CN108896526A - 拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法及装置,所述检测方法步骤如下:载体与荧光探针分子反应后,与纳米金属颗粒进行连接,得到具有拉曼增强效果的表面增强拉曼载体,随后与拉曼待测分子的混合物反应制备拉曼光谱编码的液相生物芯片,通过拉曼光谱对所述液相生物芯片的定性分析,得到所述拉曼待测分子种类的检测结果,通过荧光显微成像对所述液相生物芯片进行定量分析,得到所述拉曼待测分子数量的检测结果。该发明具备已有基于荧光编码微球的液相生物芯片的检测方法优点,而且从根本上就消除了已有液相生物芯片的解码准确性和稳定性差的问题,在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域,主要是涉及一种液相生物芯片的检测方法以及装置。
背景技术
液相生物芯片技术是一种集荧光编码微球、流式细胞术、激光检测和高速数字信号处理等多项技术为一体的新型生物分子高通量技术,它主要是以不同种类的荧光编码微球作为载体进行杂交反应和信号检测,通常多以多色流式细胞仪作为解码和检测平台,通过把芯片技术和流式细胞检测技术结合到一起,在液相反应体系中实现核酸、蛋白质等多种生物分子的检测。液相芯片技术解决了固态微阵列芯片反应速率慢、重复性及灵活性差等问题,和其他传统的免疫检测方法相比,液相生物芯片技术具有高通量、多指标联合检测、高敏感性、高特异性、线性范围宽、反应快速、重复性好以及操作简便等优点。
目前已知的商用主流液相生物芯片技术通过在微球表面接不同种类的有机荧光染料或在微球中包裹不同的荧光量子点来形成荧光编码微球。然后在荧光编码微球表面结合上探针分子,在液相环境中与被标记的待测分子进行杂交反应。选用两种不同波长照射微球,一个波长用于激发荧光编码微球的荧光来进行分类,做定性分析,一个波长用来确定荧光编码微球的强度,从而确定待测分子的数量,做定量分析。虽然通过双色激光的同时检测,可以确定被结合的生物分子的种类和数量,但是荧光编码微球的液相生物芯片的
解码准确性和稳定性差。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法及装置,从而克服荧光编码微球的液相生物芯片解码准确性和稳定性差的问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,所述检测方法的步骤:
I.载体与荧光探针分子反应后,与纳米金属颗粒进行连接,得到具有拉曼增强效果的表面增强拉曼载体,随后与拉曼待测分子的混合物反应制备拉曼光谱编码的液相生物芯片,
Ⅱ.通过拉曼光谱对所述液相生物芯片的定性分析,得到所述拉曼待测分子种类的检测结果,
Ⅲ.通过荧光显微成像对所述液相生物芯片进行定量分析,得到所述拉曼待测分子数量的检测结果。
优选地,上述技术方案中,所述液相生物芯片是基于表面增强拉曼的基础上、基于微米尺度的反应载体的表面拉曼增强基底。
优选地,上述技术方案中,所述拉曼增强探针分子的载体为微片。
优选地,上述技术方案中,所述微片为透明固体片状无毒材料,且在整个分子检测过程中除在微片表面能够修饰上探针分子以外不发生任何反应。
优选地,上述技术方案中,将阴离子聚合物修饰在所述金属纳米颗粒表面,使所述金属纳米颗粒带上负电位,将含有大量氨基的阳离子聚合物修饰在所述微片表面,使所述微片带上正电位,所述金属纳米颗粒与所述微片在液相反应环境中通过静电作用结合,得到具有拉曼增强作用的基底物质微片-金纳米颗粒。
优选地,上述技术方案中,不同种荧光探针分子的载体之间拉曼待测分子种类不同。
优选地,上述技术方案中,所述拉曼待测分子为带巯基的物质。
本发明提供了一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,在所述拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法中使用,所述装置包括有拉曼光谱通道和荧光显微成像通道,所述通道通过带反滤波片(3)进行耦合,所述拉曼光谱通道用于对拉曼光谱编码的液相生物芯片进行定性分析,得到所述拉曼待测分子种类的检测结果,所述荧光显微成像通道用于对拉曼光谱编码的液相生物芯片进行定量分析,得到所述拉曼待测分子数量的检测结果。
优选地,上述技术方案中,所述拉曼光谱通道通过样品台(8)、物镜、带反滤波片(3)、二向色镜(5)、拉曼滤波片(6)、透镜(7)、光谱仪和CCD2顺序连接,所述荧光显微成像通道通过样品台(8)、物镜、带反滤波片(3)、二向色镜(2)、透镜(4)、透镜(1)、CCD1顺序连接。
优选地,上述技术方案中,所述装置是把拉曼光谱技术和荧光检测技术相结合的多模态成像或者检测系统。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提出的一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,所述拉曼光谱具有很高的光谱分辨率,而且拉曼分子的谱峰稳定性高,根据不同的拉曼分子具有不同的拉曼特征峰,解码准确性极高,该发明提出的拉曼光谱编码的液相生物芯片检测方法具备已有基于荧光编码微球的液相生物芯片检测方法的优点,而且从根本上就消除了已有液相生物芯片的解码准确性和稳定性差的问题,在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。
所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,所述拉曼光谱解码通道和所述标记荧光检测通道所探测的信号两者产生机制完全不同,两个检测通道之间不存在任何干扰,这意味着标记荧光检测通道几乎是零背景检测,原理上就具有高灵敏度的特点,对应具备较低的待测分子浓度检测限。
附图说明
图1是拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置对基于表面拉曼增强光谱的液相生物芯片进行拉曼光谱解码和标记荧光检测的示意图。
图2是拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置。
图3是制备拉曼光谱编码的液相生物芯片步骤示意图。
图4是基于对微米尺度的反应载体的液相生物分子进行荧光检测结果。
图5是基于对微米尺度的反应载体的液相生物分子进行拉曼光谱检测结果。
主要附图标记说明:
图1的raman代表拉曼光谱,I代表荧光强度。
图2拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置的标记说明:1,4,7-焦距不同的透镜,2,5-反射光不同的二向色镜,3-带反滤波片,6-拉曼滤波片,8-样品台。
图3是制备拉曼光谱编码的液相生物芯片步骤示意图的标记说明:A,B,C,D,E代表5个操作步骤。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并未排除其它元件或其它组成部分。
图1至图3显示了根据本发明优选实施方式的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法的示意图。
图3所示,拉曼光谱编码的液相生物芯片制备包括以下步骤:
1、制备微片。微片选用了微米尺寸的透明固体片状无毒材料,且在整个分子检测过程中除在微片表面能够修饰上探针分子以外不发生任何反应。我们选玻璃薄片。图3的步骤A中的正方体代表我们所用微片尺寸约为100*100,形状为正方形。
2、微片和金属纳米颗粒结合。图3的步骤A中的黑色小棒代表金属纳米颗粒,将阴离子聚合物修饰在所述金属纳米颗粒表面,使所述金属纳米颗粒带上负电位,将含有大量氨基的阳离子聚合物修饰在所述微片表面,使所述微片带上正电位,所述金属纳米颗粒与所述微片在液相反应环境中通过静电作用结合,得到具有拉曼增强作用的基底物质微片-金纳米颗粒。
3、拉曼报告分子的选择。选择本身具有拉曼信号的物质,优选地,可选择带巯基的拉曼报告分子,选择的物质可如下:对甲苯硫酚、4-羟基苯硫酚、二奈硫酚等,图3的步骤B中红色代表我们选择的对甲苯硫酚。
4、微片-金纳米颗粒和拉曼报告分子结合。如图3的步骤C中在液相环境中将修饰过的微片-金纳米颗粒和拉曼报告分子混合,进行反应,从而得到拉曼分子链接抗原和抗体。
5、在微片上修饰荧光探针分子。该步骤中,具有相同拉曼分子的微片上修饰相同的荧光探针,同时,不同微片上修饰不同种的拉曼分子探针分子。做出不同种类的荧光探针分子种类的对应荧光强度表。
6、在步骤D,E代表了在步骤C中得到的拉曼分子链接抗原和抗体,进行荧光标记,结合完成之后,就得到我们所制备的液相生物芯片。
图2显示拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,所述装置主要包括:光源1为窄带光源,405nm激光器;光源2为窄带光源,为785nm激光器;1,4,7为焦距不同的透镜,1,7的作用是激发光耦合到CCD1和光谱仪中,4使激发光变为平行光;2,5为反射光不同的二向色镜,其中2能够反射405nm的激发光,透射激发出的荧光;5能够反射785nm的激发光,透射激发出的拉曼光;3为带反滤波片,反射光在600—1000nm之间;6为拉曼滤波片,滤掉785nm以下的光;8代表的是样品台;LED灯是使物体在CCD1中成像的光源,CCD1为面振CCD,功能是展示荧光成像;CCD2为线振CCD,功能是展示光谱;光谱仪是由狭缝,两个透镜和光栅组成,它的作用是使激发光不同波长的光进行分光,然后打到CCD2上,形成光谱。在图2所示的双模态系统中,8,3,5,6,7,物镜,光源2,光谱仪和CCD2组成拉曼光谱通道;8,3,2,4,1,物镜,光源1和CCD1组成荧光显微成像通道。两个通道通过3进行耦合。在拉曼光谱解码通道中,光源2(785nm)通过二向色镜5,打到带反反射镜3上,通过反射,经过物镜,使光源2的光打到样品8,样品产生激发光经过物镜,3,5,通过拉曼滤波片6,经过透镜7聚焦到光谱仪上,光谱仪将不同波长的光进行分光,然后打到线振CCD2上,形成拉曼光谱。
图1显示拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,通过图2的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,对根据图3流程制备的拉曼光谱编码的液相生物芯片进行拉曼光谱解码和荧光强度检测,根据测得的微片的拉曼光谱来识别待测分子,根据测得的标记荧光强度来确定待测分子数量。
如图4所示,是通过拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,对根据图3流程制备的拉曼光谱编码的液相生物芯片进行荧光强度检测的结果,清晰的可显示出了一些,不同微片上荧光强度不同,可以得出微片上的拉曼报告分子的数量不同,而后面对一些我们肉眼观察不清楚的荧光强度的微片,我们可以通过计算平均灰度值来分析不同微片之间的荧光差距。
如图5所示,是通过拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,对根据图3流程制备的拉曼光谱编码的液相生物芯片进行拉曼光谱解码检测的结果,清晰的显示出了对甲苯硫酚在852.7nm和857.6nm的拉曼特征峰,同理我们可以用同样的方法检验出4-羟基苯硫酚、二奈硫酚等多种拉曼报告分子。
综上,本发明运用一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,所述检测方法步骤如下:载体与荧光探针分子反应后,与纳米金属颗粒通过一定的方式进行连接,得到具有拉曼增强效果的表面增强拉曼载体,随后与多种拉曼待测分子的混合物反应制备拉曼光谱编码的液相生物芯片,通过拉曼光谱对所述液相生物芯片的定性分析,得到所述拉曼待测分子种类的检测结果,通过荧光显微成像对所述液相生物芯片进行定量分析,得到所述拉曼待测分子数量的检测结果。该发明具备已有基于荧光编码微球的液相生物芯片的检测方法优点,而且从根本上就消除了已有液相生物芯片的解码准确性和稳定性差的问题,具有快速,解码准确性高,编解码信号稳定性好,可编码数目大,检测灵敏度高等优点,在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型,而且性能或用途相同,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,所述检测方法的步骤:
I.载体与荧光探针分子反应后,与纳米金属颗粒进行连接,得到具有拉曼增强效果的表面增强拉曼载体,随后与拉曼待测分子的混合物反应制备拉曼光谱编码的液相生物芯片,
Ⅱ.通过拉曼光谱对所述液相生物芯片的定性分析,得到所述拉曼待测分子种类的检测结果,
Ⅲ.通过荧光显微成像对所述液相生物芯片进行定量分析,得到所述拉曼待测分子数量的检测结果。
2.根据权利要求1所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,所述液相生物芯片是基于表面增强拉曼的基础上、基于微米尺度的反应载体的表面拉曼增强基底。
3.根据权利要求1所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,所述载体为微片。
4.根据权利要求3所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,所述微片为透明固体片状无毒材料。
5.根据权利要求3所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,将阴离子聚合物修饰在所述金属纳米颗粒表面,使所述金属纳米颗粒带上负电位,将含有大量氨基的阳离子聚合物修饰在所述微片表面,使所述微片带上正电位,所述金属纳米颗粒与所述微片在液相反应环境中通过静电作用结合,得到具有拉曼增强作用的基底物质微片-金纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,不同种荧光探针分子的载体之间拉曼待测分子种类不同。
7.根据权利要求1所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法,其特征在于,所述拉曼待测分子为带巯基的物质。
8.一种拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,在所述拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测方法中使用,其特征在于,所述装置包括有拉曼光谱通道和荧光显微成像通道,所述通道通过带反滤波片(3)进行耦合,所述拉曼光谱通道用于对拉曼光谱编码的液相生物芯片进行定性分析,得到所述拉曼待测分子种类的检测结果,所述荧光显微成像通道用于对拉曼光谱编码的液相生物芯片进行定量分析,得到所述拉曼待测分子数量的检测结果。
9.根据权利要求8所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,其特征在于,所述拉曼光谱通道通过样品台(8)、物镜、带反滤波片(3)、二向色镜(5)、拉曼滤波片(6)、透镜(7)、光谱仪和CCD2顺序连接,所述荧光显微成像通道通过样品台(8)、物镜、带反滤波片(3)、二向色镜(2)、透镜(4)、透镜(1)、CCD1顺序连接。
10.根据权利要求8所述的拉曼光谱编码的液相生物芯片的检测装置,其特征在于,所述装置是把拉曼光谱技术和荧光检测技术相结合的多模态成像或者检测系统。
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