KR20180050887A - 고속 다중진단을 위한 elispot 바이오칩 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

고속 다중진단을 위한 elispot 바이오칩 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot) 바이오칩 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 플레이트 상에 복수개의 웰이 형성된 웰 플레이트; 를 포함하고, 상기 복수개의 웰 중 적어도 하나 이상의 웰 내의 플레이트 표면에 복수개의 탐침자 영역을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은, 하나의 웰에서 하나의 검체에 대한 신속한 진단뿐만 아니라, 중복 감염에 대한 진단을 신속하게 진행할 수 있다.

Description

고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩 및 이를 이용한 진단방법{ELISPOT BIOCHIP FOR RAPID AND MULTIPLEXED DETECTION AND METHOD FOR DIAGNOSING USING THE SAME}
본 발명은, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
진단분야에서 가장 많이 사용되는 기술은 면역크로마토그래피법(Immunochromatographic assay 또는 test)으로 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane)을 주재료로 사용하며 측방 유동(Lateral flow) 방식을 사용한다. 이러한 면역크로마토그래피법을 이용한 래피드 테스트는 사용이 간편하고, 가격이 저렴하며, 신속한 장점이 있어서 전체 진단시장에서 매우 높은 비중을 차지하고 있다.
래피드 테스트는 대량의 검체를 고속 진단하기 어렵고, 또한 하나의 테스트 내에서 여러 종류의 질병을 다중진단하기 어려운 문제점이 있다. 열대열성 질병인 말라리아와 뎅기열은 발병 지역과 임상 증상이 유사하여, 임상증상만으로는 두 질병을 구분하기 어렵고, 두 질병 모두 예방을 위한 백신이 아직 미개발 상태이고 뎅기열의 경우는 적절한 치료제가 없기 때문에 정확한 조기 진단 및 치료가 매우 중요하다.
효소결합면역흡착 분석(Enzyme linked immunosorbent assay, 이하 ELISA)은 래피드 테스트에 비교하여 많은 양의 검체를 반응시킬 수 있어 민감도가 높으나, 하나의 플레이트로 한 종류의 질병에 대한 표지자만 검사할 수 있기 때문에 여러 종류의 질병을 동시에 진단하기 위해서는 여러 개의 플레이트를 사용해서 검사를 실시해야 하는 단점이 있다. 이는 검사 비용의 상승을 초래하고 검사에 소요되는 시간 또한 증가시키는 요인이 된다.
본 발명은, 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 안정성 및 민감도가 우수하고, 다양한 질환 또는 질병, 또는 임상 증상이 유사한 질병 또는 질환을 하나의 웰(Well) 플레이트를 이용하여, 고속으로 다중 진단할 수 있는, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩을 이용하는, 고속 다중진단 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 양상은, 플레이트 상에 복수개의 웰이 형성된 웰 플레이트; 를 포함하고, 상기 복수개의 웰 중 적어도 하나 이상의 웰 내의 플레이트 표면에 복수개의 탐침자 영역을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 탐침자 영역은, 항원, 항체 또는 이 둘을 포함하는 탐침자를 포함하고, 상기 탐침자 영역은, 스팟, 다각형 또는 이 둘의 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 복수개의 탐침자 영역은, 서로 동일하거나 또는 상이한 탐침자를 포함하고, 상기 복수개의 탐침자 영역은, 서로 동일하거나 또는 상이한 진단 대상의 표지자를 감지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 탐침자는, 단백질, 펩티드(Peptide), DNA, RNA, 동물세포, 식물세포, 박테리아 및 압타머(Aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 탐침자 영역은, 플라즈마 표면 처리된 상기 플레이트 표면 상에 형성되고, 상기 플라즈마 표면처리는, 산소(O2), 질소(N2), 수소(H2), 아르곤(Ar), 제논(Xe) 및 헬륨(He)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 플라즈마를 이용하고, 상기 플라즈마 표면 처리된 상기 플레이트 표면은, 친수성 및 소수성 표면 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 탐침자 영역은, 진단 대상의 표지자의 감지 이후, 콘쥬게이트를 이용하여 발광, 형광 또는 발색되고, 상기 콘쥬게이트는, 효소(Enzyme), 금(Gold)입자, 은(Silver)입자, 단백질(Protein), 폴리머 비드(Polymer bead), 다공성 폴리머 비드(Porous polymer bead), 형광물질(Fluorescent substances) 및 발광물질(Chemiluminescence)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 효소는, 호스래디시 페록시다제(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼라인 포스포타제(Alkaline phosphatase, AP), 베타 갈락토시다제(β-Galactosidase) 및 글루코즈 옥시다제(Glucose oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 폴리머 비드 및 다공성 폴리머 비드는, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리아미드(Polyamide), 폴리이미드(Polyimide) 및 라텍스(Latex)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며, 상기 형광물질(Fluorescent substances) 및 발광물질(Chemiluminescence)은, 380~780 nm 영역의 형광 및 발광 영역을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 형광물질은, 아크리딘(Acridine), 시아닌(Cyanine), 플루오론(Fluorone), 옥사진(Oxazine), 페난트리딘(Phenanthpridine), 로다민(Rhodamine) 및 쿠마린(Coumarine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 발광물질(Chemiluminescence)은, 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein), 히드라지드(Hydrazide) 및 쉬프(Schiff)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 탐침자 영역은, 연결자(Linker)를 더 포함하고, 상기 연결자(Linker)는, 아비딘-비오틴(Avidin-biotin), EDC/NHS 또는 이 둘을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 플레이트 및 상기 웰은, 동일하거나 또는 상이한 폴리머 재질로 형성되고, 상기 폴리머 재질은, 폴리스틸렌(Polystyrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리메틸메타크릴레이트(Poly methyl methacrylate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(Polyetheylene terephtalate), 폴리프탈레이트 카보네이트(Polyphthalate carbonate) 및 폴리우레탄(Polyurethane)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 웰은, 5 mm 내지 15 mm의 높이 및 1 mm 내지 20 mm의 직경을 포함하고, 상기 웰은, 원기둥, 다각 기둥 또는 이 둘의 형태를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 ELISPOT 바이오칩은, 생체 분자(Biomolecule), 또는 질병 또는 질환의 진단을 위한 표지자를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 질병 또는 질환은, 열대성 질병 또는 질환이며, 상기 열대성 질병 또는 질환은, 말라리아, 뎅기열 또는 이 둘일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩의 웰 내의 탐침자 영역에 검체를 처리하는 단계; 상기 탐침자 영역에 콘쥬게이트를 처리하는 단계; 및 분석 및 진단하는 단계; 를 포함하는, ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 분석 및 진단하는 단계는, 탐침자 영역의 발색에 따른 색 변화를 관찰하여 정성 분석하는 단계; 탐침자 영역의 형광 또는 발광을 측정하여 정성 분석하는 단계; 또는 탐침자 영역의 형광 또는 발광 강도를 측정하여 정량 분석하는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 검체는, 침(Saliva), 전혈(Blood), 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 소변(Urine), 대변(Stool), 정액(Semen), 양수(Amniotic fluid), 복수(Ascitic fluid), 흉막액(Pleural fluid), 뇌척수액(Spinal fluid) 및 복막액(Peritoneal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 분석 및 진단하는 단계는, 하나의 웰 내에서 하나 이상의 생체분자; 하나 이상의 질병 또는 질환; 또는 이 둘을 진단할 수 있다.
본 발명은, 제품의 안정성 및 민감도가 향상되고, 고속 다중 진단을 신속하게 진행할 수 있는 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩을 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩은, 하나의 웰에서 한 개 검체에 대한 말라리아, 뎅기열 등의 단독 또는 중복 감염에 대한 정보를 확보할 수 있고, 대량의 검체를 동시에 고속검색(High-throughput screening, HTS)할 수 있다.
본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩은, 다양한 질병 또는 질환에 대한 생체 분자(Biomolecule)에 관련된 표지자(marker)를 동시에 진단하므로, 각각 단일검사로 진단하는 경우보다 진단에 소요되는 시간을 단축시키고, 소요되는 비용을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩은, 전통적인 ELISA 형태의 진단제품보다 소량의 항체 또는 항원 탐침자를 고정하기 때문에 생산 비용을 낮출 수 있다.
본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩은, 말라리아와 뎅기열 등과 같이 유사한 임상증상을 갖는 질병 또는 질환에 대한 정확한 진단이 가능하고, 이들의 조기 진단에 신속하게 적용될 수 있으므로, 이러한 질병 또는 질환에 대한 적절한 치료를 신속하게 수행하여 환자의 조기 치료효과를 향상시킬 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 웰 내에 고정된 복수개의 탐침자 영역의 형태를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법에 대한 흐름도를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 실시예에 따라, 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단에 대한 가이드 라인을 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 실시예에 따라, 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단에 대한 결과를 나타낸 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
본 발명은, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩은, 효소결합면역흡착 분석용(ELISA) 플레이트의 하나의 웰에서 다양한 질환 또는 질병, 또는 생체 분자를 동시에 검출할 뿐만 아니라, 한 개의 검체에 대한 중복 감염 정보를 확인할 수 있다. 또한, 다양한 질환 또는 질병, 또는 생체 분자의 정성 및 정량 분석을 하나의 웰 또는 하나의 웰 플레이트를 통하여 동시에 진행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩은, 플레이트 상에 복수개의 웰이 형성된 웰 플레이트; 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 도 1을 참조하면, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩을 예시적으로 나타낸 것으로, 도 1에서 상기 ELISPOT 바이오칩은 플레이트(110) 및 플레이트(110) 상에 복수개의 웰(120)이 형성된 웰 플레이트(100)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 복수개의 웰(120)의 적어도 하나 이상 또는 전체는, 웰(120) 내의 플레이트 표면(110')에 복수개의 탐침자 영역을 포함할 수 있다. 하나의 웰(120) 내에 복수개의 탐침자 영역을 구성하므로, 다양한 질환 또는 질병, 또는 생체 분자 등과 같은 진단 대상의 표지자(marker)를 동시에 다중 감지 및 진단할 수 있고, 더욱이, 동일하거나 또는 상이한 대량 또는 다수의 검체를 각 웰(120)에 각각 분주하여, 하나의 웰 플레이트(100)에서 각 검체에 대한 정보를 동시에 고속으로 검색할 수 있다.
예를 들어, 상기 복수개의 탐침자 영역은, 서로 동일하거나 또는 상이한 탐침자를 포함하고, 상기 복수개의 탐침자 영역은, 서로 동일하거나 또는 상이한 진단 대상의 표지자를 감지할 수 있다. 이러한 상이한 탐침자로 구성된 복수개의 탐침자 영역을 형성하여, 다양한 질병 또는 질환, 또는 생체 분자를 동시에 고속 진단할 수 있다. 예를 들어, 도 1을 참조하면, 도 1에서 하나의 웰 내에 3개의 탐치자 영역이 형성될 수 있고, 제1 탐침자 영역, 제2 탐침자 영역, 및 제3 탐침자 영역은, 서로 상이한 탐침자를 포함하고, 예를 들어, 각각 말라리아(Pan), 열대열 말라리아(P.f), 및 댕기열의 진단을 위한 탐침자로 구성되며, 하나의 웰 내에서 3 종류의 질병 또는 질환을 동시에 진단할 수 있다.
예를 들어, 복수개의 웰(120)은, 서로 동일한 복수개의 탐침자 영역 또는 서로 상이한 복수개의 탐침자 영역으로 이루어진 웰로 구성될 수 있다. 이는, 하나의 플레이트를 이용하여 다량의 검체에 대한 다중 검색이 가능하고, 하나의 검체에 대한 수많은 질병 또는 질환, 또는 생체 분자의 다중 검색을 하나의 플레이트를 통한 검색으로 이루어질 수 있으므로, 진단 시간, 비용 등을 효과적으로 줄일 수 있다.
예를 들어, 복수개의 탐침자 영역은, 동일하거나 또는 상이한 형태로 고정될 수 있으며, 예를 들어, 스팟, 다각형 또는 이 둘의 형태를 포함할 수 있다. 도 2를 참조하면, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 웰 내에 고정된 복수개의 탐침자 영역의 형태를 예시적으로 낸 것으로, 예를 들어, 원형의 스팟, 마름모, 사각형 등의 형태로 고정될 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 탐침자 영역은, 질병 또는 질환, 또는 생체 분자 등과 같은 진단 대상을 확인할 수 있는 표지자를 인식하는 탐침자를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 탐침자는, 진단 대상의 표지자와 결합 및/또는 반응할 수 있다. 예를 들어, 진단 대상의 표지자와 결합하는 항원, 항체 또는 이 둘을 포함할 수 있고, 상기 항체는 단클론항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는, 감염성, 비감염성 질환 또는 질병의 진단에 이용되는 항체이며, 바람직하게는 열대성 감염병에 관련된 항체일 수 있다. 상기 열대성 감염병은, 말라리아 및 댕기열일 수 있다. 상기 말라이아 관련 항체의 예로는, 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum), 3일열 말라리아원충(P. vivax), 4일열 말라리아원충(P. malariae) 및 난형열 말라리아원충(P. ovale)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 감지할 수 있는 항체일 수 있다.
예를 들어, 상기 탐침자는, 단백질, 펩티드(Peptide), DNA, RNA, 동물세포, 식물세포, 박테리아 및 압타머(Aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 탐침자 영역은, 상기 탐침자와 진단 대상의 결합 및/또는 반응 시 발색, 형광, 및/또는 발광에 의해서 진단 대상을 분석하고, 질병 또는 질환의 진단을 위한 정성 및 정량 분석에 적용될 수 있다. 예를 들어, 진단 대상과 결합된 탐침자에 콘쥬게이트를 처리하여 발색, 형광 및/또는 발색되거나 또는 유도할 수 있다.
예를 들어, 상기 콘쥬게이트는, 진단 대상의 표지자와 탐침자의 결합 및/또는 반응에 따라 발색, 형광, 및/또는 발광하거나 또는 유도가능한 물질이며, 예를 들어, 상기 콘쥬게이트는, 효소(Enzyme), 금(Gold)입자, 은(Silver)입자, 단백질(Protein), 폴리머 비드(Polymer bead), 다공성 폴리머 비드(Porous Polymer bead), 형광물질(Fluorescent substances) 및 발광물질(Chemiluminescence)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 효소는, 호스래디시 페록시다제(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼라인 포스포타제(Alkaline phosphatase, AP), 베타 갈락토시다제(β-Galactosidase) 및 글루코즈 옥시다제(Glucose oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 폴리머 비드 및 다공성 폴리머 비드는, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리아미드(Polyamide), 폴리이미드(Polyimide) 및 라텍스(Latex)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리머 비드 및 다공성 폴리머 비드는 색을 가질 수 있다.
예를 들어, 상기 효소, 금입자, 은입자, 단백질, 폴리머 비드, 및 다공성 폴리머 비드는 정성 분석에 이용될 수 있다.
예를 들어, 상기 형광물질 및 발광물질은, 380~780 nm 영역의 형광 및 발광 영역을 갖는 것으로, 상기 형광물질은, 아크리딘(Acridine), 시아닌(Cyanine), 플루오론(Fluorone), 옥사진(Oxazine), 페난트리딘(Phenanthpridine), 로다민(Rhodamine) 및 쿠마린(Coumarine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 발광물질은, 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein), 히드라지드(Hydrazide) 및 쉬프(Schiff)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 형광물질 및 상기 발광물질은, 광의 세기, 파장 영역 등을 이용하여 정성 및 정량 분석에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 탐침자 영역은, 상기 탐침자, 콘쥬게이트 또는 이 둘이 웰 내의 플레이트 표면에 강하게 결합하기 위해서, 연결자(Linker)를 더 포함할 수 있으며, 이는 제품의 안정성 및 진단에 대한 민감도를 향상시켜 진단의 정확도를 높일 수 있다.
예를 들어, 상기 연결자는, EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide) 등의 공유결합 물질과 같은 화학적 연결자, 아비딘-비오틴(Avidin-Biotin) 등과 같은 생물학적 연결자 또는 이 둘을 포함할 수 있다. 상기 연결자는, 탐침자, 예를 들어, 단백질 탐침자와 플레이트 표면 간에 공유 결합으로 결합될 수 있으며, 화학적 연결자로 사용된 EDC는 플레이트 표면, 예를 들어, 폴리카보네이트 표면의 카르복실기(Carboxyl group)와 탐침자 단백질의 아민기(Amine group) 사이에 공유결합을 유도할 수 있다. 더욱이, 생물학적 연결자로 사용된 아비딘은, 비오틴이 결합할 수 있는 결합부위를 4개 가지고 있으므로, 이러한 아비딘-비오틴 결합은 공유결합 다음으로 가장 강한 결합을 형성하므로, 바이오칩의 안정성 및 민감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 탐침자인 항체 등이 화학적 작용기를 통해 플레이트 표면에 고정되면 소수성 결합(Hydrophobic interaction)을 통해 고정되었을 때보다 단백질 3차원 구조를 안정하게 유지시킬 수 있기 때문에 제품의 안정성과 민감도를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 일 예로, 플레이트(110) 및 웰(120)은, 동일하거나 또는 상이한 폴리머 재질로 형성될 수 있으며, 예를 들어, 상기 폴리머 재질은, 폴리스틸렌(Polystyrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리메틸메타크릴레이트(Poly methyl methacrylate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(Polyetheylene terephtalate), 폴리프탈레이트 카보네이트(Polyphthalate carbonate) 및 폴리우레탄(Polyurethane)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리카보네이트일 수 있다. 상기 폴리머 재질은, 탐침자 영역의 탐침자 등이 고정되는 양을 증가시킬 수 있고, 특히 폴리카보네이트의 적용 시 플라즈마 처리에 따라 표면에 연결자, 즉 화학적 연결자인 EDC에 결합이 가능한 카복실기(Carboxyl group)를 형성시키며, 이는, EDC에 의해서 폴리카보네이트 표면의 카복실기와 탐침자 단백질의 아민기(Amine group) 사이에 공유결합을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 플레이트(110)의 표면의 적어도 일부분 또는 전체, 바람직하게는 웰 내에 탐침자 영역이 형성된 플레이트(110') 표면을 플라즈마 표면처리될 수 있으며, 상기 탐침자 영역은, 플라즈마 표면처리된 플레이트(110') 표면 상에 고정될 수 있다. 이는, 플레이트 표면 상에 상기 탐침자, 콘쥬게이트 또는 이 둘의 고정량을 증가시키고, 방향성을 유지시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 플라즈마 표면처리는, 산소(O2), 질소(N2), 수소(H2), 아르곤(Ar), 제논(Xe) 및 헬륨(He)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 플라즈마를 이용할 수 있다.
예를 들어, 상기 플라즈마 표면 처리된 플레이트(110) 표면은, 친수성 및 소수성 표면 특성을 동시에 가질 수 있고, 플레이트(110) 표면에 탐침자와 공유 결합을 형성할 수 있는 카르복실기 등이 형성될 수 있다.
본 발명의 일 예로, 웰(120)은, 5 mm 내지 15 mm의 높이 및 1 mm 내지 20 mm의 직경을 포함하고, 웰(120)은, 원기둥, 다각 기둥 또는 이 둘의 형태를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩은, 생체 분자, 질병 또는 질환과 같은 진단 대상의 표지자를 검출할 수 있고, 정성 및 정량 분석으로 진단할 수 있다.
예를 들어, 상기 질병 또는 질환은, 세균, 바이러스, 곰팡이, 기생충 등에 의한 감염성 질환, 비감염성 질환 등일 수 있으며, 감염성 질환의 원인인 세균, 바이러스, 곰팡이, 기생충 등을 감지할 수 있다. 상기 열대성 질병 또는 질환은, 열대성 감염병이며, 말라리아, 댕기열 등일 수 있으며, 이에 제한하는 것은 아니다.
또는 상기 질병 또는 질환은, 비감염성 질환 또는 질병이며, 예를 들어, 당뇨, 암, 빈혈, 종양 등일 수 있으며, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩은, 질환성 또는 비질환성 생체 분자의 감지 및 농도 변화에 따른 정성 및 정량 분석 등에 이용될 수 있다. 예를 들어, 임신진단, 약물진단, 배란진단, 기형아진단 등일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명은, 본 발명에 의한 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩을 포함하는 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명의 일 예로, 진단 키트는, 정성 및/또는 정량 분석 검출기를 더 포함할 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩은, 복수개의 탐침자를 포함하는 하나의 웰 플레이트를 적용하여 다양한 질병 또는 질환을 고속으로 다중 진단하고, 다량 또는 다수의 검체에 대한 정보를 고속으로 다중 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 도 3을 참조하며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명에 의한 ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것으로, 도 3에서 웰 내의 탐침자 영역에 검체를 처리하는 단계(S100); 탐침자 영역에 콘쥬게이트를 처리하는 단계(S200); 및 분석 및 진단하는 단계(S300); 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 웰 내의 탐침자 영역에 검체를 처리하는 단계(S100)는, 웰(120) 내에 침(Saliva), 전혈(Blood), 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 소변(Urine), 대변(Stool), 정액(Semen), 양수(Amniotic fluid), 복수(Ascitic fluid), 흉막액(Pleural fluid), 뇌척수액(Spinal fluid) 및 복막액(Peritoneal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 검체를 처리할 수 있고, 상기 검체는 완충용액, 식염수 등으로 희석될 수 있다.
본 발명의 일 예로, 탐침자 영역에 콘쥬게이트를 처리하는 단계(S200)는, 웰(120) 내의 각 탐침자 영역에서 탐침자의 표지자 인식에 따라 탐침자와 표지자는 반응 및/또는 결합하고, 이러한 반응 및/또는 결합된 상태에 콘쥬게이트를 처리하여 상기 탐침자 영역을 형광, 발광 및/또는 발색시키거나 또는 유도할 수 있다. 상기 콘쥬게이트는 상기 언급한 바와 같다. 예를 들어, 탐침자 영역에 콘쥬게이트를 처리하는 단계(S200)는, 10분 이상; 또는 10분 내지 60분 동안 콘쥬게이트를 처리할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 분석 및 진단하는 단계(S300)는, 탐침자 영역에 콘쥬게이트를 처리하는 단계(S200) 이후에, 발색, 형광, 및/또는 발광 특성의 변화에 정성 및/또는 정량 분석하여 질병 또는 질환을 고속으로 다중 진단할 수 있다.
예를 들어, 분석 및 진단하는 단계(S300)는, 탐침자 영역의 발색에 따른 색 변화를 관찰하여 정성 분석하는 단계(S310); 탐침자 영역의 형광 또는 발광을 측정하여 정성 분석하는 단계(S320); 및/또는 탐침자 영역의 형광 또는 발광 강도를 측정하여 정량 분석하는 단계(S330); 를 포함할 수 있다.
예를 들어, 분석 및 진단하는 단계(S300)는, 콘쥬게이트에 의한 발색, 형광, 및/또는 발광의 변화를 분석하거나 또는 콘쥬게이트 처리된 탐침자 영역에서 발색, 형광, 및/또는 발광을 유발시키기 위한 추가 처리가 이루어질 수 있다. 이는, 본 발명의 목적을 벗어나지 않는다면, 본 발명의 기술 분야에서 적용되는 방법이 적용될 수 있으며, 예를 들어, 콘쥬게이트를 처리하여 탐침자에 콘쥬게이트를 결합시키고, 다음으로, 콘쥬게이트 처리된 탐침자 영역에 goat anti-mouse IgG-HRP 처리하고, TMB-blot 발색을 진행할 수 있다.
예를 들어, 분석 및 진단하는 단계는, 하나의 웰 내에서 하나 이상의 생체 분자 및/또는 하나 이상의 질병 또는 질환을 진단할 수 있고, 하나의 웰 플레이트에서 하나 이상의 검체에 대한 하나 이상의 생체 분자 및/또는 하나 이상의 질병 또는 질환을 진단할 수 있다.
하기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
실시예
ELISPOT 바이오칩의 제조
도 1에서 제시한 폴리카보네이트 폴리머로 이루어진 플레이트 표면을 산소/아르곤(O2/Ar) 플라즈마 표면 처리하였다. 다음으로, 상기 플레이트 표면에 연결자로 EDC/NHS(5 mM/2 mM) 및 avidin (0.5 ug/ml)를 처리하고, biotinylated 단클론항체(Pan 항체: 5 ng/1 ul/spot, Pf 항체: 2.5 ng/1 ul/spot, 뎅기열 mix 항체: 5 ng/1 ul/spot)를 각각 점적하여 각 단클론항체가 고정된 3개의 탐침자 영역을 형성하고, 플레이트 상에 웰을 형성하여 웰 내에 3개의 탐침자 영역이 형성된 웰 플레이트를 제조하였다.
실험예
표 1의 혈액을 각각 1/50배로 희석한 이후, 실시예에서 제조된 ELISPOT 바이오칩의 웰 내에 처리하였다. 다음으로, conjugate 단클론항체를 처리하고 goat anti-mouse IgG-HRP 처리한 이후 2분 및 10분 이후에 웰 내의 탐침자 영역의 TMB-blot 발색 정도에 따라 도 4의 가이드 라인을 참조하여 양성 및 음성을 진단하였다. 그 결과는, 표 1 및 도 5에 나타내었다.
양성 혈액 1 양성 혈액 2 양성 혈액 3 양성 혈액 4 양성 혈액 5 정상 혈액 6
감염 말라리아
(Pan)		 말라리아
(P.f)		 뎅기열 말라리아
(Pan)/뎅기열		 말라리아
(P.f)/뎅기열		 정상 혈청
반응시간 2분 10분 2분 10분 2분 10분 2분 10분 2분 10분 2분 10분
말라리아
(Pan)		 양성 양성 양성 양성 음성 음성 양성 양성 양성 양성 음성 음성
말라리아
(P.f)		 음성 음성 양성 양성 음성 음성 음성 음성 양성 양성 음성 음성
뎅기열 음성 음성 음성 음성 양성 양성 양성 양성 양성 양성 음성 음성
표 1 및 도 4를 살펴보면, 하나의 웰 내에 3개의 탐침자 스팟을 형성하여, 말라리아(Pan), 열대열 말라리아(P.f) 및 뎅기열을 각각 2분 이내의 짧은 시간에 신속하게 진단 가능한 것을 확인할 수 있다.
또한, 하나의 웰 내에서 복합 감염된 혈액을 적용할 경우에, 각 감염에 대한 정보를 검색가능하므로, 우수한 민감도와 함께 다중 진단이 이루어지는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은, 하나의 웰 내에 복수개의 탐침자 영역을 고정시켜, 우수한 민감도와 함께 고속 다중 진단이 이루어지는 웰 플레이트를 포함하는 ELISPOT 바이오칩을 제공할 수 있으며, 유사한 증상을 갖는 질병 또는 질환을 정확하게 진단하거나 또는 복합 감염에 대한 정보를 고속으로 검색할 수 있다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (14)

  1. 플레이트 상에 복수개의 웰이 형성된 웰 플레이트; 를 포함하고,
    상기 복수개의 웰 중 적어도 하나 이상의 웰 내의 플레이트 표면에 복수개의 탐침자 영역을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot) 바이오칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복수개의 탐침자 영역은, 서로 동일하거나 또는 상이한 탐침자를 포함하고,
    상기 복수개의 탐침자 영역은, 서로 동일하거나 또는 상이한 진단 대상의 표지자를 감지하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 탐침자는, 단백질, 펩티드(Peptide), DNA, RNA, 동물세포, 식물세포, 박테리아 및 압타머(Aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 탐침자 영역은, 플라즈마 표면 처리된 상기 플레이트 표면 상에 형성되고,
    상기 플라즈마 표면처리는, 산소(O2), 질소(N2), 수소(H2), 아르곤(Ar), 제논(Xe) 및 헬륨(He)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 플라즈마를 이용하고,
    상기 플라즈마 표면 처리된 상기 플레이트 표면은, 친수성 및 소수성 표면 특성을 갖는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 탐침자 영역은, 진단 대상의 표지자의 감지 이후, 콘쥬게이트를 이용하여 발광, 형광 또는 발색되고,
    상기 콘쥬게이트는, 효소(Enzyme), 금(Gold)입자, 은(Silver)입자, 단백질(Protein), 폴리머 비드(Polymer bead), 다공성 폴리머 비드(Porous Polymer bead), 형광물질(Fluorescent substances) 및 발광물질(Chemiluminescence)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 효소는, 호스래디시 페록시다제(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼라인 포스포타제(Alkaline phosphatase, AP), 베타 갈락토시다제(β-Galactosidase) 및 글루코즈 옥시다제(Glucose oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 폴리머 비드 및 다공성 폴리머 비드는, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리아미드(Polyamide), 폴리이미드(Polyimide) 및 라텍스(Latex)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며,
    상기 형광물질(Fluorescent substances) 및 발광물질(Chemiluminescence)은, 380~780 nm 영역의 형광 및 발광 영역을 갖는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 형광물질은, 아크리딘(Acridine), 시아닌(Cyanine), 플루오론(Fluorone), 옥사진(Oxazine), 페난트리딘(Phenanthpridine), 로다민(Rhodamine) 및 쿠마린(Coumarine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 발광물질(Chemiluminescence)은, 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein), 히드라지드(Hydrazide) 및 쉬프(Schiff)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 탐침자 영역은, 연결자(Linker)를 더 포함하고,
    상기 연결자(Linker)는, 아비딘-비오틴(Avidin-biotin), EDC/NHS 또는 이 둘을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 플레이트 및 상기 웰은, 동일하거나 또는 상이한 폴리머 재질로 형성되고,
    상기 폴리머 재질은, 폴리스틸렌(Polystyrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리메틸메타크릴레이트(Poly methyl methacrylate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(Polyetheylene terephtalate), 폴리프탈레이트 카보네이트(Polyphthalate carbonate) 및 폴리우레탄(Polyurethane)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 ELISPOT 바이오칩은, 생체 분자(Biomolecule), 또는 질병 또는 질환의 진단을 위한 표지자를 검출하는 것인, 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩.
  12. 제1항의 고속 다중진단을 위한 ELISPOT 바이오칩의 웰 내의 탐침자 영역에 검체를 처리하는 단계;
    상기 탐침자 영역에 콘쥬게이트를 처리하는 단계; 및
    분석 및 진단하는 단계;
    를 포함하는, ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 분석 및 진단하는 단계는,
    탐침자 영역의 발색에 따른 색 변화를 관찰하여 정성 분석하는 단계;
    탐침자 영역의 형광 또는 발광을 측정하여 정성 분석하는 단계; 또는
    탐침자 영역의 형광 또는 발광 강도를 측정하여 정량 분석하는 단계; 를 포함하는 것인, ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 검체는, 침(Saliva), 전혈(Blood), 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 소변(Urine), 대변(Stool), 정액(Semen), 양수(Amniotic fluid), 복수(Ascitic fluid), 흉막액(Pleural fluid), 뇌척수액(Spinal fluid) 및 복막액(Peritoneal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, ELISPOT 바이오칩을 이용한 고속 다중진단 방법.
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