CN114414546A - 一种高通量液相生物分子检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高通量液相生物分子检测方法及装置，该方法包括：使用量子点修饰的微片作为分子检测载体，以微片形状和荧光光谱为组合编码信息，得到复合微片；建立载体种类与生物分子种类的对应关系，以通过微片的种类识别并区分待测分子的种类；使修饰后的复合微片与待检测溶液及标记量子点在液相环境中反应；采用检测装置对复合微片进行显微成像及荧光激发，获取复合微片的形状图像和荧光光谱；根据复合微片的形状与荧光光谱的组合确定载体的种类，进而根据建立的载体种类与生物分子种类的对应关系确定生物分子的种类；同时根据标记量子点发射的定量荧光的强度确定生物分子的浓度。该方法及装置编码稳定，解码准确，编码数量大，实现简单。

Description

一种高通量液相生物分子检测方法及装置

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种高通量液相生物分子检测方法及装置。

背景技术

生物分子检测作为一种基本研究工具，在疾病诊断、环境监测及药物筛选等领域应用广泛。生物分子检测是疾病诊断、药物筛选、环境检测等领域的基本工具。多种生物分子的同时检测不仅能提高检测效率，降低样品需求量，更为重要的是，疾病的产生和进展往往伴随多个生物指标的改变，实现多种生物分子的同时检测能够提高检测的特异性、敏感性及诊断精度。

现有的液相高通量生物分子检测主要采用荧光编码微球的方法。该方法使用包裹有荧光染料的微球作为检测载体，利用微球的荧光颜色编码分析物的种类。检测过程中将大量荧光微球在液相环境中与待检测样品一起反应，不同种类的待测分子被不同种类的荧光微球捕获。反应完成后使用流式细胞仪对荧光微球的种类进行解码以识别待测分子的种类。待测分子的浓度使用荧光定量检测方法测量。但由于荧光染料存在的光漂白性等不足，编码微球在强光下或者长时间光照后会发生光淬灭，这都影响微球的编码稳定性及准确性。虽然现有研究使用量子点代替荧光染料，但荧光本身宽的发射谱同样制约着编码间隔，影响总编码数量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量液相生物分子检测方法及装置，该方法及装置编码稳定，解码准确，编码数量大，实现简单。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高通量液相生物分子检测方法，包括以下步骤：

1）使用量子点修饰的微片作为分子检测载体，以微片形状和荧光光谱为组合编码信息，得到复合微片；所述荧光光谱为编码荧光；

2）通过在载体表面修饰特异性探针分子的方式建立载体种类与生物分子种类的对应关系，以通过微片的种类识别并区分待测分子的种类；

3）使修饰后的复合微片与待检测溶液及标记量子点在液相环境中反应；所述标记量子点的荧光光谱为定量荧光；

4）采用检测装置对复合微片进行显微成像及荧光激发，获取复合微片的形状图像、编码荧光光谱和定量荧光的强度；

5）根据复合微片的形状与编码荧光光谱的组合确定载体的种类，进而根据建立的载体种类与生物分子种类的对应关系确定生物分子的种类；同时根据标记量子点发射的定量荧光的强度确定生物分子的浓度。

进一步地，所述步骤2）中，对同一种类的载体表面接枝同一种探针分子，不同种类的载体接枝不同种类的探针分子。

进一步地，微片的横截面形状为长方形、三角形、四边形、五边形、六边形、圆形或椭圆形，长方形的长度和宽度、四边形的边长、五边形的边长、六边形的边长、球形的直径以及椭球形的长轴和短轴均介于10-300μm之间；微片的厚度介于10-100 μm之间。

进一步地，所述微片的材质为透明玻璃。

本发明还提供了一种用于实现上述方法的高通量液相生物分子检测装置，包括透明透明样品台、显微成像组件和荧光光谱检测组件，所述透明样品台用于放置复合微片，所述显微成像组件用于获取复合微片的形状，所述荧光光谱检测组件用于获取复合微片的荧光光谱及标记量子点的荧光强度。

进一步地，所述显微成像组件与荧光光谱检测组件具有相同的观察视野，所述显微成像组件还用于指导确定荧光光谱的测量位点，所述测量位点位于每个复合微片的中央。

进一步地，所述荧光光谱检测组件包括：

荧光激发模块，用于发出激光，激发量子点的荧光；

光束准直模块，用于准直和扩束激光束；

分光模块，用于将荧光的激发光和发射光按照波长分开，其中激发光被分光模块反射，发射光透光分光模块；

荧光聚焦模块，用于将荧光聚焦到光谱检测模块；

光谱检测模块，用于获取编码荧光的光谱和定量荧光的强度；以及

激光聚焦模块，用于将激光聚焦在透明样品台的复合微片上；

所述显微成像组件包括：

成像光源模块，用于为微片显微成像提供光源；

显微模块，用于对复合微片进行显微成像；

准直光聚焦模块，用于将显微模块出射的准直光聚焦在面成像模块上；以及

面成像模块，用于获取复合微片的形状图像。

进一步地，所述荧光激发模块为半导体激光器，所述光束准直模块为透镜组，所述分光模块为二向色镜，所述荧光聚焦模块为聚焦透镜，所述光谱检测模块为光谱仪，所述激光聚焦模块为物镜；所述成像光源模块为LED光源，所述显微模块为显微物镜，所述准直光聚焦模块为透镜组，所述面成像模块为面阵CCD或CMOS设备。

相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：该方法使用载体本身的形状和荧光光谱作为编码信息，微片本身稳定的物理特性及量子点稳定的发射谱可以保证高的编码稳定性，同时复合编码方法能够倍数提高编码数量，解决了编码数量不足或者荧光光谱重叠影响解码准确性的问题。该方法可以使用普通的玻璃片作为检测载体，造价低廉且工艺简单，同时成熟且高精度的激光玻璃切割技术为该方法的大规模量产提供了技术支撑。因此，该方法具有编码稳定、编码数量大、解码准确、造价低廉、工艺简单等优势，具有很强的实用性和广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例的检测方法实现原理图。

图2为本发明实施例中复合微片的制备及处理过程示意图。

图3为本发明实施例的检测装置示意图。

图4为本发明实施例中的一种编码结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如图1、2所示，本实施例提供了一种高通量液相生物分子检测方法，包括以下步骤：

1）使用量子点修饰的微片作为分子检测载体，以微片形状和荧光光谱为组合编码信息，得到复合微片；所述荧光光谱为编码荧光。

2）通过在载体表面修饰特异性探针分子的方式建立载体种类与生物分子种类的对应关系，以通过微片的种类识别并区分待测分子的种类。对同一种类的载体表面接枝同一种探针分子，不同种类的载体接枝不同种类的探针分子。

3）使修饰后的复合微片与待检测溶液及标记量子点在液相环境中反应。

待测分子被复合微片特异性捕获，标记量子点与待测分子结合。标记量子点产生的荧光光谱作为定量荧光，用于定量待测分子的浓度。标记量子点与微片表面修饰的编码量子点种类不同。

4）采用检测装置对复合微片进行显微成像及荧光激发，获取复合微片的形状图像、编码荧光光谱和定量荧光的强度。

5）根据复合微片的形状与编码荧光光谱的组合确定载体的种类，进而根据建立的载体种类与生物分子种类的对应关系确定生物分子的种类；同时根据标记量子点发射的定量荧光的强度确定生物分子的浓度。

因此，制备多种微片就可以实现对多种生物分子的同时检测。

在本实施例中，微片的横截面形状为长方形、三角形、四边形、五边形、六边形、圆形或椭圆形，长方形的长度和宽度、四边形的边长、五边形的边长、六边形的边长、球形的直径以及椭球形的长轴和短轴均介于10-300μm之间；微片的厚度介于10-100μm之间。微片的材质为透明且表面光滑的玻璃。

如图3所示，本实施例提供了用于实现上述方法的高通量液相生物分子检测装置，包括透明样品台8、显微成像组件和荧光光谱检测组件，所述透明样品台8用于放置复合微片，所述显微成像组件用于获取复合微片的形状，所述荧光光谱检测组件用于获取复合微片的荧光光谱及标记量子点的荧光强度。其中，编码荧光和微片形状一起用于确定微片的种类，进而确定待测分子的种类，定量荧光的强度用于定量待测分子的浓度。使用多种载体同时进行检测，可以完成对多种生物分子的同时检测，即高通量检测。

具体地，所述荧光光谱检测组件包括：荧光激发模块1、光束准直模块2、分光模块3、荧光聚焦模块4、光谱检测模块5和激光聚焦模块6。所述荧光激发模块1用于发出激光，激发量子点的荧光。所述光束准直模块2用于准直和扩束激光束。所述分光模块3用于将荧光的激发光和发射光按照波长分开，其中激发光被分光模块反射，发射光透过分光模块。所述荧光聚焦模块4用于将荧光聚焦到光谱检测模块。所述光谱检测模块5用于获取荧光光谱。所述激光聚焦模块6用于将激光聚焦在透明样品台8的复合微片上。

所述显微成像组件包括：成像光源模块7、显微模块9、准直光聚焦模块10和面成像模块11。所述成像光源模块7用于为微片显微成像提供光源。所述显微模块9用于对复合微片进行显微成像。所述准直光聚焦模块10用于将显微模块出射的准直光聚焦在面成像模块上。所述面成像模块11用于获取复合微片的形状图像。

在本实施例中，所述荧光激发模块1为半导体激光器，所述光束准直模块2为透镜组，所述分光模块3为二向色镜，所述荧光聚焦模块4为聚焦透镜，所述光谱检测模块5为光谱仪，所述激光聚焦模块6为物镜；所述成像光源模块7为LED光源，所述显微模块9为显微物镜，所述准直光聚焦模块10镜组，所述面成像模块11阵CCD或CMOS设备。

下面对本实施例中的复合微片，即基于微片形状及荧光光谱的复合编码微片的制备及处理过程作进一步说明。

1.制作复合微片。使用激光切割制备2种不同形状的透明玻璃片（L1：长宽高100×100×50μm的长方体，L2：底边为100×100μm高为50μm的三棱柱）。随后利用表面修饰的方法分别在三种玻璃微片表面接枝525nm和585nm（荧光发射谱的中心波长）的量子点，这两种量子点可以构建4种编码光谱，分别是F1：没有光谱，F2：525nm的荧光光谱，F3：585nm的荧光光谱，F4：包含525和585nm的荧光光谱。玻璃微片形状和编码荧光光谱组合可以构建8种复合载体，分别是L1F1，L1F2，L1F3，L1F4，L2F1，L2F2，L2F3，L2F4。

图4示出了本实施例的一种编码结果，包含8种L1F1，L1F2，L1F3，L1F4，L2F1，L2F2，L2F3，L2F4编码信号。

2.遵循抗原-抗体特异性结合或者核酸碱基互补配对原则，根据待测分子的种类对复合微片修饰探针分子（如抗体、核酸等），使复合微片具有特异性捕获生物分子的能力。该步骤中，对8种微片表面分别修饰8种不同的抗体蛋白，其中同一种微片修饰同一种抗体蛋白。

3.对上述8种抗体蛋白对应的抗原进行高通量检测，待检测溶液为8种抗原的混合溶液。将8种（每种500片）修饰完成的复合微片与待检测溶液及625nm标记量子点在液相环境中反应。8种抗原分别被8种复合微片特异性捕获，625nm标记量子点同时与8种抗原结合。625nm标记量子点的荧光强度做为定量荧光用于定量待测分子的浓度。

4.使用本发明提出的检测装置对反应后的复合微片进行显微面成像和荧光光谱检测，确定微片的形状并定量测量每片微片中央区域的荧光光谱。荧光光谱分为两部分，525 nm和585 nm位置的荧光是编码荧光，与微片形状一起用于确定待检测分子的种类；625nm位置的荧光是定量荧光，其强度与待检测分子的浓度成正比，因此通过测量定量荧光的强度实现生物分子的定量检测。为了减少误差，每一种载体选取50片，取50片定量荧光的平均强度做为定量检测结果。通过测量8种载体的定量荧光强度可以完成对8种生物分子的同时检测，即高通量检测。

然后，通过本实施例提供的检测装置进行检测。该检测装置中：光源1是405nm的半导体激光器，用于激发量子点的荧光；2是透镜组，用于准直和扩束激光束；3是二向色镜，用于将荧光的激发光和发射光按照波长分开，其中激发光会被二向色镜反射，发射的荧光会透过二向色镜；4是聚焦透镜，用于将荧光聚焦到5光谱仪中；5所示的光谱仪光谱范围需要涵盖整个可见光波段；6是物镜，用于将激光聚焦在8透明样品台上；7是LED光源，做为微片显微成像的光源；9是物镜，用于对微片进行显微成像；10是透镜组，用于将从物镜9出射的准直光聚焦在11面阵CCD上；7-11构成显微成像系统，用于对微片进行显微成像。

综上，本发明提出一种基于微片形状及荧光光谱复合编码的高通量生物分子检测方法及相应的检测装置，该方法微片形状和荧光光谱的组合作为编码信号编码待测分子的种类。该方法首先制备不同形状或者不同长宽比的玻璃微片，几何尺寸在几十至几百微米范围内。随后使用表面修饰方法在微片表面修饰量子点，使微片能够发射不同的荧光光谱。微片形状和荧光光谱共同决定微片的种类。之后根据待检分子的不同对微片修饰不同种类的探针分子，使得每种微片只能特异性捕获特定种类的生物分子，由此建立微片种类与生物分子种类的对应关系。制备好的复合微片作为检测载体与待检测分子和标记量子点在液相环境中反应。最终通过本发明提出的解码和检测装置解码微片形状和荧光光谱，并测量定量荧光强度。通过识别微片的种类确定待测分子的种类，通过测量定量荧光强度确定待测分子的浓度信息。这种编码方法使用微片本身的形状特性作为编码信息。微片本身稳定的物理特性及量子点稳定的发射谱可以保证高的编码稳定性，同时复合编码方法能够倍数提高编码数量，解决了编码数量不足或者荧光光谱重叠造成的解码错误等技术问题。该方法使用普通的玻璃片做为检测载体，造价低廉，同时成熟且高精度的激光玻璃切割技术为该方法的大规模量产提供了技术支撑。该方法所具有的编码稳定、编码数量大、解码准确、造价低廉、工艺简单等特点使其在生物分子检测、临床诊断及环境检测方面优势明显。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种高通量液相生物分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）使用量子点修饰的微片作为分子检测载体，以微片形状和荧光光谱为组合编码信息，得到复合微片；所述荧光光谱为编码荧光；

2）通过在载体表面修饰特异性探针分子的方式建立载体种类与生物分子种类的对应关系，以通过微片的种类识别并区分待测分子的种类；

3）使修饰后的复合微片与待检测溶液及标记量子点在液相环境中反应；所述标记量子点的荧光光谱为定量荧光；

4）采用检测装置对复合微片进行显微成像及荧光激发，获取复合微片的形状图像、编码荧光光谱和定量荧光的强度；

5）根据复合微片的形状与编码荧光光谱的组合确定载体的种类，进而根据建立的载体种类与生物分子种类的对应关系确定生物分子的种类；同时根据标记量子点发射的定量荧光的强度确定生物分子的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种高通量液相生物分子检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，对同一种类的载体表面接枝同一种探针分子，不同种类的载体接枝不同种类的探针分子。

3.根据权利要求1所述的一种高通量液相生物分子检测方法，其特征在于，微片的横截面形状为长方形、三角形、四边形、五边形、六边形、圆形或椭圆形，长方形的长度和宽度、四边形的边长、五边形的边长、六边形的边长、球形的直径以及椭球形的长轴和短轴均介于10-300μm之间；微片的厚度介于10-100 μm之间。

4.根据权利要求1所述的一种高通量液相生物分子检测方法，其特征在于，所述微片的材质为透明玻璃。

5.一种用于实现如权利要求1-4任一项所述方法的高通量液相生物分子检测装置，其特征在于，包括透明样品台、显微成像组件和荧光光谱检测组件，所述透明样品台用于放置复合微片，所述显微成像组件用于获取复合微片的形状，所述荧光光谱检测组件用于获取复合微片的荧光光谱及标记量子点的荧光强度。

6.根据权利要求5所述的一种高通量液相生物分子检测装置，其特征在于，所述显微成像组件与荧光光谱检测组件具有相同的观察视野，所述显微成像组件还用于指导确定荧光光谱的测量位点，所述测量位点位于每个复合微片的中央。

7.根据权利要求6所述的一种高通量液相生物分子检测装置，其特征在于，所述荧光光谱检测组件包括：

荧光激发模块，用于发出激光，激发量子点的荧光；

光束准直模块，用于准直和扩束激光束；

分光模块，用于将荧光的激发光和发射光按照波长分开，其中激发光被分光模块反射，发射光透过分光模块；

荧光聚焦模块，用于将荧光聚焦到光谱检测模块；

光谱检测模块，用于获取编码荧光的光谱和定量荧光的强度；以及

激光聚焦模块，用于将激光聚焦在透明样品台的复合微片上；

所述显微成像组件包括：

成像光源模块，用于为微片显微成像提供光源；

显微模块，用于对复合微片进行显微成像；

准直光聚焦模块，用于将显微模块出射的准直光聚焦在面成像模块上；以及

面成像模块，用于获取复合微片的形状图像。

8.根据权利要求7所述的一种高通量液相生物分子检测装置，其特征在于，所述荧光激发模块为半导体激光器，所述光束准直模块为透镜组，所述分光模块为二向色镜，所述荧光聚焦模块为聚焦透镜，所述光谱检测模块为光谱仪，所述激光聚焦模块为物镜；所述成像光源模块为LED光源，所述显微模块为显微物镜，所述准直光聚焦模块为透镜组，所述面成像模块为面阵CCD或CMOS设备。

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