Forster 공명 에너지 전달(Forster Resonant Energy Transfer: FRET) 원리를 이용하여, 이중 사용 센서는 2개의 상이하게 라벨링된 형광 분자들 또는 동일한 분자의 2개의 상이하게 라벨링된 부분들 사이의 거리의 측정을 가능하게 할 수 있다. 라벨 없는 신호는 분자 밀도를 정량화한다.
4. 2개의 기술들의 조합은 부가적인 정보를 제공할 수 있다. 라벨 없는 신호는 셀에 부착된 형광체 라벨링된 리간드의 양을 정량화하는 형광 신호를 통해 셀들의 부착을 정량화할 수 있다. 상기에 열거된 것들과 같은 라벨 없는 및 라벨 있는 생물학적 실재물들이 본 발명의 진보적인 바이오센서에서 검출되는 다른 시나리오들이 물론 가능하다.
5. 2개의 기술들의 조합은 총 결합 질량으로부터 분자 카운트를 구별함으로써 분자 질량의 측정값을 제공할 수 있다.
6. 조합된 바이오센서는 추가적으로, 억제 바인딩의 연구와 같은 다른 시나리오들에 대해 2개의 상이한 독립적인 정량화 테스트들이 수행될 수 있도록 한다. 더욱이, 억제제 리간드 바인딩을 직접적으로 정량화하는 능력을 포함하는, 단백질과 기판 사이의 억제 바인딩 상호작용들의 보다 완전한 이해 및 특성화가 가능할 수 있다. 부가적인 예로서, 바이오센서는 매우 긴밀한 바인딩 상호작용들의 연구를 촉진시키고, 이에 따라 보다 약한 바인딩 친화도를 갖는 공지된 경쟁적인 억제제는 훨씬 더 긴밀한 바인딩 실재물을 교란/관찰하는데 사용된다.
7. 조합된 ER 및 라벨 없는 바이오센서는 접기, 적층, 및 다른 생물학적 분자들과 테스트 저분자들과의 상호작용들에서 이들에 대한 변화들과 변화율들과 같이, 활동의 생물리학적 특성화를 측정하기 위해, 생물학적 분자들의 천연 형광을 사용하는 분석법들에 특히 유용하다. 그러한 특성화 측정들은 결합 형광 레벨을 이용하여 이루어질 수 있지만, 그러한 결합 라벨은 특히, 고유한 형광 특성을 가진 생물학적 물질들에 대해 필수적으로 요구되지 않는다. 단백질 및 핵산 성분들과 보조효소들(coenzymes), 이들의 흡수 및 방출 스펙트럼들과 감도의 형광 특성들의 열거를 위해, Charles R. Cantor 및 Paul R. Schimmel, parts 1-3 Biophysical Chemistry - The behavior and study of biological molecules, W.H. Freeman and Company, New York, (1980), page 443 및 table 8-2를 참조한다. 천연 형광물질을 이용하는 이러한 기술은 핵산 폴리머들(DNA, RNA)(형광 뉴클레오시드 베이스들) 적층과 혼성화, 단백질(형광 아미노산 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신) 및 지방질 막들(이들의 구획화들로 형광체들의 포함시 개선 및 소광 효과들)에서 특히 중요하다. 일 실시예에서, 라벨 없는 BIND 피쳐는 샘플 물질 또는 이에 결합된 리간드의 양의 정량화를 허용하고, ER 피쳐는 천연 형광물질을 검출하며, 생물리학적 변화의 감응성 추적을 허용한다.
예시적인 실시예들은 도면들의 참조된 도면에 도시된다. 본 발명에 개시된 그 실시예들 및 도면들은 예로서 제공되며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 범주에 관한 모든 의문점들은 청구범위를 참조로 해결될 것이다.
도 1은 종래기술의 바이오센서 배치의 도면이다.
도 2는 바이오센서로부터 반사광의 피크 파장에서 시프트들을 측정하고 바이 오센서를 조명하기 위한 종래기술의 바이오센서 및 검출 시스템의 도면이다.
도 3은 바닥 미량역가판의 저면에 부착된 도 1의 구조물을 포함하는 바이오센서 소자의 웰들의 전체 행을 판독하는 8 광 헤드들의 배치의 도면이다.
도 4는 조합된 ER 및 라벨 없는 검출 바이오센서의 제 1 실시예의 단면도이다.
도 5는 조합된 ER 및 라벨 없는 검출 바이오센서의 제 2 실시예의 단면도이다.
도 6은 건조(공기) 매체 환경에서 ER 검출을 위해 사용될 때, 도 4의 실시예의 컴퓨터 시뮬레이션을 통해, 종래기술의 ER 바이오센서("NovaChip")에 대한 입사각 세타의 함수로서 투과율을 비교하는 그래프이다.
도 7은 수용 매체(aqueous medium) 환경의 라벨 없는 검출 모드에서 도 4의 실시예에 대한 파장의 함수로서 반사율을 비교하는 그래프이고; 도 7의 그래프는 도 4의 실시예의 컴퓨터 시뮬레이션으로부터 생성된다.
도 8은 표면 질량 첨가에 응답하여 피크 파장 값의 시프트를 나타내는(바이오센서에 샘플을 첨가함으로써), 라벨 없는 검출 모드의 도 4의 실시예에 대한 파장의 함수로서 반사율의 그래프이다. 또한, 도 7의 그래프는 도 4의 실시예의 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 생성된다.
도 9는 라벨 없는 모드 및 ER 검출 모드에서 도 5의 실시예에 대한 공명 피크들을 나타내는 파장의 함수로서 반사율의 그래프이다. 그 그래프는 도 5의 실시예의 컴퓨터 시뮬레이션으로부터 생성된다.
도 10은 도 5의 실시예에 대한 세타의 함수로서 투과율의 그래프로서, 그 곡선을 ER 센서의 종래기술의 "NovaChip" 예의 투과율 곡선과 비교한다.
도 11A 및 도 11B는 각각, Budach 외의 종래기술의 물품에 개시된 ER 칩의 대략적인 근사화로서 모델링되는, ER 검출을 위해 단독으로 설계된 1차원 선형 격자 구조의 사시도 및 단면도이다.
도 12A 및 도 12B는 각각 X 방향에서 편광되는 광이 도 11A 및 도 11B의 구조물상에 입사될 때 획득되는, 파장 및 입사각의 함수로서 반사 효율의 그래프들이다.
도 13A-13C는 입사 파장 632nm에 대해, Z = 110nm에 위치된 도 11A 및 도 11B의 구조물의 하부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 13D-13F는 입사 파장 632nm에 대해 도 13A-13C에 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
도 14A-14C는 입사 파장 632nm에 대해, Z = 140nm에 위치된 도 11A 및 도 11B의 구조물의 상부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 14D-14F는 입사 파장 632nm에 대해 도 14A-14C에 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
도 15A 및 도 15B는 각각, X 편광된 광에 의해 조명될 때 물 환경에서 BIND(라벨 없는) 검출을 위해 최적화되고, Y 편광된 광에 의해 조명될 때 공기 환경에서 ER 검출을 위해 최적화되는, 격자 구조의 주기적인 홀들을 특징으로 하는 2차원 격자 설계의 사시도 및 단면도이다.
도 16 및 도 17은 각각, Y 방향에서 편광되는 광이 도 15A 및 도 15B의 구조물상에 입사될 때 획득되는, 파장 및 입사각(632.5nm)의 함수로서 반사 효율의 그래프들이다. 이러한 도면들은 ER 모드의 실용성을 입증한다.
도 18A-18C는 입사 파장 632.5nm에 대해, Z = 78nm에서 도 15A 및 도 15B의 구조물의 하부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 18D-18F는 입사 파장 632.5nm에 대해 도 18A-18C에 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
도 19A-19C는 입사 파장 632.5nm에 대해 Z = 433nm에서 도 15A 및 15B의 구조물의 상부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 19D-19F는 입사 파장 632nm에 대해 도 19A-19C에 나타낸 동일 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다.
도 19G는 X 방향에서 편광된 광에 의해 조명될 때 획득되는 도 15의 실시예에 대한 파장의 함수로서 반사 효율의 그래프이다. 이러한 공명 피크는 라벨 없는 검출을 위해 사용된다.
도 20A 및 도 20B는 X 편광된 광에 의해 조명될 때 물 환경에서 BIND(라벨 없는) 검출을 위해 하나의 방향에서 최적화되고, Y 편광된 광에 의해 조명될 때 공기 환경에서 ER 검출을 위해 최적화되는, 격자 구조에서 주기적인 포스트들을 특징으로 하는 2차원 격자 설계의 사시도 및 단면도를 각각 도시한다.
도 21A 및 도 21B는 X 방향에서 편광된 광이 도 20A 및 도 20B의 구조상에 입사될 때, 파장 및 입사각(633nm 파장)의 함수로서 반사 효율을 각각 도시한다. 상기 도면들은 ER 모드의 실용성을 입증한다.
도 22A-22C는 입사 파장 633nm에 대해, Z = 70nm에서 도 20A 및 20B의 구조의 하부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 22D-22F는 입사 파장 633nm에 대해 도 22A-22C에 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
도 23A-23C는 입사 파장 633nm에 대해 Z = 430nm에서 도 20A 및 20B의 구조의 상부 표면에 해당하는 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 도 23D-23F는 입사 파장 632nm에 대해 도 23A-23C에 의해 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
도 24는 X 방향에서 편광된 광에 의해 조명될 때 획득되는 도 20의 실시예에 대한 파장의 함수로서 반사 효율의 그래프이다. 이러한 공명 피크는 라벨 없는 검출을 위해 사용된다.
도 25는 조합된 ER 및 라벨 없는 격자-기반 센서를 위한 영상 판독 시스템의 개념도이다.
도 26은 조합된 ER 및 라벨 없는 격자-기반 센서를 위한 제 2 판독 시스템의 개념도이다.
도 27은 도 26의 실시예의 보다 상세한 도면이다.
도 28A-28C는 조합된 ER 및 라벨 없는 센서의 또 다른 실시예에 대한 2개 레벨, 2차원 격자 구조를 나타내는 단위 셀의 3개의 도면들이다.
도 29는 도 28A-28C의 구조물의 컴퓨터 시뮬레이션을 이용하여 획득된 반사 스펙트럼(반사광 파장의 함수로서 상대적 세기)의 그래프이다.
도 30은 센서의 상부 표면을 형성하는 고 굴절률 층 및 UV-경화 플라스틱 격자 층 사이에 중간 SiO2 층이 부가되는 조합된 ER 및 BIND 격자-기반 센서의 단면도이다.
도 31은 격자-기반 센서상에 증착된 스폿들의 마이크로어레이의 영상이다(ER 및 BIND 측정들을 위해 최적화되거나 최적화되지 않을 수 있음).
도 32는 센서상에 배치되는 DNA 샘플의 존재로 인해 도 31의 스폿들 중 하나에 대한 피크 시프트의 그래프이다.
도 33은 위치의 함수로서 나노미터(스폿의 DNA의 양에 수량적으로 관련됨)의 피크 파장 값의 시프트, 및 벗어난 스폿(missing spot)(스폿들의 행의 어두운 지점)을 나타내는 스폿들의 행의 도면으로서, 벗어난 스폿은 그래프의 하부 영역으로 나타낸다.
격자-기반 바이오센서들은 액체 또는 건조 환경에서, ER 검출을 위해 및 라벨 없는 검출을 위해, 최적화되고 유용한 주기적인 격자 구조를 갖는 격자-기반 바이오센서들이 개시된다. 또한, 바이오센서들과 함께 사용하기 위해 적용되는 판독 시스템이 기재된다. 또한, 본 발명의 바이오센서들을 통해 샘플을 테스트하는 방법들이 기재된다.
제 1 실시예
도 4는 격자 기반 센서의 ER 및 라벨 없는 애플리케이션들을 위한 상업적 요구조건들을 충족시키는 것으로 기대되는 격자 구조물(100)을 갖는 1차원 센서의 제 1 실시예의 개념적 단면도이다. 도 4는 1차원 또는 일 방향에서 격자 구조물(100)의 하나의 주기를 나타낸다. 그 치수들은 도 4에서 실제 크기로 도시되지 않는다.
도 4의 격자(100)는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene Terepthalate)(PET) 또는 다른 플라스틱, 유리 또는 다른 물질(미도시)과 같은 클리어 물질의 베이스 시트에 중첩 및 결합된다.
격자 구조물은 예를 들어, 층 "기판" 아래에 위치된 PET 물질의 베이스 시트에 격자 패턴을 복제하기 위해, 격자 마스터 웨이퍼(미도시)의 보조를 통해 도포되는, 에폭시와 같은 UV-경화 물질을 바람직하게 포함하는 주기적으로 반복되는 물질(102)로 이루어진다. UV 경화 물질(102)은 PET와 같은 기판 시트에 도포된다. 기판 물질들은 Zeanor®와 같은 사이클로-올레핀 폴리머들 또는 폴리카보네이트를 포함할 수도 있다. 구조화된 층(102)을 형성하는 다른 수단은 폴리머 기판에 직접 열적으로 스탬핑하는 단계를 포함한다. 중간 물질(104)은 고 굴절률을 갖는 스퍼터링되는 산화물 코팅(예, TiO2 또는 Ta2O5)을 나타낸다. 최상위 물질(106)은 일반적으로, 라벨 없는 검출 모드를 위한 물-기질 완충제(buffer) 또는 ER 모드를 위한 공기인, 샘플에 대한 매체를 나타낸다. 그 구조물은 도면에 도시된 바와 같이, 주기적인 층 구조물, 및 수평 전이 지점들을 갖는다. 물론, 설계의 특정사항들은 라벨 없는 검출 및 ER 검출을 위한 양호한 성능을 여전히 제공하면서 변경될 수 있다.
도 4의 설계가 개발되었고, 그 성능은 컴퓨터 및 소프트웨어 프로그램 GSolver(Grating Solver Development Co., Allen Texas, www.gsolver.com)의 보조를 통해 모델링되었다. 다양한 기하학적 치수들과 파라미터들, 간격, 웰 깊이, 물질들, 및 물질들과 연관된 굴절률 데이터는 파장 곡선의 함수로서 투과율 대 세타 곡선 및 반사를 예측하도록 가동되는 컴퓨터 및 시뮬레이션들에 대해, 그 설계가 연구되도록 한다. 그러한 시뮬레이션들은 샘플이 건조되는 상황들, 및 샘플이 공지된 굴절률을 통해 물 또는 다른 유체 매체에 부유될 때 상황들에서 가동될 수 있다. 그러한 시뮬레이션들은 설계자가 ER 및 라벨 없는 검출을 위한 요구조건들을 총족시키기 위해, 설계자가 다양한 설계 파라미터들(두께들, 전이들, 주기 등)을 최적화, 즉 변경할 수 있도록 한다.
ER 기술은 TE 모드 또는 편광으로서 본 발명에서 규정된, 격자에 평행한 편광을 갖는 입사광에 의해 유도되는 공명 모드를 사용한다. 라벨 없는 검출 기술은 전형적으로, TM 모드 또는 편광으로서 본 발명에서 규정된, 격자에 수직인 편광을 갖는 입사광에 의해 유도되는 공명 모드를 사용한다. 이러한 모드는 샘플이 액체 매체에 부유될 때 가장 협소한 공명을 생성한다.
도 4의 제 1 실시예에서, 액체에 부유되는 샘플의 라벨 없는 검출 및 공기(건조) 환경의 ER 검출을 위해 TM 편광을 사용하는, 격자 바이오센서 설계가 기재된다. 격자 상부의 매체를 물에서 공기로 변경하면, 라벨 없는 검출을 위해 유용한 것들로부터 633nm 여기에 응답하는 염료들의 ER 증폭을 위해 유용한 것들로 공명 특성들의 변화를 초래한다. 도 4의 설계는 물 모드의 ER 검출에 특정하게 최적화되지 않고, 물 모드의 ER을 위해 허용가능하게 작용하지 않을 수도 있다. 그러나, 많은 ER 검출 분석법들은 공기 환경에서 수행되어, 도 4의 설계는 ER 검출을 위해 많은 실용성을 갖는다.
도 6은 도 4의 제 1 설계의 모델("조합된 400 공기") 또는 컴퓨터 시뮬레이션과 종래기술의 ER 장치(NovaChip, Novartis AG)에 대해 투과율 대 세타 데이터를 비교하는 그래프이다. NovaChip 데이터는 Budach 외, "Generation of Transducers for Fluorescence-Based Microarrays with Enhanced Sensitivity and Their Application to Gene Expression Profiling", Analytical Chemistry (2003) 및 Neuschafer 외, "Evanescent resonator chips: a universal platform with superior sensitivity for fluorescence-based microarrays", Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 489-497에 개시된다. 곡선들(110, 112)은 ER 장치에 등가적으로 기능하는 시뮬레이션된 장치(ComBIND 400)를 제안하는 유사한 형상을 갖는다. NovaChip TE 공명은 수직 입사로부터 ~ 2도에서 발생한다. 도 4의 제 1 설계는 입사광의 각도를 조절할 수 있도록 주어진 사소한 차이점만이 고려된 ~ 3도에서 TE 공명을 생성한다(본 명세서에서 이후에 센서에 대한 판독 및 검출 기기의 논의를 참조한다).
도 7의 그래프는 ComBind 400 설계(도 4)를 위해 시뮬레이션된 반사율 대 파장을 도시한다. 628nm 주위에 중심을 둔 광역 반사 피크는 상기 투과율 대 세타의 ~ 3도에서 발생하는 ER-공기 모드 공명에 해당한다. 협소한 피크의, 라벨링된 "물"은 라벨 없는 모드의 검출을 위해 작용한다. 피크(114)의 최고 선명도를 유의한다. 이는 도 4의 설계가 물 환경에서 라벨 없는 검출을 위해 잘 작용한다는 것을 제안한다.
라벨 없는 모드 검출 동안, 생물학적 분자들은 TiO2 코팅에 부착되고, 그 물질의 광학 두께를 효과적으로 증가시킨다. 이는 공명의 피크 파장 값(PWV)의 시프트를 초래한다. 고정된 물질량에 대한 더 큰 PWV 시프트는 더 높은 검출 감도를 나타낸다. 컴퓨터 시뮬레이션에서 격자 설계들을 비교할 때, 부가적인 생물학적 물질의 시뮬레이션은 가상적인 생물학적 층을 부가하는 것 이외에, TiO2 층의 두께를 증분함으로써 모델링될 수 있다. 이러한 방법은 다른 격자 설계 실험들에서 유효한 것으로 입증되었다.
도 8은 시뮬레이션된(도 4의 TiO2 층(104)의 두께를 증가시킴으로써 시뮬레이션됨) 질량의 특정 양의 첨가 이전 및 이후, 물 환경에서 피크 파장 값을 도시하는 그래프이다. 피크 위치는 라벨 없는 바이오센서 동작에서 예상되는 것처럼, 더 높은 파장으로 시프트한다. 파장 시프트 대 시뮬레이션된 질량의 비율은 출원인의 본 발명의 상업화된 바이오센서들의 것과 동일하다. 따라서, 도 4의 격자는 현재 라벨 없는 바이오센서 격자들에 대한 동일한 라벨 없는 성능을 산출하는 것으로 예상된다.
요약하면, 시뮬레이션들은 도 4에 개시된 격자 설계에 대한 이중-사용 용량들을 예측한다. 건조할 때, 소산 공명(ER)으로서 공지된 기술에 따른 형광 바인딩 신호들을 증폭시킬 수 있다. 습할 때, 출원인의 SRU Biosystems, Inc.로부터 이용가능한, BIND(SRU Biosystems, Inc.의 상표명)로서 상업적으로 또는 가이드 모드 공명 검출로서 공지된 기술에 따른 라벨 없는 검출기 및 격자가 수행된다.
제 2 실시예
도 5는 UV 경화 층(102), 높은 굴절률 층(104), 및 샘플 매체(106)의 구조물, 및 1차원의 격자 구조물의 하나의 주기를 나타내는 제 2 실시예의 단면도이다. 치수들과 전이 지점들은 도면에 도시된 바와 같다. 도면은 실제 크기로 도시되지 않는다.
도 5의 설계는 도 4의 것과 몇가지 점들에서 상이하다:
a) 더 짧은 격자 주기를 갖는다.
b) 더 좁은 격자 트로프들(troughs) 또는 리세스들을 갖는다. "듀티 사이클"(단위 셀의 상위 레벨에서 격자의 퍼센티지)은 도 5에서 88%이다(0 내지 0.85 및 0.97 내지 1.0). 70 내지 95%의 듀티 사이클들을 가진 좁은 트로프들은 좁은 트로프 실시예들의 예시적인 것이다. 좁은 트로프들은 일반적으로 더 양호한 라벨 없는 검출 결과들을 준다. 좁은 트로프 피쳐는 TE 공명 피크를 좁히고, 이에 따라 증가된 필드 세기를 나타낸다. ER 효과의 실제적인 사용은 현저하게 넓은 공명을 요구하는 반면에, 과도한 폭을 가진 공명은 유용한 형광 신호 증폭을 생성하기에 불충분한 필드 세기를 가질 것이다.
c) 격자 깊이 대 반주기의 1:1 비율을 갖는다.
도 5의 설계는 물(또는 완충제) 환경에서 라벨 없는 ER 동작을 가능하게 하는 1차원 센서를 예시한다. 이는 공기의 ER 동작 및 물의 라벨 없는 동작을 위해 설계되는, 도 4의 설계와 대조적이다. 도 9의 그래프는 도 5의 설계를 위한 물 환경에서 ER(TE 편광) 및 비교적 좁은 라벨 없는 (TM 편광) 스펙트럼 공명 특성들을 나타낸다. 상기 그래프는 도 5의 실시예의 컴퓨터 시뮬레이션으로부터 생성되었다. 도 10의 그래프는 종래기술의 NovaChip과 비교하여, 도 5의 설계("ComBIND 370")의 633nm 여기를 이용하는 TE 각상 공명을 비교한다. 이 경우, 시뮬레이션된 투과 최소값(116)은 현존하는 NovaChip ER 장치의 것과 근접한, 5개의 입사각 각도들 미만에서 발생한다. 입사각, 주기, 여기 파장, 높은 굴절률 물질 두께, 격자 듀티 사이클, 및 격자 깊이는 모두 상호 연관된다. 상업적 형광체들에 대한 여기 파장들이 공지되어 있고, 검색될 수 있다. 25도 미만의 입사각들은 허용가능해야 하지만, 수직 근처의 각도들(제로에 근접한 세타)이 바람직하다. 좁은 범위들로 한정된 각도 및 파장을 통해, 기능적으로 및 상업적으로 유용한 ER 및 라벨 없는 성능을 갖는 격자를 설계하는 것은 ER 모드를 위한 특정 형광체 또는 염료의 여기 파장에서 높은 표면 필드, 및 라벨 없는 사용을 위한 질량 부착에 대응하는 높은 PWV 시프트를 초래하는, 격자 주기, 듀티 사이클, 깊이 및 높은 굴절률 물질 두께를 결정해야 한다. 부가적으로, 그 설계는 측정을 위한 실제적인 파라미터 윈도우를 산출하기에 충분한 각상 폭을 갖는 ER 공명을 유지하면서, 가능한 좁은 스펙트럼 폭을 갖는 라벨 없는 공명을 생성해야 한다. 설계는 성능 트레이드-오프들을 포함할 수 있다. 예를 들어, ER 성능의 최적화는 신호 증폭을 산출하는 필드 세기와, 센서, 기기 및 분석 변수들에 대한 공차 사이에 트레이드-오프를 결부시킨다. 보다 좁은 ER 공명은 일반적으로 더 높은 필드 세기를 나타내고, 더 넓은 ER 공명은 증가된 측정 공차를 제공한다. 전형적으로, 라벨 없는 및 ER 성능 최적화는 라벨 없는 성능을 향상시키는 격자 깊이, 및 ER 공명 폭 사이에 다른 트레이드-오프를 포함한다. 예를 들어, 도 5의 설계의 경우, 격자 깊이를 증가시키면 최적값을 넘어서게 TE/ER 공명이 넓어진다. 듀티 사이클의 증가(트로프들을 좁힘)는 보상되고, 공명을 좁히면 최적값을 향해 다시 좁아지며, 이에 따라 필드 ER 세기를 유지한다.
따라서, ER 및 라벨 없는 검출 모드들에 대한 이중 사용 허용 구조물을 구하는 것에 대한 하나의 바람직한 방법은 25도 미만의 공명 각도 및 관심사의 여기 파장(예, 633nm)에서, 공기 환경의 TM 모드, 공기 환경의 TE 모드, 또는 물 환경의 TE 모드에서 넓은 각상 공명을 산출하는 0.6 내지 1.2 이상의 범위에서 대략적으로 깊이 대 반주기 비율을 갖는 격자를 구하는 것을 포함한다. 이러한 넓은 공명은 1도 내지 10도의 폭을 갖거나, 스펙트럼 폭 면에서 5nm 내지 30nm 범위의 스펙트럼 폭을 갖는다. 그러한 설계 효과들은 예를 들어, Gsolver 소프트웨어를 이용하여, 컴퓨터에서 용이하게 구현될 수 있다. 보다 직접적으로는, RSoft Design Group, www.rsoftdesigngroup.com으로부터 이용가능한 R-Soft와 같은 소프트웨어를 이용하여 격자 표면에서 필드 세기를 비교하여 모델링할 수 있다.
100 내지 600nm 범위의 격자 깊이들, 및 300 내지 600nm 범위의 격자 주기들이 예시적으로 고려된다.
본 발명의 장점을 갖는 통상의 당업자들은 컴퓨터상에서 잠재적인 격자 설계들을 모델링할 수 있고, 본 발명에 따라 적절한 설계들에 도달할 수 있다.
2차원 격자들
ER 및 라벨 없는 검출을 위해 적절한, 2차원(2-D) 격자 구조의 가능성 또한 고려되고 바람직할 수 있다. 2차원 격자는 와플(홀들), 와플 철(포스트들), 또는 2차원에서 교대하는 높고 낮은 영역들을 갖는 체스보드 구성처럼 보일 수 있다. 2차원 격자들은 X 및 Y 방향들에서 상이한 주기들을 가질 수 있다. 이러한 피쳐들은 각진 또는 곡선형 측벽들과 같은 Z 방향에서 다양한 프로파일들을 가질 수 있다. 따라서, 와플 패턴의 경우에, 돌출부들 또는 웰들은 정사각형 형상 이외에 사각형을 가질 수 있다. 이러한 부가된 융통성(flexibility)은 상이한 파장들에서 발생하도록 라벨 없는 검출 및 ER 검출에 대한 공명 위치들을 조정할 수 있도록 한다. 이러한 융통성은 현존하는 라벨 없는 검출 기기와 호환성을 유지하면서, 상이한 여기 파장들로 ER 공명을 조정한다는 점에서 현저한 장점을 제공한다. 일 예로서, X 주기는 CY3 형광체(녹색광) 또는 CY5 형광체(적색광)를 여기시키도록 조정된 파장을 갖는 수직 입사각에서 또는 수직 입사각 근처에서 공명을 제공할 수 있고, Y 주기는 820 내지 850nm(근접 적외선)에 고정된 공명을 산출할 수 있다.
본 발명에서 기술된 2-D 바이오센서 구조물들의 예들은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어 패키지(RSoft)를 통한 컴퓨터 시뮬레이션 및 RCWA(Rigorous Coupled Wave Analysis)를 이용하여 개발되었다. 컴퓨터 시뮬레이션들은 다음을 결정하기 위해, 소자 설계자가 소자의 물리적 파라미터들(굴절률, 두께, 폭, 높이, 구조적 형상)을 가변시킬 수 있도록 한다: 1) 소자 내에서 및 소자 주위에서 전자기장 분포, 2) 광의 입사각 및 광의 파장의 함수로서 반사율 또는 투과율 특성, 및 3) 바 이오센서의 표면으로 바이오분자 물질의 부착에 의해 반사된(또는 투과된) 스펙트럼이 변경되는 방법.
본 발명에서 기술되는 특정 2-D 실시예들은 단일 소자에서 BIND 및 ER 방법들에 의해 조합된 검출을 위해 최적화되고, 센서는 BIND 측정 동안 물과 접촉하며 ER 측정 동안 공기와 접촉한다. BIND 및 ER을 위한 건식(dry) 및 습식(wet)의 임의의 조합은 유사하게 최적화될 수 있다(예, 습식 모드에서 BIND 및 ER 측정).
조합된 ER 및 BIND(라벨 없는) 2차원 소자에 의해 제공되는 장점들을 보다 충분히 이해하기 위해, ER 만을 위해 최적화되는 선형(1차원) 구조물의 도 11-14와 연계하여 초기에 논의를 나타낼 것이다. 시뮬레이션들은 ER-단독 구조물 상에서 먼저 수행된다. 그 구조물은 Budach 외, "Generation of Transducers for Fluorescence-Based Microarrays with Enhanced Sensitivity and Their Application for Gene Expression Profiling", Anal Chem 2003, 75, 2571-2577로 공개된 종래기술의 ER 칩에 대략적으로 해당한다. (유의: Budach 외의 격자는 선형 격자이므로, 그 용어로서 1-D 구조물이 본 발명에서 사용된다. Budach 외의 문헌에 의해 기술되는 더 두꺼운 Ta2O5 층과 대비하여 도 11A-11B의 더 얇은 TiO2 높은 굴절률 물질은 2개의 물질들의 상이한 굴절률들을 고려함으로써, 동일한 광학 "두께"의 소자를 달성한다. 도 11A-11B의 모델링은 Budach 외의 소자를 정확히 복제하는 것을 의미하는 것이 아니며, 이에 근사한다.)
시뮬레이션들은 Cy5 염료의 ER 개선을 위한 대표적인 소자에 대해 각도 및 파장의 함수로서 반사율 및 전자기장 분포를 결정하기 위해 수행되었다. 특히, 도 11A 및 도 11B는 각각 ER 검출을 위해 단독으로 설계된 1차원 선형 격자 구조의 사시도 및 단면도이다. 도시된 바와 같이, 그 구조는 30nm 상승된 리지(201) 및 상승된 리지(201)를 커버하는 110nm TiO2 층(203)으로 이루어진 선형 격자 프로파일을 갖는다. 주기는 Y 방향에 있다(356nm 마다 반복되는 리지(201)).
도 12A 및 도 12B는 각각 RCWA에 의해 결정된 바와 같이, 도 11A 및 도 11B의 구조물의 파장 및 입사각의 함수로서, 반사 효율을 도시한다. 수직 입사각에서, 피크 파장(도 12A의 632nm)은 Cy5의 여기 파장에 해당하고, 입사광이 격자 라인 또는 리지(201)에 대해 평행한 방향에서 각도, 세타 만큼 회전될 때, 632nm 파장의 높은 반사 효율을 가진 광범위한 각도들(도 12B)이 있다.
도 13A-13C는 632nm의 입사 파장에 대해, Z = 110nm에 위치된 도 10A 및 도 10B의 구조의 하부 표면에 해당하는 XY 평면의 전기장 세기의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 13D-13F는 632nm의 입사 파장에 대해 도 13A-13C에 나타낸 동일한 XY 평면의 자기장 세기의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
도 13의 그래프들은 소자의 하부 노출 표면상에 XY 위치의 함수로서 전기장 벡터(Ex, Ey 및 Ez) 및 자기장 벡터(Hx, Hy, 및 Hz)의 3개 성분들의 세기를 나타낸다. 구조물(200)의 상부 노출 부분은 상부 표면이 하부 표면보다 상이한 수평면에 놓이기 때문에 음영(shaded)된다. 컴퓨터 시뮬레이션에서, 센서는 공명 파장에서 1 A/m의 자기장 및 1 V/m 크기의 전기장을 갖는 광원을 통해 조명된다. 따라서, 1보다 더 큰 필드 세기 값들은 공명으로부터 발생하는 센서 표면에서 필드 세기의 집중을 나타낸다. 전자기장의 전력은 E 및 H 필드 성분들의 교차 제곱에 의해 계산된다. 구조물의 표면상의 주어진 위치에서, 필드 전력은 구조물의 표면에 결합된 형광체들을 여기시키기 위해 이용가능한 에너지를 특정한다. 더 높은 전력은 이론적으로 더 높은 형광체 방출을 초래한다. 전기장과 자기장, 이에 따른 전력은 구조물의 표면 상부에서 균일하게 분포되지 않으며, 평균 전력보다 더 높은 위치들(202에서 나타낸 도면의 컬러 버전에서 적색 및 오렌지색 영역들)에 존재하고 평균 전력보다 더 낮게(도면의 컬러 버전의 영역들, 204에서 나타낸 보라색 또는 청색의 영역들) 존재한다는 것을 나타낸다.
도 14A-14C는 입사 파장 632nm에 대해, Z = 140nm에 위치된 도 11A 및 도 11B의 구조물의 상부 표면에 해당하는 XY 평면의 전기장 세기의 X, Y 및 Z 성분들의 그래프들이다. 도 14D-14F는 입사 파장 632nm에 대해 도 14A-14C에 나타낸 동일한 XY 평면의 자기장 세기의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다.
이러한 그래프들(도 14)은 소자의 상부 노출 표면상에서 XY 위치의 함수로서 전기장 벡터(Ex, Ey, 및 Ez) 및 자기장 벡터(Hx, Hy, 및 Hz)의 3개의 성분들의 세기를 나타낸다. 구조물의 하부 노출 부분은 상부 표면이 하부 표면보다 상이한 수평면에 놓이기 때문에 200에서 나타낸 것처럼 음영진다. 도 13의 그래프들에서처럼, 시뮬레이션에서, 센서는 공명 파장에서 1 V/m 전기장, 1 A/m 자기장을 갖는 광원을 통해 조명된다. 따라서, 1보다 더 큰 필드 세기 값들은 공명으로부터 발생하는, 센서 표면에서 필드 세기의 집중을 나타낸다. 이전에서처럼, E 및 H 필드 성분들의 벡터곱(cross product)은 형광체 여기에 대해 이용가능한, 공명 파장에서 순간적인(instantaneous) 전력 분포를 나타낸다.
A. 홀들 실시예의 예들
이제, 조합된 바이오센서의 2D "홀들" 실시예의 특정 예는 도 15-19와 연계하여 기술될 것이다. 바이오센서는 단일 소자를 이용하여 ER 및 라벨 없는(BIND) 검출을 위해 최적화되기 위해 2차원들로 구성된다.
도 15A 및 도 15B는 격자 구조물의 주기적인 홀들(210)을 특징으로 하는 2차원 격자 설계를 위한 단위 셀의 사시도 및 단면도를 각각 제공한다. 격자 설계는 물 모드 BIND(라벨 없는) 검출 및 공기 모드 ER 검출을 위해 최적화된다. 소자는 베이스 기판 시트에 도포되는 것으로 도시된 바와 같이 격자 패턴을 갖는 UV-경화 물질의 하부 기판(102) 층 및 78nm 두께의 상부 TiO2 층(104)을 포함한다.
도 15A 및 도 15B에 도시된 2차원 단위 셀은 도 11A 및 도 11B의 1차원 선형 격자 설계와 상이하다. 도 15A 및 도 15B의 구조는 도시된 바와 같이, X 축에 수직으로 편광된 입사광이 BIND 신호를 생성하고, Y 축에 수직으로 편광된 입사광이 ER 측정을 가능하게 하도록 설계된다. 이러한 설계 방법을 이용하면, BIND 및 ER 공명 파장들(특정 입사각에서 - 바람직하게는 거의 수직 입사각)은 독립적으로 선택될 수 있고, 이에 따라 각각의 BIND 및 ER 공명 파장들은 매우 상이한 값들에서 발생할 수 있다. 본 실시예에서 기술되는 조합된 BIND/ER 구조는 Cy5 형광체의 여기를 위해 632.5nm에서 ER 공명을 제공하면서, 근접 적외선(~800-900nm) 파장 영역에서 BIND 공명을 제공하도록 최적화된다. 본 예에서, 설계는 ER 측정 동안 센서에 대한 공기 환경 및 BIND 측정 동안 센서 상에서 물 환경을 가정한다. ER 및 BIND를 위한 상이한 파장 요구조건들은 직사각형 "홀"(210)을 갖는 단위 셀의 선택을 야기한다. 따라서, 단위 셀은 X 및 Y 방향들에서 상이한 치수들을 가질 수 있다. 예를 들어, X 방향의 주기는 BIND 파장을 위해 550nm이지만, 더 낮은 파장 ER 공명을 위해 요구되는 바와 같이 Y 방향에서 432nm이다. 제조 프로세스는 높은 굴절률 유전체 두께는 X 및 Y 방향들에서 동일하다는 것을 나타낸다. 또한, 제조의 간략화를 위해, 설계는 일정한 격자 깊이를 갖는다. 제조 프로세스는 홀 코너들의 라운딩을 초래하지만, 설계의 원래 기능은 변화되지 않게 유지된다. 통상의 당업자는 컴퓨터가 도 15A 및 15B에 도시된 것처럼 설계를 생성 및 테스트하는데 사용될 때, 설계자는 단위 셀, 격자 깊이, 및 코팅 층들을 변경시킬 수 있고, 세타의 함수로서 필드 세기, 피크 파장, 반사율의 시뮬레이션들과 다른 테스트들을 실행할 수 있으며, 허용가능한 결과들을 달성하면서 다른 치수들을 선택할 수 있다. 따라서, 도 15A 및 도 15B의 예는 예시적인 실시예인 것으로 의도되며, 그 범주를 제한하는 의도가 아니다.
도 16 및 도 17은 각각, Y 축을 따라 편광되는 광을 통해 조명될 때 도 15A 및 15B에 개시된 구조들에 대해, 파장 및 입사각의 함수로서 반사 효율의 그래프들이다. RCWA에 의해 생성되는 이러한 도면들은 ER 모드의 동작을 나타낸다. 도 17은 공명 파장에서, 입사각의 함수로서 반사 세기가 현저한 ER 효과를 유도하는 광에 대해 허용 각도를 관찰한다는 것을 나타낸다. 물리적 측정들에서, 도 16의 그래프에서 피크들 사이의 이중 피크 및 딥(dip)이 해결되지 않을 수 있다.
상기 1D 예와 유사한 방식으로, RCWA 계산들은 도 15A 및 도 15B에 도시된 구조물에 대한 ER 공명 파장에서 자기장 성분들(Hx, Hy, 및 Hz) 및 전기장 크기 성분들(Ex, Ey, 및 Ez)의 진폭의 공간 분포를 결정하는데 사용될 수 있다. 도 18A-18C는 입사 파장 632.5nm에 대해, Z = 78nm에서 도 15A 및 도 15B의 구조물의 하부 표면에 해당하는 XY 평면의 전기장 세기의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 도 18D-18F는 입사 파장 632.5nm에 대해 도 18A-18C에 나타낸 동일한 XY 평면의 자기장 세기의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 이러한 필드 진폭 분포들은 X 및 Y 방향들에서 반복되는 단일 단위 셀에 대한 홀 내부의 하부 TiO2 표면에 도시된다. 이전에서처럼, E 및 H 필드 성분들의 벡터곱은 하부 표면에서 형광 여기를 초래하는 순간적인 전력 밀도 분포를 기술한다. 공명 파장에서 1 V/m 전기장, 1 A/m 자기장 평면파는 조명 소스로서 사용된다.
유사하게는, 전자기장 분포들은 단위 셀의 상부 TiO2 표면에 대해 계산될 수 있다. 도 19A-19C는 입사 파장 632.5nm에 대해 Z = 433nm에서 도 15A 및 도 15B의 구조물의 상부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 도 19D-19F는 입사 파장 632nm에 대해 도 19A-19C에 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 그래프 범례에 의해 나타낸 바와 같이, 더 높은 전력 밀도가 이러한 소자의 표면에서 달성될 수 있다는 것을 나타내는 종래기술 설계의 것들보다 각각의 필드 성분의 최대 진폭이 실질적으로 더 높다는 것을 유의한다. 특히, 실질적인 Ez 성분은 1D의 이전의 설계의 Ez 진폭과 대조적으로 나타났다는 것을 유의한다.
도 19G는 X축에 평행하게 편광된 입사 광을 이용하여 모델링된 파장의 함수로서 반사 효율을 도시한다. 도 15에 의해 나타낸 설계상에 입사되는, X 축 편광을 갖는 광은 대략 12.5nm의 폭 및 최대 약 830nm를 갖는 라벨 없는 검출을 위해 유용한 공명을 생성한다. 시뮬레이션은 델타(PWV)/델타(n)으로서 규정된, 벌크 굴절률 시프트 계수를 예측할 수도 있고, 여기서 델타(PWV)는 센서 위의 환경에서 델타(n)의 굴절률 변화에 의해 유도되는 피크 파장 값의 시프트이다. 이러한 양은 격자 표면으로 샘플의 바인딩에 대한 센서의 감도를 나타낸다. 도 15A 및 15B에 의해 기술된 "홀" 설계는 상기 구조가 감응성 라벨 없는 성능을 제공한다는 것을 나타내는, 200의 예측된 벌크 시프트 계수를 갖는다.
B. 포스트들 실시예의 예
이제 포스트(post)를 특징으로 하는 반복적인 단위 셀을 이용하는 2차원 격자 구조는 도 20-24를 참조로 기술될 것이다.
도 20A 및 20B는 각각, 센서 표면에서 형성되는 주기적인 포스트들(220)을 특징으로 하는 2차원 격자 설계의 단위 셀의 사시도 및 단면도이다. 각각의 단위 셀은 하나의 포스트(220)를 갖는다. 포스트들(220)은 베이스 시트(미도시)에 도포된 기판 물질(102)(예, UV 경화 폴리머)의 상승된 돌출부들이다. 높은 굴절률(예, TiO2) 코팅은 도면들에 도시된 바와 같이 돌출부들 및 기판에 제공된다. 구조물은 X 방향에서 편광된 광을 이용하여 물 환경의 BIND(라벨 없는) 검출을 위해 최적화되고, Y 방향에서 편광된 광을 이용하여 공기 모드의 ER 검출을 위해 최적화된다.
도 20의 설계는 RCWA 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 연구되었다. 도 15의 이전의 구조 단위 셀은 z 방향의 보다 상위 평면의 영역들에 의해 둘러싸이는 "홀" 영역을 포함하는 반면에, 도 20의 격자 구조물은 z 방향의 보다 하위 평면의 영역들에 의해 둘러싸이는 중심 "포스트" 영역을 포함한다. 이전에서처럼, 도 20의 설계는 Cy5 형광체의 여기를 위해 632nm의 ER을 제공하면서, 근접 적외선(~ 800-900nm) 파장 영역의 BIND 공명을 제공하도록 최적화된 BIND/ER 조합된 구조물을 나타낸다. 본 예에서, 설계는 ER 측정 동안 센서 상부의 공기 환경 및 BIND 측정 동안 센서 상부의 물 환경을 가정한다. ER 및 BIND에 대한 이러한 상이한 파장 요구조건들은 "직사각형" 단위 셀의 선택을 야기한다. 따라서, 단위 셀은 X 및 Y 방향들에서 상이한 치수들을 가질 수 있다. 예를 들어, X 방향의 주기는 BIND 파장에 대해 530nm이지만, 보다 낮은 파장 ER 공명에 대해 요구되는 바와 같이 Y 방향에서 414nm이다. 또한, 제조 프로세스는 높은 굴절률 유전체 두께가 X 및 Y 방향에서 동일하다는 것을 나타낸다. 제조의 간략화를 위해, 설계는 일정한 격자 깊이를 갖는다. 또한, 제조 프로세스는 포스트 코너들의 라운딩을 초래할 것이지만, 설계의 원리적인 기능은 변화되지 않게 유지된다. 도 20의 예는 그 범주를 제한하지 않는 예시적인 예로서 의도된다. 물론, 특정한 치수들은 가변될 수 있다.
도 21A 및 21B는 Y 축을 따라 편광된 광을 통해 조명될 때 도 20A 및 20B에 의해 나타낸 구조물들에 대해, 파장 및 입사각의 함수로서 반사 효율을 각각 나타내는 그래프들이다. RCWA에 의해 생성되는 이러한 도면들은 ER 모드의 동작을 나타낸다. 도 21A는 633nm의 공명 피크 최대 반사를 나타내고, 도 21B는 633nm에서 조명될 때 입사각들의 범위에 걸친 공명을 나타낸다.
RCWA 컴퓨터 시뮬레이션들은 ER 공명 파장에서 자기장 성분들(Hx, Hy, Hz) 및 전기장 성분들(Ex, Ey, 및 Ez)의 진폭의 공간 분포를 결정하는데 사용될 수 있다. 도 22A-22C는 입사 파장 633nm에 대해, Z = 70nm에서 도 20A 및 20B의 구조물의 하부 표면에 해당하는 XY 평면에서 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 도 22D-22F는 입사 파장 633nm에 대해 도 22A-22C에 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 나타낸다. 도 22에 도시된 것처럼, 필드 진폭 분포들은 X 및 Y 방향들에서 반복되는 단일 단위 셀에 대한 포스트들을 둘러싸는 하위 표면들에 대해 도시된다. 이전에서처럼, E 및 H 필드 성분들의 벡터곱은 하위 표면에서 형광 여기를 야기시키는 순간적인 전력 밀도 분포를 기술한다. 또한, 공명 파장에서 1 V/m 전기장, 1 A/m 자기장 평면파는 광원으로서 작용한다.
유사하게, 전자기장 분포들은 단위 셀의 상위 TiO2 표면들에 대해 계산될 수 있다. 도 23A-23C는 입사 파장 633nm에 대해 Z = 430nm에서 도 20A 및 20B의 구조물의 상부 표면에 해당하는 전기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 도 23D-23F는 입사 파장 632nm에 대해 도 23A-23C에 의해 나타낸 동일한 XY 평면에서 자기장 진폭의 X, Y 및 Z 성분들을 도시한다. 필드들의 최대 크기는 필드 성분들의 각각에 대해 종래기술의 설계(도 10) 보다 실질적으로 더 높고, 이는 잠재적으로 더 높은 전력 밀도가 이러한 소자의 표면에서 달성될 수 있다는 것을 나타낸다는 것을 유의한다.
도 24는 X 축에 평행하게 편광되는 입사 광을 이용하여 모델링되는 반사 효율을 도시한다. 도 15에 의해 나타낸 설계상에 입사하는 X 축 편광을 통한 광이 라벨 없는 검출을 위해 유용한 공명을 생성하고, 약 8nm의 폭과 약 805nm의 최대 반사율을 갖는다. 시뮬레이션들은 90의 시프트 계수(상기에서 설명됨)를 생성한다. 또한, 도 20의 실시예는 비록 도 15의 실시예보다 더 낮지만, 감응성 라벨 없는 성능을 제공할 것으로 예상된다. 2개의 2D 설계들간의 진폭 값들과 시프트 계수들의 비교는 격자 구조물의 추가적인 최적화가 다른 검출 모드에서 감소된 성능에 대한 트레이드오프로서 하나의 검출 모드의 성능을 강조할 수 있다는 것을 제안한다.
ER 검출을 위한 진폭의 양은 형광체의 여기 파장 범위내에서 센서 표면상의 형광체들의 분포에 소자 구조물로부터의 전력을 관련시킨다. 따라서, 공명 파장이 여기 파장 범위내에 속하도록 제공되는, 공명 파장에서 센서 표면의 전력 밀도 분포는 상이한 ER 소자 설계들의 감도를 비교하기 위한 수단을 제공한다. 필드 전력 또는 "배율 인자(magnification factor)"로서 벡터곱 E(max)×H(max)를 규정할 수 있다. 더 높은 전력 영역 및 더 낮은 전력 영역 사이의 차이들을 나타내기 위해 전력 밀도의 상세한 집적, 구조물의 상부, 하부 및 측면들로부터의 소산장의 세기 분포의 분석은 하나의 소자가 다른 것보다 더 효과적으로 기능하는지 여부의 보다 정확한 예측을 제공하지만, 직교 H 성분을 갖는 E 성분의 최대 진폭의 곱은 설계들을 비교하는 매우 간단하고 개략적인 방법을 제공한다. 장치들의 노출된 상부 및 하부 평면들에 대한 RCWA 분석을 이용하여, 도 11A 및 도 11B의 종래기술의 설계에 대한 E×H 배율 인자는 144이다. 반대로, 도 15A 및 도 15B의 "홀들" 단위 셀 설계에 대해, E×H 배율 인자는 6217이 반면에, 도 20A 및 도 20B의 "포스트들" 설계에 대해, E×H 배율 인자는 5180이다. 이러한 개략적인 분석을 기초로, 도 15 및 도 20의 2D 격자 설계들의 ER 특징들은 도 10의 선형 격자 설계보다 더 높은 감도의 ER 성능에 대한 잠재력을 제공하는 것으로 보인다. 더욱이, 도 15 및 도 20의 설계들은 상기에서 설명된 것처럼, 라벨 없는 검출을 위한 우수한 감도를 제공하기 위해, 컴퓨터 시뮬레이션들을 기초로 예측된다. 따라서, 단일 장치에서 조합된 유용한 ER 및 라벨 없는 검출은 전술한 2D 격자 실시예들에서 달성된다.
C. 2-레벨, 2-D 격자들
도 28A-28C는 조합된 ER 및 라벨 없는(BIND) 검출을 위해 설계되고 구성되는 바이오센서 격자 구조에 대한 단위 셀(500)의 또 다른 실시예의 3개의 사시도들이다. 이러한 구조의 피쳐들의 일부를 고려하기 위해, 소산 공명(ER) 및 라벨 없는(BIND) 센서들에 속하는 설계 특징들이 반복되는 것이 유용할 것이다. 그러한 센서들은 즉, 공명 파장, 공명 폭, 및 격자 깊이를 3개의 기본적인 설계 특징들에서 상이하다.
공명 파장
ER 센서는 여기 파장의 수 nm(~ +/-2)내에서 발생하는 공명을 선호한다. 여기 광은 일반적으로 레이저로부터 나오고 매우 좁은 대역폭을 갖는 것으로 주어지면, 이러한 요구조건은 ER 공명의 파장 위치에 높은 특이성을 둔다. BIND 모드의 동작은 ER 여기 소스로부터 BIND 신호를 스펙트럼적으로 분리시키거나, 예를 들어 외부의 주변 발광 파장 범위와 같은 다른 파장에서 공명의 장점을 가질 수 있어서, 잠재적인 중첩 검출 충돌들을 제거한다.
공명 폭
ER 센서는 생물학적 코팅 두께 및 광 수치적 개구와 같은 변수들의 존재에서 여기 파장을 중첩시키기 위해, 이에 충분한 공명 폭을 가져야 한다. 실제로, ER 공명은 약 5nm 미만, 보다 바람직하게는 10 내지 15nm의 최대 반치(half maximum)(FWHM)에서 전체 폭을 갖지 않아야 한다. 한편, BIND 감도는 피크 위치 불확정성은 피크 폭이 좁아짐에 따라 감소되기 때문에 1/sqrt(FWHM)로서 대략적으로 증가한다.
격자 깊이
BIND 센서들은 더 많은 생물학적 물질이 격자에 부착될 때 더 큰 공명 파장 시프트를 준다. 더 깊은 격자는 생물학적 물질을 바인딩하기 위해 더 많은 표면적을 제공한다. ER 효과는 필수적으로 개선될 필요는 없고, ER 격자 깊이가 증가함에 따라 저하될 수 있다.
이전에 기술된 2-D 설계들은 일정한 격자 깊이를 갖는다(예, 포스트 예들에서 포스트들의 높이, 또는 홀들 예에서 홀들의 깊이). 단일 격자 깊이를 선택하면 피크 폭 및 표면적에서 BIND 및 ER 성능 사이의 절충, 즉 BIND PWV 시프트를 포함할 수 있다.
도 28A-28C의 바이오센서의 설계는 2개의 레벨, 2차원 설계이다. 설계의 세부사항들은 이하에서 보다 상세히 논의될 것이다. 이러한 설계는 좁은 TM BIND 공명 및 높은 BIND 시프트 성능을 유지하고, 동시에 더 넓은 TE ER 공명을 제공한다. 이전에 기술된 2차원 설계들과 유사하게, BIND 및 ER 격자들은 상이한 주기들을 가질 수 있으므로, 별개로 결정된 공명 파장들을 가질 수 있다.
도 28A-28C의 이러한 "2 레벨" "comBIND" 설계는 다수의 반복되는 단위 셀들(500)을 포함하고, 그 각각은 Y 방향에서 연장되는, 상대적으로 깊은 BIND 격자(504)상의 X 방향에서 연장되는 상대적으로 얕은 ER 격자(502)와 중첩된다. 도 28A-29C는 이러한 설계를 위한 하나의 "단위 셀(unit cell)"(500)를 도시하고, XY 평면에서 복제될 때 완전한 격자를 형성한다.
단위 셀(500)은 마스터 격자 웨이퍼를 이용하여 PET 막(미도시)과 같은 베이스 기판 시트에 도포되는 UV 경화 폴리머 층(524)으로 이루어진다. 폴리머 층(524)은 BIND 격자(504)의 구조를 갖고, 즉 Y 방향에서 연장되는 낮은 영역 및 높은 영역이 교번된다. X 방향에서 UV 경화 폴리머 층(524)의 낮은 영역들과 비교하여 높은 영역의 상대적 높이가 Y 방향에서보다 훨씬 더 낮지만, X 방향에서, 격자는 교대하는 낮은 영역 및 높은 영역을 갖는다.
TiO2(또는 교대로 SiO2 또는 Ta2O5) 층(522)은 UV 경화 폴리머 층 상부에 증착된다. 이러한 층은 도시된 실시예에서 일정한 두께를 갖는다. 층(522)은 상부의 반복 표면(506, 508, 510, 512), 및 하부의 반복 표면(514, 516, 518, 519)을 포함한다. 하부 표면들(514, 516, 518, 519)은 UV 경화 폴리머 층의 상부 표면 상부에 위치된다. 공기 또는 물 샘플 매체(520)는 TiO2 또는 SiO2 층(522)의 상부 표면들(506, 508, 510, 512)과 접촉되게 배치된다.
도 28A-28C의 검사로부터 이해되는 것처럼, "2-층 2-D" 격자 구조물은 각각 상부 및 하부 격자 표면들(506/508, 510/512)을 특징으로 하는, Y 영역에서 상대적으로 깊은 BIND 격자(504)를 포함한다. 따라서, 단위 셀의 BIND 특징은 더 많은 샘플 물질의 부가를 허용하고, 더 많은 물질이 격자에 부착되도록 허용되며, 더 큰 공명 시프트를 허용한다. BIND(Y 방향)의 더 깊은 격자는 생물학적 물질을 바인딩하기 위한 더 넓은 표면적을 제공한다.
반대로, X 방향에서 연장되는 ER 격자(502)는 높은 영역들(506) 및 낮은 영역들(508)(및 높은 영역(510)과 낮은 영역(512))을 갖는 상대적으로 얕은 격자 패턴으로 이루어진다. 양호한 BIND 검출 용량을 제공하는 것과 더불어, 격자는 더 넓은 TE ER 공명에 최적 폭을 동시에 제공하는 것으로 예상된다.
도 28A-28C의 설계의 명백한 장점은 ER 및 BIND 구조물들이 독립적으로 동작해야 한다는 것이다. 따라서, ER 검출 또는 BIND 검출만을 위해 최적화되는 구조적 영역들은 도 28A-28C의 ER 및 BIND 센서의 조합을 위해 작용해야 한다. 도 28A-28C의 단위 셀을 갖는 구조물의 특정 치수들은 물론 가변될 수 있지만, 하나의 대표적 실시예에서, BIND 격자(504)는 약 260nm 내지 약 1500nm의 주기를 갖고, 격자의 깊이(표면들(506, 510) 사이의 거리)는 100nm 내지 약 3000nm이다. ER 격 자(502)에 대해, 주기는 약 200nm 내지 약 1000nm이고, 깊이(표면들(506, 508, 510, 512) 사이의 Z 거리)는 10nm 내지 약 300nm이다.
도 28A-28C의 구조물은 RCWA 및 달성되는 시뮬레이션된 반사 스펙트럼을 이용하여 컴퓨터상에서 시뮬레이션되고, X 방향에서 ER 격자 구조물의 첨가를 갖거나 갖지 않는다. 도 30은 X 방향(곡선 592)에서 ER 격자(502) 없는 BIND 격자 스펙트럼, 및 조합된 ER 및 BIND 격자 스펙트럼(곡선 590)을 도시한다. 두 개의 스펙트럼 시뮬레이션들은 바이오센서의 표면상의 물을 포함한다. BIND 격자 상부의 ER 격자의 부가(곡선 590)는 CY5 형광체의 ER 여기를 위해 적절한 위치 및 폭의 부가적인 공명 피크들(600, 602)을 생성한다. ER 격자(502)(도 28A-28C)와 곡선(590)은 총 표면적을 향상시키고, 이에 따라 BIND 시프트 개선을 위한 잠재력을 제공한다는 것을 유의한다. BIND 피크 파장 값들은 도 30에서 피크들(606, 604)에 나타낸다.
억제제들을 이용하는 ER + BIND 바이오센서에 대한 추가적인 애플리케이션들
이하의 억제 바인딩 시나리오를 추가적으로 고려하고, 여기서 검출될 물질, 예를 들어 단백질의 일부 분율은 격자 기판(라벨 없는)에 직접적으로 결합되며, 단백질의 일부 다른 분율은 형광 라벨을 갖는 억제제에 결합된다. Ks 및 Ki는 기판(Ks) 및 억제제(Ki)에 대한 균등한 바인딩 상수들이다.
Figure 112008007766110-pct00001
수학식들은 상기 전형적인 억제 바인딩 시나리오를 위한 농도들 및 균등한바인딩 상수들(K)에 대한 값들 및 관계들을 규정하도록 쓸 수 있다:
(1) KS = [단백질~기판]/[단백질]×[기판] 및
(2) K1 = [단백질~억제제]/[단백질]×[억제제]
2개의 식들 및 재배치 항목들을 조합하면, 기판에 의해 결합되는 단백질의 분율에 대한 식에 용이하게 도달할 수 있다.
기판에 의해 결합되는 단백질의 분율 =
Figure 112008007766110-pct00002
여기서,
Figure 112008007766110-pct00003
이고, Ki는 억제 바인딩 상수이며, KS는 기판 바인딩 상수이고, P, S 및 I는 각각 단백질, 기판 및 억제제의 농도들이다.
새로운 억제제들에 대한 테스트 반응들의 설정에서, 오퍼레이터는 일반적으로 예를 들어 일부 형광 라벨을 이용하여, 결합된 기판의 양만을 측정하지만, 동시에 Ki 또는 억제제 리간드 바인딩을 직접적으로 정량화할 수 없다(즉, 리간드 바인딩은 추정된다). 본 발명의 조합된 ER 및 라벨 없는 바이오센서에 의해 제공되는 2개의 독립적인 정량화 방법들과 간단한 테스트를 통해, 전술한 바인딩 시나리오에 대한 모든 변수들이 알려질 수 있다. 즉, 바인딩 특성들의 보다 완전한 이해 및 특성화는 진보적인 ER 및 라벨 없는 센서를 이용한 단일 테스트에 의해 달성된다.
형광 라벨은 격자 기판 표면 또는 억제제 상에 있을 수 있다. 이는 기판 또는 억제제가 라벨 없을 수(비표지) 있다는 것을 의미한다. 바람직한 실시예는 제 1 바인딩 분자(바이오센서의 기판일 수 있음) 및 잠재적인 제 2 바인딩 분자, 예를 들어 억제제 분자를 이용하고, 제 1 바인딩 분자를 갖는 생물학적 물질(예, 단백질)의 바인딩과 충돌하거나 영향을 줄 수 있다.
라벨 있는 및 라벨 없는 바이오센서에서 바인딩 반응들에 영향을 주기 위해 억제제들을 이용하는 이러한 기술은 매우 긴밀한 바인딩 반응들을 포함하도록 확장될 수 있고, 이에 따라 더 약한 바인딩 친화도를 갖는 공지된 경쟁의 억제제는 훨씬 더 긴밀한 바인딩 실재물을 관찰/방해하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 바이오센서를 통해 검출될 수 있는 특정 바인딩 물질들(샘플들)의 예들은 핵산들, 폴리펩티드들, 항원들, 다중 클론 항체들, 단일 클론 항체들, 단일 체인 항체들(scFv), F(ab) 파편들, F(ab')2 파편들, Fv 파편들, 유기 저분자들, 세포들, 바이러스들, 박테리아, 폴리머들, 펩티드 용액들, 단백질 용액들, 화학 화합물 라이브러리 용액들, 단일 나선 DNA 용약들, 이중 나선 DNA 용액들, 단일 및 이중 나선 DNA 용액들의 조합물들, RNA 용액들 및 생물학적 샘플들을 포함한다. 그러한 생물학적 샘플들은 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 위장관 분비물, 조직들 또는 종양들의 균질화액, 활액, 배설물, 타액, 객담, 낭종수, 양수, 뇌 척수액, 복막투석액, 폐 세척액, 정액, 림프액, 눈물 및 전립선 액으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 기술되는 바이오센서는 (a) 바이오센서 표면으로 임의의 이러한 타입들의 샘플들의 성분들의 바인딩, (b) 샘플의 다른 성분, 예를 들어 샘플의 형광체에 대한 샘플의 바인딩, 및 (c) 샘플에 부가되는 제 2 샘플에 대한 샘플 또는 샘플 성분의 바인딩을 검출하는데 사용될 수 있다. 바인딩 (b)의 일 예로서, 센서 표면은 예를 들어 스트렙타비딘-비오틴 또는 6His와 같은, 샘플의 일정 성분에 결합될 수 있고, 바이오센서는 폴리머라제 복합물과 같이, 샘플의 성분들의 부가적인 그룹핑을 통해 샘플의 결합 성분의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 바인딩 (c)의 후자 예에서, 샘플은 바이오센서에 배치되는 제 2 샘플로부터 다른 성분(들)을 특정하게 결합/끌어당기는 다른 성분 및 바이오센서의 표면에 부착되는 성분을 가질 수 있다.
천연 형광을 이용하는 실시예들
추가적인 실시예로서, 조합된 ER 및 라벨 없는 바이오센서는 다른 생물학적 분자들과 테스트 저분자들과의 상호작용시 이들에 대한 폴딩, 적층, 및 변화들과 변화율들의 생물리학적 특성화 측정들을 위해, 생물학적 분자들의 천연 형광(즉, 바운드 형광 라벨의 사용을 요구함이 없이)을 사용하는 분석법들에 대해 특히 유용하다. 그러한 특성화 측정들은 바운드 형광 라벨을 통해 이루어질 수 있지만, 그러한 바운드 라벨은 특히 고유한 형광 특성을 갖는 생물학적 물질들에 대해, 필수적으로 요구되지 않는다.
이하의 표는 단백질 및 핵산 성분들과 보조 효소들의 형광 특성들을 기술한다.
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θF에 대해 나타낸 * 값들은 일반적으로 가장 큰 것으로 관찰된다. 주어진 경우에서, 실제 값들은 상당히 더 낮을 수 있다. 출처: Charles R. Cantor 및 Paul R. Schimmel, parts 1-3 Biophysical Chemistry - The behavior and study of biological molecules, W.H. Freeman and Company, New York, (1980), page 443.
이러한 기술은 핵산 폴리머들(DNA, RNA)(형광 뉴클레오시드 베이스들) 적층 및 수소화, 단백질(형광 아미노산 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신) 및 지방질 막들(이들의 구획화들로 형광체들의 포함시 개선 및 소광 효과들)에서 특히 중요하다. 일 실시예에서, 라벨 없는 BIND 피쳐는 샘플 물질 또는 이에 결합된 리간드의 양의 정량화를 허용하고, ER 피쳐는 생물학적 변화의 감응성 추적을 허용한다.
백그라운드 형광을 감소시키기 위한 부가적인 낮은 형광 SiO 2 층을 통한 ER 및 BIND 바이오센서
본 발명의 조합된 ER 및 BIND 센서가 바운드 형광체 또는 천연 형광물질로부터 형광물질을 검출하기 위해 사용될 때, 더 높은 신호 대 잡음비를 갖는 형광 측정들을 생성할 수 있기 위해, 바이오센서 구성 물질들내에서부터 방출되는 백그라운드 형광물질을 감소시키는데 유용할 수 있다. 이를 달성하는 한가지 방법은 낮은 형광 SiO2 물질의 부가층을 UV 경화 폴리머 층에 증착한 다음, 최상위 높은 지수의(예, TiO2) 층을 SiO2 층에 증착하는 것이다. 그러한 바이오센서는 도 30에 도시되고, UV 경화 폴리머 층(524)(미도시된 기판 시트에 결합됨), 중간 SiO2 층(700), 및 상부 TiO2 층(522)을 포함한다. 공기 또는 물-기질 매체의 샘플은 TiO2 층상에 배치된다. 부가적인 SiO2 층(700)의 두께는 격자 듀티 사이클과 요구되는 백그라운드 형광 레벨에 좌우되지만, 일반적으로 500 내지 5000Å 범위내에 있을 것이다.
SiO2 층(700)은 바람직하게는 바이오센서를 조사하는데 사용되는 광원들로부터 입사광에 응답하는 낮은 천연 형광물질을 갖는다. SiO2의 형광 레벨은 제조되는 프로세스에 좌우되고, 그 구조(비정질 대 나노결정질) 또한 역할을 할 수 있다. 또한, SiO1.95와 비교하여, 층(SiO2)에서 SiO2 분자들의 전체 산화는 낮은 형광물질을 층에 제공하는데 있어서 중요한 것으로 보인다. 바람직하게는, SiO2 층은 프로세스에 의해 제조되고, 상대적으로 낮은 천연 형광을 초래하는 구조를 갖는다.
SiO2 중간 층들의 사용의 일 예는 도 28A-28C의 구조에 있고, 여기서 상부 TiO2 층(522) 아래에, 낮은 형광 SiO2 층은 UV 경화 폴리머 층 상부에 도포된다. SiO2 중간 층은 X 및 Y 방향들에서 일정한 두께이다.
또한, 낮은 형광 SiO2 물질의 부가 층은 본 명세서에서 이전에 기술된 다른 바이오센서들에 존재할 수도 있다.
도 28 및 도 30에서 및 상부의 높은 굴절률 층을 나타내는 다른 도면들에서, TiO2는 상부층(522)에 대해 요구되는 물질이 아니다. Ta2O5(탄탈 오산화물)가 작용할 수도 있다. TiO2는 Ta2O5보다 더 높은 굴절률을 갖고, 이는 높은 굴절률 층에 대해 일반적으로 사용되는 이유이다. Ta2O5를 이용할 때, 동일한 광 두께를 달성하기 위해 더 많은 물리적 두께를 갖는다. 본 발명에서 나타낸 예들에서, TiO2 또는 Ta2O5를 이용하는지 여부에 따라, 상부층(522)에 대한 두께 범위는 약 70nm 내지 250nm이다.
하나의 추가적인 가능한 실시예에서, 하프늄 산화물 코팅은 TiO2 또는 Ta2O5를 대체하는 높은 굴절률 층으로서 바이오센서에 도포된다. 적외선 및 가시광선 파장들에서, TiO2 또는 Ta2O5는 흡수를 갖지 않는다. 그러나, 낮은 파장들에서, 이러한 물질들은 모두 흡수되기 시작하고, 더 낮은 파장들로 진행됨에 따라 흡수는 증가된다. 이것은 흡수가 공명을 소멸시키는 효과를 갖기 때문에, 공명 장치들에 대한 문제점이다(즉, 어떠한 피크도 측정되지 않거나, 피크가 작을 것임). 하프늄 산화물은 400nm만큼 낮은 파장들에 대해, 흡수가 발생되지 않는다. 하프늄 산화물 코팅의 두께 및 격자 치수들은 관심 있는 UV 파장들에서 공명을 산출하도록 선택된다.
시간 분석되는 형광(TRF) 및 형광 분광(FP) 측정들에서 ER 센서의 사용
본 발명의 ER 및 BIND 센서의 신규한 사용들의 한가지 추가적인 예는 시간 분석된 형광(TRF) 및 형광 편광 측정들을 위한 센서의 사용이다. TRF 및 FP 편광은 본 발명의 조합된 라벨 없는 및 ER 소자로부터 유도되는 향상된 신호의 큰 장점을 갖는 2가지 방법들이다. 이러한 2가지 방법들은 백그라운드 신호들로부터 및 바인딩 이벤트에 참여하지 않는 분자들로부터, 이벤트들을 바인딩하기 위해 특정 ER 신호들을 분리시키기 위해 특히 유용하다. 형광체는 센서의 파장 향상 용량에 일치될 필요가 있다.
FP 및/또는 TRF에서 ER을 이용하기 위한 방법의 발명은 훨씬 더 높은 감도를 가지면서, 바인딩 이벤트에 포함되는 형광체의 존재를 깨끗하게 검출하고 백그라운드 또는 비-참여 분자들로부터 그러한 검출을 차별화시키는 기회를 사용자에게 제공한다.
FP 및 TRF는 단백질/화합물 스크리닝 산업들을 진단 및 의학적으로 테스트하는 기술들에 널리 사용된다. 예를 들어, 미국특허 제6,432,632호, 제6,207,397호, 제6,159,750호, 제6,448,018호, 제6,455,861호, 제6,566,143호, 및 제5,504,337호를 참조하고, 그 각각의 내용들은 참조로 본 발명에 포함된다. 또한, Budach 외, 미국특허 제6,870,630호 및 제6,707,561호, Neuschafer 외, 미국특허 제6,078,705호 및 제6,289,144호의 특허들을 참조한다. 상기 방법들은 이들이 백그라운드 및 비-바인딩 분자들과 같은 원치 않는 신호들로부터 바인딩 신호들의 차별화를 허용하기 때문에, 널리 행해진다. 현재의 방법들은 개선된 신호 대 잡음비들(감도)을 갖고, 감소된 반응물 소모를 허용한다. 이러한 개선점들은 감도 및 반응물이 제한되는 단백질학(proteomics)으로서 공지된 연구의 영역에서 특히 유용할 것이다. 또한, 생물리학적 결정들의 전형적인 분류들(폴딩, 다른 분자들에 대한 근접도, 크기 등)도 향상된다.
바인딩 상호작용들을 결정하는데 있어서 50-100x 개선된 감도의 가능성을 제공함으로써, 이러한 기술들은 반응물 소모의 감소, 및 낮은 신호들에서 더 큰 신뢰도 제한들을 포함하는 몇가지 상업적 장점들을 갖는다.
결점 없는 저면판의 하부측으로부터 FP를 측정할 수 있는 임의의 기기는 본 발명에서 기술되는 ER/BIND 바이오센서들에 대해 작용한다고 판단된다. 예를 들어, Molecular Devices SpectraMax M5 기기와 같이, FP 및 TRF를 측정할 수 있는 상업적으로 이용가능한 기기들이 있다. 그러나, FP 측정들의 검출을 위한 기기는 TRF 측정들을 수행하는 기기와 동일할 필요는 없다.
크게 개선된 신호 및 신호 대 잡음비를 제공함으로써, FP 또는 TRF 측정들을 위해 보다 바람직한 ER 바이오센서의 물리적 특성들은 개선된 신호에 대한 공명 효과를 생성하는 바이오센서의 격자 구조(본 명세서의 길이에서 기술됨)이다. FP 및 TRF는 스크리닝(screening)되는 화합물들의 천연 형광체로부터 나오는 원치 않는 신호들(즉, 이러한 화합물들과 함께 훨씬 더 높은 잡음/백그라운드)을 사용자들이 방지하기 때문에, 의약적 스크리닝 활동들에 대한 제안된 방법들이다.
ER 및 BIND 센서를 통한 스포팅 프로세스 및 품질 제어
본 발명의 바이오센서의 한가지 가능한 사용에서, ER 및 BIND 센서는 다수의 위치들에서 샘플을 분석하는데 사용되고, 각각의 그러한 위치들은 약 10-500마이크론 직경의 마이크로어레이 스폿을 규정한다.
"스폿(spot)"이란 용어는 바이오센서의 표면상에 배치되는 적은 양의 샘플 물질을 지칭한다. 바이오센서의 표면상에 샘플을 포함하는 타겟 용액의 작은 방울들(droplets)을 증착하고 이들을 건조시킴으로써 그러한 스폿들을 생성한다. 작은방울 크기는 스폿 크기를 결정한다. 상이한 프로세스들은 작은 방울을 증착시키기 위해 존재하고, 그러한 기술들은 일반적으로 종래기술에 공지된다. 하나의 가능한 구현예에서, 센서 표면은 어레이의 많은 스폿들을 포함하고(즉, 스폿들의 마이크로어레이), 그 대부분은 상이한 조성들을 갖는다.
그 다음, 전체 어레이에 대한 복잡도를 가변시키는 공통의 테스트 물질을 적용한다. 일 예에서, 이러한 테스트 물질은 형광 라벨링된 테스트 물질을 포함한다. 그 다음, 센서는 테스트 물질과 스폿 사이의 바인딩을 찾기 위해 광으로 조사된다. 스폿들의 크기를 갖는 마이크로어레이의 형태로 바이오센서를 분석하기 위해, 모든 스폿들을 나타내는 바이오센서의 영상을 획득하고(이하에서 논의되는 도 25의 실시예에서 영상 판독 기기를 참조), 각각의 스폿으로부터 신호(세기 및 피크 파장 값의 시프트)를 결정하기 위해, 각각의 스폿으로부터 분광기 데이터의 개별적인 캡쳐 또는 영상 분석 기술들을 사용한다. 각각의 스폿은 하나의 데이터 포인트를 제공한다. 영상은 스폿 크기 미만의 해상도 영역(픽셀 크기)을 가져야 한다.
분석 표면으로 샘플 물질들의 스포팅(예, DNA 스포팅) 동안, 프로세스 가변성은 테스트 샘플들의 순차적인 바인딩을 위해 미해결 결과들을 초래한다. 샘플 물질의 밀도 및 스폿들 간에, 제어되지 않는 변화는 형광 신호에 의해 테스트 물질 바인딩 주파수의 정량화를 현저하게 방해한다. 제 2 라벨을 적용함으로써 샘플 물질을 정량화하는 것은 일반적으로 실용적이지 않다.
본 발명의 조합된 ER 및 라벨 없는 바이오센서는 이러한 문제점들을 극복한다. 특히, BIND 신호는 형광체들 또는 다른 부가된 라벨들의 사용 없이, 비파괴성 방식으로 급속하게 스폿의 물질량을 정량화하는데 사용된다. BIND 측정들은 형광체 라벨링된 테스트 물질에 샘플(스폿들)의 노출 이전에 수행된다. ER 측정들은 형광체-라벨링된 테스트 물질에 샘플의 노출 이후 수행된다. 따라서, BIND 측정들은 각각의 스폿으로부터 형광 신호에 대한 정규화된 양을 제공한다. 또한, 스포팅된 어레이의 BIND 영상은 스폿 형태(morphology)에 관한 정보를 제공하고, 이에 따라 스포팅 프로세스에 대한 품질 제어 기능을 제공할 수 있다.
하나의 대표적인 실시예는 도 31-33과 연계하여 기술될 것이다. 도 31은 7 마이크론 해상도에서 격자-기반 센서(ER 및 BIND 측정들을 위해 최적화되거나 최적화되지 않을 수 있음)상에 증착되는 스폿들의 마이크로어레이의 영상이다. 영상은 CCD 카메라(이하에서 논의되는 도 25의 실시예 참조)에 의해 캡쳐된다. DNA 스폿들은 7마이크론, 15마이크론 및 30마이크론과 같이, 다양한 마이크론 해상도(픽셀 크기)에서 영상화될 수 있다. 도 32는 센서상에 배치되는 DNA 샘플의 존재로 인해 도 31의 스폿들 중 하나에 대한 피크 시프트의 그래프이다. 시프트는 DNA 스폿에 대해 우측으로 피크 파장 값의 이동을 나타낸다. 이러한 시프트의 양은 스폿상에 나타나는 DNA의 양의 정량적 측정이다. 도 33은 행을 따르는 위치의 함수로서 나노미터들의 피크 파장 값에서 시프트의 대응하는 그래프, 및 스폿들의 행의 도면이다. PWV의 변화는 행의 스폿들상에 위치된 DNA의 양의 정량적 측정이다. DNA 샘플 물질의 스폿을 벗어나는 센서 표면상의 영역이 도시되고(스폿들의 행의 영상에서 어두운 지점으로서 도시됨), 벗어나는 스폿은 그래프에서 낮은 영역으로 나타낸다. 따라서, 도 33의 그래프는 어레이의 스폿들상에 DNA의 양의 추가적인 정성 및 정량 측정을 추가적으로 제공한다.
따라서, 본 발명의 스포팅 특징들은 BIND 라벨 없는 기술에 사용되는 것들과 같은 나노구조의 광 표면들상에서 DNA 스폿들(또는 RNA, 단백질, 탄수화물, 펩티드 등과 같은 임의의 생물학적 물질의 일반적인 스폿들)의 두께, 균일도 및 형태의 분석을 위한 방법을 제공한다. 방법은 본 발명에서 기술되는 조합된 ER 및 라벨 없는 센서와 같은 나노구조의 광 표면들에 사용하기에 적합하다. 하나의 기술 또는 다른 기술을 위해 설계된 격자 구조물상의 스폿들의 분석을 위해 사용될 수도 있다.
프린팅된 마이크로어레이들의 품질 제어는 마이크로어레이들의 제조자들 및 사용자들 모두에게 중요하다. 프린팅된 DNA 스폿들은 종종 이들에 부착되는 식별가능한 라벨 또는 태그를 갖지 않는다(예, 형광, 양자 도트(quantum dot), 방사능). 이것은 분석이 수행되기 이전에 신속하고 신뢰가능하며 정량적으로, 품질 보장을 위한 프린팅된 스폿들을 영상화하는 것을 어렵게 한다. 스폿들상에서 인쇄되는 DNA의 양의 변화는 수소화 분석법들의 결과에 심각한 영향을 미치고, 진단 관련 애플리케이션들에서 특히 중요하다. 이러한 문제들의 관점에서, 본 발명의 진보적인 스포팅 프로세스 특징은 나노구조의 광 표면들(센서 표면들)상에 프린팅되는 DNA 스폿들을 영상화하도록 비파괴성, 비접촉 방법을 제공한다. 본 발명은 DNA 스폿 프린팅 프로세스의 품질 및 신뢰도를 보장하고 결함 있는 마이크로어레이들을 제거하는데 사용되어, 그러한 마이크로어레이들의 비용을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 원래 스포팅되는 물질양으로 이러한 칩들을 이용하여(형광 등을 통해) 수행되는 라벨링된 분석법들로부터 최종 결과들을 정규화하는데 사용될 수도 있고, 다른 수단에 의해 이전에 이용가능하지 않은 바인딩 친화도/효율성에 대한 정보를 제공한다.
본 발명의 방법들은 비접촉, 비파괴성 방식으로 수행되는 것이 바람직하다. 즉, 스폿들은 광학 수단을 통해 영상화되고, 정량적 및 정성적 정보는 도 31-33에서 설명되는 바와 같이 스폿들에 대해 달성된다. 이러한 방법은 칩의 표면상에 단일 나선 DNA에 약하게 결합되는 라벨링된 단부(형광 태그와 같이)를 포함하는 랜덤-시퀀스-짧은-올리고뉴클레오티드를 사용하는 종래기술의 방법들에 비해 우수하다고 판단된다. 결합된 스폿들로부터의 형광 신호는 스폿들에 나타나는 DNA의 양을 나타낸다. 이러한 방법들은 종종 실온에서 분해(dissociation), 스트리킹(streaking), 스포팅, 기판에 대한 비특정 바인딩과 같은 문제들을 갖고, 이에 따라 백그라운드를 증가시키며, 몇몇 경우들에서 이러한 QC 테스트들에서 세제들의 사용으로 인해 스폿들로부터 결합 DNA의 완전한 제거를 증가시킨다. Perkin Elmer는 DNA 스폿들에 존재하는 염 결정들로부터 반사되는 레이저 광을 이용하여 스폿들의 존재 및 부재를 비파괴성으로 결정하기 위해 반사 영상을 사용했다. 이것은 순수하게 정성적인(예 또는 아니오) 방법이고, 프린팅 용액이 염을 사용하지 않거나 염 결정들이 스포팅된 어레이로부터 세척되지 않는 경우에 작용하지 않을 것이다.
본 발명의 이러한 특징의 영상화 기술의 기능적인 장점들은 구조화된 광 표면에 결합된 물질량의 정량적 분석을 제공하는 것이다. 비파괴성 및 비접촉 기반의 측정 방법이다. 더욱이, 본 발명은 마이크로어레이 표면상의 스폿들의 품질(결합되는 물질의 균일도, 스폿 형태 및 양)을 보장하기 위해 마이크로어레이들의 제조자들 및 사용자들에 의해 사용될 수 있다. 또한, 분석은 종래기술에서 요구되는 상당히 더 긴 주기 대신에, 약 1분이 걸린다. 이것은 분석이 더 작은 샘플들 이외에, 모든 마이크로어레이에서 수행될 수 있도록 허용한다.
라벨 없는 검출 및 형광 증폭(ER)을 조합한 바이오센서들에 대한 판독 시스템들
조합된 ER 및 라벨 없는 바이오센서들의 상기 설명을 통해, 본 발명은 센서를 조사하고 검출기상의 단일 바인딩 지점으로부터 라벨 없는 및 ER 데이터를 획득하기 위해 유용한 판독 및 검출 시스템의 몇가지 실시예들을 기술할 것이다.
판독 및 검출 시스템(300)의 제 1 실시예는 도 25에 개념적으로 도시된다. 도 25의 시스템(300)은 영상 판독 시스템이다. 바이오센서(100)는 라벨 없는 검출 및 형광 신호의 현저한 개선을 위한 바이오센서의 소산 영역에서 높은 전자기장에 대해, 광 스펙트럼에서 뾰족한 공명 피크를 나타내도록 설계된다. 판독 시스템은 이러한 바이오센서 특성들의 장점을 갖는 이러한 효과들을 판독한다. 본 발명은 바이오센서로부터 하나의 신호 또는 두개의 신호들을 측정하는 성능을 갖는 신규한 영상 판독 시스템을 제공한다.
본 발명에서 "comBIND 센서"로서 지칭되는 바이오센서(100)는 센서의 저면으로부터 광학적으로 조사(interrogate)된다. 바이오센서(100)의 상측면상에서, 바이오센서는 물 또는 다른 액체에 액침될 수 있거나, 공기에 노출될 수 있다. 바이오센서가 검출을 위해 설계되는 임의의 분자 또는 세포질 바인딩 작용은 바이오센서(100)의 상측면에서 발생한다. 바이오센서(100)는 예를 들어 8열의 웰들, 12 웰들을 포함하는 각각의 행을 갖는 마이크로웰 플레이트와 같이, 혈관들(vessels)을 함유한 액체를 포함하는 더 큰 분석 장치의 부분일 수 있다. 바이오센서는 마이크로어레이 슬라이드의 구성요소일 수도 있다. 도 25의 도면에서, 단일 웰(검출 지점)(302)은 단면으로 도시되고, 수십, 수백 또는 수천개의 그러한 검출 지점들이 존재할 수 있다는 것이 이해된다.
영상 판독 및 검출 시스템(300)은 레이저(예, HeNe 레이저) 형태의 ER 광원(340), 할로겐 백색 광원 또는 LED(352)로서 포함되는 더 넓은 스펙트럼 BIND 광원(350), 및 연속적인 영상들에서 ER과 라벨 없는 데이터를 캡쳐하도록 공통 검출기로서 작용하는 CCD 카메라 시스템(338)을 포함한다. 시스템(300)은 광원들(340, 352)로부터 바이오센서로 입사광(372)을 조합 및 지향시키도록 작용하는 색선별(dichroic) 미러들(364, 330)을 포함하는 광선 조합 서브시스템을 포함한다. 색선별 미러(330)는 검출을 위해 신호 광을 수집하고, CCD 카메라(338)에 의해 영상화되는 렌즈(336)로 지향시킨다.
바이오센서(100) 아래에 존재하는 광선(370)은 조명 광(372) 및 반사 광(374)으로 구성된다. 반사 광(374)은 바이오센서 상에 존재하는 형광 물질이 있는 경우 직접 반사 및 형광 방출을 포함한다.
렌즈 시스템(336)을 통해 CCD 카메라(338)에 의해 검출되는 신호는 BIND(라벨 없는) 데이터(380) 또는 ER 데이터(382)가 되도록 전자적으로 또는 컴퓨터 알고리즘에 의해 처리된다. 그러한 데이터는 저장, 디스플레이되고, 판독 시스템(300)의 사용자에 의해 도 25에 도시된 기기를 위한 컴퓨터 또는 워크스테이션(도시되지 않지만, 데이터(382, 380)에 대한 액세스를 가짐)과 같은 분석 기기에서 분석될 수 있다. 더욱이, BIND 데이터(380) 및 ER 데이터(382)의 조합은 신규한 바이오센서(100)에 고유한 바인딩 상호작용들 또는 셀 상호작용들의 정보를 사용자가 수집할 수 있도록 한다.
도시된 설계에서, 광학 컴포넌트들(340, 350, 330)은 입사광의 단일 빔(372)을 생성하도록 설계되고, 바이오센서는 X 및 Y 방향들에서 이동되어, 바이오센서(100) 표면상에서 모든 웰들(302) 또는 바인딩 지점들로부터 데이터를 순차적으로 획득한다. 그러한 운동은 통상의 당업자가 익숙한 XY 운동 스테이지(미도시)상에 바이오센서(100)를 배치함으로써 생성될 수 있다. 웰(302)이 빔(372)을 통한 기록상태에 있도록 주어진 웰 또는 바인딩 지점(302)이 위치될 때, 일 실시예에서 광원들(340, 350)은 연속적으로 동작되고(또는 광이 바이오센서로 지향되도록 선택적으로 허용됨), 제 1 및 제 2 영상은 CCD 카메라(338)에 의해 캡쳐되며, 하나는 ER 영상이고 다른 하나는 BIND 영상이다. CCD 영상들의 연속적인 수집은 빔 선택 장치(360)(셔터와 같이)의 사용에 의해 용이해질 수 있으며, 소스(340) 또는 소스(350)로부터의 광이 색선별 미러(330)로 통과되고 바이오센서로 반사되도록 선택적으로 허용한다. 빔 선택은 광원들(340, 350)의 온 및 오프 시간을 전자적으로 제어함으로써, 전자적으로 수행될 수 있다. 선택적으로, 두 광원들은 입사 빔(372)이 두 광원들로부터의 광을 포함하기 위해, 두 빔들을 통과시키도록 동작되는 빔 선택 장치(360)에서 동시에 동작될 수 있다. 이러한 상황에서, CCD 카메라(338)는 ER 및 BIND 정보를 포함하는 단일 영상을 캡쳐한다. 영상 처리 기술들은 복합 영상의 BIND 및 ER 성분들을 추출하기 위해, CCD 카메라(338)로부터의 최종적인 영상에 적용된다.
ER 광원(340)은 헬륨-네온(HeNe) 레이저와 같은 레이저일 수 있다. 레이저 빔(341)은 빔 확장기와 같은 빔 조절 장치(342)를 추가로 통과한다. 빔 확장기(342)는 작은 직경의 레이저 빔이 더 큰 직경의 레이저 빔으로 확장한다. 출력 빔(343)은 조준되고 선형으로 편광된다. 바이오센서는 특정 편광에서 입사광에 응답하여 ER 효과를 생성한다. 편광은 선형으로 편광된 출력 레이저 빔을 생성하기 위해 설계된 레이저를 이용함으로써 달성될 수 있다.
BIND(라벨 없는) 광원(350)은 할로겐 또는 LED 광원(352), 및 파장 조절 장치(356)를 갖는 단색화장치(monochromator)(354)로 구성될 수 있다. 광원(352)에 의해 방출되는 광선(353)은 본질적으로 광대역이고, 단색화장치(354)의 출구 포트의 광선(355)은 단색이다.
단색화장치(354)로부터의 출력 광선(355)은 조준기일 수 있는 빔 조절 장치(358)에 의해 조절된다. 미러(365)는 조절 장치(358)의 출력으로부터 색선별 미러(364)로 광선(349)을 지향시킨다. 광원들(340, 350)로부터 조합된 광은 빔 분할 및 조합 어셈블리(330)로 지향된 다음, 바이오센서(100)의 저면으로 지향되는, 366에 도시된다.
BIND 광원(350)은 파장-가변 레이저로 구성될 수도 있다. 그 경우, 빔 조절 장치(358)는 빔 확장기이다. 또한, 파장-가변 레이저 또는 플래쉬 램프는 BIND 및 ER 측정들을 위한 단일 광원으로서 작용할 수 있다는 것을 유의한다.
또한, 편광된 광이 BIND 신호의 검출을 용이하게 하기 때문에, 광(363)이 선형으로 편광되도록 광원(352)내에 편광기가 존재할 수 있다. 선택적으로, 광 지향 엘리먼트(365)는 랜덤하게 편광된 광(359)을 선형으로 편광된 광(363)으로 변환하기 위한 편광 빔 분할기일 수 있다.
레이저 여기된 형광 신호의 검출을 위해, 빔 분할 및 조합 어셈블리(330)는 광학 필터들(332, 334)의 세트를 포함한다. 필터(332)는 샘플로부터 형광 방출 광을 투과시키면서 레이저 광을 반사시키는 색선별 필터이다. 또한, 필터(332)는 하나의 바람직한 설계에서 830nm 내지 900nm인 BIND 파장 범위에서 빔 분할기로서 기능한다. 필터(334)는 2개의 파장 범위들내에서 빔의 투과만을 허용한다: 레이저 여기된 형광 및 BIND 파장 범위. 이미징 렌즈(336)는 바이오센서 표면에서 형광 광을 수집하고 CCD 카메라(338)의 초점면에 포커싱하는데 사용될 수 있다.
또한, 도 25의 설계는 ER 검출의 목적을 위해 입사 빔(372)에 대해 바이오센서를 회전시키기 위한 회전 장치를 포함한다. 하나의 가능한 실시예에서, 회전 장치(331)는 빔 분할 및 조합 어셈블리(330)에 부착되고, 화살표들로 나타낸 바와 같이 어셈블리(330)를 회전시킨다(이에 따라, 약 θ 각도만큼 입사 빔의 회전을 제공함). 선택적 실시예에서, 회전 장치(331)는 생략되고, 그 대신 회전 장치(333)는 도 26의 장치(333)의 좌측에 화살표들로 나타낸 것처럼, (고정된) 입사 빔(372)에 대해 XY 운동 스테이지(및 그 상부에 장착된 바이오센서(100))를 회전시키도록 동작하는 XY 운동 스테이지에 부착된다.
부가적인 렌즈들, 미러들 및 광학 필터들은 목표된 성능을 달성하기 위해 판독 시스템에 포함될 수 있다. 적절히 설계된 광학 필터들은 BIND 검출 및 ER 검출 간의 바람직하지 않은 누화(cross-talk)를 제거하는데 사용될 수 있다. 또한, 전자 또는 기계적 셔터들(360) 형태의 빔 선택 장치는 2개의 채널들의 광 조명 및 검출을 적절히 동기화시키는데 사용되어, 단지 하나의 광원은 임의의 누화를 제거하기 위해 주어진 시간에서 바이오센서를 조명한다.
도 25에 기술된 바이오센서 판독 시스템의 큰 장점은 두 BIND 및 ER 데이터가 동일한 바이오센서 위치에서 동시적으로(또는 급속히 연속적으로) 수집될 수 있다는 것이다. 고해상도 영상 방법들은 셀-기반 분석법들 또는 마이크로어레이들과 같은 고용량(high content) 바이오분석법들에 유용하다.
집적형 단일 포인트 검출기는 CCD 카메라(338)를 대체할 수 있다. 그 경우, 시스템은 입사 광(372)의 위치 상부에서, 센서 동작을 검출기 출력에 동기화시킴으로써 영상을 생성한다.
추가적으로, 바이오센서로부터 ER 데이터를 획득하기 위해 CCD 카메라의 사용시 추가적인 세부사항들은 기술 문헌, 예 Dieter Neuschafer, Wolfgang Budach 외, Biosensor & Bioelectronics, Vol. 18 (2003) p.489-497에서 발견할 수 있고, 그 내용들은 참조로 본 발명에 포함된다.
판독 및 검출 기기(300)의 제 2 실시예는 도 26에 도시된다. 도 25의 설계는 영상 판독 시스템인 반면에, 도 26의 설계는 영상 시스템이 아니다. 이전에서와 같이, 바이오센서(100)는 형광 신호의 현저한 개선을 위해 바이오센서의 소산 영역에서 높은 전자기장 및 라벨 없는 검출을 위한 광 스펙트럼에서 뾰족한 공명 피크를 나타내도록 설계된다. 바이오센서의 이러한 특성들 때문에, 이러한 결과들을 판독하는 시스템이 요구된다. 도 26은 바이오센서로부터 하나의 신호 또는 두개의 신호들을 측정하는 부가적인 신규한 판독 시스템을 기술한다.
바이오센서(100)는 바인딩 지점(즉, 웰(302))의 위치에서 저면으로부터 광학적으로 조사된다. 바이오센서(100)의 상측면은 물 또는 다른 액체에 액침될 수 있거나, 공기에 노출될 수 있다. 바이오센서가 검출하도록 설계되는 임의의 바이오분자 또는 세포질 바인딩 상호작용은 바이오센서의 상측면상에서 발생한다. 본 발명에서 기술되는 임의의 측정 시스템들은 적절한 포커싱 장치를 이용하여, 목표시 상부(바인딩 슬라이드)로부터 바이오센서(100)를 판독할 수도 있다.
상기에서 주지된 것처럼, 바이오센서(100)는 마이크로웰 플레이트와 같은, 액체 함유 관들을 포함하는 더 큰 분석 장치의 부분일 수 있다. 바이오센서는 마이크로어레이 슬라이드의 구성요소일 수도 있다.
판독 시스템(300)은 BIND 광원(402), BIND 검출기(400), ER 광원(406), 및 ER 검출기(404)를 포함한다. 광학 시스템(430)은 광원들(406, 402)로부터 광을 조합하고, 입사 빔(450)으로서 그러한 광을 바이오센서(100)의 저면으로 지향시키도록 작용한다. 광학 시스템(430)은 바이오센서로부터 반사 광(452)을 추가로 수집하고, 그러한 반사 광을 검출기들(400, 404)로 지향시킨다. 광학 시스템(430)은 4개의 광선 분할 및 조합 컴포넌트들로 구성되고, 하나(432)는 BIND 검출기를 위한 것이고, 하나(434)는 BIND 광원을 위한 것이며, 하나(436)는 ER 검출기를 위한 것이고, 하나(438)는 ER 광원을 위한 것이다. 바이오센서 아래에 존재하는 광선(450)은 입사광(452) 및 복귀 광(454)으로 이루어진다. 복귀 광(454)은 바이오센서에 형광 물질이 존재하는 경우, 반사 광 및 형광 방출을 포함한다.
BIND(라벨 없는) 검출기(400)에 의해 검출되는 신호는 저장, 디스플레이 및 판독 시스템의 사용자에 의해 컴퓨터(미도시)에서 분석되는, BIND 데이터(380)가 되도록 전자적으로 또는 컴퓨터 알고리즘에 의해 처리된다. 유사하게는, ER 검출기(404)에 의해 검출되는 신호는 처리되어 사용자를 위해 ER 데이터(382)로 변환된다. 더욱이, BIND 데이터(380) 및 ER 데이터(382)의 조합은 사용자가 신규한 바이오센서에 고유한 바인딩 상호작용들 또는 셀 상호작용들의 정보를 획득할 수 있도록 한다.
또한, 도 26의 실시예는 바이오센서(100)에 대해 입사 광선(452)을 회전시키기 위한 회전 장치(331), 또는 입사광(452)에 대해 XY 스테이지 및 바이오센서(100)를 회전시키기 위한 회전 장치(333)를 포함한다. 회전 장치(331)는 전체 어셈블리(430)가 회전되도록 배치될 수 있다.
도 27은 도 26에 도시된 것과 같은 판독 시스템이지만 보다 상세히 도시한다. 본 실시예에서 BIND 검출기(400)는 분광기이다. BIND 광원(402)은 텅스텐 할로겐 광 벌브 또는 발광 다이오드(LED)의 형태를 가질 수 있다. ER 검출기(404)는 광증배관(PMT)과 같은 광 검출기를 포함한다. ER 광원(406)은 CY5 형광체의 여기를 위해 헬륨-네온(HeNe) 레이저와 같이, 바이오센서와 함께 사용하기 위한 형광체의 여기 대역내의 파장을 갖는 빔을 생성하는 레이저인 것이 바람직하다. BIND 광원(42)으로부터 방출되는 광선(456)은 BIND 신호의 검출을 위해 공칭적으로 조준되는 광이다. 따라서, 광원(402)은 조준 렌즈를 포함할 수 있다. 또한, 편광된 광의 사용은 BIND 신호의 검출을 향상시키기 때문에, 광원(402)은 광(456)이 편광되도록 편광기를 포함할 수도 있다. 선택적으로, 빔 분할기(434)는 랜덤하게 편광된 광(456)을 바이오센서(100)의 저면상에 입사되는 선형으로 편광된 광으로 변환하도록 편광 빔 분할기일 수 있다.
레이저(406)로부터의 광선(458)은 조준된 빔이다. ER 성능은 레이저 빔이 선형 편광을 갖는 경우 개선된다. 편광은 선형으로 편광된 빔을 생성하도록 설계된 레이저를 이용함으로써 달성될 수 있다.
바이오센서(100)로부터 레이저-여기된 형광 신호의 검출을 위해, 빔 분할 및 조합 어셈블리(436)는 광학 필터들(472, 474, 476)의 세트를 포함한다. 필터(472)는 레이저 소스(406)로부터의 입사 레이저 빔(458)이 빔 분할 및 조합 엘리먼트(436)를 통해 투과될 수 있도록 한다. 필터(476)는 검출기(404)의 방향에서 바이오센서(100)로부터 형광 광을 반사시키면서 소스(406)로부터 레이저 광을 투과시키는 색선별 필터이다. 필터(474)는 광 검출기(404)에서 지향되는 형광 광의 투과만을 허용한다. 이미징 렌즈(478)는 바이오센서 표면으로부터 형광을 보다 효율적으로 수집하는데 사용될 수 있다.
부가적인 렌즈들, 미러들 및 광학 필터들은 목표된 성능을 달성하기 위해 판독 시스템에 포함될 수 있다. 적절히 설계된 광학 필터들은 BIND 검출 및 ER 검출 간의 바람직하지 않은 누화를 제거하는데 사용될 수 있다. 또한, 전가 또는 기계적 셔터들은 임의의 누화를 제거하기 위해, 2개의 채널들의 광 조명 및 검출을 적절히 동기화시키는데 사용되어, 단지 하나의 광원만이 주어진 시간에서 바이오센서를 조명할 수 있다.
도 25의 설계를 갖는 경우와 같이, 도 26 및 도 27의 설계의 광 컴포넌트들은 하나의 위치에서 입사광의 빔(452)을 생성하도록 구성 및 배치될 수 있고, XY 운동 스테이지는 X 및 Y 방향들에서 바이오센서를 이동시켜서, 모든 웰들(302)로부터 데이터를 순차적으로 획득하거나 바이오센서(100) 표면상의 지점들을 바인딩시킬 수 있다. 일 실시예에서 광원들(402, 406)은 빔(452)에 의해 현재 조명되는 바인딩 지점(302) 또는 주어진 웰로부터 검출기들(400, 404)에서 연속적으로 연속 생성 데이터에서 동작된다. ER 및 BIND 데이터의 연속적인 수집은 도 26에 도시되지 않은 빔 선택 장치(셔터와 같이)의 사용에 의해, 또는 광원들(402, 406)의 전자 제어에 의해 용이해질 수 있다. 선택적으로, 두 광원들은 입사 빔(452)이 두 광원들로부터의 광을 포함하도록 동시에 동작될 수 있다. 이러한 상황에서, 검출기들(400, 404)은 데이터를 동시적으로 획득한다.
본 발명에서 기술되는 바이오센서 판독 시스템의 큰 장점은 두 BIND 및 ER 데이터가 동일한 바이오센서 위치에서 동시에(또는 신속히 연속적으로) 수집될 수 있다는 것이다. BIND 검출기(400) 및 ER 검출기(404)는 상대적으로 넓은 면적에 대해 바인딩 지점 또는 웰 단위로 단일 지점으로부터 데이터를 획득하는 집적형 검출기들, 또는 사용자 특정 해상도에서 픽셀 대 픽셀로 데이터를 수집하는 CCD 검출기들과 같은 영상 검출기들일 수 있다. 고해상도 영상화 방법들은 셀-기반 분석법들 또는 마이크로어레이들과 같은 고용량 바이오분석법들을 위해 유용하다.
더욱이, 도 25, 26 및 27의 광학 구조는 바이오센서(100)상의 다중 웰들 또는 바인딩 지점들이 예를 들어 도 3에 도시된 개념들의 장점을 갖는, 동시에 조사 및 검출될 수 있도록 복제될 수 있다.
단일 광 생성 소스를 갖는 판독 시스템
도 25의 실시예들은 각각 BIND 및 ER 측정들을 위한 개별적인 광원들(350, 340)을 포함하고, 도 26의 실시예는 각각 BIND 및 ER 측정들을 위한 개별적인 광원들(402, 406)을 포함한다. 하나의 가능한 변형으로서, 단일 광원은 BIND 및 ER 측정들을 위해 사용될 수 있다. 이러한 광원은 파장-가변 레이저, 또는 광역 스펙트럼 높은 세기의 플래쉬 램프 형태와 같이, 몇가지 가능한 형태들을 취할 수 있다. 광원으로부터의 출력은 선택적으로 조준되고, 빔 확장기를 통해 확장되며(파장-가변 레이저가 소스로서 사용되는 경우), 단색화장치 또는 필터 스테이지를 통과하며(플래쉬 램프가 사용되는 경우), 그 다음 바이오센서의 표면으로 지향된다. ER 및 BIND 신호들의 검출을 위해 사용되는 광학계들은 전술한 도 25-27에 도시된 장치의 형태를 가질 수 있다.
일 실시예에서, 바이오센서의 주어진 바인딩 지점으로부터 BIND 및 ER 데이터를 획득하기 위해, 광원은 조명을 위한 상이한 파장 범위들을 선택하도록 2회 동작될 수 있다(한번은 BIND를 위해, 한번은 ER을 위해). 예를 들어, BIND 검출기는 광원의 제 1 동작에서 BIND 데이터를 획득하고, ER 검출기는 제 2 동작에서 ER 데이터를 획득한다.
하나의 가능한 변형예에서, 광역 스펙트럼을 통해 바이오센서를 조명할 수 있고, 광대역 소스(즉, 제논 플래쉬 램프)의 경우, 복귀 신호를 분할하고 이를 2개의 상이한 필터 스테이지들을 통해 전환함으로써, BIND 및 ER 데이터를 동시에 수집할 수 있다. 동시적인 BIND/ER 조명/수집을 위해, 몇몇 입사각에서 플레이트를 조명할 필요가 있다. 거울(직접) 반사 컴포넌트는 BIND 피크를 포함하고, 그 스펙트럼 위치는 단색화장치에 의해 결정된다. 입사각 이외의 각도들에서 표면을 나오는 광만을 수집하는 렌즈 시스템, 또는 집적된 구형은 관심 있는 형광체에 대해 방출 범위를 선택하는 필터 또는 단색화장치를 통과한 이후, 상대적으로 깨끗한 ER 신호를 제공할 것이다.
상기에서 다수의 예시적인 특징들 및 실시예들이 논의되었지만, 통상의 당업자는 본 발명에 존재하는 바와 같은 특정한 변형들, 변동들, 부가들 및 이들의 부-조합들을 인식할 것이다. 따라서, 이하의 청구범위 및 이후에 소개되는 청구항들은 이들의 진정한 사상과 범주내에서 그러한 모든 변형들, 변동들, 부가들 및 부-조합들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다고 의도된다.
청구범위에서, "소산 공명(ER) 검출" 또는 "소산 공명(ER) 검출 모드"란 용어는 형광, 인광, 화학-발광, 전기발광, 또는 예를 들어 Budach 외, 미국특허 제6,707,561호에 기술된 바와 같은 다른 타입의 발광의 검출을 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 발광은 샘플 물질의 천연 발광 또는 바운드 물질, 예를 들어 형광 라벨, 또는 양자 도트들(발광 금속들)에 기인할 수 있다. 그러한 바운드 물질은 테스트되는 샘플, 바이오센서의 표면, 또는 이 둘다에 결합될 수 있다.

Claims (73)

  1. 센서 상에 배치된 샘플을 테스트하기 위한 센서로서,
    소산 공명(evanescent resonance: ER) 검출 모드 및 라벨 없는(label-free) 검출 모드에서 광을 통한 상기 센서의 광 조사(optical interrogation)를 위한 주기적인 표면 격자 구조물을 갖는 기판
    을 포함하는 샘플을 테스트하기 위한 센서.
  2. 센서 및 판독 검출 기기 조합장치(combination)로서,
    상기 센서는 제 1 항에 따른 센서를 포함하고, 상기 샘플은 공기 매체이며, 상기 검출 기기는 ER 및 라벨 없는 검출 모드들에서 상기 센서의 광 조사를 위한 적어도 하나의 광원을 포함하고, 상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 주기적인 표면 격자 구조물의 평면에 수직인 편광(polarization)을 갖는,
    센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  3. 센서 및 판독 검출 기기 조합장치로서,
    상기 센서는 제 1 항에 따른 센서를 포함하고, 상기 샘플은 액체 매체이며, 상기 검출 기기는 상기 센서의 광 조사를 위한 적어도 하나의 광원을 포함하고, 상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 주기적인 표면 격자 구조물의 평면에 평행한 편광을 갖는,
    센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 (a) 상기 샘플, (b) 상기 센서의 표면, 또는 (c) 상기 (a) 및 (b) 둘다에 결합되는 발광 물질을 활성화시키도록 선택된 파장을 갖는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 센서에 수직인 입사각에서 상기 센서를 조사하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  6. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 검출 기기는 라벨 없는 검출 모드에서 상기 샘플에 대한 반사광의 피크 파장 값을 계산하는 소프트웨어 모듈을 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 주기적인 표면 격자 구조물은 2차원(two-dimensional) 주기적인 격자 구조물을 포함하고, 상기 주기적인 격자 구조물은 제 1 영역 및 제 2 영역에서 주기적이며, 상기 제 1 및 제 2 영역은 상호 직교하는, 센서.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 제 1 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은 라벨 없는 검출을 위한 격자 구조물을 포함하고, 상기 제 2 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은 ER 검출을 위한 격자 구조물을 포함하며, 상기 제 1 영역의 상기 주기적인 격자 구조물의 깊이는 상기 제 2 영역의 상기 주기적인 격자 구조물의 깊이보다 실질적으로 더 큰, 센서.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 1 영역의 상기 주기적인 격자 구조물 및 상기 제 2 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은, 기판, 상기 기판에 결합되고 굴절률을 가진 격자 구조물을 갖는 층, 상기 격자 구조물을 갖는 상기 층 상에 증착된 SiO2 층, 및 상기 SiO2 층 상에 증착되고 상기 격자 구조물을 갖는 상기 층의 굴절률보다 더 큰 굴절률을 갖는 물질층을 포함하는 적층물(laminate)을 더 포함하는, 센서.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 1 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은 260nm 내지 1500nm의 주기 및 100nm 내지 3000nm의 격자 깊이를 갖고, 상기 제 2 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은 200nm 내지 1000nm의 주기를 가지며, 상기 제 2 영역의 격자 깊이는 10nm 내지 300nm인, 센서.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 SiO2 층은 500Å 내지 5000Å의 깊이를 갖는 층을 포함하는, 센서.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 물질층에 결합된 발광 물질을 더 포함하는, 센서.
  13. 제 8 항에 있어서,
    상기 격자 구조물은 상부 영역 및 하부 영역을 포함하는 2-레벨, 2차원 형태를 갖는 단위 셀들의 어레이를 포함하는, 센서.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 주기적인 표면 격자 구조물은 0.6 내지 1.2의 격자 깊이 대 반주기 비율을 갖는, 센서.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 주기적인 표면 격자 구조물은 상부 영역 및 하부 영역을 포함하는 2-레벨, 2차원 형태를 각각 갖는 단위 셀들의 어레이를 포함하고,
    상기 2-레벨, 2차원 형태를 각각 갖는 단위 셀들의 어레이는,
    라벨 없는 검출을 위해 제 1 영역에서 연장되는 교대하는(alternating) 높은 영역 및 낮은 영역의 제 1 주기적인 격자 구조물; 및
    ER 검출 모드를 위해 상기 제 1 영역에 직교하는 제 2 영역에서 연장되고, 상기 제 1 주기적인 격자 구조물 상에 중첩되는, 교대하는 높은 영역 및 낮은 영역을 갖는 제 2 주기적인 격자 구조물
    을 포함하는, 센서.
  16. 제 7 항에 있어서,
    상기 주기적인 격자 구조물은 상기 센서의 표면에 홀을 각각 포함하는 2차원 단위 셀들의 어레이를 포함하는, 센서.
  17. 제 7 항에 있어서,
    상기 주기적인 격자 구조물은 상기 센서의 표면으로부터 돌출되는 포스트(post)를 각각 포함하는 단위 셀들의 어레이를 포함하는, 센서.
  18. 제 7 항에 있어서,
    상기 주기적인 격자 구조물은 교대하는 높은 영역 및 낮은 영역을 갖는 체커보드(checkerboard) 구성을 포함하는, 센서.
  19. 제 7 항에 있어서,
    직교하는 상기 제 1 영역 및 제 2 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은 상기 제 1 영역 및 제 2 영역에서 상이한 주기적 격자 패턴을 갖고,
    상기 제 1 영역의 주기적 격자 패턴은 상기 샘플과 연관된 형광체(fluorophore)를 여기시키기 위해 가변하는 파장으로 수직 입사각에서 상기 제 1 광원으로부터의 입사광에 대한 광역 공명(broad resonance)을 제공하도록 구성되며, 상기 제 2 영역의 주기적 격자 패턴은 근접 적외선 파장 영역에서 상기 제 2 광원으로부터의 광을 통한 조명을 위해 뾰족한(sharp) 피크 파장의 공명을 산출하도록 구성되는, 센서.
  20. 제 1 항에 있어서,
    상기 센서에 배치된 적어도 하나의 샘플을 더 포함하고,
    상기 샘플은 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자들, 1000 내지 10,000 달톤의 분자량을 갖는 분자들, 아미노산들, 단백질들, 핵산들, 지방질들, 탄수화물들, 핵산 폴리머들, 바이러스성(viral) 입자들, 바이러스성 성분들, 세포질 성분들, 및 바이러스성 또는 세포질 성분들의 추출물들, 폴리펩티드들, 항원들, 다중 클론(polyclonal) 항체들, 단일 클론 항체들, 단일 체인 항체들(scFv), F(ab) 파편들(fragments), F(ab')2 파편들(fragments), Fv 파편들, 유기 저분자들, 세포들, 바이러스들, 박테리아, 폴리머들, 펩티드 용액들, 단백질 용액들, 화학적 화합물 라이브러리 용액들, 단일 나선(single-stranded) DNA 용액들, 이중 나선 DNA 용액들, 단일 및 이중 나선 DNA 용액들의 조합물들, RNA 용액들 및 생물학적 샘플들로 이루어진 샘플들의 그룹에서 선택되는, 센서.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플들은 혈액, 혈장(plasma), 혈청(serum), 위장관 분비물(gastrointestinal secretions), 조직들 또는 종양들의 균질화액(homogenates), 활액(synovial fluid), 배설물(feces), 타액(saliva), 객담(sputum), 낭종수(cyst fluid), 양수(amniotic fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복막투석액(peritoneal fluid), 폐 세척액(lung lavage fluid), 정액(semen), 림프액(lymphatic fluid), 눈물 및 전립선 액(prostatic fluid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 샘플들을 포함하는, 센서.
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 센서 상에 배치되는 샘플을 더 포함하고, 상기 ER 검출 모드는 상기 샘플의 천연 형광(natural fluorescence)을 검출하는, 센서.
  23. 제 1 항에 있어서,
    상기 센서 상에 배치된 샘플을 더 포함하고, 미량의 상기 샘플은 억제제에 결합되는, 센서.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 억제제는 형광체(fluorophore)를 포함하는, 센서.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 샘플은 단백질을 포함하는, 센서.
  26. 적어도 하나의 샘플을 분석하는 방법으로서,
    소산 공명(ER) 검출 모드 및 라벨 없는 검출 모드에서 광을 통한 센서의 광 조사를 위한 주기적인 표면 격자 구조물을 갖는 기판을 포함하는 상기 센서 상에 상기 적어도 하나의 샘플을 배치하는 단계;
    상기 ER 검출 모드를 위해 적어도 하나의 광원으로부터의 광을 통해 판독 검출 기기의 상기 센서를 조명(illuminating)하고, 상기 라벨 없는 검출 모드를 위해 상기 적어도 하나의 광원을 통해 상기 센서를 조명하는 단계; 및
    상기 센서로부터 반사되는 광을 분석하는 단계
    를 포함하는 샘플을 분석하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 샘플은 공기 매체에 있고 상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 주기적인 표면 격자 구조물의 평면에 수직인 편광을 갖는, 샘플을 분석하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 샘플은 액체 매체에 있고 상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 주기적인 표면 격자 구조물의 평면에 평행한 편광을 갖는, 샘플을 분석하는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 샘플에 결합된 형광체를 활성화시키도록 선택된 파장을 갖는, 샘플을 분석하는 방법.
  30. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광은 상기 샘플의 천연 형광(native fluorescence)을 활성화시키도록 선택된 파장을 갖는, 샘플을 분석하는 방법.
  31. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원은 근접 적외선 파장 영역에서 상기 센서를 조명하는, 샘플을 분석하는 방법.
  32. 제 26 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 광원으로부터의 광을 입사 빔에 조합하고 상기 입사 빔으로 상기 센서를 조명하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  33. 제 26 항에 있어서,
    상기 반사되는 광을 수집하고 이를 이미징 장치(imaging device)로 지향시키는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  34. 제 26 항에 있어서,
    상기 반사되는 광을 집적형(integrating) 검출기에 수집하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서,
    상기 입사 빔에 대해 상기 센서의 평면의 X 방향 및 Y 방향으로 상기 센서를 이동시켜서 상기 센서의 다중 검출 영역들을 조사하는 단계, 및 각각의 상기 다중 검출 영역들에 대해 ER 검출 모드 및 라벨 없는 검출 모드 데이터를 생성하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  36. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원은 제 1 라벨 없는 광원 및 제 2 ER 광원을 포함하고, 상기 방법은 상기 제 1 라벨 없는 광원 및 상기 제 2 ER 광원으로부터의 광을 통해 상기 센서를 선택적으로 조명하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  37. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 광원으로부터의 광에 대해 상기 센서의 평면의 X 방향 및 Y 방향으로 상기 센서를 이동시켜서 상기 센서의 다중 검출 영역들을 조사하는 단계, 및 각각의 상기 다중 검출 영역들에 대해 ER 검출 모드 및 라벨 없는 검출 모드 데이터를 생성하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  38. 제 26 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 샘플은 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자들, 1000 내지 10,000 달톤의 분자량을 갖는 분자들, 아미노산들, 단백질들, 핵산들, 지방질들, 탄수화물들, 핵산 폴리머들, 바이러스성 입자들, 바이러스성 성분들, 세포질 성분들, 및 바이러스성 또는 세포질 성분들의 추출물들, 폴리펩티드들, 항원들, 다중 클론 항체들, 단일 클론 항체들, 단일 체인 항체들(scFv), F(ab) 파편들, F(ab')2 파편들, Fv 파편들, 유기 저분자들, 세포들, 바이러스들, 박테리아, 폴리머들, 펩티드 용액들, 단백질 용액들, 화학적 화합물 라이브러리 용액들, 단일 나선 DNA 용액들, 이중 나선 DNA 용액들, 단일 및 이중 나선 DNA 용액들의 조합물들, RNA 용액들 및 생물학적 샘플들로 이루어진 샘플들의 그룹에서 선택되는, 샘플을 분석하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플들은 혈액, 혈장, 혈청, 위장관 분비물, 조직들 또는 종양들의 균질화액, 활액, 배설물, 타액, 객담, 낭종수, 양수, 뇌척수액, 복막투석액, 폐 세척액, 정액, 림프액, 눈물 및 전립선 액으로 이루어진 그룹에서 선택된 샘플들을 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  40. 제 26 항에 있어서,
    미량의 상기 샘플은 억제제에 결합되는, 샘플을 분석하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 억제제는 형광체(fluorophore)를 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  42. 제 26 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 샘플의 성분의 바인딩을 검출하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  43. 제 26 항에 있어서,
    상기 ER 검출 모드는 상기 샘플의 천연 형광을 검출하는, 샘플을 분석하는 방법.
  44. 제 26 항에 있어서,
    상기 센서로부터 시간이 경과함에 따라 분석된 형광 측정값들을 획득하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  45. 제 26 항에 있어서,
    상기 센서로부터 형광 및 편광 측정값들을 획득하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  46. 제 26 항에 있어서,
    상기 주기적인 표면 격자 구조물은 2차원 격자 구조물을 포함하고,
    제 1 영역의 상기 주기적인 표면 격자 구조물은 라벨 없는 검출을 위한 격자 구조물을 포함하며,
    제 2 영역의 상기 주기적인 격자 구조물은 ER 검출을 위한 격자 구조물을 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  47. 제 26 항에 있어서,
    상기 주기적인 표면 격자 구조물은, 기판, 상기 기판에 도포되고 굴절률을 가진 격자 구조물을 갖는 층, 상기 격자 구조물을 갖는 상기 층 상에 증착된 중간 SiO2 층, 및 상기 SiO2 층 상에 증착되고 상기 격자 구조물을 갖는 상기 층의 굴절률보다 더 큰 굴절률을 갖는 물질층을 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서,
    상기 주기적인 표면 격자 구조물은, 기판, 굴절률을 가진 상기 제 1 영역 및 제 2 영역의 상기 주기적인 표면 격자 구조물들을 갖는 상기 기판에 도포된 층, 상기 주기적인 표면 격자 구조물들을 갖는 상기 층 상에 증착된 중간 SiO2 층, 및 상기 SiO2 층 상에 증착되고 상기 주기적인 표면 격자 구조물들을 갖는 상기 층의 굴절률보다 더 큰 굴절률을 갖는 물질층을 더 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
  49. 제 47 항에 있어서,
    상기 SiO2 층은 500Å 내지 5000Å의 두께를 갖는, 샘플을 분석하는 방법.
  50. 제 46 항에 있어서,
    상기 제 1 영역의 상기 주기적인 표면 격자 구조물은 260nm 내지 1500nm의 주기 및 100nm 내지 3000nm의 격자 깊이를 갖고, 상기 제 2 영역의 상기 주기적인 표면 격자 구조물은 200nm 내지 1000nm이며, 상기 제 2 영역의 격자 깊이는 10nm 내지 300nm인, 샘플을 분석하는 방법.
  51. 제 26 항에 있어서,
    상기 샘플은 방울들(drops)의 어레이로 상기 주기적인 표면 격자 구조물 상에 증착되고, 상기 주기적인 표면 격자 구조물 상에 스폿들의 어레이를 형성하게 건조되며,
    라벨링된 테스트 물질은 상기 스폿들의 어레이 상에 증착되고, 상기 스폿들의 어레이의 라벨 없는 측정들은 상기 라벨링된 테스트 물질의 증착 이전에 이루어지며, 상기 스폿들의 어레이의 ER 측정들은 상기 라벨링된 테스트 물질의 증착 이후에 이루어지는, 샘플을 분석하는 방법.
  52. 센서 상에 배치된 샘플의 소산 공명(ER) 및 라벨 없는 검출을 위한 주기적인 격자 패턴을 갖는 상기 센서를 위한 판독 검출 기기로서,
    상기 센서로부터 ER 데이터를 획득하기 위해 구성된(adapted) 제 1 광원;
    상기 센서로부터 라벨 없는 검출 데이터를 획득하기 위해 구성된 제 2 광원;
    상기 제 1 및 제 2 광원으로부터의 광을 상기 센서를 조명하기 위한 조명 빔(illuminating beam)에 조합하는 광학 시스템;
    상기 센서로부터 반사광을 검출하기 위한 적어도 하나의 검출기; 및
    상기 적어도 하나의 검출기로부터의 데이터를 이용하고 상기 샘플로부터 ER 및 라벨 없는 데이터를 획득하는 분석 모듈
    을 포함하는 판독 검출 기기.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 검출기는 라벨 없는 데이터를 획득하기 위한 분광기, 및 ER 데이터를 획득하기 위한 광 검출기를 포함하는, 판독 검출 기기.
  54. 제 52 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 광원으로부터의 광을 편광시키기 위한 수단을 더 포함하는, 판독 검출 기기.
  55. 제 52 항에 있어서,
    상기 센서를 수용하고 상기 조명 빔에 대해 상기 센서를 이동시키기 위한 X-Y 운동 스테이지(motion stage)를 더 포함하는, 판독 검출 기기.
  56. 제 52 항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 한 세트의 광학 필터들과 빔 분할 및 조합 어셈블리를 더 포함하는, 판독 검출 기기.
  57. 센서 상에 배치된 샘플의 소산 공명(ER) 및 라벨 없는 검출을 위한 주기적인 격자 패턴을 갖는 상기 센서를 위한 판독 검출 기기로서,
    상기 센서로부터 ER 데이터를 획득하기 위해 구성된(adapted) 제 1 광원;
    라벨 없는 검출 데이터를 획득하기 위해 구성된 제 2 광원;
    상기 제 1 및 제 2 광원으로부터의 광을 통해 상기 센서를 선택적으로 조명하는 광학 시스템;
    상기 센서로부터 반사광을 검출하기 위한 적어도 하나의 검출기; 및
    상기 적어도 하나의 검출기로부터 ER 및 라벨 없는 데이터를 획득하는 분석 기기
    를 포함하는 판독 검출 기기.
  58. 제 57 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 검출기는 라벨 없는 데이터를 획득하기 위한 분광기, 및 ER 데이터를 획득하기 위한 광 검출기를 포함하는, 판독 검출 기기.
  59. 제 57 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 광원으로부터의 광을 편광시키기 위한 수단을 더 포함하는, 판독 검출 기기.
  60. 제 57 항에 있어서,
    상기 센서를 수용하고 상기 광학 시스템에 대해 상기 센서를 이동시키기 위한 X-Y 운동 스테이지를 더 포함하는, 판독 검출 기기.
  61. 제 57 항에 있어서,
    상기 광학 시스템은 한 세트의 광학 필터들과 빔 분할 및 조합 어셈블리를 더 포함하는, 판독 검출 기기.
  62. 센서 및 판독 검출 기기 조합장치로서,
    센서 상에 배치된 샘플의 소산 공명(ER) 및 라벨 없는 검출을 위한 주기적인 격자 패턴을 갖는 상기 센서; 및
    상기 센서로부터 데이터를 획득하기 위한 기기
    를 포함하고, 상기 기기는,
    상기 센서로부터 ER 및 라벨 없는 데이터를 획득하도록 구성된 광원;
    상기 광원으로부터의 광을 통해 상기 센서를 조명하는 광학 시스템;
    상기 센서로부터 반사광을 검출하기 위한 적어도 하나의 검출기; 및
    상기 적어도 하나의 검출기로부터 ER 및 라벨 없는 데이터를 획득하는 분석 기기를 포함하는,
    센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  63. 제 62 항에 있어서,
    상기 광원은 광대역 광원을 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  64. 제 62 항에 있어서,
    상기 광원은 파장-가변(tunable) 레이저를 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  65. 제 62 항에 있어서,
    상기 광원은 제 1 동작(activation) 및 제 2 동작으로 연속적으로 동작되고, 상기 적어도 하나의 검출기는 상기 제 1 동작에서 상기 센서로부터 라벨 없는 데이터를 획득하며 상기 제 2 동작에서 상기 센서로부터 ER 데이터를 획득하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  66. 제 62 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 검출기는 상기 광원의 단일 동작으로부터 라벨 없는 데이터 및 ER 데이터를 획득하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  67. 제 62 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 검출기는 이미징(imaging) 검출기를 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  68. 제 62 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 검출기는 광 검출기 및 분광기를 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  69. 제 64 항에 있어서,
    상기 기기는 빔 확장기(beam expander)를 더 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  70. 제 63 항에 있어서,
    상기 기기는 상기 광대역 광원으로부터 광을 수신하는 단색화장치(monochromator)를 더 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  71. 제 63 항에 있어서,
    상기 기기는 상기 광대역 광원으로부터 광을 수신하는 필터 스테이지를 더 포함하는, 센서 및 판독 검출 기기 조합장치.
  72. 제 1 항에 있어서,
    상기 센서는 상기 주기적인 표면 격자 구조물의 표면 상에 하프늄 산화물의 코팅을 더 포함하는, 센서.
  73. 제 51 항에 있어서,
    상기 라벨 없는 측정들은 상기 스폿들의 어레이의 이미지를 획득하고 상기 스폿들의 어레이의 적어도 하나의 스폿에 대한 피크 파장 값의 시프트를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플을 분석하는 방법.
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