CN117471094A - 一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条，用于检测生物标志物。金纳米颗粒作为拉曼增长因子，荧光染料作为拉曼信号分子。用自主开发的共聚焦拉曼成像仪对T线上形成的“三明治”夹心复合物进行检测，对大肠杆菌O157:H7的检测限为~1×104 cfu/mL，对新冠N蛋白的检测限达到~pM。与商业化试纸条相比，该检测限提高了1‑2个数量级，证明金纳米颗粒可以显著增强试纸条上的拉曼强度。由于使用了与商业化试纸条中的不同的抗体对，导致灵敏度不高。该实验主要用于原理论证。整个检测过程可在15分钟内完成。本发明将共焦拉曼成像与侧向流试纸条相结合，实现对目标蛋白的高灵敏度的快速、实时检测，对筛查传染病和检测细菌病原体尤为重要。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，主要涉及一种可用于高精度生物分子免疫检测的、基于共聚焦拉曼成像系统的侧向流免疫层析试纸条。
背景技术
侧向流免疫层析试纸条被认为是一种实时现场诊断工具，可以在没有任何专业技术支持的情况下快速监测目标靶蛋白。硝酸纤维素膜（NC膜）是试纸条中最重要的组成部分。首先，它作为固相载体，通过静电相互作用与抗体中的肽键结合，将初级抗体固定在NC膜上。其次，NC膜利用其多孔结构在毛细管力的作用下向前驱动液体，从而捕获和检测样品中的目标物。目前，胶体金检测试纸条是最传统的方法，使用金纳米颗粒偶联的次级抗体捕获目标物，金纳米颗粒在测试线上（T线）聚集并显示为红色。这种检测方法不需要任何设备和专业技术支持，只需通过视觉观察来判断分析结果，这就导致了该检测方法在灵敏度和定量分析上受到较大的主观等因素的影响。
为解决这一问题，各种基于侧向流免疫层析的检测方法被研发出，例如：电化学、荧光、化学发光和拉曼光谱等。其中，拉曼光谱因其可以提供样本独特的分子指纹而备受关注。大多数分子的拉曼信号通常较弱，难以用仪器进行痕量检测。表面增强拉曼克服了拉曼光谱灵敏度不足的缺点，可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息。表面拉曼增强是通过将信号分子靠近金属纳米颗粒激发表面等离子体共振造成的，分别包括两个方面：局部电场被集中在金属表面附近的“热点”的电磁增强效果和金属表面与目标分析物之间发生电荷转移的化学增强机理。
在本发明中，我们构建了一个高灵敏度的自制的共聚焦拉曼成像仪。与光谱成像器和高光谱成像器相比，拉曼成像器具有较高的光谱分辨率（通常优于1nm）。共聚焦的特征将使我们能够通过滤除附近非聚焦区域中的干扰信息来实现更高的信噪比。因此，与使用传统拉曼成像器相比，可以实现更好的灵敏度、稳定性和重现性。到目前为止，共聚焦拉曼成像技术在横向流动测试条上的应用还没有被报道。在本文中，我们表明，将我们自制的共聚焦拉曼成像仪和侧向流免疫层析试纸条相结合，可以分别对新冠病毒感染和大肠杆菌O157:H7的生物标志物进行低至pM和104 cfu/mL的目标蛋白浓度的定量检测。与商业化的测试条进行比较，我们的共聚焦拉曼成像分析可以显著提高目标蛋白质的检测水平。此外，拉曼检测设备的小型化对于高灵敏度的实时现场检测具有重要意义。
发明内容
本发明提出一种低成本高灵敏度的即时诊断技术，可以在复杂的生物环境中对蛋白质进行快速灵敏的分析，这对传染病的筛查和防御是至关重要的。该平台由新型多层滤纸条过滤系统及涂有金属纳米颗粒和拉曼信号分子的侧向流组件组成，并与共聚焦拉曼成像检测系统相结合进行生物标志物分析。基于拉曼成像的侧向流免疫层析试纸条，包括多滤纸侧向流过滤及液体驱动装置、共聚焦拉曼成像装置。侧向流部件置于塑料外壳中，可以将生物、化学等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米的芯片上，完成样品的预处理、分离、混合、化学反应和检测的一系列步骤；共聚焦拉曼成像装置具有较高的光谱分辨率（通常优于1 nm），使我们能够通过滤除附近非聚焦区域中的干扰信息来实现更高的信噪比，实现更好的灵敏度；将侧向流免疫层析试纸条和共聚焦拉曼成像装置相结合，实现高灵敏度蛋白分析物免疫定量检测。
所述的侧向流装置将在环境温度下保持稳定，并支持对样本中的生物标志物进行可靠、增强的检测和量化。液体样本被直接加到过滤试纸上，然后通过毛细管力将含有目标物的条带转移到共聚焦拉曼成像分析仪，用于对样本进行光谱免疫分析。
所述的侧向流免疫层析试纸条包含位于加样孔下面的样品过滤及吸收垫，可对液体样本进行分离并净化，并将纯化得到的液体样本以条带的形式转移到SERS检测窗口。
所述的侧向流免疫层析试纸条使用共聚焦拉曼成像装置进行检测。
所述的侧向流免疫层析试纸条中，使用的与检测抗体偶联的标记物，包括有表面拉曼增强效应的纳米粒子，这种纳米粒子可以是组分为金或银或钯的纳米结构，其中包括纳米星、纳米棒、或纳米球；以及与之相偶联的不同类型的拉曼标记物。这种标记物可以是荧光染料，5,5'-二硫代双(（2-硝基苯甲酸）（DTNB），4-巯基苯甲酸（4MBA），或罗丹明。
所述的基于表面增强拉曼成像的高灵敏度侧向流免疫层析检测装置，可实现样品预处理、洗涤、分离、混合、孵育、免疫反应和检测。
本发明的效果：
本发明将侧向流免疫层析试纸条和共聚焦拉曼成像装置相结合，利用表面增强拉曼散射的高灵敏性以及共聚焦拉曼成像的快速性特点，实现高精度、定量快速检测。
附图说明
图1为本发明的侧向流免疫层析试纸条的示意图。
图2为本发明的侧向流免疫层析试纸条的拉曼成像装置示意图。
图3为本发明中的化合物在合成过程中的表征。
图4为本发明的侧向流免疫层析试纸条对新冠病毒感染的检测结果。
图5为本发明的侧向流免疫层析试纸条对大肠杆菌O157：H7的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的覆盖范围。
实施例1
本发明构建了一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条。
金纳米颗粒的制备：在锥形瓶中加入98.9 mL水，并置于磁力搅拌器上。加入1 mL柠檬酸钠溶液（30 mg/mL），并在1200 rpm搅拌下加热至沸腾。随后，加入1 mL氯金酸溶液（25 mM），并在搅拌下沸腾反应30分钟。溶液的颜色由浅黄色变为紫色，最后变为红色，形成金种子溶液。放置37.4 mL水、1 mL金种子溶液、400 μL NH2OH·HCI （100 mM）溶液和400μL柠檬酸钠溶液（10 mg/mL）并搅拌5分钟均匀混合。加入800 μL氯金酸溶液（25 mM）并连续搅拌1小时以完成反应。
次级抗体与胶体金纳米颗粒的偶联。使用0.2 M K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调节至8.0，加入15 μL抗体（1 mg/mL），并在4℃避光中孵育1小时。使用BSA（20 μL，20%）和PEG-20000溶液（10 μL，10%）封闭金纳米球并稳定金标记的次级抗体，反应在室温下进行30分钟。将偶联溶液在4 ℃、2000 rpm下离心15分钟以去除未结合的金纳米颗粒，并在4℃、10000 rpm下离心30分钟以获得与金纳米颗粒偶联的次级抗体。使用200 μL标准工作溶液进行重悬，4°C避光储存。
侧向流免疫层析试纸条的组成。本发明基于商业化的试纸条，在使用前，用相同尺寸的玻璃纤维膜代替原先试纸条中包含金纳米颗粒偶联的次级抗体和抗质控物的的金标垫，以确保样品溶液能够完整的流过去（图1（5））。图1（1）显示了商业化的试纸条上各部分的组成，图1（2-3）显示了本发明中试纸条的具体使用情况。将Au-拉曼探针标记的抗目标物的次级抗体、Au-抗质控物抗体和不同梯度浓度的目标蛋白混合均匀（总共~100μL），进行样本上样。溶液中的目标物被Au-Alexa 647标记的抗目标物的次级抗体识别，然后在检测窗口区域被抗目标物的初级抗体捕获并聚集在NC膜上，形成三明治结构。Au-抗质控物被C线上的质控物捕获和聚集，以形成一条清晰的红线，从而确定该试纸条结果的可信度。在拉曼增强散射的作用下对夹心免疫复合物进行定量检测。
共聚焦拉曼成像系统1：该装置将自主研发的高精度共聚焦拉曼成像装置应用于侧向流免疫层析试纸条上，实现高精度、低成本的蛋白定量检测。在传统的检测中，通常只使用单点拉曼信号，这可能导致意外误差。因此，在本发明中，我们使用自制的共聚焦拉曼显微镜实现了一定范围内的光谱采集，使测量结果更加准确可靠。共焦特征可以进一步提高灵敏度。如图2所示，单模光纤耦合785nm激光器由准直器准直，然后由反射器注入系统。接下来，785nm激光束由二向色镜反射，并由物镜聚焦在样品上。样品发射的拉曼信号穿过物镜和二向色镜，然后传输到非球面消色差透镜，该透镜安装在z轴平移支架上。最后，拉曼信号聚焦在光纤上，该光纤被用作针孔以抑制失焦噪声，并固定在SMA光纤适配器板上，该适配器板组装在螺纹笼板上。光纤连接到光纤型拉曼光谱仪。上位机控制二维位移台，实现激光束聚焦在样品的不同区域。基于不同浓度的目标和相应的拉曼强度构建标准曲线。在本发明给中，每个样本扫描20个点，以提高测量精度。对每个样本至少进行三次平行测量。
共聚焦拉曼成像系统2：该装置为线共聚焦拉曼成像系统，其结构如图2（3）所示，利用激光器与线激光模块形成线激光，通过二项色镜和反射镜将其光源反射至物镜入瞳，之后利用二维位移平台实现线扫描；最后，信号光依次通过物镜，反射镜，二向色镜，长通滤光片和透镜，达到消像差成像光谱仪，实现线共聚焦的信号探测。相对于共聚焦拉曼成像系统1，第一，其探测速度更快，一次可同时探测上百个目标点；第二，自主研发的消像差图谱仪可以帮助我们达到接近显微镜分辨率极限的高光谱成像分辨率，并且旋转光栅的设置可以让我们覆盖300-1100nm范围的信号探测，使得激发光的选择范围更加广。本系统作为应用于侧向流免疫层析试纸条的另一方案选择。
对新冠病毒感染N蛋白进行检测。本发明羟胺种子生长法合成胶体金纳米颗粒作为拉曼增强因子，生成的金纳米颗粒的吸收峰结果如图3（1）所示，显示最大吸收峰在~542nm处，表明直径为~60 nm。首先，通过Alexa荧光抗体标记试剂盒对Alexa 647标记的次级抗体进行标记和纯化。其次，通过静电吸附将金纳米颗粒与次级抗体偶联。对合成中每个步骤的化合物进行Zeta电位分析，以确定它们是否被成果偶联。如图3（2）所示，化合物的Zeta电位测量依次为-11.8 mV、-17.1 mV和-27.8 mV，表明金纳米颗粒和Alexa 647已被成功标记在抗N蛋白的次级抗体上。对金纳米颗粒结合前后的化合物进行拉曼光谱分析。图3（3）中的拉曼光谱显示，在785nm的激发下，金纳米颗粒可以显著增强拉曼散射。此外，Au-Alexa 647标记的大肠杆菌O157的次级抗体也如上所述的方法进行偶联。
对新冠病毒感染进行了共聚焦拉曼成像分析，分别以抗核衣壳蛋白（N蛋白）抗体为初级抗体，Au-Alexa 647标记的抗N蛋白单克隆抗体为次级抗体，山羊抗兔抗体和Au-rabbit IgG为质控物和抗质控物。如图4（2）所示，在拉曼位移为2156 cm-1时的拉曼强度与N蛋白的浓度呈正相关。图4（1）显示了当N蛋白浓度为4.74 ng/mL时，通过共聚焦拉曼显微镜在T线中间的20个采样点（10个采样点在T线的中心部位，而T线的每个两侧各取5个点）进行拉曼强度的测定。使用具有不同梯度浓度的N蛋白和在2156 cm-1处的拉曼强度构建标准曲线。通过计算10个空白值的平均值加上3个标准偏差获得92 pg/mL的LOD值（图4（3））。对N蛋白的每个梯度浓度进行分析，得到相对标准偏差（RSD）小于~9%，表明该方法具有良好的稳定性和重现性。
为了评估基于共焦拉曼成像的侧向流免疫层析试纸条的性能，将本发明与商业胶体金测试条进行了比较，如图4（4）所示。随着N蛋白浓度的不断降低，T线上的颜色逐渐变浅。根据视觉观察，当N蛋白的浓度为23.7 ng/mL时，T线基本消失。相比之下，本研究中基于共焦拉曼成像的侧向流免疫层析试纸条的灵敏度提高了两个数量级。这证明了共聚焦拉曼成像技术在提高SERS信号灵敏度和均匀性以及减少背景噪声和杂散光干扰方面的优势。请注意，不同方法的检测灵敏度的比较是公平和一致的，因为所有方法都应用于相同的缓冲液（或相同的样品溶液）中。
对大肠杆菌O157：H7进行检测。选择大肠杆菌O157：H7抗体和Au-Alexa 647标记的大肠杆菌O157抗体作为初级抗体和次级抗体，选择山羊抗小鼠抗体和Au-小鼠IgG分别作为质控物和抗质控物。图5（1）显示了当大肠杆菌O157：H7的浓度为5×104 cfu/mL时，通过共聚焦拉曼显微镜对T线上的20个采样点的拉曼强度进行检测。用不同梯度浓度的大肠杆菌O157：H7和相应的拉曼强度建立了标准曲线（图5（2-3）），通过在10个空白值的平均值上添加3个标准偏差，确定LOD为~1×104 cfu/mL。各组大肠杆菌O157：H7的RSD被测定小于~7.8%，表明该分析具有良好的稳定性和重现性。图5（4）显示了用于大肠杆菌O157：H7的商业胶体金试纸条。根据肉眼观察，当大肠杆菌O157：H7的浓度为1×105 cfu/mL时，T线的颜色逐渐消失。与商业化胶体金检测试剂盒的结果相比，本方法使用共聚焦拉曼成像显微镜检测的灵敏度提高了一个数量级。未来可以通过选择合适的抗体对来进一步提高灵敏度，因为商业化的抗体对是经过较好的优化组合。
在本发明中，开发了一种基于共聚焦拉曼成像的侧向流免疫层析试纸条，用于检测新冠病毒感染和大肠杆菌。使用普通的金纳米颗粒作为拉曼增强因子，对大肠杆菌O157：H7的检测限为~1×104 cfu/mL，对N蛋白的检测限达到~pM。与商业胶体金试纸条相比，该技术的检测限提高了1-2个数量级，证明金纳米颗粒可以显著增强侧向流免疫试纸条中目标分子的拉曼强度。如果用合适长径比的金纳米棒代替金纳米球以给出更大的拉曼增强因子，则可以进一步提高检测极限。此外，在本发明中用于商业化试纸条的抗体对是经过多次优化选择后的最佳组合，而本发明中的共聚焦拉曼成像显微镜测试中使用的抗体对的适配性没有得到优化，因此，如果本发明的方法使用商业化试纸条中的抗体对进行实验，检测灵敏度应该会更好。该实验主要用于原理论证。整个检测过程可以在15分钟内完成，大大提高了检测效率。本发明使用国产共焦拉曼设备简单地证明了这一概念，并且可以显著减小其尺寸，使系统便携。如本发明所述，将共焦拉曼成像与侧向流免疫层析试纸条相结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和快速实时检测，对于筛查传染病和检测细菌病原体尤为重要。
Claims (5)
1.一种基于共聚焦拉曼成像的超灵敏侧向流免疫层析试纸条，其特征在于：
包括侧向流过滤及液体驱动装置和共聚焦拉曼成像装置。所述的侧向流装置，包含底衬，附着在底衬上的多层式样品过滤垫、结合垫、NC层析膜、吸水垫及外壳。这种依次紧密相连的设置可通过毛细管力将液体样品受控驱动到所需区域，并将生物、化学实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米的芯片上，完成样品的预处理、洗涤分离、混合、孵育、免疫反应和检测的一系列步骤；构建的共聚焦拉曼成像装置具有较高的光谱分辨率（通常优于1nm），使我们能够通过滤除附近非聚焦区域中的干扰信息来实现更高的信噪比，实现更好的灵敏度；侧向流装置和共聚焦拉曼成像系统相结合，可实现高灵敏度蛋白分析物免疫定量检测。
2.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的侧向流免疫层析试纸条包含位于加样孔下面的样品过滤及吸收垫，可对液体样本进行分离并净化，并将纯化得到的液体样本以条带的形式转移到SERS检测窗口。
3.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的侧向流免疫层析试纸条使用共聚焦拉曼成像装置进行检测。
4.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的侧向流免疫层析试纸条中，使用的与检测抗体偶联的标记物，包括有表面拉曼增强效应的纳米粒子，这种纳米粒子可以是组分为金或银或钯的纳米结构，其中包括纳米星、纳米棒、或纳米球；以及与之相偶联的不同类型的拉曼标记物。这种标记物可以是荧光染料，5,5'-二硫代双(（2-硝基苯甲酸）（DTNB），4-巯基苯甲酸（4MBA），或罗丹明。
5.根据权利要求1所述的联检装置，其特征在于：所述的基于表面增强拉曼成像的高灵敏度侧向流免疫层析检测装置，可实现样品预处理、洗涤、分离、混合、孵育、免疫反应和检测。
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